利用秸秆原料发酵生产琥珀酸的方法转让专利
申请号 : CN200710192025.6
文献号 : CN101215582B
文献日 : 2010-12-15
发明人 : 孙志浩 , 郑璞 , 倪晔 , 董晋军
申请人 : 江南大学
摘要 :
利用秸秆原料发酵生产琥珀酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明以秸秆为原料，经水解处理得到六碳糖和五碳糖的水解秸秆糖浆，再用琥珀酸放线杆菌CGMCC 1593在含有还原糖的水解秸秆糖浆的培养基中发酵生产琥珀酸。本发明使用发明人从瘤胃中筛选得到的微生物CGMCC 1593，在厌氧和维持pH 5.5～7.5的环境下，在5L～25L发酵罐进行补料分批厌氧发酵48h，投入总还原糖浓度68.6～70.9g/L，产琥珀酸浓度49.5～52.1g/L，琥珀酸对消耗糖产率80.0％～81.2％(糖利用率87.3～93.6％)，生产强度1.03～1.09g/(L·h)。本发明突出的优点是利用农业废弃物秸秆原料发酵生产琥珀酸，是利用可再生原料的生产方法，对环境友好，可缓解化学合成琥珀酸的石化资源紧张问题。
权利要求 :
1.利用秸秆原料发酵生产琥珀酸的方法，其特征是以秸杆为原料，经水解处理得到六碳糖和五碳糖的水解秸秆糖浆，再用琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)CGMCC 1593在含有还原糖的水解秸秆糖浆的培养基中发酵生产琥珀酸；
发酵培养基组成以每g/L计为：水解秸秆糖浆含总还原糖20～100，酵母膏10～20，玉米浆10～20，MgCl20.1～0.5，Na2HPO4·12H2O 1～5，NaH2PO4·2H2O1～5，培养基起始pH5.5～7.5；培养温度30～40℃，维持pH 5.5～7.5，厌氧条件下发酵20～60h；
所述以秸杆为原料，经水解处理得到六碳糖和五碳糖的水解秸秆糖浆，采用：
(1)稀碱处理-酶水解：将玉米秸秆原料粗切至20～30mm长，用1％NaOH稀碱液，于85～90℃浸泡1h，过滤去除黑液残余物，滤取纤维半纤维；再用纤维素水解酶10～20FPU/g总糖，酶解48h，滤取得到澄清六碳和五碳混合糖液，用NaOH调pH，按发酵培养基配料用于发酵；
或(2)稀酸处理-酶水解：将玉米秸秆原料粗切至20～30mm长，用1.0％稀硫酸，在85～90℃浸泡1h后，再用(1)方法酶水解，滤液测糖，调整总还原糖和pH，按发酵培养基配料用于发酵；
或(3)汽爆处理-酶水解：将玉米秸秆原料粗切至20～30mm长，装入汽爆罐中，在1.5Mpa下，维压10min，然后瞬间减压释放制得的粉状汽爆秸秆料，再用(1)方法酶水解，滤液测糖，调整总还原糖10％和pH，按发酵培养基配料用于发酵；
或(4)稀酸水解：将玉米秸秆原料粗切至20～30mm长，用1.0％稀硫酸做催化剂，在200℃下水解反应2h，快速冷却，过滤去残渣，滤液测糖，调整总还原糖和pH，按发酵培养基配料用于发酵。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是发酵过程中采用补加浓缩的秸秆糖浆，发酵培养基的初始总还原糖浓度35～55g/L，当发酵液残糖降为10g/L时，补加浓缩的秸秆糖浆溶液将发酵液中的糖浓度控制在10～20g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于秸秆原料选用玉米秸秆、麦草、稻草、玉米芯或甘蔗渣作物秸秆。
说明书 :
技术领域
本发明涉及利用秸秆原料发酵生产琥珀酸的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
琥珀酸(succinic acid)，又称丁二酸，分子式为C4H6O4，分子量为118.09，是一种常见的天然有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。
琥珀酸是工业上一种重要的四碳化合物，它作为有机合成原材料、中间产物或专业化学制品广泛应用在食品、医药、农药、染料、香料、油漆、塑料和材料工业。其最大的市场是用于表面活性剂、清洁剂、绿色溶剂、离子鳌合剂、生物可降解塑料等领域。其在食品行业中作为酸化剂、pH改良剂、风味物质和抗菌剂，以及作为原料或中间体用于医药、抗生素、氨基酸和维生素的生产(ApplMicrobiol Biotechnol，51：545-552，1999)。目前，发酵法生产琥珀酸和它大多数衍生物的合成还处在进一步研究和开发阶段。
目前已开发出多项技术将琥珀酸转化为重要的工业化学品，包括N-甲基吡咯烷酮、1，4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯、己二酸、PBT树脂、PBS可降解塑料等。其中许多化工产品目前都是以石油或煤化工产品(如苯、丁烷等)为原料合成的，资源紧缺，不可再生。现报道大约有250种以苯或丁烷等为原料的化工产品可以通过琥珀酸为原料来生产。因此，全球对琥珀酸的需求不断增加。
工业上琥珀酸的生产方法主要为化学方法，主要有石蜡氧化法、轻油氧化法、丁烷氧化法、丁二腈水解法、催化加氢法以及以乙烯和一氧化碳为原料的电解氧化法。目前，国内外主要使用的是催化加氢法。以化学方法获得琥珀酸，不可避免地要消耗大量不可再生的化石原料，还具有转化率低，易污染环境等弊端。
琥珀酸的生产可通过发酵方法来进行，由于化石原料的日趋减少，用微生物发酵碳水化合物生产琥珀酸的方法日益受到人们的重视。由于发酵法生产琥珀酸是以可再生糖源(如葡萄糖)和二氧化碳作为主要原料，因此微生物发酵法生产琥珀酸，具有成本低和摆脱对石化原料依赖的优点，而且开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径，更加显示了环境友好特征。
琥珀酸是继柠檬酸后最具市场潜力的发酵有机酸产品之一，但目前都还是用化学方法生产。根据美国Michigan大学MBI研究所的估计，在未来几年内，琥珀酸的总需求将达到100万吨的水平。
目前文献报道的发酵法生产琥珀酸研究所用培养基原料多为葡萄糖，无论是牛瘤胃中分离的Actinobacillus succinogenes、基因工程构建的大肠杆菌Escherichia coli生产琥珀酸的方法都是如此。使用价格低廉的碳源是降低发酵法生产琥珀酸成本的一个关键因素。目前，已有一些利用不同原料发酵生成琥珀酸的报道，比如美国Argonne在网上报道了从玉米(淀粉水解液)生产化学品琥珀酸的消息(www.ipd.anl.gov/biotech/index.html，2002)，日本三菱化学和味之素公司也联合开发了采用以玉米淀粉为原料发酵生产丁二酸(http://www.bio168.com，2005)。韩国Lee PC等与Kim DY等曾先后报道了Mannheimia succiniciproducens MBEL55E发酵乳清原料和发酵木浆水解液生产琥珀酸。发酵乳清原料产琥珀酸15.5g/L，对消耗糖产率和生产强度为93％和0.24g/(L·h)(Appl Microbiol Biotechnol 54：23-27，2000)；用NaOH预处理过的木浆水解液培养基分批发酵积累琥珀酸11.73g/L，对消耗糖产率和生产强度分别为56％和1.17g/(L·h)(Enzyme and Microbial Technology，35：648-653，2004)，反映了该菌种不适宜于纤维素原料发酵。2002年日本地球环境产业技术研究机构的Inui等人报道使用转基因微生物从废纸发酵制取琥珀酸，每升培养液中可制取约30g的琥珀酸(新华网http://news.xinhuanet.com/newscenter，2002)。由于上述研究结果产率很低，尚未能用于工业化生产。本发明人从牛瘤胃中筛选的琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes CGMCC 1593，它能发酵的糖质原料包括葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖等糖类，能利用多种农副产品如乳糖、木薯、玉米、甜菜或甘蔗糖蜜等(中国专利200610038113.6；200710019686.9)，发现它也很适于发酵秸秆、木材工业下脚料，制糖造纸业下脚料和城市纤维垃圾等木质纤维物的水解糖浆原料生产琥珀酸。
纤维质原料(秸秆、蔗渣、木材等)中含有40％～60％的纤维素、20％～40％的半纤维素和10％～25％的木质素。以纤维类物质作为发酵生产原料，首先将纤维类物质进行酸解、碱解或酶解处理，释放出的葡萄糖、木糖等六碳糖和五碳糖，再用于发酵步骤。
纤维类资源是最主要的生物质资源，它占地球生物质总量的60％～80％。我国的纤维质原料非常丰富，仅农作物秸秆、皮壳一项，每年产量就达7亿多吨，其中玉米秸秆(35％)、小麦秸杆(21％)和稻草(19％)是我国的三大秸秆(http://www.efst.sh.cn/showKnowledge)。目前这些秸秆除少量用作青储饲料和燃料外，大量秸秆成为农业废弃物。秸秆、蔗渣及森林工业副产品等具有来源丰富、品种多、再生时间短、价格低廉等优点。秸秆原料与葡萄糖或淀粉水解液比较，作为发酵工业的主要碳源具有很大潜力，同时可以减轻农林废弃物(麦草、玉米秸秆、玉米芯、大豆渣、甘蔗渣等)、工业废弃物(制浆和造纸厂的纤维渣、锯末等)、城市废弃物(废纸、包装纸等)及林业废弃物对环境造成的压力，实现可持续发展。
秸秆发酵生产琥珀酸与用粮食原料发酵生产琥珀酸相比，能节约大量粮食，有利于国家粮食安全。秸秆发酵生产琥珀酸与用秸秆发酵生产燃料乙醇相比，不仅是产品琥珀酸附加值比乙醇高，而且生产菌种琥珀酸放线杆菌除了能很好利用水解液中的葡萄糖等六碳糖外，还能直接利用木糖、阿拉伯糖等酶水解秸秆糖浆中的五碳糖，糖利用率高，而乙醇酵母未经改造一般不能利用秸秆水解糖浆中的五碳糖。但到目前为止，工业上还没有利用秸秆水解糖浆原料发酵生产琥珀酸的研究实例。
琥珀酸是工业上一种重要的四碳化合物，它作为有机合成原材料、中间产物或专业化学制品广泛应用在食品、医药、农药、染料、香料、油漆、塑料和材料工业。其最大的市场是用于表面活性剂、清洁剂、绿色溶剂、离子鳌合剂、生物可降解塑料等领域。其在食品行业中作为酸化剂、pH改良剂、风味物质和抗菌剂，以及作为原料或中间体用于医药、抗生素、氨基酸和维生素的生产(ApplMicrobiol Biotechnol，51：545-552，1999)。目前，发酵法生产琥珀酸和它大多数衍生物的合成还处在进一步研究和开发阶段。
目前已开发出多项技术将琥珀酸转化为重要的工业化学品，包括N-甲基吡咯烷酮、1，4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯、己二酸、PBT树脂、PBS可降解塑料等。其中许多化工产品目前都是以石油或煤化工产品(如苯、丁烷等)为原料合成的，资源紧缺，不可再生。现报道大约有250种以苯或丁烷等为原料的化工产品可以通过琥珀酸为原料来生产。因此，全球对琥珀酸的需求不断增加。
工业上琥珀酸的生产方法主要为化学方法，主要有石蜡氧化法、轻油氧化法、丁烷氧化法、丁二腈水解法、催化加氢法以及以乙烯和一氧化碳为原料的电解氧化法。目前，国内外主要使用的是催化加氢法。以化学方法获得琥珀酸，不可避免地要消耗大量不可再生的化石原料，还具有转化率低，易污染环境等弊端。
琥珀酸的生产可通过发酵方法来进行，由于化石原料的日趋减少，用微生物发酵碳水化合物生产琥珀酸的方法日益受到人们的重视。由于发酵法生产琥珀酸是以可再生糖源(如葡萄糖)和二氧化碳作为主要原料，因此微生物发酵法生产琥珀酸，具有成本低和摆脱对石化原料依赖的优点，而且开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径，更加显示了环境友好特征。
琥珀酸是继柠檬酸后最具市场潜力的发酵有机酸产品之一，但目前都还是用化学方法生产。根据美国Michigan大学MBI研究所的估计，在未来几年内，琥珀酸的总需求将达到100万吨的水平。
目前文献报道的发酵法生产琥珀酸研究所用培养基原料多为葡萄糖，无论是牛瘤胃中分离的Actinobacillus succinogenes、基因工程构建的大肠杆菌Escherichia coli生产琥珀酸的方法都是如此。使用价格低廉的碳源是降低发酵法生产琥珀酸成本的一个关键因素。目前，已有一些利用不同原料发酵生成琥珀酸的报道，比如美国Argonne在网上报道了从玉米(淀粉水解液)生产化学品琥珀酸的消息(www.ipd.anl.gov/biotech/index.html，2002)，日本三菱化学和味之素公司也联合开发了采用以玉米淀粉为原料发酵生产丁二酸(http://www.bio168.com，2005)。韩国Lee PC等与Kim DY等曾先后报道了Mannheimia succiniciproducens MBEL55E发酵乳清原料和发酵木浆水解液生产琥珀酸。发酵乳清原料产琥珀酸15.5g/L，对消耗糖产率和生产强度为93％和0.24g/(L·h)(Appl Microbiol Biotechnol 54：23-27，2000)；用NaOH预处理过的木浆水解液培养基分批发酵积累琥珀酸11.73g/L，对消耗糖产率和生产强度分别为56％和1.17g/(L·h)(Enzyme and Microbial Technology，35：648-653，2004)，反映了该菌种不适宜于纤维素原料发酵。2002年日本地球环境产业技术研究机构的Inui等人报道使用转基因微生物从废纸发酵制取琥珀酸，每升培养液中可制取约30g的琥珀酸(新华网http://news.xinhuanet.com/newscenter，2002)。由于上述研究结果产率很低，尚未能用于工业化生产。本发明人从牛瘤胃中筛选的琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes CGMCC 1593，它能发酵的糖质原料包括葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖等糖类，能利用多种农副产品如乳糖、木薯、玉米、甜菜或甘蔗糖蜜等(中国专利200610038113.6；200710019686.9)，发现它也很适于发酵秸秆、木材工业下脚料，制糖造纸业下脚料和城市纤维垃圾等木质纤维物的水解糖浆原料生产琥珀酸。
纤维质原料(秸秆、蔗渣、木材等)中含有40％～60％的纤维素、20％～40％的半纤维素和10％～25％的木质素。以纤维类物质作为发酵生产原料，首先将纤维类物质进行酸解、碱解或酶解处理，释放出的葡萄糖、木糖等六碳糖和五碳糖，再用于发酵步骤。
纤维类资源是最主要的生物质资源，它占地球生物质总量的60％～80％。我国的纤维质原料非常丰富，仅农作物秸秆、皮壳一项，每年产量就达7亿多吨，其中玉米秸秆(35％)、小麦秸杆(21％)和稻草(19％)是我国的三大秸秆(http://www.efst.sh.cn/showKnowledge)。目前这些秸秆除少量用作青储饲料和燃料外，大量秸秆成为农业废弃物。秸秆、蔗渣及森林工业副产品等具有来源丰富、品种多、再生时间短、价格低廉等优点。秸秆原料与葡萄糖或淀粉水解液比较，作为发酵工业的主要碳源具有很大潜力，同时可以减轻农林废弃物(麦草、玉米秸秆、玉米芯、大豆渣、甘蔗渣等)、工业废弃物(制浆和造纸厂的纤维渣、锯末等)、城市废弃物(废纸、包装纸等)及林业废弃物对环境造成的压力，实现可持续发展。
秸秆发酵生产琥珀酸与用粮食原料发酵生产琥珀酸相比，能节约大量粮食，有利于国家粮食安全。秸秆发酵生产琥珀酸与用秸秆发酵生产燃料乙醇相比，不仅是产品琥珀酸附加值比乙醇高，而且生产菌种琥珀酸放线杆菌除了能很好利用水解液中的葡萄糖等六碳糖外，还能直接利用木糖、阿拉伯糖等酶水解秸秆糖浆中的五碳糖，糖利用率高，而乙醇酵母未经改造一般不能利用秸秆水解糖浆中的五碳糖。但到目前为止，工业上还没有利用秸秆水解糖浆原料发酵生产琥珀酸的研究实例。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用廉价秸秆原料发酵生产琥珀酸的方法。
本发明的技术方案：利用秸秆原料发酵生产琥珀酸的方法，以秸杆为原料，经水解处理得到六碳糖和五碳糖的水解秸秆糖浆，再用琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC 1593在含有还原糖的水解秸秆糖浆的培养基中发酵生产琥珀酸；
发酵培养基组成以每g/L计为：水解秸秆糖浆含总还原糖20～100g，酵母膏10～20g，玉米浆10～20g，MgCl2 0.1～0.5g，Na2HPO4·12H2O 1～5g，NaH2PO4·2H2O 1～5g，培养基起始pH5.5～7.5；培养温度30～40℃，维持pH 5.5～7.5，厌氧条件下发酵20～60h。
发酵过程中采用补加浓缩的秸秆糖浆，发酵培养基的初始总还原糖浓度35～55g/L，当发酵液残糖降为10g/L时，补加浓缩的秸秆糖浆溶液将发酵液中的糖浓度控制在10～20g/L。
所用水解秸秆糖浆是秸秆原料经过稀碱预处理-纤维素酶酶水解、稀酸预处理-纤维素酶酶水解、汽爆处理-纤维素酶酶水解或稀酸水解得到的糖浆。
所述的方法，或采用发酵培养基组成中不加玉米浆的厌氧条件下发酵生产琥珀酸；或采用发酵培养基组成中不加酵母膏的厌氧条件下发酵生产琥珀酸。
所述的方法，发酵在充满CO2的厌氧条件下进行。
所述的方法，发酵过程中，用碳酸盐或碱溶液维持pH 5.5～7.5。
所述的方法，秸秆原料选用玉米秸秆、麦草、稻草、玉米芯或甘蔗渣作物秸秆。
以下是本发明方法的详细描述。
秸秆原料的预处理与酶水解：
将秸秆原料采用已经报道的通用方法(Saha BC，et.al.Process Biochemistry2005；Dongmin Li，et.al.International Journal of Hydrogen Energy 2007)稀酸或稀碱或汽爆预处理，再用纤维素酶水解：例如将玉米秸秆等植物纤维原料粗切至20～30mm长，用1％～2％NaOH稀碱液，于85～90℃，浸泡1h，以水解木质素，过滤去除黑液残余物(送锅炉焚烧或另行处理)，滤取纤维半纤维，再用纤维素水解酶(10-20 FPU/g总糖)，酶解48h，滤取得到澄清六碳和五碳混合糖液(约6％葡萄糖，3％木糖，0.5～1％杂糖)，然后用NaOH调pH 6.5，直接用于发酵配料使用；将酶水解秸秆糖液用常规方法真空浓缩，得到200～300g/L糖浓度的混合糖浆，作为补料用糖液。
酶水解秸秆糖浆发酵生产琥珀酸：
菌株：琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC 1593，为本实验室从牛的瘤胃中分离获得，保藏在中国北京中关村中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CN 1814747A已公开，公开日2006年8月9日。
种子培养基的组成为(每L)：葡萄糖5～15g，酵母膏1～10g，K2HPO4·3H2O0.5～2.0g，NaH2PO4·2H2O 0.2～2.0g，混合维生素1～10mL，pH 6.0～7.0。混合维生素组成为：B12 5mg，B6 100mg，叶酸20mg，核黄素20mg，硫胺素20mg，烟酸20mg，泛酸50mg，对氨基苯甲酸50mg，纯净水定容至1000mL。维生素等热敏性材料配制后用0.2μm微孔滤膜过滤除菌，接种前加入。
发酵培养基的组成为(每L)：酶水解秸秆糖浆(含总还原糖计)20～100g，酵母膏10～20g，玉米浆10～20g，MgCl2 0.1～0.5g，Na2HPO4·12H2O 1～5g，NaH2PO4·2H2O 1～5g，培养基起始pH 5.5～7.5。
种子培养在150mL厌氧瓶中进行，装液20～80mL。发酵在150mL厌氧瓶或5L～25L搅拌发酵罐(New Brunswich 110，New Brunswick Scientific，Edison，NJ，USA)中进行。种子和发酵培养基的灭菌温度为115～121℃，15min。 将实验菌株接种到种子培养基中，于30～40℃在充满CO2的环境中静止或震荡培养24～60h。
按1％～10％的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，在充满CO2或N2气体的环境下，30～40℃静止或震荡(或搅拌)厌氧条件下发酵20～60h，并用碳酸盐或碱溶液调节维持发酵液pH 5.5～7.5。
所用酶水解秸秆糖浆原料为稀碱、稀酸、或汽爆预处理秸秆，再用纤维素酶水解得到的六碳和五碳混合糖液(约6％葡萄糖，3％木糖，0.5％～1％阿拉伯糖等杂糖)。
分析方法：
将培养液离心，采用高效液相色谱法分析上清液中的琥珀酸等代谢产物及糖类物质。采用美国Waters高效液相色谱仪，Waters RI检测器，Breeze色谱工作站。其中，琥珀酸，乙酸，乳酸和甲酸等有机酸的测定使用Aminex HPX-87H离子色谱柱(300mm×7.8mm，9μm；Bio-Rad Chemical Division，Richmond，Calif.)，流动相8mM硫酸；柱温55℃；流速0.5mL/min；进样量10μL。葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖等糖类含量的测定采用Zobax NH2氨基柱(250mm×4.6mm，5μm；Agilent，USA)，流动相：75％乙腈；流速1mL/min进样量10μL。
酶水解秸秆糖浆总还原糖测定采用DNS法，测定时选用葡萄糖为还原糖标准物。
琥珀酸的对糖产率定义为每消耗1克还原糖所能产生的琥珀酸克数，并以百分数表示。
糖利用率定义为消耗糖所占投入糖的百分比(对于酶水解秸秆糖浆，所述的糖以总还原糖计算)。
本发明的有益效果：本发明利用从瘤胃中筛选的琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes CGMCC 1593，它也很适宜于发酵秸秆原料，用其发酵经酶水解的秸秆糖浆生产琥珀酸的产物浓度，能充分利用其中的木糖、阿拉伯糖等戊糖(阿拉伯糖能全部消耗完)，琥珀酸浓度达30～60g/L，对糖产率80％～82％(糖利用率85％～95％)和生产强度达到0.9～1.2g/(L·h)，很适用于低成本琥珀酸的工业化生产。本发明突出的优点是利用廉价秸秆原料发酵生产琥珀酸，秸秆作为一种价格低廉的农业废弃物原料可以替代纯葡萄糖或者用粮食原料玉米等水解糖作为碳源用来发酵生产琥珀酸，是一种利用可再生原料的生产方法，对环境友好，可缓解化学合成琥珀酸的石化资源紧张问题，也能够显著体现发酵可以不与人争粮、不与饲料争粮的优点，这不仅减少了发酵的培养基成本，并且能缓解粮食作为发酵原料的不足，还能解决大量农业废弃物的利用问题，有利环境，增加农民收入，利于农业与农村建设。
本发明的技术方案：利用秸秆原料发酵生产琥珀酸的方法，以秸杆为原料，经水解处理得到六碳糖和五碳糖的水解秸秆糖浆，再用琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC 1593在含有还原糖的水解秸秆糖浆的培养基中发酵生产琥珀酸；
发酵培养基组成以每g/L计为：水解秸秆糖浆含总还原糖20～100g，酵母膏10～20g，玉米浆10～20g，MgCl2 0.1～0.5g，Na2HPO4·12H2O 1～5g，NaH2PO4·2H2O 1～5g，培养基起始pH5.5～7.5；培养温度30～40℃，维持pH 5.5～7.5，厌氧条件下发酵20～60h。
发酵过程中采用补加浓缩的秸秆糖浆，发酵培养基的初始总还原糖浓度35～55g/L，当发酵液残糖降为10g/L时，补加浓缩的秸秆糖浆溶液将发酵液中的糖浓度控制在10～20g/L。
所用水解秸秆糖浆是秸秆原料经过稀碱预处理-纤维素酶酶水解、稀酸预处理-纤维素酶酶水解、汽爆处理-纤维素酶酶水解或稀酸水解得到的糖浆。
所述的方法，或采用发酵培养基组成中不加玉米浆的厌氧条件下发酵生产琥珀酸；或采用发酵培养基组成中不加酵母膏的厌氧条件下发酵生产琥珀酸。
所述的方法，发酵在充满CO2的厌氧条件下进行。
所述的方法，发酵过程中，用碳酸盐或碱溶液维持pH 5.5～7.5。
所述的方法，秸秆原料选用玉米秸秆、麦草、稻草、玉米芯或甘蔗渣作物秸秆。
以下是本发明方法的详细描述。
秸秆原料的预处理与酶水解：
将秸秆原料采用已经报道的通用方法(Saha BC，et.al.Process Biochemistry2005；Dongmin Li，et.al.International Journal of Hydrogen Energy 2007)稀酸或稀碱或汽爆预处理，再用纤维素酶水解：例如将玉米秸秆等植物纤维原料粗切至20～30mm长，用1％～2％NaOH稀碱液，于85～90℃，浸泡1h，以水解木质素，过滤去除黑液残余物(送锅炉焚烧或另行处理)，滤取纤维半纤维，再用纤维素水解酶(10-20 FPU/g总糖)，酶解48h，滤取得到澄清六碳和五碳混合糖液(约6％葡萄糖，3％木糖，0.5～1％杂糖)，然后用NaOH调pH 6.5，直接用于发酵配料使用；将酶水解秸秆糖液用常规方法真空浓缩，得到200～300g/L糖浓度的混合糖浆，作为补料用糖液。
酶水解秸秆糖浆发酵生产琥珀酸：
菌株：琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC 1593，为本实验室从牛的瘤胃中分离获得，保藏在中国北京中关村中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CN 1814747A已公开，公开日2006年8月9日。
种子培养基的组成为(每L)：葡萄糖5～15g，酵母膏1～10g，K2HPO4·3H2O0.5～2.0g，NaH2PO4·2H2O 0.2～2.0g，混合维生素1～10mL，pH 6.0～7.0。混合维生素组成为：B12 5mg，B6 100mg，叶酸20mg，核黄素20mg，硫胺素20mg，烟酸20mg，泛酸50mg，对氨基苯甲酸50mg，纯净水定容至1000mL。维生素等热敏性材料配制后用0.2μm微孔滤膜过滤除菌，接种前加入。
发酵培养基的组成为(每L)：酶水解秸秆糖浆(含总还原糖计)20～100g，酵母膏10～20g，玉米浆10～20g，MgCl2 0.1～0.5g，Na2HPO4·12H2O 1～5g，NaH2PO4·2H2O 1～5g，培养基起始pH 5.5～7.5。
种子培养在150mL厌氧瓶中进行，装液20～80mL。发酵在150mL厌氧瓶或5L～25L搅拌发酵罐(New Brunswich 110，New Brunswick Scientific，Edison，NJ，USA)中进行。种子和发酵培养基的灭菌温度为115～121℃，15min。 将实验菌株接种到种子培养基中，于30～40℃在充满CO2的环境中静止或震荡培养24～60h。
按1％～10％的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，在充满CO2或N2气体的环境下，30～40℃静止或震荡(或搅拌)厌氧条件下发酵20～60h，并用碳酸盐或碱溶液调节维持发酵液pH 5.5～7.5。
所用酶水解秸秆糖浆原料为稀碱、稀酸、或汽爆预处理秸秆，再用纤维素酶水解得到的六碳和五碳混合糖液(约6％葡萄糖，3％木糖，0.5％～1％阿拉伯糖等杂糖)。
分析方法：
将培养液离心，采用高效液相色谱法分析上清液中的琥珀酸等代谢产物及糖类物质。采用美国Waters高效液相色谱仪，Waters RI检测器，Breeze色谱工作站。其中，琥珀酸，乙酸，乳酸和甲酸等有机酸的测定使用Aminex HPX-87H离子色谱柱(300mm×7.8mm，9μm；Bio-Rad Chemical Division，Richmond，Calif.)，流动相8mM硫酸；柱温55℃；流速0.5mL/min；进样量10μL。葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖等糖类含量的测定采用Zobax NH2氨基柱(250mm×4.6mm，5μm；Agilent，USA)，流动相：75％乙腈；流速1mL/min进样量10μL。
酶水解秸秆糖浆总还原糖测定采用DNS法，测定时选用葡萄糖为还原糖标准物。
琥珀酸的对糖产率定义为每消耗1克还原糖所能产生的琥珀酸克数，并以百分数表示。
糖利用率定义为消耗糖所占投入糖的百分比(对于酶水解秸秆糖浆，所述的糖以总还原糖计算)。
本发明的有益效果：本发明利用从瘤胃中筛选的琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes CGMCC 1593，它也很适宜于发酵秸秆原料，用其发酵经酶水解的秸秆糖浆生产琥珀酸的产物浓度，能充分利用其中的木糖、阿拉伯糖等戊糖(阿拉伯糖能全部消耗完)，琥珀酸浓度达30～60g/L，对糖产率80％～82％(糖利用率85％～95％)和生产强度达到0.9～1.2g/(L·h)，很适用于低成本琥珀酸的工业化生产。本发明突出的优点是利用廉价秸秆原料发酵生产琥珀酸，秸秆作为一种价格低廉的农业废弃物原料可以替代纯葡萄糖或者用粮食原料玉米等水解糖作为碳源用来发酵生产琥珀酸，是一种利用可再生原料的生产方法，对环境友好，可缓解化学合成琥珀酸的石化资源紧张问题，也能够显著体现发酵可以不与人争粮、不与饲料争粮的优点，这不仅减少了发酵的培养基成本，并且能缓解粮食作为发酵原料的不足，还能解决大量农业废弃物的利用问题，有利环境，增加农民收入，利于农业与农村建设。
具体实施方式
以下是琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC 1593利用酶水解秸秆糖浆发酵生产琥珀酸的实施例。但本发明并不限于所列出的几个实例。
实施例1
种子培养基(每L)：葡萄糖5g，酵母膏5g，K2HPO4·3H2O 1.0g，NaH2PO4·2H2O 1.0g，混合维生素1mL，pH 7.0。37℃厌氧培养24h。
发酵培养基(每L)：酶水解秸秆糖浆(总还原糖)45g，酵母膏15g，玉米浆20g，MgCl2 0.2g，Na2HPO4·12H2O 1.5g，NaH2PO4·2H2O 1.5g，pH 6.5。37℃厌氧培养48h。
酶水解秸秆糖浆制备采用如上发明内容所述文献报道的一般方法，简述如下：
(1)稀碱处理-酶水解：将玉米秸秆等植物纤维原料粗切至20～30mm长，用1％NaOH稀碱液，于85～90℃浸泡1h，过滤去除黑液残余物，滤取纤维半纤维；再用纤维素水解酶(10～20FPU/g总糖)，酶解48h，滤取得到澄清六碳和五碳混合糖液(总还原糖约10％)，用NaOH调pH，按发酵培养基配料用于发酵。
(2)稀酸处理-酶水解：将玉米秸秆原料粗切至20～30mm长，用1.0％稀硫酸，在85～90℃浸泡1h后，再用(1)方法酶水解，滤液测糖，调整总还原糖和pH，按发酵培养基配料用于发酵。
(3)汽爆处理-酶水解：将玉米秸秆原料粗切至20～30mm长，装入汽爆罐中，在1.5 Mpa下，维压10min，然后瞬间减压释放制得的粉状汽爆植物秸秆料，再用(1)方法酶水解，滤液测糖，调整总还原糖约10％和pH，按发酵培养基配料用于发酵。
(4)稀酸水解：将玉米秸秆原料粗切至20～30mm长，用1.0％稀硫酸做催化剂，在200℃下水解反应2h，快速冷却，过滤去残渣，滤液测糖，调整总还原糖和pH，按发酵培养基配料用于发酵。
不同预处理玉米秸秆水解糖的琥珀酸发酵结果见表1。
表1不同预处理玉米秸秆水解糖的琥珀酸发酵结果(厌氧瓶分批发酵)
预处理与 水解方法 发酵残糖(g/L) 琥珀酸 (g/L) 乙酸等杂 酸(g/L) 琥珀酸 产率(％) 糖利用 率(％) 葡萄糖 木糖 阿拉伯糖 稀碱预处理-酶解 2.9 0.5 0 33.7 5.3 81.0 92.6 稀酸预处理-酶解 0.5 0.6 1.8 31.2 10.1 74.1 93.6 汽爆预处理-酶解 0.5 0.0 0.0 34.3 9.0 77.1 98.9 稀酸水解 4.3 7.2 0.0 22.2 1.0 66.3 74.4
比较以上4种处理方法，其中以稀碱处理-酶解和汽爆处理-酶解两种方法的发酵结果较好，糖利用率较高，而其它几种方法处理效果也较好，说明本发明筛选的琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes CGMCC 1593可适宜于发酵不同预处理的秸秆水解糖浆。以稀碱处理-酶解的玉米秸秆水解糖浆，初糖浓度45g/L，发酵48h，能够产生33.7g/L的琥珀酸，对消耗糖产率81.0％，糖利用率达92.6％。
实施例2
按实施例1方法，使用稀碱处理-酶解处理不同植物秸秆(玉米秸秆、玉米芯、稻草、麦秸)原料，在厌氧瓶发酵中进行分批发酵，初始还原糖浓度为45g/L，各种植物秸秆原料水解糖浆发酵生产琥珀酸的结果见表2所示。
表2不同植物秸秆酶水解糖浆的琥珀酸发酵结果(厌氧瓶分批发酵)
植物秸秆种类 残还原糖 (g/L) 琥珀酸 (g/L) 乙酸等 杂酸(g/L) 琥珀酸产 率(％) 糖利用 率(％)
玉米秸秆 3.4 33.7 5.3 81.0 92.6 玉米芯 9.0 32.07 3.53 89.2 79.9 稻草 16.9 17.64 2.24 62.8 62.4 麦秸 19.4 18.96 2.07 73.9 57.0 甘蔗渣 4.4 28.7 6.3 70.7 90.2
从以上几种不同植物秸秆水解糖浆发酵生产琥珀酸的结果可见，本发明筛选的琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes CGMCC 1593可适宜于发酵不同植物来源的秸秆水解糖浆。其中以玉米秸秆酶水解糖浆发酵生产琥珀酸的结果较好，琥珀酸产量达到33.7g/L，对消耗糖产率81.0％，糖利用率达92.6％。
实施例3
按实施例1方法，使用稀碱预处理-酶解的玉米秸秆水解糖浆，用厌氧瓶分批发酵，初始还原糖浓度分别为30，45，55，65，85g/L时，结果如表3所示：
表3不同初始还原糖浓度玉米秸秆糖浆的琥珀酸发酵结果(厌氧瓶分批发酵)
初始还原糖浓度(g/L) 残还原糖(g/L) 琥珀酸 (g/L) 乙酸等杂 酸(g/L) 琥珀酸 产率(％) 糖利用 率(％) 葡萄糖 木糖 阿拉伯糖 30 0.3 0.0 0.0 22.9 9.4 76.7 98.9 45 2.9 0.0 0.0 33.7 6.3 81.0 92.6 55 5.3 0.0 0.0 27.1 3.3 66.5 74.3 65 29.7 1.6 1.6 14.6 7.7 59.0 38.2 85 46.1 3.8 3.8 2.0 3.2 42.5 5.5
由表3可以看出，以初始还原糖浓度为45g/L时琥珀酸的产量为最高，达到33.7g/L，琥珀酸对消耗糖产率81.0％，糖利用率92.6％。
实施例4
按实施例1方法，使用稀碱处理-酶解的玉米秸秆水解糖浆，初始还原糖浓度为57.9g/L，在5L搅拌发酵罐(New Brunswich 110，New Brunswick Scientific，Edison，NJ，USA，使用两组圆盘六平直叶涡轮搅拌浆)中进行分批发酵。接种量5％，发酵温度37℃，搅拌转速200r/min，通气为100％CO2。结果如表4所示。
表4 5L搅拌罐分批发酵玉米秸秆糖浆生产琥珀酸结果
发酵时间h 残糖g/L 琥珀酸 g/L 乙酸 g/L 甲酸 g/L 葡萄糖 木糖 0 35.1 20.8 1.0 1.1 0.0 8 25.4 18.1 9.4 2.2 2.0 18 7.9 11.7 22.4 2.02 1.1 24 3.7 9.0 31.4 2.69 1.0 32 1.5 5.5 39.2 3.48 0.4 40 1.0 3.9 42.2 4.37 0 48 0.9 0.7 45.5 5.75 0
5L搅拌罐分批发酵，48h总投入玉米秸秆糖浆按最终体积计还原糖浓度为57.9g/L，发酵剩余还原糖浓度为1.6g/L，产琥珀酸45.5g/L，对消耗糖产率80.8％，糖利用率97.2％，生产强度0.95 g/(L·h)。
实施例5
在5L搅拌罐中进行稀碱处理-酶解的玉米秸秆水解糖浆的补料分批发酵，初始还原糖浓度为40g/L，当发酵液残糖降为10g/L时，用蠕动泵以一定速度流加总还原糖浓度为200g/L的浓缩玉米秸秆糖浆溶液将发酵液中的糖浓度控制在10～15g/L。实验结果如表5所示。
表5 5L搅拌罐补料分批发酵玉米秸秆糖浆生产琥珀酸结果
发酵时间 h 残糖g/L 琥珀酸 g/L 乙酸 g/L 甲酸 g/L 葡萄糖 木糖 0 22.4 13.7 0.4 0.2 0 8 15.2 7.2 15.2 3.2 1.6 16 10.8 2.7 28.2 4.4 0 24 10.7 2.2 40.2 5.5 0 32 9.8 2.5 43.3 5.3 0
40 7.8 0.6 49.4 5.6 0 48 4.4 0 52.1 5.7 0 52 3.64 0 52.48 5.85 0 56 3.53 0 53.37 5.97 0 60 2.60 0 53.62 6.07 0
5L搅拌罐补料分批发酵，48h总投入玉米秸秆糖浆按最终体积计还原糖浓度为68.6g/L，发酵剩余还原糖浓度为4.4g/L，产琥珀酸52.1g/L，对消耗糖产率81.2％，糖利用率93.6％，生产强度1.09g/(L·h)。
实施例6
在25L规模的搅拌罐(镇江东方生物工程公司发酵罐)上进行补料分批发酵，发酵条件同实施例5。与实施例5不同的是，补料采用的是间歇补料，分别于发酵12、19、25、36 h分四次补入已灭菌的含糖300g/L补料培养液约600mL。实验结果如表6所示：
表6 25L搅拌罐补料分批发酵玉米秸秆糖浆生产琥珀酸结果
发酵时间 h 残糖g/L 琥珀酸 g/L 乙酸 g/L 甲酸 g/L 葡萄糖 木糖 0 20.93 12.99 1.40 2.45 1.54 8 10.98 5.73 12.71 3.53 1.18 16 10.01 2.85 28.89 3.88 0.00 24 10.03 3.34 35.83 3.59 0.00 32 10.31 2.60 42.07 4.01 0.00 40 8.63 1.74 47.40 3.97 0.00 48 8.75 0.29 49.52 3.88 0.00
总投入玉米秸秆糖浆按最终体积计还原糖浓度为70.9g/L，发酵48h，产琥珀酸49.5g/L，对消耗糖产率80.0％，糖利用率87.3％，生产强度1.03g/(L·h)。
实施例7
按实施例5方法，得到的玉米秸秆糖浆发酵液含琥珀酸52.1g/L，乙酸5.7g/L，残余葡萄糖4.4g/L。将发酵液加热90℃以上30min，然后离心，去除菌体及蛋白，得到预处理液。取上述发酵预处理液1000mL(测定预处理后发酵液含琥珀酸53.01g/L)，在不断搅拌下，加40％CaCl2溶液，50～80℃下进行钙化2～5h，将滤饼琥珀酸钙配成浓度30％左右的溶液，在60～80℃下，缓慢滴加25％硫酸进行酸解，过滤、并水洗滤饼硫酸钙，酸解滤液用0.1％～2.0％的活性炭，70～80℃，脱色30～60min，过滤得脱色滤清液于70～80℃，0.08～0.1MPa真空下浓缩后，置冰箱中冷却析出结晶，滤出湿晶于60～65℃烘箱干燥得到白色粗晶，干重39.23g，测其纯度含琥珀酸97.10％，计算总提取收率71.％。样品经HPLC检测为一单峰，证明无杂酸，红外光谱与标准品一致。
实施例1
种子培养基(每L)：葡萄糖5g，酵母膏5g，K2HPO4·3H2O 1.0g，NaH2PO4·2H2O 1.0g，混合维生素1mL，pH 7.0。37℃厌氧培养24h。
发酵培养基(每L)：酶水解秸秆糖浆(总还原糖)45g，酵母膏15g，玉米浆20g，MgCl2 0.2g，Na2HPO4·12H2O 1.5g，NaH2PO4·2H2O 1.5g，pH 6.5。37℃厌氧培养48h。
酶水解秸秆糖浆制备采用如上发明内容所述文献报道的一般方法，简述如下：
(1)稀碱处理-酶水解：将玉米秸秆等植物纤维原料粗切至20～30mm长，用1％NaOH稀碱液，于85～90℃浸泡1h，过滤去除黑液残余物，滤取纤维半纤维；再用纤维素水解酶(10～20FPU/g总糖)，酶解48h，滤取得到澄清六碳和五碳混合糖液(总还原糖约10％)，用NaOH调pH，按发酵培养基配料用于发酵。
(2)稀酸处理-酶水解：将玉米秸秆原料粗切至20～30mm长，用1.0％稀硫酸，在85～90℃浸泡1h后，再用(1)方法酶水解，滤液测糖，调整总还原糖和pH，按发酵培养基配料用于发酵。
(3)汽爆处理-酶水解：将玉米秸秆原料粗切至20～30mm长，装入汽爆罐中，在1.5 Mpa下，维压10min，然后瞬间减压释放制得的粉状汽爆植物秸秆料，再用(1)方法酶水解，滤液测糖，调整总还原糖约10％和pH，按发酵培养基配料用于发酵。
(4)稀酸水解：将玉米秸秆原料粗切至20～30mm长，用1.0％稀硫酸做催化剂，在200℃下水解反应2h，快速冷却，过滤去残渣，滤液测糖，调整总还原糖和pH，按发酵培养基配料用于发酵。
不同预处理玉米秸秆水解糖的琥珀酸发酵结果见表1。
表1不同预处理玉米秸秆水解糖的琥珀酸发酵结果(厌氧瓶分批发酵)
预处理与 水解方法 发酵残糖(g/L) 琥珀酸 (g/L) 乙酸等杂 酸(g/L) 琥珀酸 产率(％) 糖利用 率(％) 葡萄糖 木糖 阿拉伯糖 稀碱预处理-酶解 2.9 0.5 0 33.7 5.3 81.0 92.6 稀酸预处理-酶解 0.5 0.6 1.8 31.2 10.1 74.1 93.6 汽爆预处理-酶解 0.5 0.0 0.0 34.3 9.0 77.1 98.9 稀酸水解 4.3 7.2 0.0 22.2 1.0 66.3 74.4
比较以上4种处理方法，其中以稀碱处理-酶解和汽爆处理-酶解两种方法的发酵结果较好，糖利用率较高，而其它几种方法处理效果也较好，说明本发明筛选的琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes CGMCC 1593可适宜于发酵不同预处理的秸秆水解糖浆。以稀碱处理-酶解的玉米秸秆水解糖浆，初糖浓度45g/L，发酵48h，能够产生33.7g/L的琥珀酸，对消耗糖产率81.0％，糖利用率达92.6％。
实施例2
按实施例1方法，使用稀碱处理-酶解处理不同植物秸秆(玉米秸秆、玉米芯、稻草、麦秸)原料，在厌氧瓶发酵中进行分批发酵，初始还原糖浓度为45g/L，各种植物秸秆原料水解糖浆发酵生产琥珀酸的结果见表2所示。
表2不同植物秸秆酶水解糖浆的琥珀酸发酵结果(厌氧瓶分批发酵)
植物秸秆种类 残还原糖 (g/L) 琥珀酸 (g/L) 乙酸等 杂酸(g/L) 琥珀酸产 率(％) 糖利用 率(％)
玉米秸秆 3.4 33.7 5.3 81.0 92.6 玉米芯 9.0 32.07 3.53 89.2 79.9 稻草 16.9 17.64 2.24 62.8 62.4 麦秸 19.4 18.96 2.07 73.9 57.0 甘蔗渣 4.4 28.7 6.3 70.7 90.2
从以上几种不同植物秸秆水解糖浆发酵生产琥珀酸的结果可见，本发明筛选的琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes CGMCC 1593可适宜于发酵不同植物来源的秸秆水解糖浆。其中以玉米秸秆酶水解糖浆发酵生产琥珀酸的结果较好，琥珀酸产量达到33.7g/L，对消耗糖产率81.0％，糖利用率达92.6％。
实施例3
按实施例1方法，使用稀碱预处理-酶解的玉米秸秆水解糖浆，用厌氧瓶分批发酵，初始还原糖浓度分别为30，45，55，65，85g/L时，结果如表3所示：
表3不同初始还原糖浓度玉米秸秆糖浆的琥珀酸发酵结果(厌氧瓶分批发酵)
初始还原糖浓度(g/L) 残还原糖(g/L) 琥珀酸 (g/L) 乙酸等杂 酸(g/L) 琥珀酸 产率(％) 糖利用 率(％) 葡萄糖 木糖 阿拉伯糖 30 0.3 0.0 0.0 22.9 9.4 76.7 98.9 45 2.9 0.0 0.0 33.7 6.3 81.0 92.6 55 5.3 0.0 0.0 27.1 3.3 66.5 74.3 65 29.7 1.6 1.6 14.6 7.7 59.0 38.2 85 46.1 3.8 3.8 2.0 3.2 42.5 5.5
由表3可以看出，以初始还原糖浓度为45g/L时琥珀酸的产量为最高，达到33.7g/L，琥珀酸对消耗糖产率81.0％，糖利用率92.6％。
实施例4
按实施例1方法，使用稀碱处理-酶解的玉米秸秆水解糖浆，初始还原糖浓度为57.9g/L，在5L搅拌发酵罐(New Brunswich 110，New Brunswick Scientific，Edison，NJ，USA，使用两组圆盘六平直叶涡轮搅拌浆)中进行分批发酵。接种量5％，发酵温度37℃，搅拌转速200r/min，通气为100％CO2。结果如表4所示。
表4 5L搅拌罐分批发酵玉米秸秆糖浆生产琥珀酸结果
发酵时间h 残糖g/L 琥珀酸 g/L 乙酸 g/L 甲酸 g/L 葡萄糖 木糖 0 35.1 20.8 1.0 1.1 0.0 8 25.4 18.1 9.4 2.2 2.0 18 7.9 11.7 22.4 2.02 1.1 24 3.7 9.0 31.4 2.69 1.0 32 1.5 5.5 39.2 3.48 0.4 40 1.0 3.9 42.2 4.37 0 48 0.9 0.7 45.5 5.75 0
5L搅拌罐分批发酵，48h总投入玉米秸秆糖浆按最终体积计还原糖浓度为57.9g/L，发酵剩余还原糖浓度为1.6g/L，产琥珀酸45.5g/L，对消耗糖产率80.8％，糖利用率97.2％，生产强度0.95 g/(L·h)。
实施例5
在5L搅拌罐中进行稀碱处理-酶解的玉米秸秆水解糖浆的补料分批发酵，初始还原糖浓度为40g/L，当发酵液残糖降为10g/L时，用蠕动泵以一定速度流加总还原糖浓度为200g/L的浓缩玉米秸秆糖浆溶液将发酵液中的糖浓度控制在10～15g/L。实验结果如表5所示。
表5 5L搅拌罐补料分批发酵玉米秸秆糖浆生产琥珀酸结果
发酵时间 h 残糖g/L 琥珀酸 g/L 乙酸 g/L 甲酸 g/L 葡萄糖 木糖 0 22.4 13.7 0.4 0.2 0 8 15.2 7.2 15.2 3.2 1.6 16 10.8 2.7 28.2 4.4 0 24 10.7 2.2 40.2 5.5 0 32 9.8 2.5 43.3 5.3 0
40 7.8 0.6 49.4 5.6 0 48 4.4 0 52.1 5.7 0 52 3.64 0 52.48 5.85 0 56 3.53 0 53.37 5.97 0 60 2.60 0 53.62 6.07 0
5L搅拌罐补料分批发酵，48h总投入玉米秸秆糖浆按最终体积计还原糖浓度为68.6g/L，发酵剩余还原糖浓度为4.4g/L，产琥珀酸52.1g/L，对消耗糖产率81.2％，糖利用率93.6％，生产强度1.09g/(L·h)。
实施例6
在25L规模的搅拌罐(镇江东方生物工程公司发酵罐)上进行补料分批发酵，发酵条件同实施例5。与实施例5不同的是，补料采用的是间歇补料，分别于发酵12、19、25、36 h分四次补入已灭菌的含糖300g/L补料培养液约600mL。实验结果如表6所示：
表6 25L搅拌罐补料分批发酵玉米秸秆糖浆生产琥珀酸结果
发酵时间 h 残糖g/L 琥珀酸 g/L 乙酸 g/L 甲酸 g/L 葡萄糖 木糖 0 20.93 12.99 1.40 2.45 1.54 8 10.98 5.73 12.71 3.53 1.18 16 10.01 2.85 28.89 3.88 0.00 24 10.03 3.34 35.83 3.59 0.00 32 10.31 2.60 42.07 4.01 0.00 40 8.63 1.74 47.40 3.97 0.00 48 8.75 0.29 49.52 3.88 0.00
总投入玉米秸秆糖浆按最终体积计还原糖浓度为70.9g/L，发酵48h，产琥珀酸49.5g/L，对消耗糖产率80.0％，糖利用率87.3％，生产强度1.03g/(L·h)。
实施例7
按实施例5方法，得到的玉米秸秆糖浆发酵液含琥珀酸52.1g/L，乙酸5.7g/L，残余葡萄糖4.4g/L。将发酵液加热90℃以上30min，然后离心，去除菌体及蛋白，得到预处理液。取上述发酵预处理液1000mL(测定预处理后发酵液含琥珀酸53.01g/L)，在不断搅拌下，加40％CaCl2溶液，50～80℃下进行钙化2～5h，将滤饼琥珀酸钙配成浓度30％左右的溶液，在60～80℃下，缓慢滴加25％硫酸进行酸解，过滤、并水洗滤饼硫酸钙，酸解滤液用0.1％～2.0％的活性炭，70～80℃，脱色30～60min，过滤得脱色滤清液于70～80℃，0.08～0.1MPa真空下浓缩后，置冰箱中冷却析出结晶，滤出湿晶于60～65℃烘箱干燥得到白色粗晶，干重39.23g，测其纯度含琥珀酸97.10％，计算总提取收率71.％。样品经HPLC检测为一单峰，证明无杂酸，红外光谱与标准品一致。