用于治疗神经退行性障碍特别是阿尔茨海默病或精神分裂症的含钨盐（VI）的药物组合物

摘要

本发明涉及用于治疗神经退行性障碍的药物组合物，包含有效量的钨(VI)化合物，优选钨酸盐，和更优选钨酸钠(Na2WO4)。本发明的药物组合物可用于预防性和/或治疗性治疗哺乳动物(包括人)的神经退行性障碍，且特别是在预防性和/或治疗性治疗阿尔茨海默症和精神分裂症。评估了在胰岛素抵抗大鼠模型和I型糖尿病模型中钨酸钠二水合物对tau磷酸化的影响。来自本发明的Tau相关疾病的治疗性治疗包括几个优点：GSK3抑制；特异性，因为它降低神经特异蛋白引起的tau的异常高度磷酸化；有效；缺乏毒性；以及低价格。

权利要求

1.药学可接受的阳离子部分的钨酸盐或所述盐的水合物在制备用于预防性和/或治疗性治疗哺乳动物的由GSK3介导的神经退行性障碍的口服组合物中的用途。

2.根据权利要求1的用途，其中所述由GSK3介导的神经退行性障碍是tau相关疾病。

3.根据权利要求2的用途，其中所述tau相关疾病选自阿尔茨海默症，具有与染色体

17相连的震颤性麻痹的额颞叶痴呆症、进行性核上瘫痪、肌萎缩性脊髓侧索硬化/关岛震颤麻痹痴呆综合征、皮克氏病、皮质基底节变性和嗜银颗粒病。

4.根据权利要求3的用途，其中所述tau相关疾病是阿尔茨海默症。

5.根据权利要求1的用途，其中所述由GSK3介导的神经退行性障碍是精神分裂症。

6.根据权利要求1的用途，其中所述阳离子部分选自钠、钾、镁和钙阳离子。

7.根据权利要求6的用途，其中所述药学可接受的阳离子部分的钨酸盐是钨酸钠。

8.根据权利要求7的用途，其中所述药学可接受的阳离子部分的钨酸盐是钨酸钠且所述水合物是二水合物。

9.根据权利要求1的用途，其中所述哺乳动物是人。

说明书

用于治疗神经退行性障碍特别是阿尔茨海默病或精神分裂

症的含钨盐(VI)的药物组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及包含钨(VI)化合物的药物组合物的用途，用于治疗神经退行性障碍，特别是阿尔茨海默症和其他微管相关疾病(即涉及脑中异常微管相关蛋白异形体沉积的神经退行性障碍)，以及精神分裂症。

背景技术

[0002] 神经退行性障碍可以被定义为影响神经病学和行为功能的神经系统的慢性和进行性障碍，其始于特殊的生物化学变化，这些变化最终导致独特的组织病理学和临床综合征。这些障碍中有阿尔茨海默症、亨廷顿舞蹈病和帕金森病。

[0003] 阿尔茨海默症是老年人中痴呆的最常见形式，其涉及控制思想、记忆和语言的大脑部分。其特征在于，除了特定的脑区域中神经元细胞损失之外的两个主要的病理标记：淀粉样斑块和神经原纤维缠结(NFT)。β-淀粉样蛋白是从称为淀粉样先驱蛋白(APP)剪切下来的一个蛋白片断。在健康的大脑中，这些蛋白片断被分解并消除。在阿尔茨海默症中，β-淀粉样蛋白聚集形成硬的不溶斑块(称为淀粉样斑块)。NFTs由不溶的缠结的纤维组成，该纤维在脑细胞内部发现。他们主要由称为tau的神经元特异蛋白组成，tau形成称为微管的部分亚细胞结构。微管是细胞的细胞骨架的成分之一且涉及几个功能例如胞内运输和不对称的产生。在健康状态时，tau蛋白的主要功能是稳定微管。在阿尔茨海默症及其他tau相关疾病中，tau蛋白表现出一些生物化学异常，其中高度磷酸化是最明显的。结果tau蛋白聚集，微管变得不稳定，随之神经元的功能被削弱。

[0004] 蛋白磷酸化是细胞用来调节酶和结构蛋白的翻译后调节机制。tau蛋白在苏氨酸和丝氨酸位点的磷酸化和去磷酸化由几种蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶控制。tau磷酸化蛋白激酶之一是糖原合成酶激酶-3(GSK3)。GSK3是涉及tau蛋白异常高度磷酸化过程的主要酶，并且在阿尔茨海默症患者以及其他tau相关疾病患者脑中过度表达。推测tau蛋白磷酸化的药理学抑制剂，特别是选择性GSK3抑制剂能够用于治疗阿尔茨海默症和其他神经退行性疾病。

[0005] 已知几种GSK3抑制剂，但是已知抑制剂的毒性相关副作用和关于其吸收、分布、代谢和排泄的担忧影响其临床潜力(参考，“Pharmacological inhibitors of glycogen synthase kinase3”，Laurent Meijer等人，Trends in Pharmacological Sciences2004，vol.25，No.9，pp.471-480)。

[0006] 在不干扰其他细胞信号通路的情况下该激酶的选择性抑制剂的可用性(即指抑制剂没有不利的作用)、通过血脑屏障的能力、和在体内的效价是研发用于有效治疗阿尔茨海默症和其他tau相关疾病的GSK3抑制剂的一些最重要关键。

[0007] GSK3活性调节的变化也与精神分裂症有关(参考，E.S：Emamian等人，Nat.Gene t.，2004，vo1.36，pp.131-7)。根据J.A.Lieberman，精神分裂症无疑满足定义神经退行性障碍的许多标准(cf.J.A.Lieberman，Biological Psychiatry，1999，vol.46，pp.729-739)。已经报导了精神分裂症的进行过程与正在进行的神经退行性过程相关的直接和间接证据(参考，P.C.Ashe等人，Prog.Neuro-Biol.Psychiat.&Biol.Psychiat 2001，vol.25，pp.691-707)。

[0008] 尽管过去投入的所有研究努力，神经退行性障碍例如阿尔茨海默症或精神分裂的治疗和/或预防仍然远远不能令人满意。因此，提供用于治疗人类与tau磷酸化相关的神经系统中的病理变化(例如，阿尔茨海默症和其他tau相关疾病)，以及用于治疗人精神分裂症的化合物是非常重要的。

[0009] 发明概述

[0010] 发明人发现，钨(VI)化合物在细胞培养体系及体内抑制神经细胞中的GSK3。所述抑制的主要结果是微管相关蛋白tau的GSK 3-依赖性磷酸化的显著降低。因此，假设钨(VI)化合物使得GSK3失活，这些化合物的用途代表了治疗阿尔茨海默症和其他tau相关疾病，以及治疗精神分裂症的一种新的治疗方法。

[0011] 在几种动物模型中，钨酸钠是一种抗糖尿病和抗肥胖剂。这种化合物显示了低毒性特征并已经完成了I期临床试验。EP1.400.246-A描述了钨(VI)化合物的药物组合物用于降低患有I型(IDDM)或II型(NIDDM)糖尿病人的血糖过多。EP755.681-A教导钨(VI)化合物对治疗非糖尿病人的肥胖/超重也是有效的化合物。然而钨(VI)化合物从未被建议用于治疗阿尔茨海默症或任何tau相关疾病、或精神分裂症。

[0012] 根据本发明的一个方面，提供一种药物组合物，该药物组合物用于预防性和/或治疗性治疗哺乳动物(包括人)的神经退行性障碍，例如精神分裂症或tau相关疾病，例如阿尔茨海默症，具有与染色体17相连的震颤性麻痹的额颞叶痴呆症(frontotemporal dementia)、进行性核上瘫痪(progressive supranuclear palsy)、肌萎缩性脊髓侧索硬化/关岛震颤麻痹痴呆综合征(amyotrophic lateralsclerosis/parkinsonism-dementia complex of Guam)、皮克氏病(Pick’sdisease)、皮质基底节变性(Corticobasal degeneration)、和嗜银颗粒病(Argyrophilic grain disease)，所述组合物包含有效量的由钨(VI)和药学可接受化学部分形成的化合物，或所述化合物的溶剂化物，与药学可接受赋形剂或载体组合。

[0013] 在本发明的上下文中，表述“由钨(VI)和药学可接受化学部分形成的化合物”意指包括由一个或几个6+氧化态的钨原子连接到一个自身是药学可接受的化学结构形成的6+
任何化学实体。阳离子W 既不能被观察到也不能被分离，且它总是伴随着由W(VI)原子周围的配位层部分形成的化学部分出现。配位层可以由无机配体形成(氧化物、氢氧化物、过氧化物、磷酸盐等)如，例如在钨酸根阴离子的情况下(配位层由四个氧离子形成)，或在过氧化钨酸盐情况下(配位层由氧离子和过氧离子的混合物形成)。配位层也可以由有机配体形成，有机配体是通过属于不同的药学可接受有机化合物(例如，药学可接受的醇、硫醇、羧酸、胺、氨基酸、含N杂环等)的O、S、或N原子与W(VI)原子连接的分子或离子。混合的无机/有机配位层也是可能的。当由W(VI)原子和其配位层形成的结构不是中性的，术语“化学部分”也包括使整个钨(VI)化合物变成中性的任何药学可接受的离子种类。例如，钨酸根阴离子总是陪衬着阳离子(例如钠、钾、镁、钙)来形成中性的钨酸盐。钨酸离子导致一系列的聚集程度不同的同多钨酸盐(仲钨酸盐、偏钨酸盐等)。在本发明中也考虑了他们的用途。钨(VI)化合物的溶剂化物是很常见的(例如钨酸钠的二水合物)。

[0014] 在优选的实施方案中，在药物组合物中的钨(VI)化合物是钨酸盐。特别优选的是所述盐的阳离子部分选自钠、钾、镁和钙阳离子。最优选的钨(VI)化合物是钨酸钠(Na2WO4)和其二水合物。后者可商购获得。钨酸钠二水合物是具有精细和晶体材质的白色无味的盐，其易溶于水。

[0015] 所述产品可以通过任何方便的口服递送系统施用，片剂是优选的一种形式。所述系统已经用于注册了所述化合物治疗非糖尿病人的肥胖/超重的I期临床试验的人(EP755.681-A)。

[0016] 本发明的另一个方面涉及由钨(VI)和药学可接受化学部分形成的化合物，或所述化合物的溶剂化物在制备用于预防性和/或治疗性治疗哺乳动物(包括人)的神经退行性障碍的用途。在一个具体的实施方案中，神经退行性障碍是tau相关疾病，例如阿尔茨海默症，具有与染色体17相连的震颤性麻痹的额颞叶痴呆症、进行性核上瘫痪、肌萎缩性脊髓侧索硬化/关岛震颤麻痹痴呆综合征、皮克氏病、皮质基底节变性、和嗜银颗粒病。在另一个具体的实施方案中神经退行性障碍是精神分裂症。

[0017] 本发明也涉及治疗和/或预防遭受或易受神经退行性障碍(如上文所提到的那些，特别是阿尔茨海默症或精神分裂症)的哺乳动物(包括人)的方法，所述方法包括给所述患者施用治疗有效量的由钨(VI)和药学可接受化学部分形成的化合物或所述化合物的溶剂化物(包括水合物)，连同药学可接受稀释剂或载体。

[0018] 来自本发明的tau相关疾病治疗性治疗与现有技术先前所提到的治疗相比是一种新的方法，它涉及几个显著的优点：它靶向GSK3；特异性，它降低神经特异蛋白tau的异常高度磷酸化；效能，它在短期内发生作用；缺乏毒性，I期临床试验已经完成；以及低价格。

[0019] 本发明的其他目的、优点和特点在阅读本说明书后对本领域的技术人员来说是显而易见的，或者可以通过本发明的实践获知。贯穿本说明书和权利要求的词“包含”和该词的变化形式，并不意指排出其他技术特点、添加剂、成分、或步骤。本申请摘要中的公开在此作为参考引入。下面的实施例和附图通过描述方式提供，且他们并不意指限制本发明。

附图说明

[0020] 图1绘图描述了钨酸盐对SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞GSK3-β和tau磷酸化的影响。

[0021] 图2绘图描述了钨酸盐对健康和胰岛素抵抗的大鼠脑中tau磷酸化的影响。

[0022] 图3绘图描述了钨酸盐对从STZ-糖尿病大鼠获得的脑中tau磷酸化的影响。

[0023] 具体实施方案的详细说明

[0024] 附图的详细说明

[0025] 结果部分在附图中绘图给出：

[0026] 在图1中显示了钨酸盐(W)对SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞中GSK3-β和tau磷酸化的影响。数据为3个独立实验的平均值且误差条表示标准偏差。A)在存在(+)或不存在(-)1mM钨酸钠下培育SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞10分钟，然后通过免疫印迹采用抗体探测其蛋白提取物，该抗体识别在Ser-9被磷酸化的GSK3-β和总的GSK3-β。GSK3-β在Ser-9的磷酸化导致其失活(D.A：Cross等人，Nature，vol.378，pp.785-789)。该图显示了Ser-9磷酸化的GSK3-β(GSK3-β-pS9)和GSK3-β总量之间的比例。B)SH-SY5Y细胞在增加的钨酸盐浓度下培育，tau磷酸化程度采用tau-1抗体通过免疫印迹确定，tau-1抗体识别当丝氨酸198、199或202处于非磷酸化形式时的tau。该图显示了非磷酸化tau(tau1)和tau总量(7.51)之间的比例。C)在存在(+)或不存在(-)1mM钨酸钠(W)下培育SH-SY5Y细胞10分钟，并采用AT180抗体通过免疫印迹确定tau磷酸化程度，AT180抗体识别当苏氨酸231处于磷酸化形式时的tau。该图显示了磷酸化tau(AT180)和tau总量(7.51)之间的比例。tau蛋白总量采用7.51抗体确定。

[0027] 在图2中显示了钨酸盐(W)对来自健康和胰岛素抵抗的大鼠脑中tau磷酸化的影响。A)免疫印迹分析来自颅内注射生理盐水(-)或0.1mM钨酸盐(+)的健康大鼠脑提取物的GSK3(左)和tau(右)的磷酸化。采用针对Ser-9磷酸化GSK3-β(pS9)、和在苏氨酸231磷酸化的tau(AT180)或在丝氨酸198、199和202非磷酸化的tau(tau-1)的抗体测量磷酸化。GSK 3和tau的总量通过分别与针对GSK3和tau(7.51)产生的抗体的相互作用确定。B)免疫印迹分析在对照(Ctrl)和胰岛素抵抗(IR)大鼠脑中GSK3-β(左)和tau(右)的磷酸化。采用与Ser-9磷酸化的GSK3-β(pS9-GSK3-β)或与tau-1和AT180抗体反应的抗体来测量磷酸化。GSK3和tau的总量如A中确定。C)胰岛素抵抗大鼠颅内注射生理盐水(-)或0.1mM钨酸盐(+)，然后分离它们的大脑并匀化，用tau-1和AT180抗体进行所述大脑蛋白的免疫印迹。tau蛋白总量采用7.51抗体确定。观察到与AT180的相互作用降低而与tau-1的相互作用增加。

[0028] 在图3中显示了钨酸盐(W)对从STZ-糖尿病大鼠获得的脑中tau磷酸化的影响。A)免疫印迹分析来自腹膜内注射生理盐水(Ctrl)或钨酸盐(W)(50mg/kg)的对照健康大鼠的大鼠脑提取物中GSK3的Ser-9磷酸化。该图显示了pS9-GSK3和蛋白总量(GSK3-β)之间的比例。B)如A)中，STZ-糖尿病大鼠腹膜内注射50或75mg/kg钨酸盐。C)免疫印迹分析腹膜内注射生理盐水(Ctr1)或钨酸盐(50mg/kg)的对照健康大鼠的脑提取物中在tau-1抗体识别位点处的tau磷酸化。该图显示了tau-1抗体识别的tau和7.51抗体识别的tau蛋白总量之间的比例。D)如C)中，STZ-糖尿病大鼠腹膜内注射50或75mg/kg钨酸盐。数据为3至5个独立实验的平均值和误差条表示标准偏差。

[0029] 实施例

[0030] 抗体和试剂

[0031] 从Carlo Erba(Milan，Italy)获得钨酸钠二水合物。采用下面的抗-tau抗 体：7.51(M.Novack 等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1991，vol.88，pp.5837-5841)( 来 自 Dr.C.Wischik，Universityof Aberdeen，Aberdeen，UK 的 友 情 馈 赠 )，AT-180(Innogenetics，Gent，Belgium)， 和 tau-1(Chemicon，Temecula，CA)。 抗 体AT-180识别当苏氨酸231磷酸化时的tau。抗体tau-1识别当丝氨酸198、199和202去磷酸化时的tau，7.51抗体识别总tau蛋白。根据具有441个氨基酸的最长的人tau异形体给出tau表位的编号。所使用的其他抗体是：来自Cell Signaling(Beverly，MA)的磷酸-GSK3-β(Ser-9)和抗-GSK3。除非另作说明，酶和生物化学试剂来自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。所有的其他化学品都是分析级。

[0032] 免疫印迹分析

[0033] 采用上述抗体通过免疫印迹进行tau和GSK3磷酸化程度的分析。在4℃，50mM的4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-乙基磺酸(HEPES)pH7.4，10mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.1％4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇(triton X-100)，20mM NaF，0.1mM原钒酸钠，
1mM苯甲烷磺酰氟，10μg/ml异戊酰-Val-Val-4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酰-Ala-4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸(Pepstatin A)；和10μg/ml抑肽酶中匀化细胞。细胞溶解产物在4℃10,000g下离心30分钟，然后在100℃下在电泳样品缓冲液中加热5分钟。采用BCA蛋白分析确定蛋白浓度(Pierce，Rockford，IL)。蛋白通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在10％胶上分级，并转移到硝化纤维膜上(Schleicher&Schuell Bioscience，Dassel，Germany)。在0.05％聚乙二醇去水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween
20)和5％脱脂奶粉的磷酸缓冲盐水溶液(PBS)中阻断结合到膜上的非特异性蛋白后，膜在4℃的阻断缓冲液中用一抗培育过夜。在用辣根过氧化物酶(HRP)-连二抗(Dako A/S Glostrup，Denmark)培育后，被抗体识别的蛋白采用增强的化学发光显现(Perkin Elmer Life Sciences Boston，MA)。用GS-710软件(Bio-Rad，Hercules，CA)进行标记蛋白带的光密度测量分析，并通过计算磷酸-依赖/磷酸-非依赖蛋白比来标准化磷酸-蛋白水平。

[0034] 实施例1：钨酸盐对成神经细胞瘤细胞系SH-SY5中GSK3-β在Ser-9磷酸化的影响

[0035] 为了研究钨酸盐是否影响神经元细胞，分析了钨酸钠二水合物对成神经细胞瘤细胞系sH-SY5Y(参见：94030304 of the EuropeanCollection of Cell Cultures，Salysbury，Whiltshire，GreatBritain)中GSK3-β在Ser-9磷酸化抑制的影响。人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞在补充了10％胎牛血清(FBs；Invitrogen-Gibco)，2mM谷氨酰胺，和50μg/ml庆大霉素的Dulbecco改性的Eagle培养基中生长(DMEM；Invitrogen-Gibco，Carlsbad，CA)。在实验前一天，细胞置于具有NeuroBasal(NB)无血清培养基(Invitrogen-Gibco)的多孔板中。钨酸钠二水合物溶于双次蒸馏水中并以0.1、1或5mM的终浓度添加到培育的培养基中，培育细胞5或10分钟。对照细胞在同样体积的介质中培育。将人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞暴露于钨酸钠显著增加了GSK3-β的Ser-9磷酸化(图1A)，表明通过所述处理该酶失活。

[0036] 此外，测试了钨酸盐对GSK3的抑制作用是否与该酶修饰的一致位点上tau磷酸化的降低相关。因此，分析了暴露于钨酸盐的SH-SY5Y细胞中的tau磷酸化。在免疫印迹中，测试了识别t au蛋白并且对GSK3修饰的磷酸化位点敏感的抗体。当丝氨酸198、199或202未被修饰时tau-1抗体与tau结合，而当这些丝氨酸位点被磷酸化时不与tau结合。观察到tau-1抗体在免疫反应中显著增加(图1B)，表明暴露于钨酸盐削弱tau蛋白中丝氨酸
198、199或202的磷酸化。此外，在用钨酸盐处理的细胞中还观察到，识别tau中GSK3磷酸化依赖表位的另一个抗体(AT-180)识别的表位的磷酸化降低(图1C)。

[0037] 这些结果表明钨酸盐刺激神经细胞中GSK3-β在Ser-9的磷酸化并抑制该激酶修饰的某些位点上的tau磷酸化。

[0038] 实施例2：钨酸钠对体内tau磷酸化的影响

[0039] 为了研究钨酸盐对体内tau磷酸化的影响，首先分析了未处理和钨酸盐处理的健康Wistar大鼠脑中该蛋白的磷酸化程度和GSK3-β在Ser-9的磷酸化程度。在控制的温度和湿度下，在12:12-小时的光-黑暗循环中将重220-240g的雄Wistar大鼠(IFFA CREDO，L′Arbresse，France)每只一笼。在存在或不存在钨酸盐的每组中，都没有观察到tau或GSK3磷酸化的显著变化(图2A)。这些结果和先前显示钨酸盐在健康动物中测试时无活性的数据是一致的。

[0040] 然后，在胰岛素抵抗的模型中测试了钨酸盐的影响，在该模型中钨酸盐是药学活性的：由富含脂肪的饮食诱导肥胖大鼠。该大鼠或者以控制的饮食喂养(8％卡路里为脂肪，type AO4来自Panlab，Barcelona，Spain)，或者以其中65％卡路里为脂肪形式的高脂肪饮食喂养 (参考，M.Clare t等人，Obes Res 2004，vol.12，pp.1596-1603)，以诱导胰岛素抵抗。在这些饮食规定情况下30天后，如(“Tungstate Decreases weight gain and adiposity in obeserat through increa sed thermogenesis and lipid oxidation”，M.Claret et al，Endocrinology，vol.146，pp.4362-4369)描述，将大鼠麻醉并心室内注射5μl生理盐水或110nM钨酸钠的生理盐水溶液。24小时后，除去大鼠大脑并分离皮层，在磷酸盐缓冲盐水中匀化。所述蛋白提取物通过免疫印迹采用抗-tau和抗-GSK3-β抗体检测。

[0041] 与健康瘦动物相比，在来自胰岛素抵抗大鼠的脑中GSK3-β在Ser-9的磷酸化水平降低(图2B左)。这个发现表明该激酶在胰岛素抵抗的大鼠中更活跃。这将导致该组动物中tau磷酸化增加，因为该蛋白是一个很好的GSK3底物。确实，与非肥胖对照相比，在肥胖大鼠中结合tau的AT180抗体增加而tau-1抗体的结合降低(图2B右)。钨酸盐处理降低在被AT180抗体识别的表位上的tau磷酸化和增加了tau-1抗体识别的蛋白的量(图2C)。这些结果与从培养的神经细胞中获得的数据一致：钨酸盐处理降低GSK3-依赖性tau磷酸化。

[0042] 此外，测试了钨酸盐对I型糖尿病模型(链脲霉素(STZ)-糖尿病大鼠)的影响(参考，A.Junod等人，J.Clin.Invest.1969，vol.48，pp.2129-2139)。通过确定来自尾静脉的血糖过多来确认糖尿病(Glucometer Elite，Bayer，Barcelona，Spain)。总共采用3只实验大鼠和3只对照大鼠(+或-钨酸盐)。对STZ-糖尿病大鼠腹膜内注射钨酸盐溶液(50或75mg/kg)。

[0043] 在未处理或钨酸盐-处理的健康动物中，还是没有观察到GSK3在SeT-9磷酸化或tau在tau-1抗体识别位点上磷酸化的变化(图3A和C)。然而，在STZ-糖尿病动物中，钨酸盐处理增加GSK3-β的Ser-9磷酸化并降低在tau-1抗体识别位点上的tau磷酸化(图3B和D)。

[0044] 这些结果表明钨酸钠降低了在胰岛素抵抗和糖尿病大鼠中的tau磷酸化。所有的实验都按照实验动物护理原则进行(EuropeanCommunity and local government guidelines)，此前巴塞罗纳大学的动物研究协会(the Animal Research Committee of the Universityof Barcelona)批准了这些方案。