一种检测孔雀石绿的分子印迹聚合物微球转让专利
申请号 : CN200710304752.7
文献号 : CN101216464B
文献日 : 2010-10-20
发明人 : 车会莲 , 何计国 , 袁长梅 , 茅文玺 , 曹冬冬
申请人 : 中国农业大学
摘要 :
本发明提供了一种用于快速检测水产品中孔雀石绿的分子印迹聚合物微球，其是通过下述方法制备：将两种功能单体以一定比例混合，再将孔雀石绿模板与单体以一定比例混合，按一定顺序加入交联剂、引发剂、乳化剂和亲脂溶剂，制备分子印迹聚合物微球。本发明还进一步提供了检测样品中的孔雀石绿的方法，该方法包括对处理的水产样品进行识别、吸附和浓缩，并利用分光光度法检测其中孔雀石绿的浓度。还可以对其进行浓缩，降低了检测的检出限，对低含量样品的检测尤为有效。
权利要求 :
1.一种分子印迹聚合物微球的制备方法，其包括如下步骤：(1).将两种功能单体以一定比例混合；
(2).将孔雀石绿模板与单体以一定比例混合，然后加入交联剂、引发剂、乳化剂和亲脂溶剂，乳化，热聚合；
(3).微球洗涤、烘干，过筛，
其中，所采用的功能单体选自丙烯酰胺、甲基丙烯酸和4-乙烯基吡啶；
其中，两功能单体按物质的量比1～8∶1～8混合；孔雀石绿模板与混合单体的物质的量比为1∶1～8；
其中，所述交联剂为乙二醇二甲基丙稀酸酯，其物质的量是总功能单体的2～10倍；引发剂偶为氮二异丁腈，其质量是单体的1～8倍；乳化剂选自十二烷基硫酸钠、聚乙烯醇、羟磺基甜菜碱、谷氨酸钠和吐温80，按蒸馏水体积的1～10％添加；
其中，所述亲脂溶剂选自氯仿、石油醚、三氯甲烷和甲醇，亲脂溶剂与水的体积比是1∶5～20；反应体系的水油体积比是5～40∶1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，两功能单体按物质的量比1∶1混合。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，热聚合温度为50～70℃。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，使用超声波洗脱和索式提取洗脱对微球进行洗涤，洗涤液为蒸馏水、酒精或20～80％的乙腈-乙酸胺溶液。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，利用分子筛对制备的微球进行均质筛选，100目筛下，200目筛上，得到直径为50～200μm微球。
说明书 :
技术领域
本发明涉及一种分子印迹检测技术，具体地，涉及一种利用分子印迹技术的快速检测水产品中孔雀石绿的方法，本发明还涉及用于该检测方法的分子印迹聚合物微球。
背景技术
众所周知，孔雀石绿在水产养殖中抗菌效果较好，价格低廉，目前对其危害性的宣传力度较弱，从而使得被不少水产养殖业户广泛使用。基于此，我国制定了《无公害食品水产品中渔药残留限量(NY5070-2002)》标准，其中规定水产品中不得检出孔雀石绿等危害性物质。
《2000年度中国出口动物源性食品中有毒有害物质残留监控计划》首次将出口鳗鱼中孔雀石绿残留量的监控列入年度计划，并延续至今。2002年5月欧盟曾向我国通报在2批浙江舟山向德国出口的鳗鱼中检出孔雀石绿。2005年6月5日，英国食品标准局在英国一家知名的超市连锁店出售的鲑鱼体内发现一种名为“孔雀石绿”的成分，有关方面将此事迅速通报给欧洲国家所有的食品安全机构，发出了食品安全警报。英国食品标准局发布消息说，任何鱼类都不允许含有孔雀石绿，并且这种化学物质不应该出现在任何食品中。2005年7月7日农业部办公厅发布了《关于组织查处“孔雀石绿”等禁用兽药的紧急通知》，要求各地尽快组织开展孔雀石绿等禁用药物的专项整治工作。农业部渔业局马上组织调查组奔赴各地调查孔雀石绿问题，并组织专家商讨对策。2005年以来欧盟、日本、韩国等国加大了对我国出口鳗鱼中孔雀石绿的检验力度。日本从2005年7月1日起，开始对来自我国的鳗鱼产品强制检测孔雀石绿。同时，香港、新加坡等地也加强了水产品检验，检出多批大陆水产品中含有孔雀石绿残留。
孔雀石绿别名：碱性绿、盐基块绿、孔雀绿，其分子式为C23H25ClN2，分子量为364.92，属于三苯甲烷类染料，是一分子苯甲醛与两分子二甲基苯胺在浓硫酸或氯化锌存在的条件下聚合而形成的深绿色晶体，具有金属光泽。孔雀石绿极易溶于水，水溶液呈兰绿色(4.0g/100ml)，也能溶于乙醇、甲醇或戌醇。孔雀石绿在细胞分裂时，抑制细胞内的谷氨酸转变为肽类及相关产物，从而抑制细胞分裂，达到抗菌效果(HECHT T等.J Appl Ichth，1998，14(3-4)：213-221.)。
孔雀石绿有强烈的致癌作用，由于其为脂溶性化合物，在鱼体内和环境中残留时间长，且代谢缓慢，在人体残留时间长，对人体的危害是积蓄式的(刘峰延等.中国水产，2006(1)：58-59.)。有时虽然摄入量不多，不会有很明显的中毒症状，但当体内的孔雀石绿堆积到一定程度，就可能引发各种疾病。
孔雀石绿及其代谢产物无色孔雀石绿具有高残留性、高致癌性、高致畸性、致突变性、高毒性等特性。研究发现孔雀石绿能导致大鼠肝细胞空泡化，使甲状腺滤泡上皮大量凋亡，抑制雄鼠甲状腺激素的释放；抑制血浆胆碱脂酶的作用，进而造成乙酰胆碱的蓄积有出现神经症状的可能性(MUSAS O等.J Aquat Sci，1999，14：37-42.)。此外，它还能通过溶解足够的锌(Srivastava S等.Aquat Toxicol，2004，66：319-3291；SVOBODOVA Z等.Acta Vet Brno，1997，66(2)：111-116)，导致水生动物急性锌中毒，引起水生生物消化道、鳃和皮肤轻度炎症，从而影响其正常摄食和生长，还可阻碍肠道酶(如胰蛋白酶、α-淀粉酶)的活性，影响水生动物的消化吸收功能(SRIVASTAVA K等.ActaHydrobiol，1995，37(2)：113-119；SRIVASTAVAS J等.J Adv Zool，1998，19(1)：46-49)。
目前检测孔雀石绿方法包括同时检测孔雀石绿和无色孔雀石绿残留《无公害食品水产品中孔雀石绿残留量的测定液相色谱法》(SC/T3021-2004)标准。2005年9月5日中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局和国家标准化管理委员会发布《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》，规定将高效液相色谱和液相色谱-串联质谱作为孔雀石绿检测的国标方法。国外还采用气相色谱-质谱联用法、薄层色谱法和毛细管电泳法等进行孔雀石绿的检测(Turnipseed S B等.J AOACInt，1995，78(4)：971-977；Matysik FM.1998，802(2)：349；Tarbin J A等.Jthe analyst Int，1998，123(12)：2567-2571)。但这些检测方法都要依赖复杂精密仪器，对样品分离净化的步骤也相对繁琐。
分子印迹技术是为获得在空间结构和结合点位上与某一分子(通常称为模板分子)完全匹配的聚合物的实验制备技术。其工作原理一般分三个步骤：使印迹分子与功能单体相互作用形成复合物；加交联剂和聚合引发剂，发生聚合反应；除去聚合物中的印迹分子后即获得分子印迹聚合物。分子印迹聚合物具有制作简单、成本低廉、功能可设计、坚固耐用、适用范围广等优点，被誉为“万能的分子识别材料”。其中分子印迹聚合物微球使用更方便、识别效率更高，应用前景也更加广阔。主要应用于色谱分离、抗体和受体模拟物、固相萃取、生物传感器敏感材料、催化作用等。
孔雀石绿的分子结构属三苯甲烷类，其分子中含有三个苯环，一个二甲基氨和一个次二甲基氨，分子结构本身具有足够的空间特征，易与不同的功能单体形成有特异性的空间结构空穴。此外孔雀石绿的亲水基团次二甲基氨，可与功能单体很好地作用，形成强烈的氢键，这无论在制备印迹分子还是在吸附模板分子中都是强有力的因素。分子中的两个疏水基团苯环和二甲基氨可互相作用，且与溶剂作用，形成结合位点。鉴于对孔雀石绿分子式的研究和性质的考虑，采用悬浮聚合分子印迹法较适合制备以孔雀石绿为模板的印迹分子聚合物微球。因为孔雀石绿是水溶性分子，而水会削弱功能单体与模板分子之间或分子印迹聚合物微球与模板分子之间的非共价键作用，从而影响复合物的形成或分子印迹聚合物微球的识别效果。如何在水溶性的环境中合成并识别模板分子，是一个新的挑战。所以本发明选用悬浮乳液聚合法，利用分散剂使亲水性表面和亲脂性表面隔开，使得亲水基团朝着同一个方向，这样有利于孔雀石绿分子和功能单体的结合。
目前国内外已经出现了一些检测孔雀石绿的检测方法，有些已经申请了专利，国内相关的专利有水产品中孔雀石绿间接竞争ELISA检测试剂盒(专利号申请为200510060995.1)、孔雀石绿快速检测方法及快速检测试剂盒(专利申请号为200710068348.4)和一种水及水产品中孔雀石绿残留的快速检测试剂盒(专利申请号为200620113227.8)，美国有两项利用免疫学技术检测孔雀石绿的专利(专利申请号为20070254323和20070072242)，其检测原理均不是利用分子印迹技术。
迄今为止，我国还没有稳定可靠的快速检测水产品中孔雀石绿残留的检测方法，所以目前迫切想找到一种新的、快速的检测方法，其既能避免繁琐的操作步骤和冗长的检测过程，又能做到灵敏度高，检出限低。
《2000年度中国出口动物源性食品中有毒有害物质残留监控计划》首次将出口鳗鱼中孔雀石绿残留量的监控列入年度计划，并延续至今。2002年5月欧盟曾向我国通报在2批浙江舟山向德国出口的鳗鱼中检出孔雀石绿。2005年6月5日，英国食品标准局在英国一家知名的超市连锁店出售的鲑鱼体内发现一种名为“孔雀石绿”的成分，有关方面将此事迅速通报给欧洲国家所有的食品安全机构，发出了食品安全警报。英国食品标准局发布消息说，任何鱼类都不允许含有孔雀石绿，并且这种化学物质不应该出现在任何食品中。2005年7月7日农业部办公厅发布了《关于组织查处“孔雀石绿”等禁用兽药的紧急通知》，要求各地尽快组织开展孔雀石绿等禁用药物的专项整治工作。农业部渔业局马上组织调查组奔赴各地调查孔雀石绿问题，并组织专家商讨对策。2005年以来欧盟、日本、韩国等国加大了对我国出口鳗鱼中孔雀石绿的检验力度。日本从2005年7月1日起，开始对来自我国的鳗鱼产品强制检测孔雀石绿。同时，香港、新加坡等地也加强了水产品检验，检出多批大陆水产品中含有孔雀石绿残留。
孔雀石绿别名：碱性绿、盐基块绿、孔雀绿，其分子式为C23H25ClN2，分子量为364.92，属于三苯甲烷类染料，是一分子苯甲醛与两分子二甲基苯胺在浓硫酸或氯化锌存在的条件下聚合而形成的深绿色晶体，具有金属光泽。孔雀石绿极易溶于水，水溶液呈兰绿色(4.0g/100ml)，也能溶于乙醇、甲醇或戌醇。孔雀石绿在细胞分裂时，抑制细胞内的谷氨酸转变为肽类及相关产物，从而抑制细胞分裂，达到抗菌效果(HECHT T等.J Appl Ichth，1998，14(3-4)：213-221.)。
孔雀石绿有强烈的致癌作用，由于其为脂溶性化合物，在鱼体内和环境中残留时间长，且代谢缓慢，在人体残留时间长，对人体的危害是积蓄式的(刘峰延等.中国水产，2006(1)：58-59.)。有时虽然摄入量不多，不会有很明显的中毒症状，但当体内的孔雀石绿堆积到一定程度，就可能引发各种疾病。
孔雀石绿及其代谢产物无色孔雀石绿具有高残留性、高致癌性、高致畸性、致突变性、高毒性等特性。研究发现孔雀石绿能导致大鼠肝细胞空泡化，使甲状腺滤泡上皮大量凋亡，抑制雄鼠甲状腺激素的释放；抑制血浆胆碱脂酶的作用，进而造成乙酰胆碱的蓄积有出现神经症状的可能性(MUSAS O等.J Aquat Sci，1999，14：37-42.)。此外，它还能通过溶解足够的锌(Srivastava S等.Aquat Toxicol，2004，66：319-3291；SVOBODOVA Z等.Acta Vet Brno，1997，66(2)：111-116)，导致水生动物急性锌中毒，引起水生生物消化道、鳃和皮肤轻度炎症，从而影响其正常摄食和生长，还可阻碍肠道酶(如胰蛋白酶、α-淀粉酶)的活性，影响水生动物的消化吸收功能(SRIVASTAVA K等.ActaHydrobiol，1995，37(2)：113-119；SRIVASTAVAS J等.J Adv Zool，1998，19(1)：46-49)。
目前检测孔雀石绿方法包括同时检测孔雀石绿和无色孔雀石绿残留《无公害食品水产品中孔雀石绿残留量的测定液相色谱法》(SC/T3021-2004)标准。2005年9月5日中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局和国家标准化管理委员会发布《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》，规定将高效液相色谱和液相色谱-串联质谱作为孔雀石绿检测的国标方法。国外还采用气相色谱-质谱联用法、薄层色谱法和毛细管电泳法等进行孔雀石绿的检测(Turnipseed S B等.J AOACInt，1995，78(4)：971-977；Matysik FM.1998，802(2)：349；Tarbin J A等.Jthe analyst Int，1998，123(12)：2567-2571)。但这些检测方法都要依赖复杂精密仪器，对样品分离净化的步骤也相对繁琐。
分子印迹技术是为获得在空间结构和结合点位上与某一分子(通常称为模板分子)完全匹配的聚合物的实验制备技术。其工作原理一般分三个步骤：使印迹分子与功能单体相互作用形成复合物；加交联剂和聚合引发剂，发生聚合反应；除去聚合物中的印迹分子后即获得分子印迹聚合物。分子印迹聚合物具有制作简单、成本低廉、功能可设计、坚固耐用、适用范围广等优点，被誉为“万能的分子识别材料”。其中分子印迹聚合物微球使用更方便、识别效率更高，应用前景也更加广阔。主要应用于色谱分离、抗体和受体模拟物、固相萃取、生物传感器敏感材料、催化作用等。
孔雀石绿的分子结构属三苯甲烷类，其分子中含有三个苯环，一个二甲基氨和一个次二甲基氨，分子结构本身具有足够的空间特征，易与不同的功能单体形成有特异性的空间结构空穴。此外孔雀石绿的亲水基团次二甲基氨，可与功能单体很好地作用，形成强烈的氢键，这无论在制备印迹分子还是在吸附模板分子中都是强有力的因素。分子中的两个疏水基团苯环和二甲基氨可互相作用，且与溶剂作用，形成结合位点。鉴于对孔雀石绿分子式的研究和性质的考虑，采用悬浮聚合分子印迹法较适合制备以孔雀石绿为模板的印迹分子聚合物微球。因为孔雀石绿是水溶性分子，而水会削弱功能单体与模板分子之间或分子印迹聚合物微球与模板分子之间的非共价键作用，从而影响复合物的形成或分子印迹聚合物微球的识别效果。如何在水溶性的环境中合成并识别模板分子，是一个新的挑战。所以本发明选用悬浮乳液聚合法，利用分散剂使亲水性表面和亲脂性表面隔开，使得亲水基团朝着同一个方向，这样有利于孔雀石绿分子和功能单体的结合。
目前国内外已经出现了一些检测孔雀石绿的检测方法，有些已经申请了专利，国内相关的专利有水产品中孔雀石绿间接竞争ELISA检测试剂盒(专利号申请为200510060995.1)、孔雀石绿快速检测方法及快速检测试剂盒(专利申请号为200710068348.4)和一种水及水产品中孔雀石绿残留的快速检测试剂盒(专利申请号为200620113227.8)，美国有两项利用免疫学技术检测孔雀石绿的专利(专利申请号为20070254323和20070072242)，其检测原理均不是利用分子印迹技术。
迄今为止，我国还没有稳定可靠的快速检测水产品中孔雀石绿残留的检测方法，所以目前迫切想找到一种新的、快速的检测方法，其既能避免繁琐的操作步骤和冗长的检测过程，又能做到灵敏度高，检出限低。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种利用分子印迹技术、操作简单，吸附、浓缩和分离效果好的快速检测孔雀石绿的方法。该方法除可检测样品中的孔雀石绿外，还可以对其进行浓缩，降低了检测的检出限，对低含量样品的检测尤为有效。本发明的另一个目的在于提供一种用于该检测方法的分子印迹聚合物微球，该微球特别适合对水产品中孔雀石绿残留的检测。
本发明分子印迹聚合物微球是以孔雀石绿为模板制备获得。
具体地说，通过如下步骤制备获得：
(1).将两种功能单体以一定比例混合；
(2).将孔雀石绿模板与单体以一定比例混合，然后依次加入交联剂、引发剂、乳化剂和亲脂溶剂，乳化，热聚合；
(3).微球洗涤、烘干，过筛。
其中，所述两功能单体按物质的量比1～8∶1～8混合；孔雀石绿模板与混合单体的物质的量比为1∶1～8。
其中，所述交联剂优选为乙二醇二甲基丙稀酸酯，其物质的量是总功能单体的2～10倍；引发剂偶优选为氮二异丁腈，其质量是单体的1～8倍；乳化剂选可为十二烷基硫酸钠、聚乙烯醇、羟磺基甜菜碱、谷氨酸钠或吐温80，按蒸馏水体积的1～10％；亲脂溶剂可为氯仿、石油醚、三氯甲烷或甲醇，亲脂溶剂与水的体积比是1∶5～20；反应体系的水油比是5～40∶1。
在制备分子印迹微球的过程中，为使体系稳定，采用超声波或分散乳化机先对混合溶液进行乳化，为保持溶液稳定的乳化状态，对乳化液进行搅拌，搅拌的速度为0～200rpm；搅拌时间为0～24h；引发热聚合温度为50～70℃。
在对制备的微球进行洗涤的过程中可用超声波洗涤和索式提取洗涤方法，洗涤液可为蒸馏水、酒精、20～80％的乙腈-乙酸胺溶液。洗涤后利用分子筛对制备的微球进行均质筛选，100目筛下，200目筛上，得到直径为50～200μm微球。
利用分子印迹微球进行水产品的检测时，按照孔雀石绿国标方法先将样品研磨匀浆后浸泡、搅拌、过滤，将滤液通过由分子印迹微球填满的过滤柱，再使用80～98％的乙腈缓冲溶液对微球进行洗脱，利用分光光度计在620nm条件下检测洗脱液中孔雀石绿的含量。随后对分子印迹微球的吸附效果进行作了评价，结果得出产量最高的单体组等比例丙烯酰胺和甲基丙烯酸组成的功能单体对孔雀石绿再吸附能力最强，静态分布系数达到3.96，证实了对最佳单体的选择。
利用分子印迹技术快速检测水产品中孔雀石绿的技术方案，优选为，以等比例的丙烯酰胺和甲基丙烯酸作为功能单体，混合单体与模板分子摩尔比为8∶1，以石油醚为溶剂，体积比为3％的吐温-80为乳化剂，加入交联剂乙二醇二甲基丙稀酸酯和引发剂偶氮丁异二腈，分散乳化机对混合溶液分散乳化3min，65℃水浴热聚合24h，索式提取洗脱过夜，收集100～200目筛之间的微粒，即可得到分散性好、颗粒均匀且产量高的孔雀石绿分子印迹微球，回收率在60％以上。
将样品滤液通过由微球填满的过滤柱，再使用80％的乙腈缓冲溶液对微球进行洗脱，利用分光光度计在620nm条件下检测洗脱液中孔雀石绿的含量。检出限为0.63±0.07μg/kg，回收率为102±1.4。
本发明工艺简单易行，有良好的重现性，可反复使用，并能进行工业化生产，成本低廉，一般实验室均可进行，不需要复杂昂贵的设备。检测效果基本达到GB水平，同时具有可再生、操作方法简便快速、易于推广等优点。
本发明分子印迹聚合物微球是以孔雀石绿为模板制备获得。
具体地说，通过如下步骤制备获得：
(1).将两种功能单体以一定比例混合；
(2).将孔雀石绿模板与单体以一定比例混合，然后依次加入交联剂、引发剂、乳化剂和亲脂溶剂，乳化，热聚合；
(3).微球洗涤、烘干，过筛。
其中，所述两功能单体按物质的量比1～8∶1～8混合；孔雀石绿模板与混合单体的物质的量比为1∶1～8。
其中，所述交联剂优选为乙二醇二甲基丙稀酸酯，其物质的量是总功能单体的2～10倍；引发剂偶优选为氮二异丁腈，其质量是单体的1～8倍；乳化剂选可为十二烷基硫酸钠、聚乙烯醇、羟磺基甜菜碱、谷氨酸钠或吐温80，按蒸馏水体积的1～10％；亲脂溶剂可为氯仿、石油醚、三氯甲烷或甲醇，亲脂溶剂与水的体积比是1∶5～20；反应体系的水油比是5～40∶1。
在制备分子印迹微球的过程中，为使体系稳定，采用超声波或分散乳化机先对混合溶液进行乳化，为保持溶液稳定的乳化状态，对乳化液进行搅拌，搅拌的速度为0～200rpm；搅拌时间为0～24h；引发热聚合温度为50～70℃。
在对制备的微球进行洗涤的过程中可用超声波洗涤和索式提取洗涤方法，洗涤液可为蒸馏水、酒精、20～80％的乙腈-乙酸胺溶液。洗涤后利用分子筛对制备的微球进行均质筛选，100目筛下，200目筛上，得到直径为50～200μm微球。
利用分子印迹微球进行水产品的检测时，按照孔雀石绿国标方法先将样品研磨匀浆后浸泡、搅拌、过滤，将滤液通过由分子印迹微球填满的过滤柱，再使用80～98％的乙腈缓冲溶液对微球进行洗脱，利用分光光度计在620nm条件下检测洗脱液中孔雀石绿的含量。随后对分子印迹微球的吸附效果进行作了评价，结果得出产量最高的单体组等比例丙烯酰胺和甲基丙烯酸组成的功能单体对孔雀石绿再吸附能力最强，静态分布系数达到3.96，证实了对最佳单体的选择。
利用分子印迹技术快速检测水产品中孔雀石绿的技术方案，优选为，以等比例的丙烯酰胺和甲基丙烯酸作为功能单体，混合单体与模板分子摩尔比为8∶1，以石油醚为溶剂，体积比为3％的吐温-80为乳化剂，加入交联剂乙二醇二甲基丙稀酸酯和引发剂偶氮丁异二腈，分散乳化机对混合溶液分散乳化3min，65℃水浴热聚合24h，索式提取洗脱过夜，收集100～200目筛之间的微粒，即可得到分散性好、颗粒均匀且产量高的孔雀石绿分子印迹微球，回收率在60％以上。
将样品滤液通过由微球填满的过滤柱，再使用80％的乙腈缓冲溶液对微球进行洗脱，利用分光光度计在620nm条件下检测洗脱液中孔雀石绿的含量。检出限为0.63±0.07μg/kg，回收率为102±1.4。
本发明工艺简单易行，有良好的重现性，可反复使用，并能进行工业化生产，成本低廉，一般实验室均可进行，不需要复杂昂贵的设备。检测效果基本达到GB水平，同时具有可再生、操作方法简便快速、易于推广等优点。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 孔雀石绿分子印迹聚合物微球的制备
在250mL三角瓶中加入2mmol孔雀石绿、8mmol丙烯酰胺和8mmol甲基丙烯酸，再加入15mL石油醚。量取蒸馏水150mL，加入4.5mL吐温-80(按蒸馏水体积的3％添加)，加热使完全溶解，冷却至常温。将蒸馏水倒入三角瓶中，并加入交联剂乙二醇二甲基丙稀酸酯(40mmol，7.56mL)，引发剂偶氮丁异二腈(200mg)。超声脱气5min，分散乳化机乳化3min，65℃水浴聚合24h。所得聚合物用蒸馏水洗涤至澄清后，以80％的乙腈-乙酸胺缓冲液为洗涤液进行索氏提取。最后在固相萃取装置中用80％的乙腈-乙酸胺缓冲液冲洗，直至流出液在紫外-可见光谱检测无孔雀石绿检出为止。所得微球烘干，用筛子筛选微球(100目筛下，200目筛上)。得到分散性好、颗粒均匀的孔雀石绿分子印迹微球，回收率为63％。
实施例2 孔雀石绿印迹分子聚合物微球的制备
在250mL三角瓶中加入2mmol孔雀石绿、4mmol丙烯酰胺和4mmol 4-乙烯基吡啶，再加入15mL氯仿，量取蒸馏水150mL，加入7.5mL吐温-80(按蒸馏水体积的3％添加)，加热使完全溶解，冷却至常温。将蒸馏水倒入三角瓶中，并加入交联剂乙二醇二甲基丙稀酸酯(40mmol，7.56mL)，引发剂偶氮丁异二腈(200mg)。超声脱气10min，分散乳化机乳化5min，70℃水浴聚合4h。所得聚合物用蒸馏水洗涤至澄清后，以80％的乙腈-乙酸胺缓冲液为洗涤液进行索氏提取。最后在固相萃取装置中用60％的乙腈-乙酸胺缓冲液冲洗，直至流出液在紫外-可见光谱检测无孔雀石绿检出为止。所得微球烘干，用筛子筛选微球(100目筛下，200目筛上)。得到分散性好、颗粒均匀的孔雀石绿分子印迹微球，回收率为57％。
实施例3 孔雀石绿印迹分子聚合物微球的制备
在250mL三角瓶中加入2mmol孔雀石绿、4mmol甲基丙烯酸和4mmol 4-乙烯基吡啶，再加入15mL三氯甲烷。量取蒸馏水150mL，加入6.0mL十二烷基硫酸钠(按蒸馏水体积的4％添加)，加热使完全溶解，冷却至常温。将蒸馏水倒入三角瓶中，并加入交联剂乙二醇二甲基丙稀酸酯(40mmol，7.56mL)，引发剂偶氮丁异二腈(200mg)。超声脱气2min，分散乳化机乳化5min，60℃水浴聚合12h。所得聚合物用蒸馏水洗涤至澄清后，以50％的乙腈-乙酸胺缓冲液为洗脱液进行超声波洗脱。最后在固相萃取装置中用60％的乙腈-乙酸胺缓冲液冲洗，直至流出液在紫外-可见光谱检测无孔雀石绿检出为止。所得微球烘干，用筛子筛选微球(100目筛下，200目筛上)。得到分散性好、颗粒均匀的孔雀石绿分子印迹微球，回收率为44％。
实施例4 孔雀石绿印迹分子聚合物微球的制备
在250mL三角瓶中加入2mmol孔雀石绿、4mmol甲基丙烯酸和4mmol丙烯酰胺，再加入15mL谷氨酸钠。量取蒸馏水150mL，加入3.0mL十二烷基硫酸钠(按蒸馏水体积的2％添加)，加热使完全溶解，冷却至常温。将蒸馏水倒入三角瓶中，并加入交联剂乙二醇二甲基丙稀酸酯(40mmol，7.56mL)，引发剂偶氮丁异二腈(200mg)。超声脱气5min，分散乳化机乳化3min，65℃水浴聚合24h。所得聚合物用蒸馏水洗涤至澄清后，以60％的乙腈-乙酸胺缓冲液为洗脱液进行超声波洗脱。最后在固相萃取装置中用50％的乙腈-乙酸胺缓冲液冲洗，直至流出液在紫外-可见光谱检测无孔雀石绿检出为止。所得微球烘干，用筛子筛选微球(100目筛下，200目筛上)。得到分散性好、颗粒均匀的孔雀石绿分子印迹微球，回收率为51％。
实施例5 孔雀石绿分子印迹聚合物微球的制备
在250mL三角瓶中加入2mmol孔雀石绿、8mmol丙烯酰胺和8mmol甲基丙烯酸，再加入15mL石油醚。量取蒸馏水150mL，加入4.5mL吐温-80(按蒸馏水体积的3％添加)，加热使完全溶解，冷却至常温。将蒸馏水倒入三角瓶中，并加入交联剂乙二醇二甲基丙稀酸酯(40mmol，7.56mL)，引发剂偶氮丁异二腈(200mg)。超声脱气5min，分散乳化机乳化3min，65℃水浴、搅拌速度为200rpm、聚合24h。所得聚合物用蒸馏水洗涤至澄清后，以80％的乙腈-乙酸胺缓冲液为洗涤液进行索氏提取。最后在固相萃取装置中用80％的乙腈-乙酸胺缓冲液冲洗，直至流出液在紫外-可见光谱检测无孔雀石绿检出为止。所得微球烘干，用筛子筛选微球(100目筛下，200目筛上)。得到分散性好、颗粒均匀的孔雀石绿分子印迹微球，回收率为53％。
实施例6 水产样品中孔雀石绿的快速检测
取2.00g孔雀石绿分子印迹微球(实施例1)装入的固相萃取小柱内，轻击柱壁填实。用80％乙腈-乙酸胺溶液反复冲洗至洗出液在紫外-可见分光光度计下检测620nm处无读数。称取5.00g市售鲜鳗鱼置于50mL离心管内，按照孔雀石绿国家标准处理样品，将样品研磨匀浆后浸泡、搅拌、过滤，将滤液通过由微球填满的过滤柱，再使用80％的乙腈缓冲溶液对微球进行洗脱，利用分光光度计在620nm条件下检测洗脱液中孔雀石绿的浓度，从而得到受检水产品中孔雀石绿的含量为0.29ppm。
实施例7 水产样品中孔雀石绿的快速检测
取2.00g孔雀石绿分子印迹微球装入的固相萃取小柱内，轻击柱壁填实。用90％乙腈-乙酸胺溶液反复冲洗至洗出液在紫外-可见分光光度计下检测620nm处无读数。称取5.00g市售鲜八宝鱼置于50mL离心管内，按照孔雀石绿国家标准处理样品，称取5.00g已捣碎样品于50mL离心管中，加入200μL混合内标标准溶液，加入11mL乙腈，超声波振荡提取2min，8000r/min匀浆提取30s，4000r/min离心5min，上清液转移至25mL比色管中；另取一50mL离心管加入11mL乙腈，洗涤匀浆刀头10s，洗涤液移入前一离心管中，用玻棒捣碎离心管中的沉淀，漩涡混匀器上振荡30s，超声波振荡5min，4000r/min离心5min，上清液合并至25mL比色管中，用乙腈定容至25.0mL，摇匀备用，将样品处理液通过由微球填满的过滤柱，再使用60％的乙腈缓冲溶液对微球进行洗脱，利用分光光度计在620nm条件下检测洗脱液中孔雀石绿的含量。从而得到受检水产品中孔雀石绿的含量为0.14ppm。
实施例8 水产样品中孔雀石绿的快速检测
取2.00g孔雀石绿分子印迹微球装入的固相萃取小柱内，轻击柱壁填实。用80％乙腈-乙酸胺溶液反复冲洗至洗出液在紫外-可见分光光度计下检测620nm处无读数。称取5.00g市售鲜鲑鱼置于50mL离心管内，按照孔雀石绿国家标准处理样品，称取5.00g已捣碎样品于50mL离心管中，加入200μL混合内标标准溶液，加入11mL乙腈，超声波振荡提取2min，8000r/min匀浆提取30s，4000r/min离心5min，上清液转移至25mL比色管中；另取一50mL离心管加入11mL乙腈，洗涤匀浆刀头10s，洗涤液移入前一离心管中，用玻棒捣碎离心管中的沉淀，漩涡混匀器上振荡30s，超声波振荡5min，4000r/min离心5min，上清液合并至25mL比色管中，用乙腈定容至25.0mL，摇匀备用，将样品液通过由微球填满的过滤柱，再使用98％的乙腈缓冲溶液对微球进行洗脱，利用分光光度计在620nm条件下检测洗脱液中孔雀石绿的含量。从而得到受检水产品中孔雀石绿的含量为0.17ppm。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
实施例1 孔雀石绿分子印迹聚合物微球的制备
在250mL三角瓶中加入2mmol孔雀石绿、8mmol丙烯酰胺和8mmol甲基丙烯酸，再加入15mL石油醚。量取蒸馏水150mL，加入4.5mL吐温-80(按蒸馏水体积的3％添加)，加热使完全溶解，冷却至常温。将蒸馏水倒入三角瓶中，并加入交联剂乙二醇二甲基丙稀酸酯(40mmol，7.56mL)，引发剂偶氮丁异二腈(200mg)。超声脱气5min，分散乳化机乳化3min，65℃水浴聚合24h。所得聚合物用蒸馏水洗涤至澄清后，以80％的乙腈-乙酸胺缓冲液为洗涤液进行索氏提取。最后在固相萃取装置中用80％的乙腈-乙酸胺缓冲液冲洗，直至流出液在紫外-可见光谱检测无孔雀石绿检出为止。所得微球烘干，用筛子筛选微球(100目筛下，200目筛上)。得到分散性好、颗粒均匀的孔雀石绿分子印迹微球，回收率为63％。
实施例2 孔雀石绿印迹分子聚合物微球的制备
在250mL三角瓶中加入2mmol孔雀石绿、4mmol丙烯酰胺和4mmol 4-乙烯基吡啶，再加入15mL氯仿，量取蒸馏水150mL，加入7.5mL吐温-80(按蒸馏水体积的3％添加)，加热使完全溶解，冷却至常温。将蒸馏水倒入三角瓶中，并加入交联剂乙二醇二甲基丙稀酸酯(40mmol，7.56mL)，引发剂偶氮丁异二腈(200mg)。超声脱气10min，分散乳化机乳化5min，70℃水浴聚合4h。所得聚合物用蒸馏水洗涤至澄清后，以80％的乙腈-乙酸胺缓冲液为洗涤液进行索氏提取。最后在固相萃取装置中用60％的乙腈-乙酸胺缓冲液冲洗，直至流出液在紫外-可见光谱检测无孔雀石绿检出为止。所得微球烘干，用筛子筛选微球(100目筛下，200目筛上)。得到分散性好、颗粒均匀的孔雀石绿分子印迹微球，回收率为57％。
实施例3 孔雀石绿印迹分子聚合物微球的制备
在250mL三角瓶中加入2mmol孔雀石绿、4mmol甲基丙烯酸和4mmol 4-乙烯基吡啶，再加入15mL三氯甲烷。量取蒸馏水150mL，加入6.0mL十二烷基硫酸钠(按蒸馏水体积的4％添加)，加热使完全溶解，冷却至常温。将蒸馏水倒入三角瓶中，并加入交联剂乙二醇二甲基丙稀酸酯(40mmol，7.56mL)，引发剂偶氮丁异二腈(200mg)。超声脱气2min，分散乳化机乳化5min，60℃水浴聚合12h。所得聚合物用蒸馏水洗涤至澄清后，以50％的乙腈-乙酸胺缓冲液为洗脱液进行超声波洗脱。最后在固相萃取装置中用60％的乙腈-乙酸胺缓冲液冲洗，直至流出液在紫外-可见光谱检测无孔雀石绿检出为止。所得微球烘干，用筛子筛选微球(100目筛下，200目筛上)。得到分散性好、颗粒均匀的孔雀石绿分子印迹微球，回收率为44％。
实施例4 孔雀石绿印迹分子聚合物微球的制备
在250mL三角瓶中加入2mmol孔雀石绿、4mmol甲基丙烯酸和4mmol丙烯酰胺，再加入15mL谷氨酸钠。量取蒸馏水150mL，加入3.0mL十二烷基硫酸钠(按蒸馏水体积的2％添加)，加热使完全溶解，冷却至常温。将蒸馏水倒入三角瓶中，并加入交联剂乙二醇二甲基丙稀酸酯(40mmol，7.56mL)，引发剂偶氮丁异二腈(200mg)。超声脱气5min，分散乳化机乳化3min，65℃水浴聚合24h。所得聚合物用蒸馏水洗涤至澄清后，以60％的乙腈-乙酸胺缓冲液为洗脱液进行超声波洗脱。最后在固相萃取装置中用50％的乙腈-乙酸胺缓冲液冲洗，直至流出液在紫外-可见光谱检测无孔雀石绿检出为止。所得微球烘干，用筛子筛选微球(100目筛下，200目筛上)。得到分散性好、颗粒均匀的孔雀石绿分子印迹微球，回收率为51％。
实施例5 孔雀石绿分子印迹聚合物微球的制备
在250mL三角瓶中加入2mmol孔雀石绿、8mmol丙烯酰胺和8mmol甲基丙烯酸，再加入15mL石油醚。量取蒸馏水150mL，加入4.5mL吐温-80(按蒸馏水体积的3％添加)，加热使完全溶解，冷却至常温。将蒸馏水倒入三角瓶中，并加入交联剂乙二醇二甲基丙稀酸酯(40mmol，7.56mL)，引发剂偶氮丁异二腈(200mg)。超声脱气5min，分散乳化机乳化3min，65℃水浴、搅拌速度为200rpm、聚合24h。所得聚合物用蒸馏水洗涤至澄清后，以80％的乙腈-乙酸胺缓冲液为洗涤液进行索氏提取。最后在固相萃取装置中用80％的乙腈-乙酸胺缓冲液冲洗，直至流出液在紫外-可见光谱检测无孔雀石绿检出为止。所得微球烘干，用筛子筛选微球(100目筛下，200目筛上)。得到分散性好、颗粒均匀的孔雀石绿分子印迹微球，回收率为53％。
实施例6 水产样品中孔雀石绿的快速检测
取2.00g孔雀石绿分子印迹微球(实施例1)装入的固相萃取小柱内，轻击柱壁填实。用80％乙腈-乙酸胺溶液反复冲洗至洗出液在紫外-可见分光光度计下检测620nm处无读数。称取5.00g市售鲜鳗鱼置于50mL离心管内，按照孔雀石绿国家标准处理样品，将样品研磨匀浆后浸泡、搅拌、过滤，将滤液通过由微球填满的过滤柱，再使用80％的乙腈缓冲溶液对微球进行洗脱，利用分光光度计在620nm条件下检测洗脱液中孔雀石绿的浓度，从而得到受检水产品中孔雀石绿的含量为0.29ppm。
实施例7 水产样品中孔雀石绿的快速检测
取2.00g孔雀石绿分子印迹微球装入的固相萃取小柱内，轻击柱壁填实。用90％乙腈-乙酸胺溶液反复冲洗至洗出液在紫外-可见分光光度计下检测620nm处无读数。称取5.00g市售鲜八宝鱼置于50mL离心管内，按照孔雀石绿国家标准处理样品，称取5.00g已捣碎样品于50mL离心管中，加入200μL混合内标标准溶液，加入11mL乙腈，超声波振荡提取2min，8000r/min匀浆提取30s，4000r/min离心5min，上清液转移至25mL比色管中；另取一50mL离心管加入11mL乙腈，洗涤匀浆刀头10s，洗涤液移入前一离心管中，用玻棒捣碎离心管中的沉淀，漩涡混匀器上振荡30s，超声波振荡5min，4000r/min离心5min，上清液合并至25mL比色管中，用乙腈定容至25.0mL，摇匀备用，将样品处理液通过由微球填满的过滤柱，再使用60％的乙腈缓冲溶液对微球进行洗脱，利用分光光度计在620nm条件下检测洗脱液中孔雀石绿的含量。从而得到受检水产品中孔雀石绿的含量为0.14ppm。
实施例8 水产样品中孔雀石绿的快速检测
取2.00g孔雀石绿分子印迹微球装入的固相萃取小柱内，轻击柱壁填实。用80％乙腈-乙酸胺溶液反复冲洗至洗出液在紫外-可见分光光度计下检测620nm处无读数。称取5.00g市售鲜鲑鱼置于50mL离心管内，按照孔雀石绿国家标准处理样品，称取5.00g已捣碎样品于50mL离心管中，加入200μL混合内标标准溶液，加入11mL乙腈，超声波振荡提取2min，8000r/min匀浆提取30s，4000r/min离心5min，上清液转移至25mL比色管中；另取一50mL离心管加入11mL乙腈，洗涤匀浆刀头10s，洗涤液移入前一离心管中，用玻棒捣碎离心管中的沉淀，漩涡混匀器上振荡30s，超声波振荡5min，4000r/min离心5min，上清液合并至25mL比色管中，用乙腈定容至25.0mL，摇匀备用，将样品液通过由微球填满的过滤柱，再使用98％的乙腈缓冲溶液对微球进行洗脱，利用分光光度计在620nm条件下检测洗脱液中孔雀石绿的含量。从而得到受检水产品中孔雀石绿的含量为0.17ppm。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。