一种高产海洋微生物酯酶的芽孢杆菌MP-2及其产生的海洋微生物酯酶转让专利
申请号 : CN200710179288.3
文献号 : CN101225369B
文献日 : 2010-06-09
发明人 : 孙谧 , 郝建华 , 王跃军 , 袁翠
申请人 : 中国水产科学研究院黄海水产研究所
摘要 :
本发明涉及一种高产海洋微生物酯酶的芽孢杆菌MP-2，其特征在于该细菌MP-2是从渤海海底淤泥中筛选分离获得的高产海洋微生物酯酶的菌株芽孢杆菌Bacillussp.MP-2，于2007年6月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号这CCTCC No：M207078，以及高产海洋微生物酯酶，广泛应用于医学、化工、食品、能源及环保等领域。
权利要求 :
1.一种高产海洋微生物酯酶的芽孢杆菌MP-2(Bacillus sp.MP-2)，其特征在于该芽孢杆菌MP-2是从渤海海底淤泥中筛选分离获得的高产海洋微生物酯酶的芽孢杆菌，于2007年6月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No：M207078。
2.一种权利要求1的高产海洋微生物酯酶的芽孢杆菌MP-2的高产海洋微生物酯酶。
说明书 :
技术领域
本发明涉及海洋微生物领域，特别是从渤海海域底泥中筛选分离获得的一种高产海洋微生物酯酶的芽孢杆菌MP-2及其产生的海洋微生物酯酶。
背景技术
微生物酯酶来源于自然界的微生物，在自然界中能产生酯酶的微生物资源有陆源生物和海洋微生物，陆源微生物例如：从黄石公园温泉得到的一株耐热的极端微生物Thermus aquaticus，该菌株培养温度为80℃，DongG等人从Thermus aquaticus中分离出的胞外碱性磷酸酯酶最适温度为75～80℃；从Thermotaga neaplitana分离纯化得到胞内碱性磷酸酯酶最适温度为85℃。Thermus S p.FD3041是国内温泉分离得到的一株栖热菌，培养温度为70℃。得到的胞内碱性磷酸酯酶FD2TAP，最适温度是70℃。Pyrococcus abyssi是从深海火山中分离得到的异养古细菌，最适生长温度是100℃，得到胞内碱性磷酸酯酶的最适温度为70℃等。然而现有陆源微生物酯酶常因耐酸、耐碱或耐热性能差，应用范围受到很大限制，因此寻找具有特殊性质的微生物酯酶及其产生菌株受到世界各国的高度重视，已成为该领域关注的中心之一。
海洋环境中的微生物资源十分丰富，而且由于海洋环境条件的独特性，包括高盐、高压、低营养、低温等，造就了海洋微生物有别于陆生微生物的许多特异性，海洋环境微生物及其所产生的酶也相应具有一些特殊的性质，尤其海洋微生物酯酶具有更为独特的生理功能和广阔的应用领域。此外，海洋微生物不易培养、形态多样且在保藏和移种过程中很容易死亡等，导致对于它们种类区分的困难，不利于海洋微生物研究和开发的深入，因此若从海洋环境中定向分离各种特殊性质酯酶的产生菌，构建一个酯酶产生菌的菌种库，具有极大的实用性。
目前迫切需要开发达到快速、简便、准确可靠和良好经济性的选育分离手段和方法，以便能分离得到有用微生物菌株，为海洋微生物资源的开发利用奠定基础。
与此同时，需要建立一些简单、方便、易于操作的分类鉴定方法对海洋微生物进行分析，使人们在一定程度上更科学、更精确、更快速地找到海洋分离物的分类地位，为海洋微生物资源的开发利用奠定基础。目前，大分子rRNA已成为一个分子指标，广泛地用于各种微生物的遗传和分子差异的研究，加上大量已知微生物的DNA都已被测定并输入国际基因数据库，成为微生物鉴定分类非常有用的参照系统，从而可以通过对未知微生物DNA序列的测定和比较分析，达到以其进行快速、有效的鉴定分类的目的。
微生物酯酶是一种重要的工业酶类，涉及到酯合成、内酯合成、酯交换、多肽合成、立体异构体的转化和拆分等催化反应，酯酶催化不需要辅酶且具有反应条件温和、方法简便、催化活性高、选择性强、产物易于分离、易于回收等优点。因此广泛应用于食品工业、医药行业、日用化工业、军事和生物防护等领域。尤其嗜热酯酶的高温反应活性，以及对有机溶剂、去污剂和变性剂的较强抗性，使它在食品、医药、制革、石油开采及废物处理等方面都有广泛的应用潜力。
国际上自九十年代初到现在，相继开发出中温酯酶、高温碱性酯酶、中温碱性酯酶等，但酯酶的酶学性质仍无法满足现代工业的需求。因此从海洋中筛选出具有独特酶学性质的海洋微生物酯酶，实为微生物酯酶开发的一大进步，并将会对酶制剂工业带来新的生机和活力。从上世纪七十年代，国外就开始对产酯酶海洋细菌进行了筛选，但未见有关海洋微生物产酯酶制备和性质方面的报道(M.Chandrasekaran，1997)。我国海洋微生物酯酶研究起步较晚，仅有杨从发等人从海水，海泥海洋生物的消化道分离到碱性酯酶产生菌(杨从发，2000)。但由于海洋微生物存在海水培养和酯酶分离纯化困难等问题，限制了海洋酯酶在制备与应用方面的进一步开发。
海洋环境中的微生物资源十分丰富，而且由于海洋环境条件的独特性，包括高盐、高压、低营养、低温等，造就了海洋微生物有别于陆生微生物的许多特异性，海洋环境微生物及其所产生的酶也相应具有一些特殊的性质，尤其海洋微生物酯酶具有更为独特的生理功能和广阔的应用领域。此外，海洋微生物不易培养、形态多样且在保藏和移种过程中很容易死亡等，导致对于它们种类区分的困难，不利于海洋微生物研究和开发的深入，因此若从海洋环境中定向分离各种特殊性质酯酶的产生菌，构建一个酯酶产生菌的菌种库，具有极大的实用性。
目前迫切需要开发达到快速、简便、准确可靠和良好经济性的选育分离手段和方法，以便能分离得到有用微生物菌株，为海洋微生物资源的开发利用奠定基础。
与此同时，需要建立一些简单、方便、易于操作的分类鉴定方法对海洋微生物进行分析，使人们在一定程度上更科学、更精确、更快速地找到海洋分离物的分类地位，为海洋微生物资源的开发利用奠定基础。目前，大分子rRNA已成为一个分子指标，广泛地用于各种微生物的遗传和分子差异的研究，加上大量已知微生物的DNA都已被测定并输入国际基因数据库，成为微生物鉴定分类非常有用的参照系统，从而可以通过对未知微生物DNA序列的测定和比较分析，达到以其进行快速、有效的鉴定分类的目的。
微生物酯酶是一种重要的工业酶类，涉及到酯合成、内酯合成、酯交换、多肽合成、立体异构体的转化和拆分等催化反应，酯酶催化不需要辅酶且具有反应条件温和、方法简便、催化活性高、选择性强、产物易于分离、易于回收等优点。因此广泛应用于食品工业、医药行业、日用化工业、军事和生物防护等领域。尤其嗜热酯酶的高温反应活性，以及对有机溶剂、去污剂和变性剂的较强抗性，使它在食品、医药、制革、石油开采及废物处理等方面都有广泛的应用潜力。
国际上自九十年代初到现在，相继开发出中温酯酶、高温碱性酯酶、中温碱性酯酶等，但酯酶的酶学性质仍无法满足现代工业的需求。因此从海洋中筛选出具有独特酶学性质的海洋微生物酯酶，实为微生物酯酶开发的一大进步，并将会对酶制剂工业带来新的生机和活力。从上世纪七十年代，国外就开始对产酯酶海洋细菌进行了筛选，但未见有关海洋微生物产酯酶制备和性质方面的报道(M.Chandrasekaran，1997)。我国海洋微生物酯酶研究起步较晚，仅有杨从发等人从海水，海泥海洋生物的消化道分离到碱性酯酶产生菌(杨从发，2000)。但由于海洋微生物存在海水培养和酯酶分离纯化困难等问题，限制了海洋酯酶在制备与应用方面的进一步开发。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术存在不足。经发明人长期从事海洋微生物酶学工程的开发研究及筛选菌株的基础研究中，开发出快速、简便、准确可靠和良好经济性相结合的选育分离手段，从而提供一株高产海洋微生物酯酶的芽孢杆菌MP-2及其产生的海洋微生物酯酶。
本发明提供的高产海洋微生物酯酶的芽孢杆菌MP-2，是从渤海海底淤泥中筛选分离获得的高产海洋微生物酯酶的芽孢杆菌Bacillus sp.MP-2(简称菌株MP-2)，于2007年6月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号这CCTCC No：M207078。
本发明提供的高产海洋微生物酯酶的芽孢杆菌MP-2的形态特征：
形态特征
菌株MP-2的菌落表面光滑，红褐色，半透明，边缘整齐，有树根状隆起；细胞杆状，大小为(0.3-0.8)μm×(2.0-3.0)μm，二分裂法繁殖，以周生鞭毛运动，无荚膜，菌株革兰色染色为阳性，偶尔能观察到椭圆形的芽孢，芽孢中生，芽孢囊无明显膨大。
培养特征
严格好氧，在营养琼脂平板上中度生长，菌落平、光滑、黄灰色、无可溶性色素；假若表面潮湿可以活跃扩展，边缘不整齐。在葡萄糖琼脂平板上生长较厚，可变成皱褶。
核酸序列于说明书未页
菌株MP-2及其从GenBank等数据库中调集的相关属种构建的以16S rDNA序列为基础的系统发育树(图18)
将其与从GenBank等数据库调集的芽孢杆菌属相关菌株的16S rDNA序列进行比较。
从所构建的系统发育树可以明显看出，菌株MP-2与本属一个有效发表种地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)形成一个单独的分支，16S rDNA序列同源性达97％。该分支与其它几种芽孢杆菌聚成一群，其中菌株MP-2与B.licheniformis，B.subtilis的同源性分别为96.3％，95.0％，发育关系较近。细菌分类学家普遍认为当16S rRNA序列同源性高于97％，可以认为是属内的同种，低于93％-95％则可能为属外成员。并且该菌株与地衣芽孢杆菌的形态特征、生理生化特征没有较大差异且与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别做阴阳性对照。因此，菌株MP-2为芽孢杆菌(Bacillus sp.MP-2)。
菌株MP-2筛选自深海底泥；能在4℃-50℃生长，最适生长温度30℃；并且通过耐盐实验发现该菌株能在0％-9％NaCl培养基中生长，生长最适盐浓度为4％。因此依据海洋微生物的定义，结合本菌株的来源、低温适应性、盐耐受性，认为该菌株为海洋细菌。与陆栖细菌相比，海洋细菌普遍耐盐，最适盐度在2％-5％，可以利用耐盐度筛选真正的海洋细菌。
生理生化特性
菌株MP-2的生理生化特性，列于表1，
注：+，90-100％的菌株为阳性；-，90-100％的菌株为阴性；d，11-89％的菌株为阳性；v，在一个菌株内性质不稳定；ND，未测定。
通过对菌株MP-2形态特征、生理生化特征以及16S rDNA序列进行的多相分类研究，发现该菌株具有典型的芽孢杆菌属的形态学特征。16S rDNA序列与本属菌株序列同源性都很高，其中与本属中的地衣芽孢杆菌的序列同源性达97％，结合地衣芽孢杆菌的形态特征、生理生化特征且与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别做阴阳性对照，将菌株MP-2定为芽孢杆菌(Bacillus sp.MP-2)。
菌株MP-2的发酵培养
菌株MP-2的生长曲线
对菌株MP-2进行活化培养，培养基：葡萄糖1％，NaCl0.5％，牛肉膏1％，蛋白胨1％，每隔2h取样，在550nm处测定菌悬液的OD值，其OD曲线(即生长曲线)如图2所示。
由图2可知，菌株MP-2由接种到第4h处于延滞期，细胞的生理状态从衰退变为恢复，即将生长，细胞数目并不增加：从第4h到第6h处于加速期，这期间细胞最初的分裂已经进行，并且细胞数目开始增加；从第6h到第12h为指数生长期，此期间细胞的同化作用大于异化作用，代谢旺盛，处于积极的生长的状态，细胞成分平衡发展；从第12h到第16h细胞处于减速时期，细胞分裂后状态不变而停止生长，16h后处于稳定期，同化作用与异化作用基本保持平衡。
菌株MP-2发酵曲线
由图3可知，菌株MP-2在0～32h，酯酶活性几乎没有提高，从36h后，酯酶活力迅速上升，在56h达到最大值。
培养基组成的影响
碳源对菌株MP-2产酶的影响
根据本章基础培养基的组成，以相应碳源代替葡萄糖，按照培养方法进行活化，隔时取样，对葡萄糖、蔗糖、玉米粉、花生粕、可溶性淀粉，棉籽等碳源在不同的浓度下做单因素试验图4。
通过对碳源筛选，发现一些农副产品能够很好促进酯酶的生产。其中以花生粕效果最佳，花生粕是天然培养基成分，含有细胞所需的多种营养成分，因此对产酶提高是碳源和其它营养成分的综合作用，且价格低廉，适宜作为工业发酵的培养基原料。与之相比，培养基中仅含葡萄糖时，酯酶产量较低。根据以往文献和资料显示，葡萄糖一般是碳源中最容易利用的糖。因此以葡萄糖为碳源时，可能由于微生物很快将碳源消耗尽，且菌体密度迅速增大导致摇瓶中溶氧不足，从而导致酯酶的产量下降。因此在工业生产酯酶时，在供氧条件的前提下，可以考虑葡萄糖和花生粕共同作为微生物培养基中的碳源。通过优化配比，从而达到快速利用的碳源和缓慢利用碳源的优化组合，这样即可以迅速使微生物达到一定的生长密度，同时又保证有充足的碳源可用于酯酶的合成又不至于加剧发酵过程中的供氧负担。
氮源对菌株MP-2产酶的影响
用相应的氮源代替基础培养基中的牛肉膏在不同浓度下做无机氮源、有机氮源以及复合氮源包括蛋白陈、豆饼粉、酵母膏、牛肉膏、硫酸铵、尿素等对菌株MP-2进行产酶试验，结果见图5。
氮源作为培养基中的主要成分，用于构成菌体细胞物质(氨基酸、蛋白质、核酸等)和含氮代谢物，常用的氮源分为有机氮源和无机氮源。氮源筛选结果(图5)所示：培养基中添加有机氮源时，酯酶产量明显优于培养基中只含无机氮源情况，其中以豆饼粉与硫酸铵相组合的复合氮源效果最佳且价格低廉、来源广泛而成为理想发酵原料，与有机氮源相比，硫酸铵和尿素不适宜单独作为培养基的氮源。
无机盐对菌株MP-2产酶的影响
将常见的无机盐的代替基础培养基中的相应成分作金属离子对菌株MP-2的产酶试验，结果见图6。
由图6看出，MgSO4和KH2PO4在浓度0.05％对菌株MP-2的产酶有较大的促进作用；CaCl2对产酶几乎没有影响，但随着浓度的增加对产酶具有抑制作用；而FeSO4、ZnSO4、CuSO4、PbCl2等无机盐对产酶具有抑制作用，其中ZnSO4、PbCl2的抑制尤为明显。由此可知，浓度为0.05％的MgSO4和KH2PO4两种无机盐对产酶效果最佳。
酯类、脂肪酸脂、结构类似物及表面活性剂对菌株MP-2产酶的影响
将不同种类与数量的酯类、脂肪酸酯、结构类似物及表面活性剂添加到培养基中(详见图7)，接种培养后测定酯酶活力。
由图7分析可知，当添加0.8(v/v)的花生油和Tween-80(聚环氧乙烷失水山梨糖醇单油酸酯)时，相对酶活有所提高；添加三丁酸甘油酯、三油酸甘油酯、Tween-20(聚环氧乙烷失水山梨糖醇单月桂酸酯)时，则对产酶几乎没有影响，当添加橄榄油时，对产酶有明显的抑制作用。由此可见，添加诱导物的种类和数量对产酶有明显影响，菌株MP-2所产酶可能为诱导酶。
培养条件
初始pH对菌株MP-2产酶的影响
将pH6.0～7.5的Na2HPO4-柠檬酸，pH8～8.5甘氨酸-NaOH的缓冲液作为培养基的初始pH，接种培养后测定酯酶活力，相对酶活如图8。
由图8可知，以培养基初始pH为7.0时菌株MP-2产酶最好，相对酶活力达到最大值。
接种量对菌株MP-2产酶的影响
以3.0％，4.0％，5.0％，6.0％，7.0％和8.0％的接种量在相同的条件下培养后测其酶活，结果见图9。
由图9可知，接种量对菌株MP-2产酶影响较显著，以6.0％的接种量为最佳。
培养温度和时间对菌株MP-2产酶的影响
分别在25℃，30℃，32℃，35℃四种不同温度下，从一开始培养起每隔4h进行取样测定酶活，得出在四种不同温度及不同培养时间下的酶活变化曲线，如图10所示。
由图10可知，当反应温度较高时(30℃)，可能由于加快酶促反应，而导致整个发酵周期缩短，但同时由于温度的提高导致酯酶比较容易失活或者培养基内养分迅速消耗，从而导致酯酶发酵生产过程中的稳定期较短。当发酵温度较低时(25℃)，可能由于菌体生长缓慢，酯酶生产的达峰时间拖后，整个发酵周期延长，并且脂肪酶的产量下降。因此，过低和过高的温度对于脂肪酶的发酵生产均不适宜。因此30℃为最佳产酶温度，实验中还发现发酵时间对产酶的影响很显著，在40-48h之间，酶活达到最高。
对产酶有显著影响(P＜0.05)的因素为花生粕，豆饼粉和接种量。其中花生粕对产酶呈现出负效应，豆饼粉和接种量呈现正效应，其他因素的变化对产酶的影响不显著。由各因素效应得出，欲要提高酶活力，应提高豆饼粉浓度，延长种龄，降低花生粕浓度。当花生粕浓度在0.75～1.25％，豆饼粉浓度在2～3％，接种量浓度在5～7％之间，酯酶活力最高。当浓度过高或过低时，都会导致酯酶活力下降。菌株MP-2产酯酶发酵的最佳条件：花生粕0.9％；豆饼粉2.29％；(NH4)2SO40.2％；KH2PO40.1％；K2HPO40.1％；MgSO40.05％；Tween800.8％；花生油0.8％；pH为7.0；发酵温度30℃；种龄12h；接种量5.98％。在此条件下，优化后酶活力由258.8U/mL提高到318.2U/mL。
海洋微生物酯酶(简称酯酶)的酶学性质
海洋微生物酯酶最适作用温度
由图11可知，该酯酶在60℃时酶活性最高，在50℃到70℃之间相对酶活保持在80％之间，高于70℃或低于50℃时则酶活呈下降趋势，在4℃和100℃时相对酶活只能维持在25％。由此可知，酯酶最适作用温度范围50～70℃，在60℃表现出了最高活性，为最适作用温度。
酯酶最适作用pH
所谓酶的最适作用pH就是指酶反应速度达到最大值，并且高于或低于某一pH值，酶促反应速度都会降低。各种酶的最适pH各不相同，而且有时随着底物的不同而各异。在2.5～12范围内，向酶反应体系中分别添加相差1个单位pH的Na2HPO4-柠檬酸(pH2.5～8)，甘氨酸-NaOH缓冲液(pH8～12)，测定了酶在不同pH缓冲体系下的活性。结果如图12所示
由图12可知当pH为10时的酶相对活性最高，为酯酶的最适作用pH，但当pH2.5～9时酶活只能维持在70％以下，认为主要原因是由于pH值引起的酸碱度变化对酶-底物或酶-底物的中间物的电离情况发生变化，使酶蛋白质出现不可逆变性。就此酶而言，反应介质的pH变化影响到酯酶与底物对硝基苯磷酸酯的结合，使得曲线呈现倒“V”型，说明介质的pH变化对该酯酶酶活有很强的作用。
酯酶的热稳定性
酯酶溶于pH10的NaOH-甘氨酸的缓冲液中，置于不同温度(4～70℃)下，恒温水浴处理2h，每隔20min取样，迅速冷却，测定其残余酶活，以不经处理的酶活为100％，其余折合成剩余酶活力的百分数，结果于图13
由图13可知，在经恒温水浴处理2h后，酯酶在4～40℃酶活能保持80％以上，50～60℃酶活仍能维持在60％以上，表明该酶具有良好的热稳定性。
酯酶的pH稳定性
酯酶溶于不同pH(2～12)的缓冲液中，置于4℃下，保温48h后，再将酶液调回到最适pH10，以最适反应pH10下保温所得的酶活力为100％，其余折合成剩余酶活力的百分数，结果于图14。
从图14可以看出，酯酶置于4℃下，保温48h后，在pH 2～9酶活只能保持30％以下，而在pH10酶活性维持在70％以上，表明在pH10该酶较稳定属于碱性酶。
金属离子对酯酶活性的影响
在酯酶测活体系中加入各种金属离子，并保持测活反应体系中金属离子浓度为0.01mol/L，以缓冲液作对照于60℃、pH10测定酯酶活性，结果于图15。
由图15可知Co2+，Li+对酶具有激活作用，Ca2+对酯酶的活力没有显著影响，而Cu2+、Pb2+、Ag+、Mn2+、Zn2+、Fe3+、Ba2+、Mg2+对酯酶的活性有抑制作用。
化学试剂对酯酶的影响
酯酶溶液中加入各种化学试剂，并保持试剂的浓度为：10mmol/L SDS(十二烷基硫酸钠)、1mol/LTris(三羟甲基氨基甲烷)、10mmol/L半胱氨酸、10mmol/L EDTA、10％尿素、10％Tween-20、10％Tween-80、以缓冲液为对照于常温下静置30min，于60℃、pH10测定酯酶相对活性，结果于图16
由图16可知，SDS，EDTA，Tween-20对酯酶的抑制效果显著。此外，当酯酶溶液中加入10mmol/L的EDTA时，酯酶的活性被抑制到4.91％，由此可推测该酯酶的活性中心可能含有金属离子。金属螯合剂EDTA对耐热碱性磷酸酯酶有抑制作用。
酯酶在有机溶剂中的稳定性
酯酶溶于有机溶剂，在常温下反应4h，经过滤后挥发除去有机溶剂测其酶活，以酶的pH10的缓冲液为对照，结果于图17。
由图17可知，常见有机溶剂中除了二甲基亚砜对酶活的抑制作用显著外，其他有机溶剂对酶活几乎无影响，其中正己烷对酶活影响最小。说明此酶对常见有机溶剂的具有良好的耐受力。
酯酶对底物选择性的研究
将酯酶作用于具有不同的碳链长度、不同的饱和度及不同的分支程度的甘油三酯。取一定的酶液与1mmol/L各种酯的水溶液或乳化液混匀放入反应器中，采用氢氧化钠滴定法和分光光度计法测定酯酶活力，以p-NPP为底物的酶活为100％，其余折合成剩余酶活力的百分数结果于表2。
表2酯酶对底物的选择性
对底物的选择性是酯酶的一个重要的酶学性质对不同碳原子数的各种甘油酯的水解时发现，该酯酶的水解活力随底物中脂肪酸链长的增长而活力下降。短碳链的甘油酯如三醋酸甘油酯、三丁酸甘油酯及乙酸乙酯的相对酶活较高，分别为66.5％、45.8％和56.9％，但对长碳链的高级脂肪酸脂如18碳三油酸甘油酯不水解，众所周知，橄榄油是判断脂肪酶酶活的最佳底物之一，该酯酶对橄榄油催化活力最低，不表现出酶活，说明脂肪酶和酯酶存在底物的差异性。
通过上述对该酯酶的基本性质的研究表明：最适作用温度范围50～70℃，在60℃表现出了最高活性，属于耐热酶；当pH为10时的酶活性最高，为酯酶的最适作用pH，属于碱性酶，其pH值作用范围比较窄；酯酶在经恒温水浴处理2h后，在4～40℃酶活能保持80％以上，50～60℃酶活仍能维持在60％以上，表明该酶具有良好的热稳定性；酯酶置于4℃下，保温48h后，在pH2～9酶活只能保持30％以下，而在pH10酶活性维持在70％以上，表明在pH10该酶较稳定。
通过金属离子、化学试剂、有机溶剂对酯酶活性影响进行研究，结果表明：Co2+，Li+对酶具有激活作用，Ca2+对酯酶的活力没有显著影响，而Cu2+、Pb2+、Ag+、Mn2+、Zn2+、Fe3+、Ba2+、Mg2+对酯酶的活性有抑制作用；SDS，EDTA，非离子表面活性剂Tween-20对酯酶的抑制效果显著；常见有机溶剂中除了二甲基亚砜对酶活的抑制作用显著外，其他有机溶剂对酶活几乎无影响，其中正己烷对酶活影响最小。说明此酶对常见有机溶剂的具有良好的耐受力。
通过对该酯酶的底物选择性的研究表明：以p-NPP为底物的酶活为100％，短碳链的甘油酯如三醋酸甘油酯、三丁酸甘油酯及乙酸乙酯的相对酶活较高，分别为66.5％、45.8％和56.9％，但对长碳链的高级脂肪酸脂如18碳三油酸甘油酯和橄榄油不表现活性。说明该酯酶的水解活力随底物中脂肪酸链长的增长而活力下降。
本发明提供的高产海洋微生物酯酶的芽孢杆菌MP-2及其产生海洋微生物酯酶被广泛应用于医学、化工、食品、能源及环保等领域。
本发明提供的高产海洋微生物酯酶的芽孢杆菌MP-2，是从渤海海底淤泥中筛选分离获得的高产海洋微生物酯酶的芽孢杆菌Bacillus sp.MP-2(简称菌株MP-2)，于2007年6月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号这CCTCC No：M207078。
本发明提供的高产海洋微生物酯酶的芽孢杆菌MP-2的形态特征：
形态特征
菌株MP-2的菌落表面光滑，红褐色，半透明，边缘整齐，有树根状隆起；细胞杆状，大小为(0.3-0.8)μm×(2.0-3.0)μm，二分裂法繁殖，以周生鞭毛运动，无荚膜，菌株革兰色染色为阳性，偶尔能观察到椭圆形的芽孢，芽孢中生，芽孢囊无明显膨大。
培养特征
严格好氧，在营养琼脂平板上中度生长，菌落平、光滑、黄灰色、无可溶性色素；假若表面潮湿可以活跃扩展，边缘不整齐。在葡萄糖琼脂平板上生长较厚，可变成皱褶。
核酸序列于说明书未页
菌株MP-2及其从GenBank等数据库中调集的相关属种构建的以16S rDNA序列为基础的系统发育树(图18)
将其与从GenBank等数据库调集的芽孢杆菌属相关菌株的16S rDNA序列进行比较。
从所构建的系统发育树可以明显看出，菌株MP-2与本属一个有效发表种地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)形成一个单独的分支，16S rDNA序列同源性达97％。该分支与其它几种芽孢杆菌聚成一群，其中菌株MP-2与B.licheniformis，B.subtilis的同源性分别为96.3％，95.0％，发育关系较近。细菌分类学家普遍认为当16S rRNA序列同源性高于97％，可以认为是属内的同种，低于93％-95％则可能为属外成员。并且该菌株与地衣芽孢杆菌的形态特征、生理生化特征没有较大差异且与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别做阴阳性对照。因此，菌株MP-2为芽孢杆菌(Bacillus sp.MP-2)。
菌株MP-2筛选自深海底泥；能在4℃-50℃生长，最适生长温度30℃；并且通过耐盐实验发现该菌株能在0％-9％NaCl培养基中生长，生长最适盐浓度为4％。因此依据海洋微生物的定义，结合本菌株的来源、低温适应性、盐耐受性，认为该菌株为海洋细菌。与陆栖细菌相比，海洋细菌普遍耐盐，最适盐度在2％-5％，可以利用耐盐度筛选真正的海洋细菌。
生理生化特性
菌株MP-2的生理生化特性，列于表1，
注：+，90-100％的菌株为阳性；-，90-100％的菌株为阴性；d，11-89％的菌株为阳性；v，在一个菌株内性质不稳定；ND，未测定。
通过对菌株MP-2形态特征、生理生化特征以及16S rDNA序列进行的多相分类研究，发现该菌株具有典型的芽孢杆菌属的形态学特征。16S rDNA序列与本属菌株序列同源性都很高，其中与本属中的地衣芽孢杆菌的序列同源性达97％，结合地衣芽孢杆菌的形态特征、生理生化特征且与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别做阴阳性对照，将菌株MP-2定为芽孢杆菌(Bacillus sp.MP-2)。
菌株MP-2的发酵培养
菌株MP-2的生长曲线
对菌株MP-2进行活化培养，培养基：葡萄糖1％，NaCl0.5％，牛肉膏1％，蛋白胨1％，每隔2h取样，在550nm处测定菌悬液的OD值，其OD曲线(即生长曲线)如图2所示。
由图2可知，菌株MP-2由接种到第4h处于延滞期，细胞的生理状态从衰退变为恢复，即将生长，细胞数目并不增加：从第4h到第6h处于加速期，这期间细胞最初的分裂已经进行，并且细胞数目开始增加；从第6h到第12h为指数生长期，此期间细胞的同化作用大于异化作用，代谢旺盛，处于积极的生长的状态，细胞成分平衡发展；从第12h到第16h细胞处于减速时期，细胞分裂后状态不变而停止生长，16h后处于稳定期，同化作用与异化作用基本保持平衡。
菌株MP-2发酵曲线
由图3可知，菌株MP-2在0～32h，酯酶活性几乎没有提高，从36h后，酯酶活力迅速上升，在56h达到最大值。
培养基组成的影响
碳源对菌株MP-2产酶的影响
根据本章基础培养基的组成，以相应碳源代替葡萄糖，按照培养方法进行活化，隔时取样，对葡萄糖、蔗糖、玉米粉、花生粕、可溶性淀粉，棉籽等碳源在不同的浓度下做单因素试验图4。
通过对碳源筛选，发现一些农副产品能够很好促进酯酶的生产。其中以花生粕效果最佳，花生粕是天然培养基成分，含有细胞所需的多种营养成分，因此对产酶提高是碳源和其它营养成分的综合作用，且价格低廉，适宜作为工业发酵的培养基原料。与之相比，培养基中仅含葡萄糖时，酯酶产量较低。根据以往文献和资料显示，葡萄糖一般是碳源中最容易利用的糖。因此以葡萄糖为碳源时，可能由于微生物很快将碳源消耗尽，且菌体密度迅速增大导致摇瓶中溶氧不足，从而导致酯酶的产量下降。因此在工业生产酯酶时，在供氧条件的前提下，可以考虑葡萄糖和花生粕共同作为微生物培养基中的碳源。通过优化配比，从而达到快速利用的碳源和缓慢利用碳源的优化组合，这样即可以迅速使微生物达到一定的生长密度，同时又保证有充足的碳源可用于酯酶的合成又不至于加剧发酵过程中的供氧负担。
氮源对菌株MP-2产酶的影响
用相应的氮源代替基础培养基中的牛肉膏在不同浓度下做无机氮源、有机氮源以及复合氮源包括蛋白陈、豆饼粉、酵母膏、牛肉膏、硫酸铵、尿素等对菌株MP-2进行产酶试验，结果见图5。
氮源作为培养基中的主要成分，用于构成菌体细胞物质(氨基酸、蛋白质、核酸等)和含氮代谢物，常用的氮源分为有机氮源和无机氮源。氮源筛选结果(图5)所示：培养基中添加有机氮源时，酯酶产量明显优于培养基中只含无机氮源情况，其中以豆饼粉与硫酸铵相组合的复合氮源效果最佳且价格低廉、来源广泛而成为理想发酵原料，与有机氮源相比，硫酸铵和尿素不适宜单独作为培养基的氮源。
无机盐对菌株MP-2产酶的影响
将常见的无机盐的代替基础培养基中的相应成分作金属离子对菌株MP-2的产酶试验，结果见图6。
由图6看出，MgSO4和KH2PO4在浓度0.05％对菌株MP-2的产酶有较大的促进作用；CaCl2对产酶几乎没有影响，但随着浓度的增加对产酶具有抑制作用；而FeSO4、ZnSO4、CuSO4、PbCl2等无机盐对产酶具有抑制作用，其中ZnSO4、PbCl2的抑制尤为明显。由此可知，浓度为0.05％的MgSO4和KH2PO4两种无机盐对产酶效果最佳。
酯类、脂肪酸脂、结构类似物及表面活性剂对菌株MP-2产酶的影响
将不同种类与数量的酯类、脂肪酸酯、结构类似物及表面活性剂添加到培养基中(详见图7)，接种培养后测定酯酶活力。
由图7分析可知，当添加0.8(v/v)的花生油和Tween-80(聚环氧乙烷失水山梨糖醇单油酸酯)时，相对酶活有所提高；添加三丁酸甘油酯、三油酸甘油酯、Tween-20(聚环氧乙烷失水山梨糖醇单月桂酸酯)时，则对产酶几乎没有影响，当添加橄榄油时，对产酶有明显的抑制作用。由此可见，添加诱导物的种类和数量对产酶有明显影响，菌株MP-2所产酶可能为诱导酶。
培养条件
初始pH对菌株MP-2产酶的影响
将pH6.0～7.5的Na2HPO4-柠檬酸，pH8～8.5甘氨酸-NaOH的缓冲液作为培养基的初始pH，接种培养后测定酯酶活力，相对酶活如图8。
由图8可知，以培养基初始pH为7.0时菌株MP-2产酶最好，相对酶活力达到最大值。
接种量对菌株MP-2产酶的影响
以3.0％，4.0％，5.0％，6.0％，7.0％和8.0％的接种量在相同的条件下培养后测其酶活，结果见图9。
由图9可知，接种量对菌株MP-2产酶影响较显著，以6.0％的接种量为最佳。
培养温度和时间对菌株MP-2产酶的影响
分别在25℃，30℃，32℃，35℃四种不同温度下，从一开始培养起每隔4h进行取样测定酶活，得出在四种不同温度及不同培养时间下的酶活变化曲线，如图10所示。
由图10可知，当反应温度较高时(30℃)，可能由于加快酶促反应，而导致整个发酵周期缩短，但同时由于温度的提高导致酯酶比较容易失活或者培养基内养分迅速消耗，从而导致酯酶发酵生产过程中的稳定期较短。当发酵温度较低时(25℃)，可能由于菌体生长缓慢，酯酶生产的达峰时间拖后，整个发酵周期延长，并且脂肪酶的产量下降。因此，过低和过高的温度对于脂肪酶的发酵生产均不适宜。因此30℃为最佳产酶温度，实验中还发现发酵时间对产酶的影响很显著，在40-48h之间，酶活达到最高。
对产酶有显著影响(P＜0.05)的因素为花生粕，豆饼粉和接种量。其中花生粕对产酶呈现出负效应，豆饼粉和接种量呈现正效应，其他因素的变化对产酶的影响不显著。由各因素效应得出，欲要提高酶活力，应提高豆饼粉浓度，延长种龄，降低花生粕浓度。当花生粕浓度在0.75～1.25％，豆饼粉浓度在2～3％，接种量浓度在5～7％之间，酯酶活力最高。当浓度过高或过低时，都会导致酯酶活力下降。菌株MP-2产酯酶发酵的最佳条件：花生粕0.9％；豆饼粉2.29％；(NH4)2SO40.2％；KH2PO40.1％；K2HPO40.1％；MgSO40.05％；Tween800.8％；花生油0.8％；pH为7.0；发酵温度30℃；种龄12h；接种量5.98％。在此条件下，优化后酶活力由258.8U/mL提高到318.2U/mL。
海洋微生物酯酶(简称酯酶)的酶学性质
海洋微生物酯酶最适作用温度
由图11可知，该酯酶在60℃时酶活性最高，在50℃到70℃之间相对酶活保持在80％之间，高于70℃或低于50℃时则酶活呈下降趋势，在4℃和100℃时相对酶活只能维持在25％。由此可知，酯酶最适作用温度范围50～70℃，在60℃表现出了最高活性，为最适作用温度。
酯酶最适作用pH
所谓酶的最适作用pH就是指酶反应速度达到最大值，并且高于或低于某一pH值，酶促反应速度都会降低。各种酶的最适pH各不相同，而且有时随着底物的不同而各异。在2.5～12范围内，向酶反应体系中分别添加相差1个单位pH的Na2HPO4-柠檬酸(pH2.5～8)，甘氨酸-NaOH缓冲液(pH8～12)，测定了酶在不同pH缓冲体系下的活性。结果如图12所示
由图12可知当pH为10时的酶相对活性最高，为酯酶的最适作用pH，但当pH2.5～9时酶活只能维持在70％以下，认为主要原因是由于pH值引起的酸碱度变化对酶-底物或酶-底物的中间物的电离情况发生变化，使酶蛋白质出现不可逆变性。就此酶而言，反应介质的pH变化影响到酯酶与底物对硝基苯磷酸酯的结合，使得曲线呈现倒“V”型，说明介质的pH变化对该酯酶酶活有很强的作用。
酯酶的热稳定性
酯酶溶于pH10的NaOH-甘氨酸的缓冲液中，置于不同温度(4～70℃)下，恒温水浴处理2h，每隔20min取样，迅速冷却，测定其残余酶活，以不经处理的酶活为100％，其余折合成剩余酶活力的百分数，结果于图13
由图13可知，在经恒温水浴处理2h后，酯酶在4～40℃酶活能保持80％以上，50～60℃酶活仍能维持在60％以上，表明该酶具有良好的热稳定性。
酯酶的pH稳定性
酯酶溶于不同pH(2～12)的缓冲液中，置于4℃下，保温48h后，再将酶液调回到最适pH10，以最适反应pH10下保温所得的酶活力为100％，其余折合成剩余酶活力的百分数，结果于图14。
从图14可以看出，酯酶置于4℃下，保温48h后，在pH 2～9酶活只能保持30％以下，而在pH10酶活性维持在70％以上，表明在pH10该酶较稳定属于碱性酶。
金属离子对酯酶活性的影响
在酯酶测活体系中加入各种金属离子，并保持测活反应体系中金属离子浓度为0.01mol/L，以缓冲液作对照于60℃、pH10测定酯酶活性，结果于图15。
由图15可知Co2+，Li+对酶具有激活作用，Ca2+对酯酶的活力没有显著影响，而Cu2+、Pb2+、Ag+、Mn2+、Zn2+、Fe3+、Ba2+、Mg2+对酯酶的活性有抑制作用。
化学试剂对酯酶的影响
酯酶溶液中加入各种化学试剂，并保持试剂的浓度为：10mmol/L SDS(十二烷基硫酸钠)、1mol/LTris(三羟甲基氨基甲烷)、10mmol/L半胱氨酸、10mmol/L EDTA、10％尿素、10％Tween-20、10％Tween-80、以缓冲液为对照于常温下静置30min，于60℃、pH10测定酯酶相对活性，结果于图16
由图16可知，SDS，EDTA，Tween-20对酯酶的抑制效果显著。此外，当酯酶溶液中加入10mmol/L的EDTA时，酯酶的活性被抑制到4.91％，由此可推测该酯酶的活性中心可能含有金属离子。金属螯合剂EDTA对耐热碱性磷酸酯酶有抑制作用。
酯酶在有机溶剂中的稳定性
酯酶溶于有机溶剂，在常温下反应4h，经过滤后挥发除去有机溶剂测其酶活，以酶的pH10的缓冲液为对照，结果于图17。
由图17可知，常见有机溶剂中除了二甲基亚砜对酶活的抑制作用显著外，其他有机溶剂对酶活几乎无影响，其中正己烷对酶活影响最小。说明此酶对常见有机溶剂的具有良好的耐受力。
酯酶对底物选择性的研究
将酯酶作用于具有不同的碳链长度、不同的饱和度及不同的分支程度的甘油三酯。取一定的酶液与1mmol/L各种酯的水溶液或乳化液混匀放入反应器中，采用氢氧化钠滴定法和分光光度计法测定酯酶活力，以p-NPP为底物的酶活为100％，其余折合成剩余酶活力的百分数结果于表2。
表2酯酶对底物的选择性
对底物的选择性是酯酶的一个重要的酶学性质对不同碳原子数的各种甘油酯的水解时发现，该酯酶的水解活力随底物中脂肪酸链长的增长而活力下降。短碳链的甘油酯如三醋酸甘油酯、三丁酸甘油酯及乙酸乙酯的相对酶活较高，分别为66.5％、45.8％和56.9％，但对长碳链的高级脂肪酸脂如18碳三油酸甘油酯不水解，众所周知，橄榄油是判断脂肪酶酶活的最佳底物之一，该酯酶对橄榄油催化活力最低，不表现出酶活，说明脂肪酶和酯酶存在底物的差异性。
通过上述对该酯酶的基本性质的研究表明：最适作用温度范围50～70℃，在60℃表现出了最高活性，属于耐热酶；当pH为10时的酶活性最高，为酯酶的最适作用pH，属于碱性酶，其pH值作用范围比较窄；酯酶在经恒温水浴处理2h后，在4～40℃酶活能保持80％以上，50～60℃酶活仍能维持在60％以上，表明该酶具有良好的热稳定性；酯酶置于4℃下，保温48h后，在pH2～9酶活只能保持30％以下，而在pH10酶活性维持在70％以上，表明在pH10该酶较稳定。
通过金属离子、化学试剂、有机溶剂对酯酶活性影响进行研究，结果表明：Co2+，Li+对酶具有激活作用，Ca2+对酯酶的活力没有显著影响，而Cu2+、Pb2+、Ag+、Mn2+、Zn2+、Fe3+、Ba2+、Mg2+对酯酶的活性有抑制作用；SDS，EDTA，非离子表面活性剂Tween-20对酯酶的抑制效果显著；常见有机溶剂中除了二甲基亚砜对酶活的抑制作用显著外，其他有机溶剂对酶活几乎无影响，其中正己烷对酶活影响最小。说明此酶对常见有机溶剂的具有良好的耐受力。
通过对该酯酶的底物选择性的研究表明：以p-NPP为底物的酶活为100％，短碳链的甘油酯如三醋酸甘油酯、三丁酸甘油酯及乙酸乙酯的相对酶活较高，分别为66.5％、45.8％和56.9％，但对长碳链的高级脂肪酸脂如18碳三油酸甘油酯和橄榄油不表现活性。说明该酯酶的水解活力随底物中脂肪酸链长的增长而活力下降。
本发明提供的高产海洋微生物酯酶的芽孢杆菌MP-2及其产生海洋微生物酯酶被广泛应用于医学、化工、食品、能源及环保等领域。
附图说明
图1为菌株MP-2的电镜照片(3000×)
图2为菌株MP-2的生长曲线
图3为菌株MP-2的发酵曲线
图4为碳源对酯酶产量的影响(图示：1.葡萄糖2.蔗糖3.玉米粉4.花生粕5.可溶性淀粉6.棉籽饼粉)
图5为氮源对酯酶产量的影响(图示：1.蛋白胨2.豆饼粉+硫酸铵3.酵母膏4.牛肉膏5.豆饼粉6.硫酸铵7.尿素)
图6为无机盐对酯酶产量的影响(图示：1.空白对照2.氯化钙3.硫酸镁4.磷酸二氢钾5.硫酸铁6.硫酸铜7.氯化钡8.硫酸锌9.氯化铅)
图7为酯类、脂肪酸、结构类似物及表面活性剂对酯酶产量的影响(图示：1.空白对照2.花生油3.玉米油4.豆油5.葵花油6.橄榄油7.吐温-808.吐温-209.三丁酸甘油酯10.三油酸甘油酯)
图8为初始PH对酯酶产量的影响
图9为接种量对酯酶产量的影响
图10为温度对酯酶产量的影响
图11为温度对酯酶活力的影响
图12为PH对酯酶活力的影响
图13为酯酶的热稳定性
图14为酯酶的PH稳定性
图15为金属离子对酯酶活力的影响
图16为化学试剂对酯酶活力的影响
图17为酯酶在机溶剂中的稳定性
图18为菌株MP-2及其从GenBank等数据库中调集的相关属种构建的以16S rDNA序列为基础的系统发育树
图2为菌株MP-2的生长曲线
图3为菌株MP-2的发酵曲线
图4为碳源对酯酶产量的影响(图示：1.葡萄糖2.蔗糖3.玉米粉4.花生粕5.可溶性淀粉6.棉籽饼粉)
图5为氮源对酯酶产量的影响(图示：1.蛋白胨2.豆饼粉+硫酸铵3.酵母膏4.牛肉膏5.豆饼粉6.硫酸铵7.尿素)
图6为无机盐对酯酶产量的影响(图示：1.空白对照2.氯化钙3.硫酸镁4.磷酸二氢钾5.硫酸铁6.硫酸铜7.氯化钡8.硫酸锌9.氯化铅)
图7为酯类、脂肪酸、结构类似物及表面活性剂对酯酶产量的影响(图示：1.空白对照2.花生油3.玉米油4.豆油5.葵花油6.橄榄油7.吐温-808.吐温-209.三丁酸甘油酯10.三油酸甘油酯)
图8为初始PH对酯酶产量的影响
图9为接种量对酯酶产量的影响
图10为温度对酯酶产量的影响
图11为温度对酯酶活力的影响
图12为PH对酯酶活力的影响
图13为酯酶的热稳定性
图14为酯酶的PH稳定性
图15为金属离子对酯酶活力的影响
图16为化学试剂对酯酶活力的影响
图17为酯酶在机溶剂中的稳定性
图18为菌株MP-2及其从GenBank等数据库中调集的相关属种构建的以16S rDNA序列为基础的系统发育树
具体实施方式
本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例
实施例1
初选
将渤海海域底泥1克加入装有20mL无菌水的250mL三角瓶中(内放数十粒玻璃珠)，振荡均匀后用移液管吸5mL悬浮液加入盛有25mL富集培养基的250mL三角瓶中，在30℃下，200r/min摇瓶发酵培养。筛选细菌富集48h，霉菌富集96h，再移取5mL培养液至另一盛有新鲜培养基的三角瓶中继续培养。如此重复3次，然后进行平板稀释分离。
培养基的组成：葡萄糖1.0；牛肉膏1.0；蛋白胨1.0；NaCl0.5；调pH至7.0。初筛平板培养基的组成：初筛细菌培养基+三醋酸甘油酯1.0(V/V)(均经细菌过滤器除菌后加入)+琼脂2.0。
富集过的培养液涂布在初筛平板上，放入恒温培养箱中，30℃培养，相隔24h定期的观察结果。采用涂布法操作，将具有变色透明圈的菌落选出，细菌挑至细菌斜面培养基上保存，
摇瓶发酵培养
将初筛的菌株接入装有25mL复筛培养基的三角瓶中，在30℃下，200r/min，进行液体摇瓶发酵培养。细菌培养36h，霉菌培养72h。在4℃下，15000r/min离心培养后的发酵液，得上清液即为粗酶液。发酵培养基为葡萄糖1.0；牛肉膏1.0；蛋白胨1.0；NaCl0.5；调pH至7.0。
将上述发酵培养液打孔注入装有溴甲酚紫的检测培养基平板中，于30℃恒温培养箱中反应，以p-Npp(对硝基苯棕榈酸酯)为底物进行测活，筛选到一株高产海洋微生物酯酶的菌株MP-2，酶活达218.6u/ml。经鉴定为芽孢杆菌Bacillus sp.MP-2。
实施例2
将菌株MP-2通过三角瓶摇床中发酵培养，发酵温度30℃，种龄12h，接种量5.98％，
发酵培养基：花生粕0.9％；豆饼粉2.29％；(NH4)2SO40.2％；KH2PO40.1％；K2HPO40.1％；MgSO40.05％；Tween-800.8％；花生油0.8％；pH为7.0。
发酵培养后酶活力高达318.2u/ml。
序列表
<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所
<120>一种高产海洋微生物酯酶的芽孢杆菌MP-2及其产生的海洋微生物酯酶
<160>1
<210>1
<211>1417
<212>DNA
<213>芽孢杆菌(Bacillus sp.MP-2)
<400>1
5’-tgcgtgtcga gcggactgat gggagcttgg tccctgatgt tgtcggcggt cggttgagta 60
acacgtgtat aacctgcctg gaagactggt ataactccgg gaaaccggcg ctaataccgg 120
atgcttgatt gaaccgcatg gttcaattat aaaaggtggc ttttagctac cacttacaga 180
tggacccgcg gcgcattatc tagctgctca gttcggctca ccaaggcgac gatgcgtatc 240
cgacctgaga gggtgatcag tctcaatgtc attgacacct tccccagact cctacgggag 300
gcagcactta ggaatcttcc gcaatggatg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg 360
atgaaggttt tcggatcgta caactctgtt gttaaggaag aacatgtacc gttcgaatat 420
ctgggtacct tgacggtacc taatctcaaa gcctgggcta actacgtgcc agcagccgcg 480
gtaatacgta ggtggtcaag cgttgtcccg gaattattgg gcgtaaagcg cgcgcaggcg 540
gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaacccgg ggagggtcat tggaaactgg 600
ggaacttgag tgcagaagag gagagtggaa ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga 660
tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact ctctggtctg taactgacgc tgaggcgcga 720
aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc 780
taagtgttag agggtttccg ccctttagtg ctgcagcaaa cgcattaagc actccgcctg 840
gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg 900
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aaccctagag atagggcttc cccttcgggg gcagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt 1020
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acccgaagtc ggtgaggtaa cctttgagcc agccgct 1417
实施例1
初选
将渤海海域底泥1克加入装有20mL无菌水的250mL三角瓶中(内放数十粒玻璃珠)，振荡均匀后用移液管吸5mL悬浮液加入盛有25mL富集培养基的250mL三角瓶中，在30℃下，200r/min摇瓶发酵培养。筛选细菌富集48h，霉菌富集96h，再移取5mL培养液至另一盛有新鲜培养基的三角瓶中继续培养。如此重复3次，然后进行平板稀释分离。
培养基的组成：葡萄糖1.0；牛肉膏1.0；蛋白胨1.0；NaCl0.5；调pH至7.0。初筛平板培养基的组成：初筛细菌培养基+三醋酸甘油酯1.0(V/V)(均经细菌过滤器除菌后加入)+琼脂2.0。
富集过的培养液涂布在初筛平板上，放入恒温培养箱中，30℃培养，相隔24h定期的观察结果。采用涂布法操作，将具有变色透明圈的菌落选出，细菌挑至细菌斜面培养基上保存，
摇瓶发酵培养
将初筛的菌株接入装有25mL复筛培养基的三角瓶中，在30℃下，200r/min，进行液体摇瓶发酵培养。细菌培养36h，霉菌培养72h。在4℃下，15000r/min离心培养后的发酵液，得上清液即为粗酶液。发酵培养基为葡萄糖1.0；牛肉膏1.0；蛋白胨1.0；NaCl0.5；调pH至7.0。
将上述发酵培养液打孔注入装有溴甲酚紫的检测培养基平板中，于30℃恒温培养箱中反应，以p-Npp(对硝基苯棕榈酸酯)为底物进行测活，筛选到一株高产海洋微生物酯酶的菌株MP-2，酶活达218.6u/ml。经鉴定为芽孢杆菌Bacillus sp.MP-2。
实施例2
将菌株MP-2通过三角瓶摇床中发酵培养，发酵温度30℃，种龄12h，接种量5.98％，
发酵培养基：花生粕0.9％；豆饼粉2.29％；(NH4)2SO40.2％；KH2PO40.1％；K2HPO40.1％；MgSO40.05％；Tween-800.8％；花生油0.8％；pH为7.0。
发酵培养后酶活力高达318.2u/ml。
序列表
<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所
<120>一种高产海洋微生物酯酶的芽孢杆菌MP-2及其产生的海洋微生物酯酶
<160>1
<210>1
<211>1417
<212>DNA
<213>芽孢杆菌(Bacillus sp.MP-2)
<400>1
5’-tgcgtgtcga gcggactgat gggagcttgg tccctgatgt tgtcggcggt cggttgagta 60
acacgtgtat aacctgcctg gaagactggt ataactccgg gaaaccggcg ctaataccgg 120
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gcagcactta ggaatcttcc gcaatggatg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg 360
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