姚虻唾液腺免疫调节肽及其基因和应用转让专利
申请号 : CN200810058075.X
文献号 : CN101220091B
文献日 : 2011-08-24
发明人 : 赖仞 , 武静 , 徐学清 , 李东升 , 马冬莹
申请人 : 中国科学院昆明动物研究所
摘要 :
本发明涉及一种姚虻唾液腺免疫调节肽及其基因和应用，属于生物医学领域。该免疫调节肽是中国虻科昆虫唾液腺免疫调节肽基因编码的一种线状多肽，其全序列为：甘氨酸—甘氨酸—缬氨酸—丝氨酸—甘氨酸—缬氨酸—丝氨酸—天冬氨酸—苯丙氨酸—谷氨酸—脯氨酸—异亮氨酸—谷氨酸—缬氨酸—丝氨酸—甘氨酸—谷氨酸—天冬氨酸—酪氨酸—天冬酰胺—丝氨酸—天冬氨酸—谷氨酸—丙氨酸—天冬氨酸—谷氨酸—天冬氨酸—甘氨酸—赖氨酸—丙氨酸。免疫调节肽基因由362个核苷酸组成，其中编码成熟编码姚虻唾液腺免疫调节肽为第115-204位核苷酸。该姚虻唾液腺免疫调节肽作为抑制多种细胞因子的应用。本发明的免疫调节肽具有结构简单、人工合成方便、抗菌活性强等特点。
权利要求 :
1.姚虻唾液腺免疫调节肽，其特征在于由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成。
2.编码姚虻唾液腺免疫调节肽的基因，其特征在于由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列组成。
3.编码姚虻唾液腺免疫调节肽的基因，其由SEQ ID NO：1的第115-204位核苷酸序列组成。
4.权利要求1所述的姚虻唾液腺免疫调节肽在制备免疫调节药物中的应用。
说明书 :
姚虻唾液腺免疫调节肽及其基因和应用
技术领域：
[0001] 本发明提供一种姚虻唾液腺免疫调节肽及其基因和应用，属于生物医学技术领域。背景技术：
[0002] 免疫调节肽在其生理浓度、有盐和血清存在的条件下具有广泛的生物学活性，包括在先天性免疫细胞(嗜中性粒细胞、上皮细胞)中与炎症反应、先天性免疫和适应性免疫相关的活性，在单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞中作为先天性免疫和适应性免疫的沟通桥- +梁[1，2，3，4]。抗菌肽可以中和G 菌脂多糖、G 菌脂磷壁酸和细菌未甲基化CpG DNA等细菌信号分子。这些信号分子可以与宿主细胞表面Toll样受体结合，启动信号级联放大和细胞因子(如TNF-α、IL-6等)正调节[5]。低浓度细菌信号分子可引发机体有益的炎症反应和发热，但是如果反应剧烈或持续时间延长，可以导致全身循环障碍、器官衰竭，甚至死亡。抗菌肽可抑制脂多糖与血清脂多糖结合蛋白因子结合，防止内毒素血症和死亡[6，7，8，
9]。免疫调节肽还参与宿主天然免疫的其他反应，比如，通过有丝分裂原激活的蛋白激酶信号通路或是其它信号通路提高单核趋化蛋白的水平来刺激单核细胞和嗜中性白细胞的趋化作用[10]、促进肥大细胞组织胺的释放、抑制组织蛋白酶以及促进创伤愈合[11]。 [0003] 细胞因子是一类主要由免疫细胞和相关细胞产生的高活性、多功能小分子蛋白质。细胞因子的产生细胞非常广泛，除淋巴细胞、单核/巨噬细胞可产生多种细胞因子外，粘膜上皮细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等多种细胞也能产生。通常休止期细胞不产生或仅自发产生少量的细胞因子，当受抗原、丝裂原或其他激活剂激活后可大量产生一定种类的细胞因子。细胞因子通过与靶细胞表面的相应受体结合后发挥生物学功能。由于细胞因子与其受体间具有很高的亲和力，因此极微量细胞因子就能产生明显的生物学效应。一般根据细胞因子的名称和生物学活性可分为主要起免疫调节作用的白细胞介素、有抗病毒作用的干扰素、能刺激骨髓造血前体细胞生长和分化的集落刺激因子、有一定抗肿瘤活性并有明显炎症介质作用的肿瘤坏死因子、能刺激细胞生长的生长因子以及对免疫细胞有趋化作用的趋化性细胞因子等六类[12]。
9]。免疫调节肽还参与宿主天然免疫的其他反应，比如，通过有丝分裂原激活的蛋白激酶信号通路或是其它信号通路提高单核趋化蛋白的水平来刺激单核细胞和嗜中性白细胞的趋化作用[10]、促进肥大细胞组织胺的释放、抑制组织蛋白酶以及促进创伤愈合[11]。 [0003] 细胞因子是一类主要由免疫细胞和相关细胞产生的高活性、多功能小分子蛋白质。细胞因子的产生细胞非常广泛，除淋巴细胞、单核/巨噬细胞可产生多种细胞因子外，粘膜上皮细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等多种细胞也能产生。通常休止期细胞不产生或仅自发产生少量的细胞因子，当受抗原、丝裂原或其他激活剂激活后可大量产生一定种类的细胞因子。细胞因子通过与靶细胞表面的相应受体结合后发挥生物学功能。由于细胞因子与其受体间具有很高的亲和力，因此极微量细胞因子就能产生明显的生物学效应。一般根据细胞因子的名称和生物学活性可分为主要起免疫调节作用的白细胞介素、有抗病毒作用的干扰素、能刺激骨髓造血前体细胞生长和分化的集落刺激因子、有一定抗肿瘤活性并有明显炎症介质作用的肿瘤坏死因子、能刺激细胞生长的生长因子以及对免疫细胞有趋化作用的趋化性细胞因子等六类[12]。
[0004] 细胞因子的异常表达，常与临床上许多疾病的发生有密切的关联。一方面，细胞因子表达过高、过低或缺陷，均会导致与机体免疫有关疾病的发生；另一方面，伴随着临床上许多疾病进程，某些细胞因子的表达量也会出现明显的变化。
[0005] 虻科昆虫俗称牛虻，属于吸血节肢动物，其寄生成功的关键是通过产生特异唾液拮抗剂来影响宿主免疫反应。根据国内外文献报道，这些物质存在显著的生化和药理学多样性，其天然多样性用在药物治疗和生化研究中将有很好前景，同时也对于扩展我们对宿主保护机制性机制的理解以及对唾液产品和先天性免疫间作用的研究。
[0006] 参考文献：
[0007] [1]Bowdish，D.M.，D.J.Davidson，Y.E.Lau，K.Lee，M.G.Scott，and R.E.W.Hancock(2005) Impact of LL-37 on antiinfective immunity.J.Leukoc.Biol.77，451-459
[0008] [2]Gennaro，R.，M.Zanetti，M.Benincasa，E.Podda，and M.Miani(2002)Pro-rich antimicrobialpeptides from animals：structure，biological functions and mechanism of action.Curr.Pharm.Des.8，763-778.
[0009] [3]McPhee，J.B.and R.E.W.Hancock(2005)Function and therapeutic potential of host defencepeptides.J.Pept.Sci.11，677-687
[0010] [4]Davidson，D.J.，A.J.Currie，G.S.Reid，D.M.Bowdish，K.L.MacDonald，R.C.Ma，R.E.W.Hancock，and D.P.Speert(2004)The cationic antimicrobial peptide LL-37 modulatesdendritic cell differentiation and dendritic cell-induced T cell polarization.J.Immunol.172，1146-1156.
[0011] [5]Mookherjee N，BrownK L，BowdishDM，etal.Modulation of the TLR-mediated inflammatoryresponse by the endogenous human host defense poptide LL-37.J lmmunol，2006，176(4)：2455-2464
[0012] [6]Golec M.Cathelicidin LL-37：LPS-neutralifing，pleiotropic peptide.Ann AgIic Environ Med，2007，14(1)：1-4
[0013] [7]Giacometti A，Cirioni O，Ghiselli R，et al.Potential therapeutic role of cationic peptides inthree experimental models of septic shock.Antimicrob.Agents Chemother，2002，46(7)：2132-2136
[0014] [8]Chertov O，Michiel D F，Xu L，et al.Identification of defensin-1，defensin-2，and CAP37/azurocidin as T-cell chemoattractant proteins released from interleukin-8-stimulatedneutrophils.J Biol Chem，1996，271(6)：2935-2940 [0015] [9]Mookherjee N，Hancock R E.Cationic host ddence peptides：innate immune regulatorypeptides as a novel approach for treating infections.Cel Mol Life Sci，2007，64(7-8)：922-933
[0016] [10]Scott，M.G.，C.M.Rosenberger，M.R.Gold，B.B.Finlay，and R.E.W.Hancock(2000)Analpha-helical cationic antimicrobial peptide selectively modulates macrophage responsesto lipopolysaccharide and directly alters macrophage gene expression.J.Immunol.165，3358-3365.
[0017] [11]Zanetti M.Cathelicidins，multifunctional peptides of the innate immunity[J]..J leukoc Bio，2004，75(1)：39-48
[0018] [12]吴敏毓，刘恭植主编。医学免疫学，合肥：中国科学技术大学出版社，2002，2. [0019] 经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。发明内容：
[0020] 本发明的目的是基于上述技术和理论基础，提供一种具有免疫调节活性，如抑制肿瘤坏死因子(TNF-α)、单核趋化蛋白-1(MCP-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-8(IL-8)和白细胞介素-10(IL-10)的姚虻唾液腺免疫调节多肽及其基因和应用。 [0021] 为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：
[0022] 姚虻唾液腺免疫调节多肽：
[0023] 姚虻唾液腺免疫调节肽是中国虻科昆虫唾液腺免疫调节肽基因编码的一种线状多肽，其全序列为：甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-谷氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-缬氨酸-丝氨酸-甘氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-丝氨酸-天冬氨 酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-赖氨酸-丙氨酸
[0024] 姚虻唾液腺免疫调节肽基因的克隆包括：姚虻唾液腺总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选免疫调节肽基因。扩增引物长度为25个核苷酸，其序列为5’CTCATTGTGGGACTGTTTACATCAT3’，PCR另一扩增引物为TMCLONTECH公司SMART cDNA Library ConstructionKit中的3’PCR Primer引物，其序列为5′ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3′。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。 [0025] 基因测序结果表明编码姚虻唾液腺免疫调节多肽的基因由362个核苷酸组成，自
5’端至3’端序列为：
5’端至3’端序列为：
[0026] atgttgttaa aaagttacgt tttcttttta ttgagcctgc tcattgtggg actgtttaca 60 [0027] tcatgtgatg cggatgccca atatgaggat ctcgtcacag gctatttacg aaaaggaggc 120 [0028] gttagtggag ttagtgactt tgaacccatc gaggtctctg gcgaagacta taacagtgat 180 [0029] gaagcggacg aagacggaaa agcgtaattc taccaccttt aacccataac agcaaagcca 240 [0030] atgaagcaga gtgcaattta gtttgaatag ttttatgtat aatcccacca ttcatatggc 300 [0031] attgagtaat gatatggaaa aatatatgca aattaaacaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 [0032] aa 362 [0033] 编码姚虻唾液腺免疫调节肽为第115-204位核苷酸，其氨基酸序列为： [0034] Gly Gly Val Ser Gly Val Ser Asp Phe Glu Pro Ile Glu Val Ser Gly Glu Asp Tyr [0035] 1 5 10 15 [0036] Asn Ser Asp Glu Ala Asp Glu Asp Gly Lys Ala
[0037] 20 25 30
[0038] 本发明的有益效果在于：由姚虻唾液腺免疫调节肽编码基因推导其氨基酸结构，合成的姚虻唾液腺免疫调节肽具有显著的抑制肿瘤坏死因子(TNF-α)、单核趋化蛋白1(MCP-1)、白细胞介素8(IL-8)、白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素2(IL-2)的作用。该多肽能够抑制多种细胞因子，能从姚虻唾液腺产品和先天性免疫之间的关系角度揭示吸血节肢动物寄生的机制。具有结构简单、人工合成方便、抗菌活性强的特点。 附图说明：
[0039] 图1显示姚虻唾液腺免疫调节肽对Wistar大鼠肿瘤坏死因子(TNF-α)的抑制作用。
[0040] 图2显示姚虻唾液腺免疫调节肽对Wistar大鼠单核趋化蛋白-1(MCP-1)的抑制作用。
[0041] 图3显示姚虻唾液腺免疫调节肽对Wistar大鼠白细胞介素-8(IL-8)的抑制作用。
[0042] 图4显示姚虻唾液腺免疫调节肽对Wistar大鼠白细胞介素-10(IL-10)的抑制作用。
[0043] 图5显示姚虻唾液腺免疫调节肽对Wistar大鼠白细胞介素-2(IL-2)抑制的作用。具体实施方式：
[0044] 实施例一：姚虻唾液腺免疫调节肽基因克隆：
[0045] I、姚虻唾液腺总RNA提取：
[0046] A.活体解剖姚虻，挑取唾液腺立即放入液氮中，累积六十只左右，称重，取300mg姚虻唾液腺组织，加入10ml总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国GIBCOBRL公司产品)，于20ml玻璃匀浆器中匀浆30分钟。
[0047] B.加入等体积酚/氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。
[0048] C.上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为姚虻唾液腺总RNA。
[0049] II、姚虻唾液腺mRNA的纯化：
[0050] 姚虻唾液腺mRNA分离纯化采用美国PROMEGA公司的 mRNAIsolation Systems试剂盒。
[0051] A.取姚虻唾液腺总RNA 500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分钟，加人3μl的Oligo(dT)探针和13μl 20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。 [0052] B.磁珠(SA-PMP)的洗涤：将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5×SSC 0.3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml 0.5×SSC悬浮，称之为B液。 [0053] C.将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次，最后弃上清，加0.1ml DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0.15ml DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，则上清中为纯化的姚虻唾液腺mRNA。
[0054] D.加入1/10体积3M乙酸钠，pH5.2，等体积异丙醇，于-70℃放置30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。
TM
TM
[0055] III、姚 虻 唾 液 腺 cDNA 文 库 构 建：采 用 CLONTECH 公 司 Creator TMSMART cDNALibrary Construction Kit质粒cDNA文库构建试剂盒。
[0056] A.cDNA第一链合成(mRNA反转录)：
[0057] 1.在0.5ml无菌的离心管加入1μl姚虻唾液腺mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、1μl CDSIII/3’PCR引物，加2μl去离子水使总体积达到5μl。
[0058] 2.混匀离心管中的试剂并短暂离心，72℃保温2分钟。
[0059] 3.将离心管在冰上孵育2分钟。
[0060] 4.在离心管中加入以下试剂2.0μl 5×第一链缓冲、1.0μl 20mM二硫苏糖醇、1.0μl 10mM dNTP混合物、1.0μl PowerScript反转录酶。
[0061] 5.混合离心管中试剂并短暂离心，在42℃保温1小时。
[0062] 6.将离心管置于冰上中止第一链的合成。
[0063] 7.从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。
[0064] B.采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链
[0065] 1.95℃预热PCR仪。
[0066] 2.将2μl cDNA第一链(mRNA反转录)、80μl去离子水、10μl 10×Advantage2PCR缓冲、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDSIII/3’PCR引物以及2μl大肠杆菌聚合酶离心管进行反应。
[0067] 3.在PCR仪中按以下程序扩增：
[0068] ①95℃ 20秒钟
[0069] ②22个循环：
[0070] 95℃ 5秒钟
[0071] 68℃ 6分钟
[0072] 4.循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链进行抽提。
[0073] C.PCR产物用PROMEGA公司的 SV Gel and PCR Clean-Up System试剂盒进行抽提回收，步骤如下：
[0074] 1.将通过PCR得到的cDNA双链加入等体积的膜结合缓冲颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室温静置5分钟，使DNA充分与硅胶膜结合。16,000g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
[0075] 2.加入700μl的洗脱液(含乙醇)于离心纯化柱中，16,000g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
[0076] 3.重复步骤2。
[0077] 4.16,000g离心5分钟。
[0078] 5.将离心纯化柱置于新的离心管中。
[0079] 6.加入30μl超纯水，在室温下静置5分钟。
[0080] 7.16,000g离心1分钟，管底溶液即为所纯化过的cDNA双链。
[0081] D.大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：
[0082] 1.挑取单个DH5α菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接种于50ml LB培养液中，37℃振荡2小时。当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物。
[0083] 2.将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上方置10min，使培养物冷却至0℃。
[0084] 3.于4℃以4100r/min离心10min，以回收细胞。
[0085] 4.倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。
[0086] 5.每50ml初始培养液且30ml预冷的0.1mol/L CaCl2-MgCl2溶液(80mmol/L MgCl2，20mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。
[0087] 6.于4℃以4100r/min离心10min，以回收细胞。
[0088] 7.倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。
[0089] 8.每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份细胞沉淀，分装后备用。
[0090] E.酶切、连接以及连接产物的转化：
[0091] 1.在微量离心管中加入1μl Takara pMD18-T载体、4μl无指盘臭蛙cDNA双链溶液，全量为5μl。
[0092] 2.加入5μl(等量)的连接酶缓冲混合物。
[0093] 3.16℃反应2小时。
[0094] 4.全量(10μl)加入至100μl DH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟。 [0095] 5.42℃加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟。
[0096] 6.加入37℃温浴过的LB培养基890μl，37℃缓慢振荡培养60分钟。 [0097] 7.取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培养基上37℃培养16小时，形成单菌落。
[0098] 8.每个LB平皿用5ml LB液体培养基洗涤菌落，加30％甘油冻存。构建的cDNA6
大约含1×10 个单独克隆。
大约含1×10 个单独克隆。
[0099] IV、姚虻唾液腺免疫调节肽基因克隆筛选：
[0100] 扩增引物长度为25个核苷酸，其序列为5’CTCATTGTGGGACTGTTTACATCAT3’，PCR另TM一扩增引物为CLONTECH公司SMART cDNA Library ConstructionKit中的3’PCR Primer引物，其序列为5′ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3′。
[0101] PCR反应在如下条件下进行：94℃30秒钟，56℃30秒钟和72℃60秒钟，30个循环。
[0102] 首先滴定构建的细菌cDNA文库，然后用含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基稀释至适当的细菌浓度(大约5000个细菌/毫升，和30个细菌/毫升分别用于首轮筛选第二轮筛选)，在96孔培养板上按8×8矩阵铺板(共64孔，每孔100μl)，37℃过夜培养。按行、列分别合并细菌培养液，有16个样品进行PCR鉴定，交叉阳性孔细菌样品进入第二轮筛选。
[0103] V、姚虻唾液腺免疫调节肽基因序列测定和结果：
[0104] 提 取 质 粒DNA 用 双 脱 氧 法 测 定 核 苷 酸 序 列，使 用 仪 器 为 美 国TMAppliedBiosystems373A全 自 动 核 苷 酸 序 列 测 定 仪，测 序 引 物 为 BcaBEST TM TM
SequencingPrimer RV-M和BcaBEST Sequencing Primer M13-47，BcaBEST Sequencing TM
Primer RV-M 序 列：5`GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3’，BcaBEST SequencingPrimer M13-47：5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’。基因测序结果自5’端至3’端序列为： [0105] atgttgttaa aaagttacgt tttcttttta ttgagcctgc tcattgtggg actgtttaca 60 [0106] tcatgtgatg cggatgccca atatgaggat ctcgtcacag gctatttacg aaaaggaggc 120 [0107] gttagtggag ttagtgactt tgaacccatc gaggtctctg gcgaagacta taacagtgat 180 [0108] gaagcggacg aagacggaaa agcgtaattc taccaccttt aacccataac agcaaagcca 240 [0109] atgaagcaga gtgcaattta gtttgaatag ttttatgtat aatcccacca ttcatatggc 300 [0110] attgagtaat gatatggaaa aatatatgca aattaaacaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 [0111] aa 362 [0112] 姚虻唾液腺免疫调节肽基因核苷酸的序列表为：序列长度为362个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cDNA，来源：姚虻唾液腺。 [0113] 编码姚虻唾液腺免疫调节肽为第115-204位核苷酸，其氨基酸序列为： [0114] Gly Gly Val Ser Gly Val Ser Asp Phe Glu Pro Ile Glu Val Ser Gly Glu Asp Tyr [0115] 1 5 10 15 [0116] Asn Ser Asp Glu Ala Asp Glu Asp Gly Lys Ala
SequencingPrimer RV-M和BcaBEST Sequencing Primer M13-47，BcaBEST Sequencing TM
Primer RV-M 序 列：5`GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3’，BcaBEST SequencingPrimer M13-47：5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’。基因测序结果自5’端至3’端序列为： [0105] atgttgttaa aaagttacgt tttcttttta ttgagcctgc tcattgtggg actgtttaca 60 [0106] tcatgtgatg cggatgccca atatgaggat ctcgtcacag gctatttacg aaaaggaggc 120 [0107] gttagtggag ttagtgactt tgaacccatc gaggtctctg gcgaagacta taacagtgat 180 [0108] gaagcggacg aagacggaaa agcgtaattc taccaccttt aacccataac agcaaagcca 240 [0109] atgaagcaga gtgcaattta gtttgaatag ttttatgtat aatcccacca ttcatatggc 300 [0110] attgagtaat gatatggaaa aatatatgca aattaaacaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 [0111] aa 362 [0112] 姚虻唾液腺免疫调节肽基因核苷酸的序列表为：序列长度为362个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cDNA，来源：姚虻唾液腺。 [0113] 编码姚虻唾液腺免疫调节肽为第115-204位核苷酸，其氨基酸序列为： [0114] Gly Gly Val Ser Gly Val Ser Asp Phe Glu Pro Ile Glu Val Ser Gly Glu Asp Tyr [0115] 1 5 10 15 [0116] Asn Ser Asp Glu Ala Asp Glu Asp Gly Lys Ala
[0117] 20 25 30
[0118] 姚虻唾液腺免疫调节肽基因作为基因工程制备姚虻唾液腺免疫调节肽的应用。 [0119] 实施例二：制备姚虻唾液腺免疫调节肽：
[0120] I、姚虻唾液腺免疫调节肽的制备方法：根据编码姚虻唾液腺免疫调节肽的基因推断姚虻唾液腺免疫调节肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。
[0121] II、分 子 量 测 定 采 用 快 原 子 轰 击 质 谱 法 (Fast atom bombardment massspectrometry，FAB-MS)，以甘油∶间硝基苄醇∶二甲亚砜(1∶1∶1，V∶V∶V，体+积比)为底物，Cs 作为轰击粒子，电流为1μA，发射电压为25Kv。
[0122] III、纯化的姚虻唾液腺免疫调节肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
[0123] 实施例三：姚虻唾液腺免疫调节肽的药理实验：
[0124] 1、姚虻唾液腺免疫调节肽对肿瘤坏死因子(TNF-α)抑制的作用(图1)： [0125] 大鼠脾细胞的准备和培养：大鼠断颈椎处死，无菌取出脾脏并剥离脂肪组织，在RPMI1640培养基中冲掉血迹，无菌剪碎脾脏后转移至200目铜网，并用2ml注射器芯将脾脏研磨分散成单个细胞。1000rpm/min离心10分钟，弃上清，将沉淀悬浮于含10％胎牛血6
清、2ug/ml细菌脂多糖(LPS)的RPMI1640培养基， 调整细胞浓度至2×10 个/ml。于96孔板的每个孔中加入细胞悬液196ul，并加入浓度为1mg/ml的牛虻免疫调节肽4ul，使之终浓度达20ug/ml，设2个重复孔；同时设置用LPS或者不用LPS刺激，不加牛虻免疫调节肽的细胞作为对照，设2个重复孔.37℃，5％CO2及饱和湿度下培养48小时，收集细胞培养液于1.5ml离心管中，2000rpm/min离心10min，保留上清，并保存于-20℃，用于细胞因子的检测。将保存于-20℃，用于TNF-α检测的细胞上清加入ELISA试剂盒的空白微孔中50ul/孔，设2个重复孔；根据ELISA检测试剂盒说明书，在样品孔中加入10ul的生物素标记液；
在样品孔中加入50ul的酶标记溶液；37℃孵育反应60分钟；洗涤液5次，每次静置10-20秒；每孔加入底物A、B液各50ul；37℃下避光孵育反应15分钟；每孔加入50ul终止液，终止反应；于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值；以OD值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘制曲线图；根据样品的OD值查找对应的浓度范围，2个重复孔的浓度取平均值。 [0126] 2、姚虻唾液腺免疫调节肽对单核趋化蛋白-1(MCP-1)抑制的作用(图2)： [0127] 大鼠脾细胞的准备和培养：大鼠断颈椎处死，无菌取出脾脏并剥离脂肪组织，在RPMI1640培养基中冲掉血迹，无菌剪碎脾脏后转移至200目铜网，并用2ml注射器芯将脾脏研磨分散成单个细胞。1000rpm/min离心10分钟，弃上清，将沉淀悬浮于含10％胎牛血
6
清、2ug/ml细菌脂多糖(LPS)的RPMI1640培养基，调整细胞浓度至2×10 个/ml。于96孔板的每个孔中加入细胞悬液196ul，并加入浓度为1mg/ml的牛虻免疫调节肽4ul，使之终浓度达20ug/ml，设2个重复孔；同时设置用LPS或者不用LPS刺激，不加牛虻免疫调节肽的细胞作为对照，设2个重复孔.37℃，5％C02及饱和湿度下培养48小时，收集细胞培养液于1.5ml离心管中，2000rpm/min离心10min，保留上清，并保存于-20℃，用于细胞因子的检测。将保存于-20℃，用于MCP-1检测的细胞上清加入ELISA试剂盒的空白微孔中50ul/孔，设2个重复孔；根据ELISA检测试剂盒说明书，在样品孔中加入10ul的生物素标记液；
在样品孔中加入100ul的酶标记溶液；37℃孵育反应60分钟；洗涤液5次，每次静置10-20秒；每孔加入底物A、B液各50ul；37℃下避光孵育反应15分钟；每孔加入50ul终止液，终止反应；于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值；以OD值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘制曲线图；根据样品的OD值查找对应的浓度范围，2个重复孔的浓度取平均值。 [0128] 3、姚虻唾液腺免疫调节肽对白细胞介素-8(IL-8)抑制的作用(图3)： [0129] 大鼠脾细胞的准备和培养：大鼠断颈椎处死，无菌取出脾脏并剥离脂肪组织，在RPMI1640培养基中冲掉血迹，无菌剪碎脾脏后转移至200目铜网，并用2ml注射器芯将脾脏研磨分散成单个细胞。1000rpm/min离心10分钟，弃上清，将沉淀悬浮于含10％胎牛血清、
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2ug/ml细菌脂多糖(LPS)的RPMI1640培养基，调整细胞浓度至2×10 个/ml。于96孔板的每个孔中加入细胞悬液196ul，并加入浓度为1mg/ml的牛虻免疫调节肽4ul，使之终浓度达
20ug/ml，设2个重复孔；同时设置用LPS或者不用LPS刺激，不加牛虻免疫调节肽的细胞作为对照，设2个重复孔.37℃，5％CO2及饱和湿度下培养48小时，收集细胞培养液于1.5ml离心管中，2000rpm/min离心10min，保留上清，并保存于-20℃，用于细胞因子的检测。将保存于-20℃，用于IL-8检测的细胞上清加入ELISA试剂盒的空白微孔中100ul/孔，设2个重复孔；根据ELISA检测试剂盒说明书，在样品孔中加入50ul的酶标记溶液；37℃孵育反应60分钟；洗涤液5次，每次静置10-20秒；每孔加入底物A、B液各50ul；37℃下避光孵育反应15分钟；每孔加入50ul终止液，终止反应；于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值；以OD值为纵坐 标，以标准品的浓度为横坐标，绘制曲线图；根据样品的OD值查找对应的浓度范围，2个重复孔的浓度取平均值。
清、2ug/ml细菌脂多糖(LPS)的RPMI1640培养基， 调整细胞浓度至2×10 个/ml。于96孔板的每个孔中加入细胞悬液196ul，并加入浓度为1mg/ml的牛虻免疫调节肽4ul，使之终浓度达20ug/ml，设2个重复孔；同时设置用LPS或者不用LPS刺激，不加牛虻免疫调节肽的细胞作为对照，设2个重复孔.37℃，5％CO2及饱和湿度下培养48小时，收集细胞培养液于1.5ml离心管中，2000rpm/min离心10min，保留上清，并保存于-20℃，用于细胞因子的检测。将保存于-20℃，用于TNF-α检测的细胞上清加入ELISA试剂盒的空白微孔中50ul/孔，设2个重复孔；根据ELISA检测试剂盒说明书，在样品孔中加入10ul的生物素标记液；
在样品孔中加入50ul的酶标记溶液；37℃孵育反应60分钟；洗涤液5次，每次静置10-20秒；每孔加入底物A、B液各50ul；37℃下避光孵育反应15分钟；每孔加入50ul终止液，终止反应；于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值；以OD值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘制曲线图；根据样品的OD值查找对应的浓度范围，2个重复孔的浓度取平均值。 [0126] 2、姚虻唾液腺免疫调节肽对单核趋化蛋白-1(MCP-1)抑制的作用(图2)： [0127] 大鼠脾细胞的准备和培养：大鼠断颈椎处死，无菌取出脾脏并剥离脂肪组织，在RPMI1640培养基中冲掉血迹，无菌剪碎脾脏后转移至200目铜网，并用2ml注射器芯将脾脏研磨分散成单个细胞。1000rpm/min离心10分钟，弃上清，将沉淀悬浮于含10％胎牛血
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清、2ug/ml细菌脂多糖(LPS)的RPMI1640培养基，调整细胞浓度至2×10 个/ml。于96孔板的每个孔中加入细胞悬液196ul，并加入浓度为1mg/ml的牛虻免疫调节肽4ul，使之终浓度达20ug/ml，设2个重复孔；同时设置用LPS或者不用LPS刺激，不加牛虻免疫调节肽的细胞作为对照，设2个重复孔.37℃，5％C02及饱和湿度下培养48小时，收集细胞培养液于1.5ml离心管中，2000rpm/min离心10min，保留上清，并保存于-20℃，用于细胞因子的检测。将保存于-20℃，用于MCP-1检测的细胞上清加入ELISA试剂盒的空白微孔中50ul/孔，设2个重复孔；根据ELISA检测试剂盒说明书，在样品孔中加入10ul的生物素标记液；
在样品孔中加入100ul的酶标记溶液；37℃孵育反应60分钟；洗涤液5次，每次静置10-20秒；每孔加入底物A、B液各50ul；37℃下避光孵育反应15分钟；每孔加入50ul终止液，终止反应；于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值；以OD值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘制曲线图；根据样品的OD值查找对应的浓度范围，2个重复孔的浓度取平均值。 [0128] 3、姚虻唾液腺免疫调节肽对白细胞介素-8(IL-8)抑制的作用(图3)： [0129] 大鼠脾细胞的准备和培养：大鼠断颈椎处死，无菌取出脾脏并剥离脂肪组织，在RPMI1640培养基中冲掉血迹，无菌剪碎脾脏后转移至200目铜网，并用2ml注射器芯将脾脏研磨分散成单个细胞。1000rpm/min离心10分钟，弃上清，将沉淀悬浮于含10％胎牛血清、
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2ug/ml细菌脂多糖(LPS)的RPMI1640培养基，调整细胞浓度至2×10 个/ml。于96孔板的每个孔中加入细胞悬液196ul，并加入浓度为1mg/ml的牛虻免疫调节肽4ul，使之终浓度达
20ug/ml，设2个重复孔；同时设置用LPS或者不用LPS刺激，不加牛虻免疫调节肽的细胞作为对照，设2个重复孔.37℃，5％CO2及饱和湿度下培养48小时，收集细胞培养液于1.5ml离心管中，2000rpm/min离心10min，保留上清，并保存于-20℃，用于细胞因子的检测。将保存于-20℃，用于IL-8检测的细胞上清加入ELISA试剂盒的空白微孔中100ul/孔，设2个重复孔；根据ELISA检测试剂盒说明书，在样品孔中加入50ul的酶标记溶液；37℃孵育反应60分钟；洗涤液5次，每次静置10-20秒；每孔加入底物A、B液各50ul；37℃下避光孵育反应15分钟；每孔加入50ul终止液，终止反应；于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值；以OD值为纵坐 标，以标准品的浓度为横坐标，绘制曲线图；根据样品的OD值查找对应的浓度范围，2个重复孔的浓度取平均值。
[0130] 4、姚虻唾液腺免疫调节肽对白细胞介素-10(IL-10)抑制的作用(图4)： [0131] 大鼠脾细胞的准备和培养：大鼠断颈椎处死，无菌取出脾脏并剥离脂肪组织，在RPMI1640培养基中冲掉血迹，无菌剪碎脾脏后转移至200目铜网，并用2ml注射器芯将脾脏研磨分散成单个细胞。1000rpm/min离心10分钟，弃上清，将沉淀悬浮于含10％胎牛血清、6
5ug/ml伴刀豆球蛋白(ConA)的RPMI1640培养基，调整细胞浓度至2×10 个/ml。于96孔板的每个孔中加入细胞悬液196ul，并加入浓度为1mg/ml的牛虻免疫调节肽4ul，使之终浓度达20ug/ml，设2个重复孔；同时设置用ConA或者不用ConA刺激，不加牛虻免疫调节肽的细胞作为对照，设2个重复孔.37℃，5％CO2及饱和湿度下培养48小时，收集细胞培养液于1.5ml离心管中，2000rpm/min离心10min，保留上清，并保存于-20℃，用于细胞因子的检测。将保存于-20℃，用于IL-10检测的细胞上清加入ELISA试剂盒的空白微孔中50ul/孔，设2个重复孔；根据ELISA检测试剂盒说明书，在样品孔中加入10ul的生物素标记液；
在样品孔中加入50ul的酶标记溶液；37℃孵育反应60分钟；洗涤液5次，每次静置10-20秒；每孔加入底物A、B液各50ul；37℃下避光孵育反应15分钟；每孔加入50ul终止液，终止反应；于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值；以OD值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘制曲线图；根据样品的OD值查找对应的浓度范围，2个重复孔的浓度取平均值。 [0132] 5、姚虻唾液腺免疫调节肽对白细胞介素-2(IL-2)抑制的作用(图5)： [0133] 大鼠脾细胞的准备和培养：大鼠断颈椎处死，无菌取出脾脏并剥离脂肪组织，在RPMI1640培养基中冲掉血迹，无菌剪碎脾脏后转移至200目铜网，并用2ml注射器芯将脾脏研磨分散成单个细胞。1000rpm/min离心10分钟，弃上清，将沉淀悬浮于含10％胎牛血
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清、5ug/ml伴刀豆球蛋白(ConA)的RPMI1640培养基，调整细胞浓度至2×10 个/ml。于
96孔板的每个孔中加入细胞悬液196ul，并加入浓度为1mg/ml的牛虻免疫调节肽4ul，使之终浓度达20ug/ml，设2个重复孔；同时设置用ConA或者不用ConA刺激，不加牛虻免疫调节肽的细胞作为对 照，设2个重复孔。37℃，5％CO2及饱和湿度下培养48小时，收集细胞培养液于1.5ml离心管中，2000rpm/min离心10min，保留上清，并保存于-20℃，用于细胞因子的检测。将保存于-20℃，用于IL-2检测的细胞上清加入ELISA试剂盒的空白微孔中
100ul/孔，设2个重复孔；根据ELISA检测试剂盒说明书，在样品孔中加入50ul的酶标记溶液；37℃孵育反应60分钟；洗涤液5次，每次静置10-20秒；每孔加入底物A、B液各50ul；
37℃下避光孵育反应15分钟；每孔加入50ul终止液，终止反应；于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值；以OD值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘制曲线图；根据样品的OD值查找对应的浓度范围，2个重复孔的浓度取平均值。
5ug/ml伴刀豆球蛋白(ConA)的RPMI1640培养基，调整细胞浓度至2×10 个/ml。于96孔板的每个孔中加入细胞悬液196ul，并加入浓度为1mg/ml的牛虻免疫调节肽4ul，使之终浓度达20ug/ml，设2个重复孔；同时设置用ConA或者不用ConA刺激，不加牛虻免疫调节肽的细胞作为对照，设2个重复孔.37℃，5％CO2及饱和湿度下培养48小时，收集细胞培养液于1.5ml离心管中，2000rpm/min离心10min，保留上清，并保存于-20℃，用于细胞因子的检测。将保存于-20℃，用于IL-10检测的细胞上清加入ELISA试剂盒的空白微孔中50ul/孔，设2个重复孔；根据ELISA检测试剂盒说明书，在样品孔中加入10ul的生物素标记液；
在样品孔中加入50ul的酶标记溶液；37℃孵育反应60分钟；洗涤液5次，每次静置10-20秒；每孔加入底物A、B液各50ul；37℃下避光孵育反应15分钟；每孔加入50ul终止液，终止反应；于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值；以OD值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘制曲线图；根据样品的OD值查找对应的浓度范围，2个重复孔的浓度取平均值。 [0132] 5、姚虻唾液腺免疫调节肽对白细胞介素-2(IL-2)抑制的作用(图5)： [0133] 大鼠脾细胞的准备和培养：大鼠断颈椎处死，无菌取出脾脏并剥离脂肪组织，在RPMI1640培养基中冲掉血迹，无菌剪碎脾脏后转移至200目铜网，并用2ml注射器芯将脾脏研磨分散成单个细胞。1000rpm/min离心10分钟，弃上清，将沉淀悬浮于含10％胎牛血
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清、5ug/ml伴刀豆球蛋白(ConA)的RPMI1640培养基，调整细胞浓度至2×10 个/ml。于
96孔板的每个孔中加入细胞悬液196ul，并加入浓度为1mg/ml的牛虻免疫调节肽4ul，使之终浓度达20ug/ml，设2个重复孔；同时设置用ConA或者不用ConA刺激，不加牛虻免疫调节肽的细胞作为对 照，设2个重复孔。37℃，5％CO2及饱和湿度下培养48小时，收集细胞培养液于1.5ml离心管中，2000rpm/min离心10min，保留上清，并保存于-20℃，用于细胞因子的检测。将保存于-20℃，用于IL-2检测的细胞上清加入ELISA试剂盒的空白微孔中
100ul/孔，设2个重复孔；根据ELISA检测试剂盒说明书，在样品孔中加入50ul的酶标记溶液；37℃孵育反应60分钟；洗涤液5次，每次静置10-20秒；每孔加入底物A、B液各50ul；
37℃下避光孵育反应15分钟；每孔加入50ul终止液，终止反应；于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值；以OD值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘制曲线图；根据样品的OD值查找对应的浓度范围，2个重复孔的浓度取平均值。
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