参与昆虫肽基-二肽酶A活性而调控害虫的生理条件的试剂及方法转让专利
申请号 : CN200680029741.6
文献号 : CN101243183B
文献日 : 2013-02-06
发明人 : 下川床康孝 , 马克·范德·克雷恩 , 艾琳·努尔恩 , 桑德拉·图尔科尼 , 扬·纳乌德特 , 盖伊·尼斯 , 于尔根·德巴维伊
申请人 : 住友化学株式会社
摘要 :
本发明提供调控害虫的生理条件的试剂，其中所述试剂具有调控昆虫肽基-二肽酶A活性的能力；用于检测测试物质的杀虫活性的方法，其包括在肽基-二肽酶A与测试物质接触的反应系统中检测肽基-二肽酶A活性的步骤，等等。
权利要求 :
1.检测测试物质的杀虫活性的方法，其包括：(1)第一步，检测选自下组A的肽基-二肽酶A在所述肽基-二肽酶A与测试物质接触的反应系统中的活性；和(2)第二步，基于通过比较在第一步中测定的活性与对照活性而获得的差别评估所述测试物质的杀虫活性；
<组A>
(a)由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的蛋白；和(b)由核苷酸序列SEQ ID NO：2编码的氨基酸序列组成的蛋白。
2.筛选杀虫物质的方法，其包括选择具有通过按照权利要求1的方法评估的杀虫活性的物质。
3.一种控制害虫的方法，其包括：
鉴定具有通过按照权利要求1的方法评估的杀虫活性的物质，并且将害虫与所鉴定的杀虫物质接触。
4.一种昆虫肽基-二肽酶A，其由以下组成：(a)氨基酸序列SEQ ID NO：1；或(b)由核苷酸序列SEQ ID NO：2编码的氨基酸序列。
5.按照权利要求4的昆虫肽基-二肽酶A作为提供评估杀虫活性的指示剂的试剂的应用。
6.一种多聚核苷酸，其由编码按照权利要求4的肽基-二肽酶A的氨基酸序列的核苷酸序列组成。
7.按照权利要求6的多聚核苷酸，其由核苷酸序列SEQ ID NO：2组成。
8.一种多聚核苷酸，其由与按照权利要求6或7的多聚核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成。
9.引物对，其由核苷酸序列SEQ ID NO：3和4组成。
10.获得由编码肽基-二肽酶A的氨基酸序列的核苷酸序列组成的多聚核苷酸的方法，其包括：通过聚合酶链式反应扩增需要的多聚核苷酸的步骤，聚合酶链式反应使用按照权利要求9的引物对，其中肽基-二肽酶A的氨基酸序列为SEQ IDNO：1的氨基酸序列；
鉴定所扩增的需要的多聚核苷酸的步骤；和
回收所鉴定的多聚核苷酸的步骤。
11.一种基本由按照权利要求6的多聚核苷酸的核苷酸序列和杆状病毒启动子组成的环形多聚核苷酸，其中所述核苷酸序列可操作地与所述杆状病毒启动子连接。
12.按照权利要求11的环形多聚核苷酸，其中所述启动子是多角体蛋白基因启动子。
13.按照权利要求11的环形多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸还包含用于在宿主细胞中自动复制的复制起点。
14.按照权利要求11、12或13的环形多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸还包含杆状病毒穿梭载体的核苷酸序列，并且能够作为病毒在昆虫细胞中繁殖。
15.制备环形多聚核苷酸的方法，其包括将按照权利要求6或7的多聚核苷酸连接到载体中。
16.一种转化体，其中引入按照权利要求6或7的多聚核苷酸。
17.按照权利要求16的转化体，其中所述转化体是转化的昆虫细胞；
18.制备转化体的方法，其包括将按照权利要求6或7的多聚核苷酸引入到宿主细胞中。
19.一种重组杆状病毒，在其基因组中包含按照权利要求6或7的多聚核苷酸。
20.生产肽基-二肽酶A的方法，其包括培养按照权利要求16或17的转化体并且回收所生产的肽基-二肽酶A的步骤。
21.按照权利要求4的肽基-二肽酶A或按照权利要求6-9中任一项的多聚核苷酸作为研究工具的应用。
22.按照权利要求21的应用，其中所述研究工具是用于筛选杀虫物质的实验工具。
说明书 :
参与昆虫肽基-二肽酶A活性而调控害虫的生理条件的试
剂及方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种调节害虫的生理条件的试剂，所述试剂参与昆虫肽基-二肽酶A活性，等等。
背景技术
[0002] 关于昆虫肽基-二肽酶A，例如，已经报道：
[0003] 在果蝇(Drosophila)肽基-二肽酶A中，存在下述两种酶：Ance：血管紧张素转化酶和Acer：血管紧张素转化酶相关的酶，并且在黑腹果蝇(D.melanogaster)幼虫中，已
经在中肠、大脑和血淋巴中检测到高水平的肽基-二肽酶A活性(例如，Houard等，Eur J
Biochem.(欧洲生物化学杂志)；257(3)：599-606，1998)；
经在中肠、大脑和血淋巴中检测到高水平的肽基-二肽酶A活性(例如，Houard等，Eur J
Biochem.(欧洲生物化学杂志)；257(3)：599-606，1998)；
[0004] 在胚胎发生过程中和整个发育的胚胎后阶段检测到通过RNA检测证实的Ance和Acer mRNAs(例如，Tatei等，Mech Dev.(发育机制)，51(2-3)：157-68，1995；Taylor等，Gene.(基因)，181(1-2)，191-7，1996)；
[0005] 关于这两种黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)肽基-二肽酶A基因(Ance和Acer)的缺失突变体在早期幼虫阶段表现出隐性致死性表型(例如，Tatei等，Mech Dev.
(发育机制)，51(2-3)：157-68，1995等)；
(发育机制)，51(2-3)：157-68，1995等)；
[0006] Ance在心脏、内脏或睾丸的收缩中起作用(例如，Tatei等，Mech Dev.(发育机制)，51(2-3)：157-68，1995等)；
[0007] 在 亚 洲 飞 蝗 (Locusta migratoria) 中，暗 示 肽 基 - 二 肽 酶 A 在locustamyotropins样神经肽代谢中的可能的作用(例如，Isaac等，BiochemJ.(生物化
学杂志)；330(Pt1)：61-5，1998；Isaac等，Ann NY Acad Sci(纽约科学院年刊)，839：
288-292，1998等)；和
学杂志)；330(Pt1)：61-5，1998；Isaac等，Ann NY Acad Sci(纽约科学院年刊)，839：
288-292，1998等)；和
[0008] 肽基-二肽酶A已经在斯氏按蚊(Anopheles stephensi)雌蚊中证实，在雌蚊中该酶由血液进食诱导(例如，Ekbote等，FEBS Lett(FEBS通信)； 455(3)：219-22，1999)，并且肽基-二肽酶A在发育的卵巢中积累，并且进入蚊子卵中，在卵中它在胚胎发生过程中
在肽的代谢中起作用。
在肽的代谢中起作用。
[0009] 农业化学药品的发现传统上是基于随机筛选过程，通常直接检测具体的化学品对整个生物体诸如昆虫、真菌和/或植物的作用，并且确定生物活性。一旦发现具有适当生物活性的化合物，需要更深刻的研究来专门确定这些化合物在分子水平上的作用模式或作用
位点，以预测这些化合物的安全性和环境负担。
位点，以预测这些化合物的安全性和环境负担。
发明内容
[0010] 本发明描述一种更基于靶点的筛选农业化学品的方法，其中针对已经鉴定为与化学妨碍目标位点的目的生物学和/或生理学相关的特异的靶点筛选控制昆虫或其它有害
生物体的化合物。
生物体的化合物。
[0011] 具体地，本发明描述调控害虫的生理条件并且具有调控昆虫肽基-二肽酶A活性的能力的试剂用于控制害虫。
[0012] 即，本发明提供：
[0013] 1.一种调控害虫的生理条件的试剂，其中所述试剂具有调控昆虫肽基-二肽酶A活性的能力；
[0014] 2.按照第1项的试剂，其中所述肽基-二肽酶A是棉蚜肽基-二肽酶A；
[0015] 3.按照第1项的试剂，其中所述试剂是杀虫剂；
[0016] 4.按照第1项的试剂，其中所述调控昆虫肽基-二肽酶A活性的能力是抑制昆虫肽基-二肽酶A与邻-氨基苯甲酰甘氨酰-对-硝基-L-苯丙氨酰-L-脯氨酸反应的能
力；
力；
[0017] 5.一种杀虫剂，其包括具有调控昆虫肽基-二肽酶A活性的能力的物质或者所述物质的农业可用的盐作为活性成分；
[0018] 6.按照第5项的杀虫剂，其中所述物质具有抑制昆虫肽基-二肽酶A与邻-氨基苯甲酰甘氨酰-对-硝基-L-苯丙氨酰-L-脯氨酸反应的能力；
[0019] 7.按照第6项的杀虫剂，其中所述物质具有在不含细胞的系统中抑制昆虫肽基-二肽酶A与邻-氨基苯甲酰甘氨酰-对-硝基-L-苯丙氨酰-L-脯氨酸反应的能力，
其中存在10μM或更多的所述物质时，所述肽基-二肽酶A的活性低于不存在所述物质时
的活性；
其中存在10μM或更多的所述物质时，所述肽基-二肽酶A的活性低于不存在所述物质时
的活性；
[0020] 8.按照第6项的杀虫剂，其中所述物质具有在不含细胞的系统中抑制昆虫肽基-二肽酶A与邻-氨基苯甲酰甘氨酰-对-硝基-L-苯丙氨酰-L-脯氨酸反应的能力，
具有100μM或更低的IC50；
具有100μM或更低的IC50；
[0021] 9.检测测试物质的杀虫活性的方法，其包括：
[0022] (1)第一步，检测选自下组A的肽基-二肽酶A在所述肽基-二肽酶A与测试物质接触的反应系统中的活性；和
[0023] (2)第二步，基于通过比较在第一步中测定的活性与对照活性而获得的差别评估所述测试物质的杀虫活性；
[0024] <组A>
[0025] (a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的蛋白；
[0026] (b)包含在氨基酸序列SEQ ID NO：1中删除、添加或取代一个或多个氨基酸的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有肽基-二肽酶A活性；
[0027] (c)包含与氨基酸序列SEQ ID NO：1有65％或更高的序列相同性的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有肽基-二肽酶A活性；
[0028] (d)包含由核苷酸序列SEQ ID NO：2编码的氨基酸序列的蛋白；
[0029] (e)包含由与核苷酸序列SEQ ID NO：2有65％或更高的序列相同性的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有肽基-二肽酶A活性；
[0030] (f)包含由多聚核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白，其中所述多聚核苷酸在严格条件下与包含同核苷酸序列SEQ ID NO：2互补的核苷酸序列的多聚核苷酸杂交，并且其中所
述蛋白具有肽基-二肽酶A活性；
述蛋白具有肽基-二肽酶A活性；
[0031] (g)包含昆虫肽基-二肽酶A的氨基酸序列的蛋白；和
[0032] (h)包含棉蚜肽基-二肽酶A的氨基酸序列的蛋白；
[0033] 10.筛选杀虫物质的方法，其包括选择具有通过按照第9项的方法评估的杀虫活性的物质；
[0034] 11.一种杀虫剂，其包括通过按照第10项的方法选择的物质或其农业可用的盐作为活性成分；
[0035] 12.控制害虫的方法，其包括将有效量的按照第5、6、7、8或11项的杀虫剂应用到害虫、害虫栖息地或要防治害虫的植物；
[0036] 13.一种控制害虫的方法，其包括：
[0037] 鉴定具有通过按照第9项的方法评估的杀虫活性的物质，并且
[0038] 将害虫与所鉴定的杀虫物质接触；
[0039] 14.一种昆虫肽基-二肽酶A，其包含选自下组B的氨基酸序列：
[0040] <组B>
[0041] (a)氨基酸序列SEQ ID NO：1；
[0042] (b)在氨基酸序列SEQ ID NO：1中删除、添加或取代一个或多个氨基酸的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有肽基-二肽酶A活性；
[0043] (c)与氨基酸序列SEQ ID NO：1有65％或更高的序列相同性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有肽基-二肽酶A活性；
[0044] (d)由核苷酸序列SEQ ID NO：2编码的氨基酸序列；
[0045] (e)由与核苷酸序列SEQ ID NO：2有65％或更高的序列相同性的核苷酸序列编码的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有肽基-二肽酶A活性；
[0046] (f)由多聚核苷酸编码的氨基酸序列，其中所述多聚核苷酸在严格条件下与包含同核苷酸序列SEQ ID NO：2互补的核苷酸序列的多聚核苷酸杂交，并且其中所述氨基酸序
列具有肽基-二肽酶A活性；和
列具有肽基-二肽酶A活性；和
[0047] (g)棉蚜肽基-二肽酶A的氨基酸序列；
[0048] 15.昆虫肽基-二肽酶A作为提供评估杀虫活性的指示剂的试剂的应用；
[0049] 16.按照第14项的昆虫肽基-二肽酶A作为提供评估杀虫活性的指示剂的试剂的应用；
[0050] 17.一种多聚核苷酸，其包含编码按照第14项的肽基-二肽酶A的氨基酸序列的核苷酸序列；
[0051] 18.按照第17项的多聚核苷酸，其包括核苷酸序列SEQ ID NO：2；
[0052] 19.一种多聚核苷酸，其包含与按照第17或18项的多聚核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列；
[0053] 20.一种多聚核苷酸，其包含：
[0054] 按照第17或18项的多聚核苷酸的部分核苷酸序列；或
[0055] 与所述部分核苷酸序列互补的核苷酸序列；
[0056] 21.按照第20项的多聚核苷酸，其包含核苷酸序列SEQ ID NO：3或4；
[0057] 22.获得包含编码肽基-二肽酶A的氨基酸序列的核苷酸序列的多聚 核苷酸的方法，其包括：
[0058] 通过聚合酶链式反应扩增需要的多聚核苷酸的步骤，聚合酶链式反应使用按照第20或21项的多聚核苷酸作为引物；
[0059] 鉴定所扩增的需要的多聚核苷酸的步骤；和
[0060] 回收所鉴定的多聚核苷酸的步骤；
[0061] 23.获得包含编码肽基-二肽酶A的氨基酸序列的核苷酸序列的多聚核苷酸的方法，其包括：
[0062] 通过杂交检测需要的多聚核苷酸的步骤，杂交使用按照第19、20或21项的多聚核苷酸作为探针；
[0063] 鉴定所检测的需要的多聚核苷酸的步骤；和
[0064] 回收所鉴定的多聚核苷酸的步骤；
[0065] 24.一种包含按照第17或18项的多聚核苷酸的核苷酸序列的环形多聚核苷酸，其中所述核苷酸序列可操作地与杆状病毒启动子连接；
[0066] 25.按照第24项的环形多聚核苷酸，其中所述启动子是多角体蛋白基因启动子；
[0067] 26.按照第24或25项的环形多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸包含用于在宿主细胞中自动复制的复制起点；
[0068] 27.按照第24、25或26项的环形多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸包含杆状病毒穿梭载体的核苷酸序列，并能够作为病毒在昆虫细胞中繁殖；
[0069] 28.制备环形多聚核苷酸的方法，其包括将按照第17或18项的多聚核苷酸连接到载体中；
[0070] 29.一种转化体，其中引入按照第17或18项的多聚核苷酸；
[0071] 30.按照第29项的转化体，其中所述转化体是转化的昆虫细胞；
[0072] 31.制备转化体的方法，其包括将按照第17或18项的多聚核苷酸引入到宿主细胞中；
[0073] 32.一种重组杆状病毒，在其基因组中包含按照第17或18项的多聚核苷酸；
[0074] 33.生产肽基-二肽酶A的方法，其包括培养按照第29或30项的转化体并且回收所生产的肽基-二肽酶A的步骤；
[0075] 34.按照第14项的肽基-二肽酶A或按照第17-21项中任一项的多聚 核苷酸作为研究工具的应用；
[0076] 35.按照第34项的应用，其中所述研究工具是用于筛选杀虫物质的实验工具；和
[0077] 36.一种系统，其包括：
[0078] 输入、存储和管理测试物质的能力的数据信息的装置，其中所述能力是调控昆虫肽基-二肽酶A活性的能力；
[0079] 基于需要的标准查询并且回传(retrieve)数据信息的装置；和
[0080] 显示并且输出查询和回传的结果的装置。
[0081] 实行本发明的方式
[0082] 本发明将在下文中详细地阐释。
[0083] 在本发明中，“害虫”是指通过直接伤害人和动物或者通过损害农作物而给人的生活带来伤害或不适的小动物。它的实例包括节肢动物诸如昆虫、螨类、蜱类和线虫类
(Nematoda)，并且其典型的实例如下：
(Nematoda)，并且其典型的实例如下：
[0084] 半翅目(Hemiptera)：
[0085] 飞 虱 科 (Delphacidae) 如 灰 飞 虱 (Laodelphax striatellus)、褐 飞虱(Nilaparvata lugens)和 白 背 稻 飞 虱 (Sogatella furcifera)，角 顶 叶 蝉 科
(Deltocephalidae)如黑尾叶蝉(Nephotettix cincticeps)和Empoasca onukii，蚜科
(Aphididae)如棉蚜(Aphis gossypii)和桃蚜(Myzus persicae)，蝽科(Pentatomidae)，
粉虱科(Aleyrodidae)如温室粉虱(Trialeurodesvaporariorum)、甘薯粉虱(Bemisia
tabaci)和Bemisia argentifolli，蚧 科(Coccidae)，网蝽 科(Tingidae)，木 虱 科
(Psyllidae)，等。
(Deltocephalidae)如黑尾叶蝉(Nephotettix cincticeps)和Empoasca onukii，蚜科
(Aphididae)如棉蚜(Aphis gossypii)和桃蚜(Myzus persicae)，蝽科(Pentatomidae)，
粉虱科(Aleyrodidae)如温室粉虱(Trialeurodesvaporariorum)、甘薯粉虱(Bemisia
tabaci)和Bemisia argentifolli，蚧 科(Coccidae)，网蝽 科(Tingidae)，木 虱 科
(Psyllidae)，等。
[0086] 鳞翅目(Lepidoptera)：
[0087] 螟 蛾 科 (Pyralidae) 如 二 化 螟 (Chilo suppressalis)、稻 纵 卷 叶野 螟 (Cnaphalocrocis medinalis)、 欧 洲 玉 米 螟 (Ostrinia nubilalis) 和
Parapediasiateterrella，夜 蛾 科 (Noctuidae) 如 斜 蚊 贪 夜 蛾 (Spodoptera
litura)、贪夜 蛾(Spodoptera exigua)、粘虫(Pseudaletia separata)、甘蓝夜 蛾
(Mamestrabrassicae)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、粉夜蛾属(Trichoplusia spp.)、
实夜蛾属(Heliothis spp.)、Helicoverpa和山卷蛾(Earias spp.)，粉蝶科(Pieridae)
如菜粉蝶日本亚种(Pieris rapae crucivora)，卷蛾科(Tortricidae) 如棉褐带卷
蛾(Adoxophyes orana fasciata)、梨小食心虫(Grapholitamolesta)和苹果皮小卷蛾
(Cydia pomonella)，蛀果蛾科(Carposinidae)如桃蛀果蛾(Carposina niponensis)，
Bucculatricidae如桃潜夜蛾(Lyonetiaclerkella)，细蛾科(Gracillariidae)如金纹
小潜细蛾(Phyllonorycterringoniella)，夜潜蛾科(Phyllocnistidae)如柑橘夜潜蛾
(Phyllocnistiscitrella)，巢蛾科(Yponomeutidae)如小菜蛾(Plutella xylostella)，
麦蛾科(Gelechiidae)如红铃麦蛾(Pectinophora gossypiella)，灯蛾科(Arctiidae)，谷
蛾科(Tineidae)，等。
Parapediasiateterrella，夜 蛾 科 (Noctuidae) 如 斜 蚊 贪 夜 蛾 (Spodoptera
litura)、贪夜 蛾(Spodoptera exigua)、粘虫(Pseudaletia separata)、甘蓝夜 蛾
(Mamestrabrassicae)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、粉夜蛾属(Trichoplusia spp.)、
实夜蛾属(Heliothis spp.)、Helicoverpa和山卷蛾(Earias spp.)，粉蝶科(Pieridae)
如菜粉蝶日本亚种(Pieris rapae crucivora)，卷蛾科(Tortricidae) 如棉褐带卷
蛾(Adoxophyes orana fasciata)、梨小食心虫(Grapholitamolesta)和苹果皮小卷蛾
(Cydia pomonella)，蛀果蛾科(Carposinidae)如桃蛀果蛾(Carposina niponensis)，
Bucculatricidae如桃潜夜蛾(Lyonetiaclerkella)，细蛾科(Gracillariidae)如金纹
小潜细蛾(Phyllonorycterringoniella)，夜潜蛾科(Phyllocnistidae)如柑橘夜潜蛾
(Phyllocnistiscitrella)，巢蛾科(Yponomeutidae)如小菜蛾(Plutella xylostella)，
麦蛾科(Gelechiidae)如红铃麦蛾(Pectinophora gossypiella)，灯蛾科(Arctiidae)，谷
蛾科(Tineidae)，等。
[0088] 双翅目(Diptera)：
[0089] 库 蚊 属 (Culex)如 淡 色 库 蚊(Culex pipiens pallens)、三 带 喙 库 蚊(Culestritaeniorhynchus)和致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)，伊蚊属(Aedes)
如埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)，按蚊属(Anopheles)
如中华按蚊(Anophelinae sinensis)，摇蚊科(Chironomidae)，蝇科(Muscidae)如家
蝇(Musca domestica)和厩腐蝇(Muscina stabulans)，丽蝇科(Calliphoridae)，麻
蝇科(Sarcophagidae)，夏厕蝇(Fanniacanicularis)，花蝇科(Anthomyiidae)如灰地
种蝇(Delia platura)和葱地种蝇(Delia antigua)，实蝇科(Trypetidae)，果蝇科
(Drosophilidae)，毛蠓科(Psychodidae)，蚋科(Simuliidae)，虻科(Tabanidae)，螫蝇科(Stomoxyidae)，潜蝇科(Agromyzidae)，等。
如埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)，按蚊属(Anopheles)
如中华按蚊(Anophelinae sinensis)，摇蚊科(Chironomidae)，蝇科(Muscidae)如家
蝇(Musca domestica)和厩腐蝇(Muscina stabulans)，丽蝇科(Calliphoridae)，麻
蝇科(Sarcophagidae)，夏厕蝇(Fanniacanicularis)，花蝇科(Anthomyiidae)如灰地
种蝇(Delia platura)和葱地种蝇(Delia antigua)，实蝇科(Trypetidae)，果蝇科
(Drosophilidae)，毛蠓科(Psychodidae)，蚋科(Simuliidae)，虻科(Tabanidae)，螫蝇科(Stomoxyidae)，潜蝇科(Agromyzidae)，等。
[0090] 翘翅目(Coleoptera)：
[0091] 谷物食虫(Diabrotica)如西方谷物食虫(Diabrotica virgifera)和南方谷物食虫(Diabrotica undecimpunctata howardi)，金龟科(Scarabaeidae)如古铜异丽金
龟(Anomala cuprea)和多色异丽金龟(Anomala rufocuprea)，象虫科(Curculionidae)
如玉米象(Sitophilus zeamais)、稻水象(Lissorphoptrus oryzophilus)和绿豆象
(Calosobruchys chinensis)，拟步甲科(Tenebrionidae)如黄粉甲(Tenebrio molitor)
和赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)，叶甲科(Chrysomelidae)如水稻负泥虫(Oulema
oryzae)、黄守瓜(Aulacophora femoralis)、黄曲条菜跳甲(Phyllotreta striolata)
和马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata)，窃蠹科(Anobiidae)，瓢虫(Epilachna
spp.)如二十八斑瓢虫(Epilachna vigintioctopunctata)，粉蠹 科(Lyctidae)，长蠹科
(Bostrychidae)，天牛科(Cerambycidae)，毒隐翅虫(Paederus fuiscipes)，等。
龟(Anomala cuprea)和多色异丽金龟(Anomala rufocuprea)，象虫科(Curculionidae)
如玉米象(Sitophilus zeamais)、稻水象(Lissorphoptrus oryzophilus)和绿豆象
(Calosobruchys chinensis)，拟步甲科(Tenebrionidae)如黄粉甲(Tenebrio molitor)
和赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)，叶甲科(Chrysomelidae)如水稻负泥虫(Oulema
oryzae)、黄守瓜(Aulacophora femoralis)、黄曲条菜跳甲(Phyllotreta striolata)
和马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata)，窃蠹科(Anobiidae)，瓢虫(Epilachna
spp.)如二十八斑瓢虫(Epilachna vigintioctopunctata)，粉蠹 科(Lyctidae)，长蠹科
(Bostrychidae)，天牛科(Cerambycidae)，毒隐翅虫(Paederus fuiscipes)，等。
[0092] 缨翅目(Thysanoptera)：
[0093] 蓟马科(Thripidae)，如包括palmi蓟马(Thrips palmi)的蓟马(Thripsspp.)，包括西方花蓟马(Flankliniella occidentalis)的花蓟马(Frankliniellaspp.)，包括
Sciltothrips dorsalis的Sciltothrips，管蓟马科(Phlaeothripidae)，等。
Sciltothrips dorsalis的Sciltothrips，管蓟马科(Phlaeothripidae)，等。
[0094] 膜翅目(Hymenoptera)：
[0095] 叶蜂科(Tenthredinidae)，蚁科(Formicidae)，胡蜂科(Vespidae)，等。
[0096] 网翅目(Dictyoptera)：
[0097] 蜚蠊科(Blattidae)，Blattellidae，等；
[0098] 直翅目(Orthoptera)：
[0099] 剑角蝗科(Acrididae)，蝼蛄科(Gryllotalpidae)，等。
[0100] 蚤目(Siphonaptera)：
[0101] 人蚤(Pulex irritans)，等。
[0102] 虱目(Anoplura)：
[0103] 体虱(Pediculus humanus capitis)，等。
[0104] 等翅目(Isoptera)：
[0105] 白蚁科(Termitidae)，等。
[0106] 蜱螨目(Acarina)：
[0107] 叶螨科(Tetranychidae)如二斑叶螨(Tetranychus urticae)、神泽氏叶螨(Tetranychus kanzawai)、柑橘全爪螨(Panonychus citri)、苹果全爪螨(Panonychus
ulmi)和小爪螨(Oligonychus spp.)，瘿螨科(Eriophyidae)如橘刺皮瘿螨(Aculops
pelekassi)和斯氏针刺瘿螨(Aculus schlechtendali)，跗线螨科(Tarsonemidae)如
侧多食跗线螨(Polyphagotarsonemus latus)，细须螨科(Tenuipalpidae)，杜克螨科
(Tuckerellidae)，硬蜱科(Ixodidae)如长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)、褐黄
血蜱(Haemaphysalis flava)、台湾革蜱(Dermacentor taiwanicus)、卵形硬蜱(Ixodes
ovatus)、全沟硬蜱(Ixodes persulcatus)和微小牛蜱(Boophilus microplus)，粉螨科
(Acaridae)如腐食酪螨(Tyrophagus putrescentiae)，皮刺螨科(Dermanyssidae)，肉食
螨科(Cheyletidae)如粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)和屋尘螨(Dermatophagoides
ptrenyssnus)，诸如普通肉食螨(Cheyletus eruditus)、马六甲肉食螨(Cheyletus
malaccensis)和Cheyletusmoorei、皮刺螨(Dermanyssus spp.)，等。
ulmi)和小爪螨(Oligonychus spp.)，瘿螨科(Eriophyidae)如橘刺皮瘿螨(Aculops
pelekassi)和斯氏针刺瘿螨(Aculus schlechtendali)，跗线螨科(Tarsonemidae)如
侧多食跗线螨(Polyphagotarsonemus latus)，细须螨科(Tenuipalpidae)，杜克螨科
(Tuckerellidae)，硬蜱科(Ixodidae)如长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)、褐黄
血蜱(Haemaphysalis flava)、台湾革蜱(Dermacentor taiwanicus)、卵形硬蜱(Ixodes
ovatus)、全沟硬蜱(Ixodes persulcatus)和微小牛蜱(Boophilus microplus)，粉螨科
(Acaridae)如腐食酪螨(Tyrophagus putrescentiae)，皮刺螨科(Dermanyssidae)，肉食
螨科(Cheyletidae)如粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)和屋尘螨(Dermatophagoides
ptrenyssnus)，诸如普通肉食螨(Cheyletus eruditus)、马六甲肉食螨(Cheyletus
malaccensis)和Cheyletusmoorei、皮刺螨(Dermanyssus spp.)，等。
[0108] 线虫类(Nematodes)：
[0109] 咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae)，伪短体线虫(Pratylenchusfallax)，大豆异皮线虫(Heterodera glycines)，马铃薯金线虫(Globoderarostochiensis)，北方根结线虫(Meloidogyne hapla)，南方根结线虫(Meloidogyne incognita)，等。
[0110] 在本发明中，“调控害虫的生理条件”是指改变生命体内诸如各种现象的条件，所述条件是害虫生存应该维持的，例如，功能如呼吸、消化、分泌、体液循环、新陈代谢、神经传递等，或其机制，改变成除正常条件以外的条件。实例包括通过停止呼吸以致不提供害虫内部新陈代谢必需的氧气而改变条件，和通过停止害虫的神经传递功能以致终止害虫的各种活动而改变条件。
[0111] 在本发明中，“调控害虫的生理条件的试剂”是当对害虫应用时可以调控害虫的生理条件的试剂。
[0112] 在本发明中，“昆虫肽基-二肽酶A”是指在昆虫中存在的肽基-二肽酶A，是在各种生物体中存在的肽基-二肽酶A之一。在本文中，昆虫是在动物界(Animalia)，
节肢动物门(Arthropod)，昆虫纲(Insecta)下分类的动物，并且它的实例包括下列各目
的节肢动物：Protura，弹尾目(Collembola)，双尾目(Diplura)，缨尾目(Thysanura)，
蜉蝣目(Ephemeroptera)，蜻蜒目(Odonata)，织翼夜蛾目(Plecoptera)，蛩蠊目
(Grylloblattodea)，直翅目(Orthoptera)，Phasmatodea，革翅目(Dermaptera)，螳螂目
(Mantodea)，Blattaria，等翅目(Isoptera)，纺足目(Embioptera)，啮虫目(Psocoptera)，食毛目(Mallophaga)，虱目(Anoplura)，缨翅目(Thysanoptera)，半翅目(Hemiptera)，脉翅目(Neuroptera)，长翅目(Mecoptera)，毛翅目(Trichoptera)，鳞翅目(Lepidoptera)，鞘翅目(Coleoptera)，双翅目(Diptera)，膜翅目 (Hymenoptera)，蚤目(Siphonaptera)，捻翅目(Strepsiptera)，等等。
节肢动物门(Arthropod)，昆虫纲(Insecta)下分类的动物，并且它的实例包括下列各目
的节肢动物：Protura，弹尾目(Collembola)，双尾目(Diplura)，缨尾目(Thysanura)，
蜉蝣目(Ephemeroptera)，蜻蜒目(Odonata)，织翼夜蛾目(Plecoptera)，蛩蠊目
(Grylloblattodea)，直翅目(Orthoptera)，Phasmatodea，革翅目(Dermaptera)，螳螂目
(Mantodea)，Blattaria，等翅目(Isoptera)，纺足目(Embioptera)，啮虫目(Psocoptera)，食毛目(Mallophaga)，虱目(Anoplura)，缨翅目(Thysanoptera)，半翅目(Hemiptera)，脉翅目(Neuroptera)，长翅目(Mecoptera)，毛翅目(Trichoptera)，鳞翅目(Lepidoptera)，鞘翅目(Coleoptera)，双翅目(Diptera)，膜翅目 (Hymenoptera)，蚤目(Siphonaptera)，捻翅目(Strepsiptera)，等等。
[0113] 肽基-二肽酶A(EC 3.4.15.1；血管紧张素I-转化酶(ACE)，激酶II或二肽基羧肽酶I)是一种从短肽水解分裂羧基端二肽的金属肽酶。
[0114] 肽基-二肽酶A具有从短肽激素的羧基端分裂二肽的活性。尽管还没有鉴定昆虫中肽基-二肽酶A的内源底物，但是可以使用合成底物，邻-氨基苯甲酰甘氨酰-对-硝
基-L-苯丙氨酰-L-脯氨酸(Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro)(由Bachem制备，目录号M-1100)来
检测肽基-二肽酶A的活性。这种底物是一种表现出非常微弱的荧光的内在猝灭的肽。当
肽键Gly-Phe(NO2)分裂时这种猝灭消除，并且增加的荧光性与肽基-二肽酶A活性成比例。
更具体地，肽基-二肽酶A的活性可以按照Carmel等(1979)Clinica Chimica Acta，93，
215-220中所述的方法进行检测。
基-L-苯丙氨酰-L-脯氨酸(Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro)(由Bachem制备，目录号M-1100)来
检测肽基-二肽酶A的活性。这种底物是一种表现出非常微弱的荧光的内在猝灭的肽。当
肽键Gly-Phe(NO2)分裂时这种猝灭消除，并且增加的荧光性与肽基-二肽酶A活性成比例。
更具体地，肽基-二肽酶A的活性可以按照Carmel等(1979)Clinica Chimica Acta，93，
215-220中所述的方法进行检测。
[0115] 肽基-二肽酶A的活性可以使用天然或合成的酶底物应用体外检测而测定。例如，肽基-二肽酶A活性可以使用放射性标记的血管紧张素I底物应用基于放射活性的检测而
进行检测，如Huggins和Thampi，Life Sci.(生命科学)7(12)，1968，633-639所述。使用
血管紧张素I作为底物监测肽基-二肽酶A活性的另一个实例是基于所形成的产物的反
相-HPLC分离，如Meng等，Biochem Pharmacol(生物化学药学)50，1995，1445-1450所述。
类似地，存在许多可以使用合成的底物而不是天然底物如血管紧张素I和缓激肽用来确定
肽基-二肽酶A活性的检测。这些方法包括检测放射性标记的底物的分裂产物，所分裂的
底物的荧光或比色分析。所述检测的类型由Holmquist等，Analytical Biochemistry(分
析生物化学)95，540-548(1979)；Carmel和Yaron，Eur J Biochem(欧洲生物化学杂
志)87，265-273(1978)；Araujo等，Biochemistry(生物化学)39(29)，8519-8525(2000)；
Shepley等，Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis(制药学和生物医学
分析杂志)，6(3)，241-251(1988)；Cushman和Cheung，Biochem Pharmacol.(生物化学制
药学)20(7)：1637-1648(1971)；Groff等，Clin Chem(临床化学)39(3)，400-404(1993)；
Dive等，PNAS 96，4330-4335(1999)；Cheviron等，Analytical Biochemistry(分析生物化学)280，58-64(2000)；Meng和Oparil，Journal of Chromatography A(色谱A杂志)743，
105-122(1996)所述。
进行检测，如Huggins和Thampi，Life Sci.(生命科学)7(12)，1968，633-639所述。使用
血管紧张素I作为底物监测肽基-二肽酶A活性的另一个实例是基于所形成的产物的反
相-HPLC分离，如Meng等，Biochem Pharmacol(生物化学药学)50，1995，1445-1450所述。
类似地，存在许多可以使用合成的底物而不是天然底物如血管紧张素I和缓激肽用来确定
肽基-二肽酶A活性的检测。这些方法包括检测放射性标记的底物的分裂产物，所分裂的
底物的荧光或比色分析。所述检测的类型由Holmquist等，Analytical Biochemistry(分
析生物化学)95，540-548(1979)；Carmel和Yaron，Eur J Biochem(欧洲生物化学杂
志)87，265-273(1978)；Araujo等，Biochemistry(生物化学)39(29)，8519-8525(2000)；
Shepley等，Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis(制药学和生物医学
分析杂志)，6(3)，241-251(1988)；Cushman和Cheung，Biochem Pharmacol.(生物化学制
药学)20(7)：1637-1648(1971)；Groff等，Clin Chem(临床化学)39(3)，400-404(1993)；
Dive等，PNAS 96，4330-4335(1999)；Cheviron等，Analytical Biochemistry(分析生物化学)280，58-64(2000)；Meng和Oparil，Journal of Chromatography A(色谱A杂志)743，
105-122(1996)所述。
[0116] 在前文提及的检测肽基-二肽酶A活性的各种方法中，使用邻-氨基苯甲酰甘氨酰-对-硝基-L-苯丙氨酰-L-脯氨酸作为底物的反应优选用于许多样品的肽基-二肽酶
A活性的自动和有效的检测。具体的实例包括在已报道的文献(Carmel等(1979)Clinica
Chimica Acta，93，215-220)中所述的方法。
A活性的自动和有效的检测。具体的实例包括在已报道的文献(Carmel等(1979)Clinica
Chimica Acta，93，215-220)中所述的方法。
[0117] 另外，检测昆虫肽基-二肽酶A活性的方法可以通过与上述方法相似的方法进行。 [0118] 在不同的昆虫物种中已经鉴定了一些肽基-二肽酶A的氨基酸序列，例如，在黑腹果蝇ANCE中(登记号NP_477046)，在西方角蝇(Haematobiairritans)中(登记号
S65472)，在刚比亚按蚊(Anopheles gambiae)中(登记号XP_318838)，在家蚕蛾(Bombyx
mori)中(登记号BAA97657)，在意大利蜜蜂(Apis mellifera)中(登记号XP_393561)，在
亚洲飞蝗中(登记号AAR85358)，等等，这些可以在公共数据库中找到。此外，已经在不同
的昆虫物种中鉴定了一些肽基-二肽酶A基因的核苷酸序列，例如，在黑腹果蝇中(登记号
NM_057698)，在西方角蝇中(登记号L43965)，在刚比亚按蚊中(登记号AAAB01008980)，在
家蚕蛾中(登记号AB026110)，在意大利蜜蜂中(登记号XM_393561)，在亚洲飞蝗中(登记
号AY487174)，等等，这些可以在公共数据库中找到。
S65472)，在刚比亚按蚊(Anopheles gambiae)中(登记号XP_318838)，在家蚕蛾(Bombyx
mori)中(登记号BAA97657)，在意大利蜜蜂(Apis mellifera)中(登记号XP_393561)，在
亚洲飞蝗中(登记号AAR85358)，等等，这些可以在公共数据库中找到。此外，已经在不同
的昆虫物种中鉴定了一些肽基-二肽酶A基因的核苷酸序列，例如，在黑腹果蝇中(登记号
NM_057698)，在西方角蝇中(登记号L43965)，在刚比亚按蚊中(登记号AAAB01008980)，在
家蚕蛾中(登记号AB026110)，在意大利蜜蜂中(登记号XM_393561)，在亚洲飞蝗中(登记
号AY487174)，等等，这些可以在公共数据库中找到。
[0119] 另外，按照下文所述的方法，可以从棉蚜鉴定肽基-二肽酶A的氨基酸序列和肽基-二肽酶A基因的核苷酸序列。所鉴定的棉蚜肽基-二肽酶A的氨基酸序列在SEQ ID
NO：1中显示，并且棉蚜肽基-二肽酶A基因的核苷酸序列在SEQ ID NO：2中显示。
NO：1中显示，并且棉蚜肽基-二肽酶A基因的核苷酸序列在SEQ ID NO：2中显示。
[0120] 在除昆虫之外的动物中已经鉴定了一些肽基-二肽酶A的氨基酸序列，例如，在智人(Homo sapiens)中(登记号NP_000780)，在牛(Bos taurus)中(登记号1919242A)，在
秀丽隐杆线虫(Ceanorhabditis elegans)中(登记号AAA98719)，等等，这些可以在公共数
据库中找到。此外，在除昆虫之外的动物中已经鉴定了一些肽基-二肽酶A基因的核苷酸
序列，例如，在智人中(登记号NM_000789)，在牛中(登记号AJ309016)，在秀丽隐杆线虫中(登记号U56966)，等等，这些可以在公共数据库中找到。
秀丽隐杆线虫(Ceanorhabditis elegans)中(登记号AAA98719)，等等，这些可以在公共数
据库中找到。此外，在除昆虫之外的动物中已经鉴定了一些肽基-二肽酶A基因的核苷酸
序列，例如，在智人中(登记号NM_000789)，在牛中(登记号AJ309016)，在秀丽隐杆线虫中(登记号U56966)，等等，这些可以在公共数据库中找到。
[0121] 表1显示棉蚜肽基-二肽酶A的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和棉蚜肽基 -二肽酶A基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)与在其它动物中发现的肽基-二肽酶A及其基因的
序列的序列相同性。
序列的序列相同性。
[0122] 表1
[0123]序列来源 相对于SEQ ID NO：1的氨基酸 序列的相同性 (％) 相对于SEQ ID NO：2的核苷酸 序列的相同性 (％)
黑腹果蝇(D.melanogaster)ANCE 37.8 45.5
西方角蝇(Haematobia irritans) 35.1 49.4
刚比亚按蚊(Anopheles gambiae) 34.4 49.4
家蚕蛾(Bombyx mori) 51.5 53.7
意大利蜜蜂(Apis mellifera) 61.9 63.3
亚洲飞蝗(Locusta migratoria) 51.3 48.6
智人(Homo sapiens) 31.3 47.8
牛(Bos taurus) 31.1 53.8
秀丽隐杆线虫(Ceanorhabditis elegans) 29.3 44.7
黑腹果蝇(D.melanogaster)ANCE 37.8 45.5
西方角蝇(Haematobia irritans) 35.1 49.4
刚比亚按蚊(Anopheles gambiae) 34.4 49.4
家蚕蛾(Bombyx mori) 51.5 53.7
意大利蜜蜂(Apis mellifera) 61.9 63.3
亚洲飞蝗(Locusta migratoria) 51.3 48.6
智人(Homo sapiens) 31.3 47.8
牛(Bos taurus) 31.1 53.8
秀丽隐杆线虫(Ceanorhabditis elegans) 29.3 44.7
[0124] 调控昆虫肽基-二肽酶A活性的能力是指增加或者减少昆虫肽基-二肽酶A活性的能力，即，意指激活肽基-二肽酶A的能力，或者抑制肽基-二肽酶A活性的能力。并
且，可以向检测肽基-二肽酶A活性的反应系统中加入测试物质，以研究所述测试物质对肽
基-二肽酶A活性的影响。
且，可以向检测肽基-二肽酶A活性的反应系统中加入测试物质，以研究所述测试物质对肽
基-二肽酶A活性的影响。
[0125] 例如，已知氯离子(Cl-)为具有激活肽基-二肽酶A的能力的物质(Lamango NS等，Biochem J.(生物化学杂志)1996年3月1；314(Pt2)：639-46.)，并且已知贝那普利、
喹那普利、卡托普利、依那普利等为具有抑制肽基-二肽酶A活性的能力的物质。
喹那普利、卡托普利、依那普利等为具有抑制肽基-二肽酶A活性的能力的物质。
[0126] 然而，从来不被发现或者从来不知道这样的暗示，即，这些物质调控昆虫的生理条件，特别地，可以作为杀虫剂的活性成分。
[0127] 反应中测试物质的IC50值意指不含测试物质的反应的活性的50％被抑 制的测试物质的浓度。测试物质的IC50值可以通过这样确定：将不同浓度的测试物质添加到肽基-二肽酶A活性检测反应系统中，检测在添加的测试物质的每一浓度(剂量)的肽基-二肽酶A
活性(反应)，产生剂量-反应曲线，并且计算肽基-二肽酶A活性被抑制50％时的所加入
的测试物质的浓度。更具体地，剂量-反应曲线可以应用四参数逻辑模型或S形剂量-反
应模型生成：
活性(反应)，产生剂量-反应曲线，并且计算肽基-二肽酶A活性被抑制50％时的所加入
的测试物质的浓度。更具体地，剂量-反应曲线可以应用四参数逻辑模型或S形剂量-反
应模型生成：
[0128] f(x)＝(A+((B-A)/(1+((C/x)^D)))
[0129]
[0130] 以计算IC50值。特别地，IC50值可以应用商购计算软件XLfit(由IDBS制作)进行计算。
[0131] 具有调控昆虫肽基-二肽酶A活性的能力的试剂是一种含有具有调控昆虫肽基-二肽酶A活性的能力的物质作为活性成分的试剂。
[0132] 在本发明中，“调控害虫的生理条件的试剂，其中所述试剂具有调控昆虫肽基-二肽酶A活性的能力”是一种具有通过前文提及的检测方法指明的调控昆虫肽基-二肽酶A活性的能力的试剂，并且意指可以调控害虫的生理条件的试剂。所述试剂的优选实例包括
这样的试剂，即，其中昆虫肽基-二肽酶A是棉蚜肽基-二肽酶A。另外，所述试剂的优选实
例包括这样的试剂，即，其中调控害虫的生理条件的试剂是杀虫剂。另外，所述试剂的优选实例包括这样的试剂，即，其中调控昆虫肽基-二肽酶A活性的能力是抑制使用邻-氨基苯
甲酰甘氨酰-对-硝基-L-苯丙氨酰-L-脯氨酸作为底物的反应的能力。
这样的试剂，即，其中昆虫肽基-二肽酶A是棉蚜肽基-二肽酶A。另外，所述试剂的优选实
例包括这样的试剂，即，其中调控害虫的生理条件的试剂是杀虫剂。另外，所述试剂的优选实例包括这样的试剂，即，其中调控昆虫肽基-二肽酶A活性的能力是抑制使用邻-氨基苯
甲酰甘氨酰-对-硝基-L-苯丙氨酰-L-脯氨酸作为底物的反应的能力。
[0133] 在本发明中，“杀虫剂”是指具有控制害虫的能力的试剂。除本发明中公开的方法之外，用于检测控制害虫的能力的方法的实例还包括，检测关于害虫的杀虫活性的方法。具体地，例如，可以按照下述方法检测杀虫活性。
[0134] 按照昆虫饲养手册(Handbook of Insect Rearing)第1卷(Elsevier科学出版(Elsevier Science Publisers)1985)第35-36页所述的方法，除了制备具有下述组合物
(表2)的无菌人工饲料之外，并且将测试试剂在 DMSO中的溶液以0.5体积％加入到人工
饲料中，并且混合，饲养棉蚜，在6天后研究存活的棉蚜的数目，并且按照下述方程获得控制值。
(表2)的无菌人工饲料之外，并且将测试试剂在 DMSO中的溶液以0.5体积％加入到人工
饲料中，并且混合，饲养棉蚜，在6天后研究存活的棉蚜的数目，并且按照下述方程获得控制值。
[0135] 表2
[0136]氨基酸 (mg/100ml) 维生素 (mg/100ml)
L-丙氨酸 100.0 维生素C 100.0
L-精氨酸 275.0 生物素 0.1
L-天冬酰胺 550.0 泛酸钙 5.0
L-天冬氨酸 140.0 氯化胆碱 50.0
L-半胱氨酸(氢氯 化物) 40.0 肌醇 50.0
L-谷氨酸 140.0 烟酸 10.0
L-谷氨酰胺 150.0 硫胺 2.5
L-甘氨酸 80.0
L-组氨酸 80.0 其它 (mg/100ml)
L-异亮氨酸 80.0 蔗糖 12500.0
L-亮氨酸 80.0 磷酸氢二钾 1500.0
L-赖氨酸 (氢氯化物) 120.0 硫酸镁 123.0
L-甲硫氨酸 80.0 氯化铜 0.2
L-苯丙氨酸 40.0 氯化铁 11.0
L-脯氨酸 80.0 氯化锰 0.4
L-丝氨酸 80.0 硫酸锌(无水) 0.8
L-苏氨酸 140.0
L-色氨酸 80.0 调整到pH6.8
L-酪氨酸 40.0
L-缬氨酸 80.0
L-丙氨酸 100.0 维生素C 100.0
L-精氨酸 275.0 生物素 0.1
L-天冬酰胺 550.0 泛酸钙 5.0
L-天冬氨酸 140.0 氯化胆碱 50.0
L-半胱氨酸(氢氯 化物) 40.0 肌醇 50.0
L-谷氨酸 140.0 烟酸 10.0
L-谷氨酰胺 150.0 硫胺 2.5
L-甘氨酸 80.0
L-组氨酸 80.0 其它 (mg/100ml)
L-异亮氨酸 80.0 蔗糖 12500.0
L-亮氨酸 80.0 磷酸氢二钾 1500.0
L-赖氨酸 (氢氯化物) 120.0 硫酸镁 123.0
L-甲硫氨酸 80.0 氯化铜 0.2
L-苯丙氨酸 40.0 氯化铁 11.0
L-脯氨酸 80.0 氯化锰 0.4
L-丝氨酸 80.0 硫酸锌(无水) 0.8
L-苏氨酸 140.0
L-色氨酸 80.0 调整到pH6.8
L-酪氨酸 40.0
L-缬氨酸 80.0
[0137] 控制值(％)＝{1-(Cb×Tai)/(Cai×Tb)}×100
[0138] 在所述方程中的字母代表下述意义：
[0139] Cb：在未处理部分中在处理之前存活的虫子数目
[0140] Cai：在未处理部分中在观察时存活的虫子数目
[0141] Tb：在未处理部分中在处理之前存活的虫子数目
[0142] Tai：在处理部分中在观察时存活的虫子数目
[0143] 可以这样说，表现出显著高的控制值的测试试剂具有杀虫活性。更优选地，可以确定具有30％或更大的控制值的测试试剂具有实质杀虫活性，并且可以确定具有小于30％的控制值的测试试剂没有实质杀虫活性。
[0144] 本发明的杀虫剂包含具有调控昆虫肽基-二肽酶A活性的能力的化学物质或其农业可用的盐作为活性成分。
[0145] 在本发明中，农业可用的盐是指这样形式的盐，即，控制试剂的制备及所述制剂的应用不是变得不可能，并且可以是以任何形式的盐。具体地，所述盐的实例包括与无机酸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、和磷酸，有机酸如甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、延胡索酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、和乙磺酸，或酸性氨基酸如天冬氨酸和谷氨酸形成的酸式加成盐；与无机碱如钠、钾、镁和铝，有机碱如甲胺、乙胺和乙醇胺，或碱性氨基酸如赖氨酸和鸟氨酸形成的盐；以及铵盐。
[0146] 在本发明中，“包含具有调控昆虫肽基-二肽酶A活性的能力的物质或其农业可用的盐作为活性成分的杀虫剂”意指可以通过包含具有在检测方法中鉴定的调控昆虫肽
基-二肽酶A活性的能力的物质或其农业可用的盐作为活性成分而控制害虫的试剂。所述
物质的优选实例包括具有抑制肽基-二肽酶A与邻-氨基苯甲酰甘氨酰-对-硝基-L-苯丙
氨酰-L-脯氨酸反应的能力的化合物。所述物质的更优选的实例包括具有在不含细胞的系
统中抑制昆虫肽基-二肽酶A与邻-氨基苯甲酰甘氨酰-对-硝基-L-苯丙氨酰-L-脯氨
酸反应的能力的物质，其中在存在10μM或更多的所述物质下，肽基-二肽酶A的活性低于
在不存所述物质下的活性。另外，所述物质的其它优选的实例包括具有在不含细胞的系统
中以100μM或更小的IC50值而抑制昆虫肽基-二肽酶A与邻-氨基苯甲酰甘氨酰-对-硝
基-L-苯丙氨酰-L-脯氨酸反应的能力的物质。
基-二肽酶A活性的能力的物质或其农业可用的盐作为活性成分而控制害虫的试剂。所述
物质的优选实例包括具有抑制肽基-二肽酶A与邻-氨基苯甲酰甘氨酰-对-硝基-L-苯丙
氨酰-L-脯氨酸反应的能力的化合物。所述物质的更优选的实例包括具有在不含细胞的系
统中抑制昆虫肽基-二肽酶A与邻-氨基苯甲酰甘氨酰-对-硝基-L-苯丙氨酰-L-脯氨
酸反应的能力的物质，其中在存在10μM或更多的所述物质下，肽基-二肽酶A的活性低于
在不存所述物质下的活性。另外，所述物质的其它优选的实例包括具有在不含细胞的系统
中以100μM或更小的IC50值而抑制昆虫肽基-二肽酶A与邻-氨基苯甲酰甘氨酰-对-硝
基-L-苯丙氨酰-L-脯氨酸反应的能力的物质。
[0147] 在本发明中，“用于检测测试物质的杀虫活性的方法，其包括第一步， 在肽基-二肽酶A与测试物质接触的反应系统中检测选自组A的肽基-二肽酶A的活性，和第二步，基于通过比较在第一步中测定的活性与对照的活性而获得的差别而评估测试物质的杀虫活
性”是指特征在于在用于检测测试物质的杀虫能力的各种方法中包括第一步和第二步的方
法。
性”是指特征在于在用于检测测试物质的杀虫能力的各种方法中包括第一步和第二步的方
法。
[0148] 在本文中，组A是指：
[0149] (a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的蛋白；
[0150] (b)包含在氨基酸序列SEQ ID NO：1中删除、添加或取代一个或多个氨基酸的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有肽基-二肽酶A活性；
[0151] (c)包含与氨基酸序列SEQ ID NO：1有65％或更高的序列相同性的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有肽基-二肽酶A活性；
[0152] (d)包含由核苷酸序列SEQ ID NO：2编码的氨基酸序列的蛋白；
[0153] (e)包含由与核苷酸序列SEQ ID NO：2有65％或更高的序列相同性的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有肽基-二肽酶A活性；
[0154] (f)包含由多聚核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白，其中所述多聚核苷酸在严格条件下与包含同核苷酸序列SEQ ID NO：2互补的核苷酸序列的多聚核苷酸杂交，并且其中所
述蛋白具有肽基-二肽酶A活性；
述蛋白具有肽基-二肽酶A活性；
[0155] (g)包含昆虫肽基-二肽酶A的氨基酸序列的蛋白；和
[0156] (h)包含(f)棉蚜肽基-二肽酶A的氨基酸序列的蛋白(以下叫作组A)。
[0157] 第一步是在通过将测试物质加入到前文提及的各种肽基-二肽酶A活性检测反应系统中而使得肽基-二肽酶A与测试物质接触的状态下检测肽基-二肽酶A活性的步骤。
另外，第二步是比较测试物质检测的活性与对照物质的活性并且基于差异评估杀虫能力的
步骤。在本文中，对照意指，例如，在将溶解在溶剂中的测试物质添加到反应系统中的情形中，其中只加入与用来溶解所述测试物质相同的溶剂的检测部分。
另外，第二步是比较测试物质检测的活性与对照物质的活性并且基于差异评估杀虫能力的
步骤。在本文中，对照意指，例如，在将溶解在溶剂中的测试物质添加到反应系统中的情形中，其中只加入与用来溶解所述测试物质相同的溶剂的检测部分。
[0158] 在具有第一步和第二步用于检测测试物质所拥有的杀虫能力的方法中所用的肽基-二肽酶A是在组A中所示的蛋白。在组A的蛋白中，在由(a)代表的蛋白的氨基酸序
列和由(b)，(c)，(e)，(f)，(g)和(h)代表的蛋白的氨基酸序列之间可以识别的差别是部
分氨基酸的删除、取代、加成等。这些包括，例如，由于具有由(a)代表的氨基酸序列的蛋白在细胞中受到的加工 引起的删除。另外，实例包括由下列各项所产生的氨基酸的删除、取代、添加等：由于剪接差异或蛋白来源的生物体的个体差异而引起的天然存在的基因突变，或通过基因定点诱变、随机诱变、突变处理等而人工引入的基因突变。
列和由(b)，(c)，(e)，(f)，(g)和(h)代表的蛋白的氨基酸序列之间可以识别的差别是部
分氨基酸的删除、取代、加成等。这些包括，例如，由于具有由(a)代表的氨基酸序列的蛋白在细胞中受到的加工 引起的删除。另外，实例包括由下列各项所产生的氨基酸的删除、取代、添加等：由于剪接差异或蛋白来源的生物体的个体差异而引起的天然存在的基因突变，或通过基因定点诱变、随机诱变、突变处理等而人工引入的基因突变。
[0159] 经受删除、取代、添加等的氨基酸数目可以是在可以发现肽基-二肽酶A的肽酶活性的范围内的数目。另外，氨基酸取代的实例包括用在疏水性、电荷、pH和空间结构上特征相似的氨基酸进行取代。所述取代的具体实例包括在下列各组中的取代：(1)甘氨酸，丙氨酸；(2)缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；(3)天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，(4)丝氨酸，苏氨酸；(5)赖氨酸，精氨酸；(6)苯丙氨酸，酪氨酸等。
[0160] 人工引入氨基酸的删除、添加或取代(下文，在一些情形中笼统叫作氨基酸的改变)的方法的实例包括将基因定点突变引入到编码由(a)代表的氨基酸序列的DNA中，并
且然后通过常规方法表达这一DNA的方法。在此处，基因定点诱变的实例包括应用amber
突变的方法(缺口双链方法(gapped duplex method)，Nucleic Acids Res.(核酸研究)，
12，9441-9456(1984))、通过应用引入突变的引物的PCR的方法等。另外，人工改变氨基酸的方法的实例包括将突变随机引入到编码由(a)代表的氨基酸序列的DNA中并且然后通过
常规方法表达这一DNA的方法。在此处，随机引入突变的方法的实例包括使用编码任一种
前文提及的氨基酸序列的DNA作为模板并且使用可以扩增每种全长DNA的引物对在下列
反应条件下进行PCR的方法：即，在用作底物的每种dATP，dTTP，dGTP和dCTP的添加量从
2+
常规浓度改变的反应条件下，或在促进聚合酶反应的Mg 的浓度从常规浓度升高的反应条
件下。PCR方法的实例包括，例如，在Method in Molecular Biology(分子生物学方法)，
(31)，1994，97-112中所述的方法。另一个实例包括在WO 0009682中所述的方法。
且然后通过常规方法表达这一DNA的方法。在此处，基因定点诱变的实例包括应用amber
突变的方法(缺口双链方法(gapped duplex method)，Nucleic Acids Res.(核酸研究)，
12，9441-9456(1984))、通过应用引入突变的引物的PCR的方法等。另外，人工改变氨基酸的方法的实例包括将突变随机引入到编码由(a)代表的氨基酸序列的DNA中并且然后通过
常规方法表达这一DNA的方法。在此处，随机引入突变的方法的实例包括使用编码任一种
前文提及的氨基酸序列的DNA作为模板并且使用可以扩增每种全长DNA的引物对在下列
反应条件下进行PCR的方法：即，在用作底物的每种dATP，dTTP，dGTP和dCTP的添加量从
2+
常规浓度改变的反应条件下，或在促进聚合酶反应的Mg 的浓度从常规浓度升高的反应条
件下。PCR方法的实例包括，例如，在Method in Molecular Biology(分子生物学方法)，
(31)，1994，97-112中所述的方法。另一个实例包括在WO 0009682中所述的方法。
[0161] 在本文中，“序列相同性”是指两种核苷酸序列或两种氨基酸之间的相同性。“序列相同性”通过比较在待比较的序列的所有区域的最佳状态排列的两个序列而确定的。在此处，在待比较的核苷酸序列或氨基酸序列的最佳比对中，可以允许添加或删除(例如，缺口等)。可以通过使用如FASTA[Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(美国科学院
学报) 4，2444-2448(1988)]、BLAST[Altschul等，Journal of Molecular Biology(分子生物学杂志)，215，403-410(1990)]、CLUSTAL W[Thompson，Higgins和Gibson，Nucleic Acid Research(核酸研究)，22，4673-4680(1994a)]等的程序进行产生序列比对的同源性分析
而计算序列相同性。所述程序一般在日本DNA数据库【日本信息生物学和DNA数据库中心
国家遗传所(Genetics，Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan)管理的国际DNA数据库；CIB/DDBJ】的网址(http://www.ddbj.nig.ac.jp)上可用。备选
地，序列相同性还可以应用商购序列分析软件而获得。具体地，例如，可以应用GENETYX-WIN Ver.5(由软件开发有限公司(SoftwareDevelopment Co.Ltd.)制造)通过Lipman-Pearson
方法【Lipman，D.J.和Pearson，W.R.，Science(科学)，227，1435-1441，(1985)】进行同源性分析并且生成序列比对而计算序列相同性。
学报) 4，2444-2448(1988)]、BLAST[Altschul等，Journal of Molecular Biology(分子生物学杂志)，215，403-410(1990)]、CLUSTAL W[Thompson，Higgins和Gibson，Nucleic Acid Research(核酸研究)，22，4673-4680(1994a)]等的程序进行产生序列比对的同源性分析
而计算序列相同性。所述程序一般在日本DNA数据库【日本信息生物学和DNA数据库中心
国家遗传所(Genetics，Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan)管理的国际DNA数据库；CIB/DDBJ】的网址(http://www.ddbj.nig.ac.jp)上可用。备选
地，序列相同性还可以应用商购序列分析软件而获得。具体地，例如，可以应用GENETYX-WIN Ver.5(由软件开发有限公司(SoftwareDevelopment Co.Ltd.)制造)通过Lipman-Pearson
方法【Lipman，D.J.和Pearson，W.R.，Science(科学)，227，1435-1441，(1985)】进行同源性分析并且生成序列比对而计算序列相同性。
[0162] 在(f)中所述的“严格条件”的实例包括这样的条件，即，在所述条件下，在按照Sambrook J.，Frisch E.F.，Maniatis T.，分子克隆第二版，冷泉港实验室出版社
(Molecular Cloning 2nd edition，Cold Spring HarborLaboratory press)所述的常
规方法进行的杂交中，例如，杂交体在45℃在含有6×SSC(含有1.5m NaCl和0.15m柠檬
酸三钠的溶液是10×SSC)的溶液中形成，并且然后，将这一杂交体在50℃用2×SSC洗涤
(MolecularBiology(分子生物学)，John Wiley和Sons，纽约(1989)，6.3.1-6.3.6)。洗涤步骤的盐浓度可以从2×SSC(低严格条件)到0.2×SSC(高严格条件)的条件进行选择。
洗涤步骤的温度，例如，可以在从室温(低严格条件)到65℃(高严格条件)的条件进行选
择。备选地，盐浓度和温度都是可以变化的。
(Molecular Cloning 2nd edition，Cold Spring HarborLaboratory press)所述的常
规方法进行的杂交中，例如，杂交体在45℃在含有6×SSC(含有1.5m NaCl和0.15m柠檬
酸三钠的溶液是10×SSC)的溶液中形成，并且然后，将这一杂交体在50℃用2×SSC洗涤
(MolecularBiology(分子生物学)，John Wiley和Sons，纽约(1989)，6.3.1-6.3.6)。洗涤步骤的盐浓度可以从2×SSC(低严格条件)到0.2×SSC(高严格条件)的条件进行选择。
洗涤步骤的温度，例如，可以在从室温(低严格条件)到65℃(高严格条件)的条件进行选
择。备选地，盐浓度和温度都是可以变化的。
[0163] 在(h)中描述的蛋白是指在昆虫肽基-二肽酶A中存在于棉蚜中的肽基-二肽酶A，并且包括含有(a)中所述的氨基酸序列的蛋白。
[0164] 另外，组A的蛋白包括含有在(g)中所述的昆虫肽基-二肽酶A的氨基酸序列的蛋白，并且更优选地包括这样的蛋白，即，其中当与氨基酸序列SEQID NO：1比对时以致获得最大的序列相同性，在与氨基酸序列SEQ ID NO：1的(I)位置478，(II)位置498，(III)
位置570，和(IV)位置567相对应的位置的氨基酸残基分别为(I)半胱氨酸(在与478对
应的位置)，(II)谷氨酸(在 与498对应的位置)，(III)酪氨酸(在与507对应的位置)，
(IV)甲硫氨酸(在与567对应的位置)。在此处，“与氨基酸序列SEQ ID NO：1比对以致
获得最大的序列相同性”意指包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的多个待分析的氨基酸序列的
序列相同性通过如上文所述的FASTA，BLAST，CLUSTAL W程序进行分析，并且对它们进行序列比对。通过所述方法比对多个序列，而不管氨基酸序列的插入或删除，可以确定每一氨基酸序列中的保守氨基酸残基的位置。认为保守氨基酸残基存在于目的蛋白的三维空间结构
中的相同位置，并且推测关于目的蛋白的特异功能具有相似的作用。例如，当将包括在本发明中公开的肽基-二肽酶A序列的昆虫肽基-二肽酶A与氨基酸序列SEQ ID NO：1比对
以致获得氨基酸序列的最大的序列相同性时，显示在与氨基酸序列SEQ ID NO：1的(I)位
置478，(II)位置498，(III)位置507，(IV)位置567相对应的位置的氨基酸残基分别为
(I)半胱氨酸(在与478对应的位置)，(II)谷氨酸(在与498对应的位置)，(III)酪氨
酸(在与507对应的位置)，(IV)甲硫氨酸(在与567对应的位置)。
位置570，和(IV)位置567相对应的位置的氨基酸残基分别为(I)半胱氨酸(在与478对
应的位置)，(II)谷氨酸(在 与498对应的位置)，(III)酪氨酸(在与507对应的位置)，
(IV)甲硫氨酸(在与567对应的位置)。在此处，“与氨基酸序列SEQ ID NO：1比对以致
获得最大的序列相同性”意指包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的多个待分析的氨基酸序列的
序列相同性通过如上文所述的FASTA，BLAST，CLUSTAL W程序进行分析，并且对它们进行序列比对。通过所述方法比对多个序列，而不管氨基酸序列的插入或删除，可以确定每一氨基酸序列中的保守氨基酸残基的位置。认为保守氨基酸残基存在于目的蛋白的三维空间结构
中的相同位置，并且推测关于目的蛋白的特异功能具有相似的作用。例如，当将包括在本发明中公开的肽基-二肽酶A序列的昆虫肽基-二肽酶A与氨基酸序列SEQ ID NO：1比对
以致获得氨基酸序列的最大的序列相同性时，显示在与氨基酸序列SEQ ID NO：1的(I)位
置478，(II)位置498，(III)位置507，(IV)位置567相对应的位置的氨基酸残基分别为
(I)半胱氨酸(在与478对应的位置)，(II)谷氨酸(在与498对应的位置)，(III)酪氨
酸(在与507对应的位置)，(IV)甲硫氨酸(在与567对应的位置)。
[0165] 具有杀虫能力的物质可以通过使用检测对上文提及的害虫的杀虫能力或控制作用而测定杀虫能力的方法进行筛选。
[0166] 备选地，具有杀虫能力的物质还可以通过使用肽基-二肽酶A测定杀虫能力的方法进行筛选。具体地，当应用使用肽基-二肽酶A测定杀虫能力的方法鉴定测试物质的杀
虫能力是特定的值或更大，或者特定的值或更小时，可以通过选择所述物质而筛选具有杀
虫能力的物质。
虫能力是特定的值或更大，或者特定的值或更小时，可以通过选择所述物质而筛选具有杀
虫能力的物质。
[0167] 由于通过所述筛选方法选择的物质具有杀虫能力，所以它可以用作包含所述物质或农业可用的盐作为活性成分的杀虫剂。
[0168] 害虫的控制通常可以通过将有效量的杀虫剂应用到被保护的农作物、害虫或害虫的栖息地而进行。
[0169] 当将杀虫剂用于农业和林业时，其使用量通常关于每1000m2的杀虫剂的量为0.1到1000g。当将杀虫剂配制成乳液、水可分散的粉剂、易流动的制剂、微胶囊制剂等时，所述试剂通常通过用水将活性成分稀释至1到10,000ppm的浓度，并且用其喷雾而应用，并且当
杀虫剂配制成粒剂、粉剂等时，所述试剂通常如其那样进行应用。
杀虫剂配制成粒剂、粉剂等时，所述试剂通常如其那样进行应用。
[0170] 杀虫剂可以通过叶子-处理如农作物等需要防止害虫的植物而使用， 并且还可以通过在移植农作物的苗之前处理苗床，或者处理在种植时的种植洞或株基而使用。此外，为了控制害虫在耕地的土壤中栖息的目的，可以通过处理所述土壤而应用所述试剂。备选
地，所述试剂可以通过将已经加工成薄片或细线的树脂制剂环绕在农作物上，将所述制剂
在农作物附近延伸和/或散布在株基的土壤表面而使用。
地，所述试剂可以通过将已经加工成薄片或细线的树脂制剂环绕在农作物上，将所述制剂
在农作物附近延伸和/或散布在株基的土壤表面而使用。
[0171] 当将杀虫剂用作害虫控制剂用于防止时疫时，乳液、水可分散的粉剂、流动物等通常通过用水稀释以致活性成分的浓度为0.01到10,000ppm而应用，并且油剂、气溶胶、薰剂、毒饵等按照原样进行应用。
[0172] 杀虫剂的一种用途的实例包括控制家畜如牛、绵羊、山羊和鸡或小动物如狗、猫、大鼠和小鼠的外部寄生虫，在这种情形中，所述试剂可以通过兽医已知的方法施用给动物。作为一种具体的施用方法，当意欲全身控制时，例如，所述试剂通过片剂、混合在饲料中、栓剂、注射剂(肌内、皮下、静脉内、腹膜内等)等而施用，当意欲非全身控制时，所述试剂通过喷雾油性试剂或水性液体试剂、在治疗时进行倾倒或打点、用洗发精制剂清洗动物或给动
物附上已经加工成项圈或耳签的树脂制剂的方法而应用。当施用给动物体时杀虫剂的量通
常在0.1到1,000mg范围，其表示为每1kg动物化合物A和化合物B的总量。
物附上已经加工成项圈或耳签的树脂制剂的方法而应用。当施用给动物体时杀虫剂的量通
常在0.1到1,000mg范围，其表示为每1kg动物化合物A和化合物B的总量。
[0173] 它们的使用量和使用浓度都不同，这取决于这样的情形诸如制剂种类、使用时间、使用位置、使用方法、害虫种类、损害程度等，可以增加或减少，而不管前文提及的范围，并且可以适当地选择。
[0174] 前文提及的杀虫剂可以用于上文所述的控制害虫的方法中。
[0175] 另外，在另一方面，害虫还可以通过使用前文提及的测定测试物质拥有的杀虫能力的方法鉴定具有杀虫能力的物质(所述鉴定方法具有第一步和第二步，使用选自组A的
肽基-二肽酶A)，并且将所鉴定的具有杀虫能力的物质与害虫接触而进行控制。在此处，作为将所鉴定的具有杀虫能力的物质与害虫接触的方法，可以应用前文提及的制备方法、应
用方法等。
肽基-二肽酶A)，并且将所鉴定的具有杀虫能力的物质与害虫接触而进行控制。在此处，作为将所鉴定的具有杀虫能力的物质与害虫接触的方法，可以应用前文提及的制备方法、应
用方法等。
[0176] 组B中所示的氨基酸序列是昆虫肽基-二肽酶A的氨基酸序列，其包含下述(a)到(g)任一种氨基酸序列。
[0177] (a)氨基酸序列SEQ ID NO：1；
[0178] (b)在氨基酸序列SEQ ID NO：1中删除、添加或取代一个或多个氨基 酸的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有肽基-二肽酶A活性；
[0179] (c)与氨基酸序列SEQ ID NO：1有65％或更高的序列相同性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有肽基-二肽酶A活性；
[0180] (d)由核苷酸序列SEQ ID NO：2编码的氨基酸序列；
[0181] (e)由与核苷酸序列SEQ ID NO：2有65％或更高的序列相同性的核苷酸序列编码的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有肽基-二肽酶A活性；
[0182] (f)由多聚核苷酸编码的氨基酸序列，其中所述多聚核苷酸在严格条件下与包含同核苷酸序列SEQ ID NO：2互补的核苷酸序列的多聚核苷酸杂交，并且其中所述氨基酸序
列具有肽基-二肽酶A活性；和
列具有肽基-二肽酶A活性；和
[0183] (g)(f)棉蚜肽基-二肽酶A的氨基酸序列。
[0184] 在组B的氨基酸序列中，在由(a)代表的氨基酸序列和由(b)，(c)，(e)，(f)和(g)代表的氨基酸序列之间可以识别的差别是部分氨基酸的删除、取代、添加等。这些包括，例如，由于具有由(a)代表的氨基酸序列的蛋白在细胞中受到的加工引起的删除。另外，实例包括由下列各项所产生的氨基酸的删除、取代、添加等：由于剪接差异或蛋白来源的生物体的个体差异而引起的天然存在的基因突变，或通过基因定点诱变、随机诱变、突变处理等而人工引入的基因突变。
[0185] 经受删除、取代、添加等的氨基酸数目可以是在可以发现肽基-二肽酶A的肽酶活性的范围内的数目。另外，氨基酸取代的实例包括用在疏水性、电荷、pH和空间结构上特征相似的氨基酸进行取代。所述取代的具体实例包括在下列各组中的取代：(1)甘氨酸，丙氨酸；(2)缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；(3)天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，(4)丝氨酸，苏氨酸；(5)赖氨酸，精氨酸；(6)苯丙氨酸，酪氨酸等。
[0186] 人工引入氨基酸的删除、添加或取代(下文，在一些情形中笼统叫作氨基酸的改变)的方法的实例包括将基因定点突变引入到编码由(a)代表的氨基酸序列的DNA中，并
且然后通过常规方法表达这一DNA的方法。在此处，基因定点诱变的实例包括应用amber
突变的方法(缺口双链方法，Nucleic Acids Res.(核酸研究)，12，9441-9456(1984))、通过应用引入突变的引物的PCR的方法等。另外，人工改变氨基酸的方法的实例包括将突变
随机引入到编码由(a)代表的氨基酸序列的DNA中并且然后通过常规方 法表达这一DNA
的方法。在此处，随机引入突变的方法的实例包括使用编码任一种前文提及的氨基酸序列
的DNA作为模板并且使用可以扩增每种全长DNA的引物对在下列反应条件下进行PCR的方
法：即，在用作底物的每种dATP，dTTP，dGTP和dCTP的添加量从常规浓度改变的反应条件
2+
下，或在促进聚合酶反应的Mg 的浓度从常规浓度升高的反应条件下。PCR方法的实例包
括，例如，在Method in Molecular Biology(分子生物学方法)，(31)，1994，97-112中所述的方法。另一个实例包括在WO 0009682中所述的方法。
且然后通过常规方法表达这一DNA的方法。在此处，基因定点诱变的实例包括应用amber
突变的方法(缺口双链方法，Nucleic Acids Res.(核酸研究)，12，9441-9456(1984))、通过应用引入突变的引物的PCR的方法等。另外，人工改变氨基酸的方法的实例包括将突变
随机引入到编码由(a)代表的氨基酸序列的DNA中并且然后通过常规方 法表达这一DNA
的方法。在此处，随机引入突变的方法的实例包括使用编码任一种前文提及的氨基酸序列
的DNA作为模板并且使用可以扩增每种全长DNA的引物对在下列反应条件下进行PCR的方
法：即，在用作底物的每种dATP，dTTP，dGTP和dCTP的添加量从常规浓度改变的反应条件
2+
下，或在促进聚合酶反应的Mg 的浓度从常规浓度升高的反应条件下。PCR方法的实例包
括，例如，在Method in Molecular Biology(分子生物学方法)，(31)，1994，97-112中所述的方法。另一个实例包括在WO 0009682中所述的方法。
[0187] 在本文中，“序列相同性”是指两种核苷酸或两种氨基酸之间的相同性。“序列相同性”通过比较在待比较的序列的所有区域的最佳状态排列的两个序列而确定的。在此处，在待比较的核苷酸序列或氨基酸序列的最佳比对中，可以允许添加或删除(例如，缺口等)。可以通过使用如FASTA[Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(美国科学院
学报)4，2444-2448(1988)]、BLAST[Altschul等，Journal of Molecular Biology(分子生物学杂志)，215，403-410(1990)]、CLUSTAL W[Thompson，Higgins和Gibson，Nucleic Acid Research(核酸研究)，22，4673-4680(1994a)]等的程序进行产生序列比对的同源性分析
而计算序列相同性。所述程序一般在日本DNA数据库【日本信息生物学和DNA数据库中心
国家遗传所(Genetics，Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan)管理的国际DNA数据库；CIB/DDBJ】的网址(http://ddbj.nig.ac.jp)上可用。备选地，
序列相同性还可以应用商购序列分析软件而获得。具体地，例如，可以应用GENETYX-WIN
Ver.5(由软件开发有限公司(SoftwareDevelopment Co.Ltd.)制造)通过Lipman-Pearson
方法【Lipman，D.J.和Pearson，W.R.，Science(科学)，227，1435-1441，(1985)】进行同源性分析并且生成序列比对而计算序列相同性。
学报)4，2444-2448(1988)]、BLAST[Altschul等，Journal of Molecular Biology(分子生物学杂志)，215，403-410(1990)]、CLUSTAL W[Thompson，Higgins和Gibson，Nucleic Acid Research(核酸研究)，22，4673-4680(1994a)]等的程序进行产生序列比对的同源性分析
而计算序列相同性。所述程序一般在日本DNA数据库【日本信息生物学和DNA数据库中心
国家遗传所(Genetics，Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan)管理的国际DNA数据库；CIB/DDBJ】的网址(http://ddbj.nig.ac.jp)上可用。备选地，
序列相同性还可以应用商购序列分析软件而获得。具体地，例如，可以应用GENETYX-WIN
Ver.5(由软件开发有限公司(SoftwareDevelopment Co.Ltd.)制造)通过Lipman-Pearson
方法【Lipman，D.J.和Pearson，W.R.，Science(科学)，227，1435-1441，(1985)】进行同源性分析并且生成序列比对而计算序列相同性。
[0188] 在(f)中所述的“严格条件”的实例包括这样的条件，即，在所述条件下，在按照Sambrook J.，Frisch E.F.，Maniatis T.，分子克隆第二版，冷泉港实验出版社(Molecular Cloning 2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratorypress)所述的常规方法进行的杂交中，例如，杂交体在45℃在含有6×SSC(含有1.5m NaCl和0.15m柠檬酸三钠的溶液
是10×SSC)的溶液中形 成，并且然后，将这一杂交体在50℃用2×SSC洗涤(Molecular
Biology(分子生物学)，John Wiley和Sons，纽约(1989)，6.3.1-6.3.6)。洗涤步骤的盐
浓度可以从2×SSC(低严格条件)到0.2×SSC(高严格条件)的条件进行选择。洗涤步骤
的温度，例如，可以在从室温(低严格条件)到65℃(高严格条件)的条件进行选择。备选
地，盐浓度和温度都是可以变化的。
是10×SSC)的溶液中形 成，并且然后，将这一杂交体在50℃用2×SSC洗涤(Molecular
Biology(分子生物学)，John Wiley和Sons，纽约(1989)，6.3.1-6.3.6)。洗涤步骤的盐
浓度可以从2×SSC(低严格条件)到0.2×SSC(高严格条件)的条件进行选择。洗涤步骤
的温度，例如，可以在从室温(低严格条件)到65℃(高严格条件)的条件进行选择。备选
地，盐浓度和温度都是可以变化的。
[0189] 具有在(g)中所述的氨基酸序列的蛋白是指在昆虫肽基-二肽酶A中存在于棉蚜中的肽基-二肽酶A，并且包括包含(a)中所述的氨基酸序列的蛋白。
[0190] 例如，具有在组B中所示的氨基酸序列的蛋白可以按照下文所述的方法使用编码在组B中所示的氨基酸序列的多聚核苷酸进行制备。
[0191] 昆虫肽基-二肽酶A可以用作提供评估杀虫活性的指示的试剂。具体地，例如，昆虫肽基-二肽酶A可以通过用作肽基-二肽酶A用于使用肽基-二肽酶A测定杀虫能力的
方法中而提供评估杀虫活性的指示的试剂。另外，更特别的方法可以按照前文所述的检测
肽基-二肽酶A活性的方法而进行。
方法中而提供评估杀虫活性的指示的试剂。另外，更特别的方法可以按照前文所述的检测
肽基-二肽酶A活性的方法而进行。
[0192] 另外，当昆虫肽基-二肽酶A用作提供评估杀虫活性的指示的试剂时，更优选地，理想的是昆虫肽基-二肽酶A是具有在组B中所示的氨基酸序列的肽基-二肽酶A。
[0193] 具有编码在组B中所示的氨基酸序列的核苷酸序列的多聚核苷酸(以下，在一些情形中叫作多聚核苷酸组B)具有可以在生物体的细胞中或体外翻译系统中产生具有组B
中所示的氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列。多聚核苷酸组B可以是从天然克隆的DNA、向从
天然克隆的DNA中引入核苷酸的删除、取代或添加的DNA，例如，通过基因定点诱变或随机
诱变，或人工合成的DNA。具体地，实例包括包含由SEQ ID NO：2代表的核苷酸序列的多聚核苷酸。
中所示的氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列。多聚核苷酸组B可以是从天然克隆的DNA、向从
天然克隆的DNA中引入核苷酸的删除、取代或添加的DNA，例如，通过基因定点诱变或随机
诱变，或人工合成的DNA。具体地，实例包括包含由SEQ ID NO：2代表的核苷酸序列的多聚核苷酸。
[0194] <第一种获得方法>
[0195] 例如，将在下文中显示获得包含多聚核苷酸组B中所包含的核苷酸序列SEQ IDNO：2的多聚核苷酸的方法。作为一个步骤，总RNA从棉蚜获得， 合成cDNA文库，并且进行PCR扩增，由此可以获得目的多聚核苷酸。
[0196] 将在盆栽黄瓜的叶片上培养的一群棉蚜(Aphis gossypii)的成虫和卵用小刷子从叶片表面刮下，并且将630mg得到的群体用研钵和研棒在液氮中压成粉末。从得到的冷
冻压碎的粉末中使用RNA提取试剂ISOGEN(由Nippon基因制备)如下分离RNA。在将10ml
ISOGEN加入到在研钵中冷冻压碎的粉末中后，将所述压碎的粉末碾磨10分钟，同时保持
在冰上。碾磨后，将流体样品用移液管转移到15ml试管中，并且向其中加入2ml氯仿(由
Wako纯化学工业有限公司(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)制备)。立即将混合
物用力振荡15秒，然后在室温静置3分钟。然后，将得到的混合物在4℃以12,000xg离心
15分钟，并且将每5ml水相层转移到两个新管中。在将5ml ISOGEN加入到每一管中后，将
混合物立即用力振荡15秒，并且然后在室温静置3分钟。然后，将得到的混合物在4℃以
12,000xg离心15分钟，并且将每10ml水相层分别转移到新的50ml管中。随后，将10ml异
丙醇(由Wako纯化学工业有限公司制备)加入到每一管中，并且将混合物在冰上放置30
分钟。将得到的混合物在4℃以12,000xg离心10分钟以沉淀RNA。去除上清后，向剩余物
中加入20ml 70％乙醇。将得到的混合物在4℃以10,000xg离心5分钟。去除上清后，将
总RNA的沉淀稍微干燥，并且然后溶解在1ml商购的不含RNA酶的水(Nacalai Tesque有
限公司)中。在260nm检测制备的总RNA的吸收，以按照常规方法计算浓度。
冻压碎的粉末中使用RNA提取试剂ISOGEN(由Nippon基因制备)如下分离RNA。在将10ml
ISOGEN加入到在研钵中冷冻压碎的粉末中后，将所述压碎的粉末碾磨10分钟，同时保持
在冰上。碾磨后，将流体样品用移液管转移到15ml试管中，并且向其中加入2ml氯仿(由
Wako纯化学工业有限公司(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)制备)。立即将混合
物用力振荡15秒，然后在室温静置3分钟。然后，将得到的混合物在4℃以12,000xg离心
15分钟，并且将每5ml水相层转移到两个新管中。在将5ml ISOGEN加入到每一管中后，将
混合物立即用力振荡15秒，并且然后在室温静置3分钟。然后，将得到的混合物在4℃以
12,000xg离心15分钟，并且将每10ml水相层分别转移到新的50ml管中。随后，将10ml异
丙醇(由Wako纯化学工业有限公司制备)加入到每一管中，并且将混合物在冰上放置30
分钟。将得到的混合物在4℃以12,000xg离心10分钟以沉淀RNA。去除上清后，向剩余物
中加入20ml 70％乙醇。将得到的混合物在4℃以10,000xg离心5分钟。去除上清后，将
总RNA的沉淀稍微干燥，并且然后溶解在1ml商购的不含RNA酶的水(Nacalai Tesque有
限公司)中。在260nm检测制备的总RNA的吸收，以按照常规方法计算浓度。
[0197] 应用通过上述方法获得的棉蚜总RNA作为模板，并且按照附在试剂上的手册使用随机引物(由Invitrogen制备)和superscript III(由Invitrogen制备)进行RT-PCR，
以合成cDNA文库。
以合成cDNA文库。
[0198] 应用通过上述方法获得的棉蚜cDNA文库作为模板，并且按照附在试剂上的手册使用包含核苷酸序列SEQ ID NO：3的寡核苷酸引物和包含核苷酸序列SEQ ID NO：4的寡核
苷酸引物以及PfuUtra高保真聚合酶(由Stratagene制备)进行PCR。PCR的条件如下：
在94℃温育10分钟；然后是40个PCR循环，一个循环为94℃ 15秒，60℃ 15秒和72℃ 3
分钟；并且接着在72℃温育7分钟。
苷酸引物以及PfuUtra高保真聚合酶(由Stratagene制备)进行PCR。PCR的条件如下：
在94℃温育10分钟；然后是40个PCR循环，一个循环为94℃ 15秒，60℃ 15秒和72℃ 3
分钟；并且接着在72℃温育7分钟。
[0199] 如上文所述，可以获得包含核苷酸序列SEQ ID NO：2的多聚核苷酸。
[0200] <第二种获得方法>
[0201] 备选地，在多聚核苷酸组B中所示的多聚核苷酸还可以通过制备具有由下列方法引入其中的突变的多聚核苷酸而获得：应用为上文提及的基因定点诱变的amber突变的方
法、通过使用引入突变等的引物使用包含核苷酸序列SEQ ID NO：2的多聚核苷酸作为模板
的PCR方法。
法、通过使用引入突变等的引物使用包含核苷酸序列SEQ ID NO：2的多聚核苷酸作为模板
的PCR方法。
[0202] <第三种获得方法>
[0203] 备选地，在多聚核苷酸组B中所示的多聚核苷酸还可以通过使用包含核苷酸序列SEQ ID NO：2的多聚核苷酸作为探针的杂交方法而获得。更具体地，第三种获得方法可以
按照在前文提及的由冷泉港实验出版社出版的Sambrook J.，Frisch E.F.，Maniatis T.，分子克隆第二版中所述的常规杂交而进行。
按照在前文提及的由冷泉港实验出版社出版的Sambrook J.，Frisch E.F.，Maniatis T.，分子克隆第二版中所述的常规杂交而进行。
[0204] <第四种获得方法>
[0205] 备选地，在多聚核苷酸组B中所示的多聚核苷酸还可以通过基于已知的昆虫肽基-二肽酶A的氨基酸序列制备引物并且进行PCR而获得。为了从其它昆虫物种如德国蟑
螂(德国小蠊(Blatella germanica))分离肽基-二肽酶A的同系物，应用Codehop程序
(在由Fred Hutchinson癌症研究中心管理的Blocks蛋白质分析服务器(Blocks Protein
Analysis Server)的网址 http://blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.html公共可用)，
并且基于前文提及的来源于棉蚜的肽基-二肽酶A基因序列和先前已知的蚕基因(NCBI
登记号AB026110.1)，刚比亚按蚊基因(AAAB01008980)，黑腹果蝇基因(NP_477046.1，
AAN10856，AAF52693)，和西方角蝇基因(Q10715)的核苷酸序列，设计简并引物。
螂(德国小蠊(Blatella germanica))分离肽基-二肽酶A的同系物，应用Codehop程序
(在由Fred Hutchinson癌症研究中心管理的Blocks蛋白质分析服务器(Blocks Protein
Analysis Server)的网址 http://blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.html公共可用)，
并且基于前文提及的来源于棉蚜的肽基-二肽酶A基因序列和先前已知的蚕基因(NCBI
登记号AB026110.1)，刚比亚按蚊基因(AAAB01008980)，黑腹果蝇基因(NP_477046.1，
AAN10856，AAF52693)，和西方角蝇基因(Q10715)的核苷酸序列，设计简并引物。
[0206] 在选择的昆虫物种中的肽基-二肽酶A基因同系物的部分序列通过一系列PCR扩增，所述PCR使用来源于昆虫物种的第一链cDNA作为模板。在此处，所述作为模板的第一链cDNA通过前文提及的方法使用Superscript III制备。PCR扩增使用作为正向引物和反向
引物的一套简并引物以及Amplitaq Gold(由应用生物系统(Applied Biosystems)制备)
按照附在所述试剂上的生产商的方法而进行。PCR条件为在94℃ 10分钟；然后 是40个
PCR循环，一个循环为94℃30秒，45℃1分钟和72℃每1kb长度的预计扩增产物1分钟；
并且接着在72℃7分钟。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以获得目的DNA。
此外，将获得的DNA克隆到pCR-XL-TOPO载体(由Invitrogen制备)中，并且测序。
引物的一套简并引物以及Amplitaq Gold(由应用生物系统(Applied Biosystems)制备)
按照附在所述试剂上的生产商的方法而进行。PCR条件为在94℃ 10分钟；然后 是40个
PCR循环，一个循环为94℃30秒，45℃1分钟和72℃每1kb长度的预计扩增产物1分钟；
并且接着在72℃7分钟。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以获得目的DNA。
此外，将获得的DNA克隆到pCR-XL-TOPO载体(由Invitrogen制备)中，并且测序。
[0207] 然后，设计对所得到的肽基-二肽酶A基因的昆虫同系物的部分序列特异的引物，并且进行3’RACE PCR或5’RACE PCR，以获得所述基因的全长序列。3’和5’RACE PCRs这样进行，即，应用从昆虫总RNA制备的第一链cDNA作为模板，并且使用SMART PCR cDNA合
成试剂盒(由Clontech制备)按照附在所述试剂盒上的生产商的用法指导而进行。
成试剂盒(由Clontech制备)按照附在所述试剂盒上的生产商的用法指导而进行。
[0208] 在3’RACE和5’RACE反应中，在SMART PCR cDNA合成试剂盒中包含的通用引物混合物(UPM)与对目的序列特异的正向引物或反向引物组合使用。PCR条件为在94℃10分
钟1个循环；然后40个PCR循环，一个循环为94℃15秒，63℃15秒和72℃每1kb长度的
预计扩增产物1分钟；并且接着在72℃7分钟1个循环。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶
电泳进行分析和纯化，以获得目的DNA。此外，将获得的DNA克隆到pCR-XL-TOPO载体(由
Invitrogen制备)中，并且测序。
钟1个循环；然后40个PCR循环，一个循环为94℃15秒，63℃15秒和72℃每1kb长度的
预计扩增产物1分钟；并且接着在72℃7分钟1个循环。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶
电泳进行分析和纯化，以获得目的DNA。此外，将获得的DNA克隆到pCR-XL-TOPO载体(由
Invitrogen制备)中，并且测序。
[0209] 当通过第一轮PCR没有获得明显的扩增产物时，使用第一轮PCR产物作为模板进行嵌套式PCR。关于引物，在SMART PCR cDNA合成试剂盒中包含的NUP引物与特异的正向
引物或特异的反向引物组合使用，所述特异的正向引物或特异的反向引物设计成与第一轮
目的PCR产物的内部序列结合。PCR条件为在94℃10分钟1个循环；然后40个PCR循环，
一个循环为94℃15秒，63℃15秒和72℃2分钟；并且接着在72℃7分钟1个循环。得到
的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以获得目的DNA。此外，将获得的DNA克
隆到pCR-XL-TOPO载体(由Invitrogen制备)中，并且测序。
引物或特异的反向引物组合使用，所述特异的正向引物或特异的反向引物设计成与第一轮
目的PCR产物的内部序列结合。PCR条件为在94℃10分钟1个循环；然后40个PCR循环，
一个循环为94℃15秒，63℃15秒和72℃2分钟；并且接着在72℃7分钟1个循环。得到
的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以获得目的DNA。此外，将获得的DNA克
隆到pCR-XL-TOPO载体(由Invitrogen制备)中，并且测序。
[0210] 上述测序结果显示5’-端序列和3’-端序列，每一个分别编码昆虫肽基-二肽酶A的N-端区域和C-端区域。
[0211] 因此，在多聚核苷酸组B中所示的多聚核苷酸可以通过基于已知的昆虫肽基-二肽酶A的氨基酸序列制备引物通过PCR而获得。
[0212] 具有与多聚核苷酸组B的多聚核苷酸序列互补的核苷酸序列的多聚 核苷酸可以用来应用杂交方法获得在多聚核苷酸组B中所示的多聚核苷酸。
[0213] 本发明中的获得方法包括通过杂交检测需要的多聚核苷酸的步骤，鉴定所检测的需要的多聚核苷酸的步骤，和回收所鉴定的需要的多聚核苷酸的步骤。每一步骤将在下文
中具体阐释。
中具体阐释。
[0214] 通过杂交检测需要的多聚核苷酸的步骤和鉴定所检测的需要的多聚核苷酸的步骤可以这样进行，即，通过使用具有与多聚核苷酸组B的核苷酸序列互补的核苷酸序
列的多聚核苷酸作为探针，按照例如“MolecularCloning：A Laboratory Manual 2nd
edition(分子克隆：实验室手册第二版)”(1989)，冷泉港实验室出版社，“Current
Protocols In Molecular Biology(当代分子生物学方法)”(1987)，John Wiley和Sons
有限公司ISBN0-471-50338-X等中所述的方法进行。
列的多聚核苷酸作为探针，按照例如“MolecularCloning：A Laboratory Manual 2nd
edition(分子克隆：实验室手册第二版)”(1989)，冷泉港实验室出版社，“Current
Protocols In Molecular Biology(当代分子生物学方法)”(1987)，John Wiley和Sons
有限公司ISBN0-471-50338-X等中所述的方法进行。
[0215] 具体地，例如，将具有与SEQ ID NO：2代表的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA通过已知的方法用放射性同位素或荧光标记进行标记，其使用随机引发的DNA标记
试剂盒(Random Primed DNA Labelling Kit，由Boehringer制备)、随机引物DNA标
记试剂盒Ver.2(由TAKARA SHUZO有限公司制备)、ECL直接核酸标记和检测系统(ECL
Direct Nucleic AcidLabelling and Ditection System，由(Amersham生物科学制备)，
或Megaprime DNA-标记系统(由Amersham生物科学制备)进行标记，并且这可以用作探
针。
试剂盒(Random Primed DNA Labelling Kit，由Boehringer制备)、随机引物DNA标
记试剂盒Ver.2(由TAKARA SHUZO有限公司制备)、ECL直接核酸标记和检测系统(ECL
Direct Nucleic AcidLabelling and Ditection System，由(Amersham生物科学制备)，
或Megaprime DNA-标记系统(由Amersham生物科学制备)进行标记，并且这可以用作探
针。
[0216] 用于杂交的条件的实例包括严格条件，并且具体地，实例包括这样的条件，即，在所述条件下，在65℃在存在6×SSC(0.9M NaCl，0.09M柠檬酸钠)、5×Denhart’s杂交溶液(0.1％(w/v)菲克400，0.1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮，0.1％BSA)、0.5％(w/v)SDS和
100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA下，或者在含有100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA的DIG便易
杂交溶液(DIGEASY Hby solution，Boehringer Mamnnheim)中进行温育，然后，在室温在存在1×SSC(0.15m NaCl，0.015m柠檬酸钠)和0.5％SDFS下进行温育两次持续15分钟，并且
此外，在68℃在存在0.1×SSC(0.015m NaCl，0.0015m柠檬酸钠)和0.5％SDS下进行温育
持续30分钟。更具体地，例如，可以通过应用具有与多聚核苷酸组B的核苷酸序列互补的核苷酸序列 的多聚核苷酸作为模板，使用Megaprime DNA-标记系统(由AmershamPharmacia
32
生物技术制备)并且使用在试剂盒中指定的反应溶液，而制备用 p标记的探针。使用这
一探针按照常规方法进行菌落杂交，在65℃在存在6×SSC(0.9M NaCl，0.09M柠檬酸钠)、
5×Denhart’s杂交溶液(0.1％(w/v)菲克400，0.1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮，0.1％BSA)、
0.5％(w/v)SDS和100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA下，或者在含有100μg/ml变性的鲑鱼
精子DNA的DIG便易杂交溶液(DIG EASY Hby solution，BoehringerMamnnheim)中进行温
育，然后，在室温在存在1×SSC(0.15m NaCl，0.015m柠檬酸钠)和0.5％SDS下进行温育两
次持续1 5分钟，并且此外，在68℃在存在0.1×SSC(0.015m NaCl，0.0015m柠檬酸钠)和
0.5％SDS下进行温育持续30分钟，由此可以检测(包含)杂交的多聚核苷酸(的菌落)。
因此，可以通过杂交检测需要的多聚核苷酸，并且可以鉴定所检测的需要的多聚核苷酸。 [0217] 对于回收所鉴定的需要的多聚核苷酸，可以通过前文提及的方法，例如，按照如在“分子克隆：实验室手册第二版”(1989)，冷泉港实验室出版社中所述的碱方法的方法，从含有所检测并且鉴定的多聚核苷酸的菌落回收质粒DNA。所回收的需要的多聚核苷酸(质粒
DNA)的核苷酸序列可以通过马克萨姆吉尔伯特方法(Maxam Gilbert method) (例如，在
Maxam，A.M和W.Gilbert，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，74，560，1977等中所述)或桑格方法(Sanger method)(例如，在Sanger，F.和A.R.Coulson，J.Mol.
Biol.(分子生物学杂志)，94，441，1975，Sanger，F.和Nicklen和A.R.Coulson.，Proc.
Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，74，5463，1977等中所述)进行验证。因此，例如，可以使用商购的Termo测序酶II染色终止子循环测序试剂盒(由Amersham生物科学
制备)、染色终止子循环测序FS快速反应试剂盒(由应用生物系统(AppliedBiosystems)
制备)等。
100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA下，或者在含有100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA的DIG便易
杂交溶液(DIGEASY Hby solution，Boehringer Mamnnheim)中进行温育，然后，在室温在存在1×SSC(0.15m NaCl，0.015m柠檬酸钠)和0.5％SDFS下进行温育两次持续15分钟，并且
此外，在68℃在存在0.1×SSC(0.015m NaCl，0.0015m柠檬酸钠)和0.5％SDS下进行温育
持续30分钟。更具体地，例如，可以通过应用具有与多聚核苷酸组B的核苷酸序列互补的核苷酸序列 的多聚核苷酸作为模板，使用Megaprime DNA-标记系统(由AmershamPharmacia
32
生物技术制备)并且使用在试剂盒中指定的反应溶液，而制备用 p标记的探针。使用这
一探针按照常规方法进行菌落杂交，在65℃在存在6×SSC(0.9M NaCl，0.09M柠檬酸钠)、
5×Denhart’s杂交溶液(0.1％(w/v)菲克400，0.1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮，0.1％BSA)、
0.5％(w/v)SDS和100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA下，或者在含有100μg/ml变性的鲑鱼
精子DNA的DIG便易杂交溶液(DIG EASY Hby solution，BoehringerMamnnheim)中进行温
育，然后，在室温在存在1×SSC(0.15m NaCl，0.015m柠檬酸钠)和0.5％SDS下进行温育两
次持续1 5分钟，并且此外，在68℃在存在0.1×SSC(0.015m NaCl，0.0015m柠檬酸钠)和
0.5％SDS下进行温育持续30分钟，由此可以检测(包含)杂交的多聚核苷酸(的菌落)。
因此，可以通过杂交检测需要的多聚核苷酸，并且可以鉴定所检测的需要的多聚核苷酸。 [0217] 对于回收所鉴定的需要的多聚核苷酸，可以通过前文提及的方法，例如，按照如在“分子克隆：实验室手册第二版”(1989)，冷泉港实验室出版社中所述的碱方法的方法，从含有所检测并且鉴定的多聚核苷酸的菌落回收质粒DNA。所回收的需要的多聚核苷酸(质粒
DNA)的核苷酸序列可以通过马克萨姆吉尔伯特方法(Maxam Gilbert method) (例如，在
Maxam，A.M和W.Gilbert，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，74，560，1977等中所述)或桑格方法(Sanger method)(例如，在Sanger，F.和A.R.Coulson，J.Mol.
Biol.(分子生物学杂志)，94，441，1975，Sanger，F.和Nicklen和A.R.Coulson.，Proc.
Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，74，5463，1977等中所述)进行验证。因此，例如，可以使用商购的Termo测序酶II染色终止子循环测序试剂盒(由Amersham生物科学
制备)、染色终止子循环测序FS快速反应试剂盒(由应用生物系统(AppliedBiosystems)
制备)等。
[0218] 具有多聚核苷酸组B的核苷酸序列的部分核苷酸序列的多聚核苷酸或具有与所述部分核苷酸序列互补的核苷酸序列的多聚核苷酸可以用来使用PCR获得在多聚核苷酸
组B中所示的多聚核苷酸。更具体地，实例包括包含由SEQ ID NO：3或4代表的核苷酸序
列的多聚核苷酸。本发明中的 获得方法包括通过PCR扩增需要的多聚核苷酸的步骤，鉴定
所扩增的需要的多聚核苷酸的步骤，和回收所鉴定的需要的多聚核苷酸的步骤。每一步骤
将在下文中具体阐释。
组B中所示的多聚核苷酸。更具体地，实例包括包含由SEQ ID NO：3或4代表的核苷酸序
列的多聚核苷酸。本发明中的 获得方法包括通过PCR扩增需要的多聚核苷酸的步骤，鉴定
所扩增的需要的多聚核苷酸的步骤，和回收所鉴定的需要的多聚核苷酸的步骤。每一步骤
将在下文中具体阐释。
[0219] 在通过PCR扩增需要的多聚核苷酸的步骤中，具体地，基于约20bp-约40bp的核苷酸序列，例如，选自由SEQ ID NO：2代表的核苷酸序列和与SEQ ID NO：2代表的核苷酸
序列有互补性的序列的核苷酸序列，从多聚核苷酸组B的核苷酸序列的部分核苷酸序列或
与所述部分核苷酸序列有互补性的核苷酸序列设计并且合成的DNA可以用作引物对。引物
对的实例包括一套包含SEQ ID NO：3代表的核苷酸序列的多聚核苷酸和包含SEQ ID NO：
4代表的核苷酸序列的多聚核苷酸。例如，通过将商购的PCR试剂盒指定的反应溶液添加
到通过前文提及的方法制备的cDNA文库中而制备PCR反应溶液。反应条件可以变化，这取
决于要用的引物对，并且例如，可以应用下列条件：这样的条件，即在所述条件下，在94℃温育10秒钟后，重复大约40个循环，1个循环为94℃15秒，60℃15秒，和72℃3分钟，并
且继续在72℃进行温育3分钟；这样的条件，即在所述条件下，在94℃进行温育2分钟，然
后在约8℃进行温育3分钟，并且然后重复大约40个循环，1个循环为94℃30秒，55℃30
秒，和72℃4分钟；或者这样的条件，即在所述条件下，进行5-10个循环，1个循环为94℃5秒，然后72℃4分钟，并且继续进行约20-40个循环，1个循环为在94℃温育5秒，然后在
70℃4分钟。在PCR中，例如，可以使用PfuUltra高保真度聚合酶(由Stratagene制备)，
Amplitaq Gold(由应用生物系统制备)，Takara Heraculase(商标名)(由TAKARA SHUZO
有限公司制备)，包含在便利cDNA PCR试剂盒(Advantage cDNA PCR Kit)中的DNA聚合
酶(由Clonetech制备)，TaKaRa Ex Taq(由TAKARA SHUZO有限公司制备)，PLATINUMTM
PCR超级混合物(由东方生命技术(Lifetech Oriental)制备)。
序列有互补性的序列的核苷酸序列，从多聚核苷酸组B的核苷酸序列的部分核苷酸序列或
与所述部分核苷酸序列有互补性的核苷酸序列设计并且合成的DNA可以用作引物对。引物
对的实例包括一套包含SEQ ID NO：3代表的核苷酸序列的多聚核苷酸和包含SEQ ID NO：
4代表的核苷酸序列的多聚核苷酸。例如，通过将商购的PCR试剂盒指定的反应溶液添加
到通过前文提及的方法制备的cDNA文库中而制备PCR反应溶液。反应条件可以变化，这取
决于要用的引物对，并且例如，可以应用下列条件：这样的条件，即在所述条件下，在94℃温育10秒钟后，重复大约40个循环，1个循环为94℃15秒，60℃15秒，和72℃3分钟，并
且继续在72℃进行温育3分钟；这样的条件，即在所述条件下，在94℃进行温育2分钟，然
后在约8℃进行温育3分钟，并且然后重复大约40个循环，1个循环为94℃30秒，55℃30
秒，和72℃4分钟；或者这样的条件，即在所述条件下，进行5-10个循环，1个循环为94℃5秒，然后72℃4分钟，并且继续进行约20-40个循环，1个循环为在94℃温育5秒，然后在
70℃4分钟。在PCR中，例如，可以使用PfuUltra高保真度聚合酶(由Stratagene制备)，
Amplitaq Gold(由应用生物系统制备)，Takara Heraculase(商标名)(由TAKARA SHUZO
有限公司制备)，包含在便利cDNA PCR试剂盒(Advantage cDNA PCR Kit)中的DNA聚合
酶(由Clonetech制备)，TaKaRa Ex Taq(由TAKARA SHUZO有限公司制备)，PLATINUMTM
PCR超级混合物(由东方生命技术(Lifetech Oriental)制备)。
[0220] 通过PCR扩增的需要的多聚核苷酸的鉴定可以通过琼脂糖凝胶电泳按照“分子克隆：实验室手册第二版”(1989)，冷泉港实验室出版社中所述的方法检测分子量而进行。另外，关于所扩增的需要的多聚核苷酸，使用商购的DNA测序反应试剂盒，例如，染色终止子循环测序FS快速反应试剂盒(由应用生物系统制备)按照附在试剂盒上的手册进行测序
反应， 并且使用DNA测序仪3100(由应用生物系统制备)分析核苷酸，由此，可以读取扩增
片段的核苷酸序列。
反应， 并且使用DNA测序仪3100(由应用生物系统制备)分析核苷酸，由此，可以读取扩增
片段的核苷酸序列。
[0221] 回收所鉴定的需要的多聚核苷酸的方法的实例包括按照“分子克隆：实验室手册第二版”(1989)，冷泉港实验室出版社中所述的方法从琼脂糖凝胶纯化并且回收通过琼脂
糖凝胶电泳鉴定的前文提及的多聚核苷酸的方法。另外，这样回收的多聚核苷酸或通过PCR扩增的需要的多聚核苷酸可以按照“分子克隆：实验室手册第二版”(1989)，冷泉港实验
室出版社中所述的方法、和“当代分子生物学方法”(1987)，John Wiley和Sons有限公司
ISBN0-471-50338-X中所述的方法克隆到载体中。要用的载体实例包括pUCA119(由TAKARA
SHUZO有限公司制备)，pTVA118N(由TAKARA SHUZO有限公司制备)，pBluescriptII(由
Toyobo有限公司制备)，pCR2.1-TOPO(由Invitrogen制备)等。另外，克隆的多聚核苷酸
的核苷酸序列可以通过马克萨姆吉尔伯特方法(Maxam Gilbert method)(例如，在Maxam，
A.M和W.Gilbert，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，74，560，1977中所
述)或桑格方法(Sanger method)(例如，在Sanger，F.和A.R.Coulson，J.Mol.Biol.(分
子生物学杂志)，94，441，1975，Sanger，F.和Nicklen和A.R.Coulson.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，74，5463，1977中所述)进行验证。因此，例如，可以使用商购的Termo测序酶II染色终止子循环测序试剂盒(由Amersham生物科学制备)、染色终
止子循环测序FS快速反应试剂盒(由应用生物系统(AppliedBiosystems)制备)等。
糖凝胶电泳鉴定的前文提及的多聚核苷酸的方法。另外，这样回收的多聚核苷酸或通过PCR扩增的需要的多聚核苷酸可以按照“分子克隆：实验室手册第二版”(1989)，冷泉港实验
室出版社中所述的方法、和“当代分子生物学方法”(1987)，John Wiley和Sons有限公司
ISBN0-471-50338-X中所述的方法克隆到载体中。要用的载体实例包括pUCA119(由TAKARA
SHUZO有限公司制备)，pTVA118N(由TAKARA SHUZO有限公司制备)，pBluescriptII(由
Toyobo有限公司制备)，pCR2.1-TOPO(由Invitrogen制备)等。另外，克隆的多聚核苷酸
的核苷酸序列可以通过马克萨姆吉尔伯特方法(Maxam Gilbert method)(例如，在Maxam，
A.M和W.Gilbert，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，74，560，1977中所
述)或桑格方法(Sanger method)(例如，在Sanger，F.和A.R.Coulson，J.Mol.Biol.(分
子生物学杂志)，94，441，1975，Sanger，F.和Nicklen和A.R.Coulson.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，74，5463，1977中所述)进行验证。因此，例如，可以使用商购的Termo测序酶II染色终止子循环测序试剂盒(由Amersham生物科学制备)、染色终
止子循环测序FS快速反应试剂盒(由应用生物系统(AppliedBiosystems)制备)等。
[0222] 另外，具有多聚核苷酸组B的核苷酸序列的部分核苷酸序列的多聚核苷酸或具有与所述部分核苷酸序列互补的核苷酸序列的多聚核苷酸可以用来获得多聚核苷酸组B中
所示的多聚核苷酸，其不但使用PCR方法还使用前文提及的杂交方法。更具体地，实例包括包含由SEQ ID NO：3或4代表的核苷酸序列的多聚核苷酸。
所示的多聚核苷酸，其不但使用PCR方法还使用前文提及的杂交方法。更具体地，实例包括包含由SEQ ID NO：3或4代表的核苷酸序列的多聚核苷酸。
[0223] 制备具有在组B中所示的氨基酸序列的蛋白的方法的实例包括培养其中引入选自多聚核苷酸组B的多聚核苷酸的转化体并且回收所生产的蛋白的方法。另外，为了制备
本文所用的转化体，其为这样的工作，诸如制备包含这样的多聚核苷酸的环形多聚核苷酸，即，在所述多聚核苷酸中， 选自多聚核苷酸组B的多聚核苷酸可操作性地与来源于杆状病
毒的启动子连接。所述方法将在下文详细阐述。
本文所用的转化体，其为这样的工作，诸如制备包含这样的多聚核苷酸的环形多聚核苷酸，即，在所述多聚核苷酸中， 选自多聚核苷酸组B的多聚核苷酸可操作性地与来源于杆状病
毒的启动子连接。所述方法将在下文详细阐述。
[0224] 另外，通过类似的方法，使用具有编码所用的肽基-二肽酶A的核苷酸序列的多聚核苷酸，可以制备并且获得在组A中所示的肽基-二肽酶A，所述肽基-二肽酶A用于使用
肽基-二肽酶A来测定杀虫能力的方法中。
肽基-二肽酶A来测定杀虫能力的方法中。
[0225] 杆状病毒是属于各种组的感染许多不同物种的昆虫作为它们的天然宿主的大双链DNA病毒中的病毒。杆状病毒基因组在感染的宿主细胞的细胞核中复制并且转录，在所
述宿主细胞的细胞核中大的环形杆状病毒DNA(80-200kb)包装成杆状核壳体。用于外源
基因表达的分离体的实例为苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(Autographa californica
multiple nuclearpolyhedrosis virus(AcMNPV))和家蚕蛾(Bombyx mori)(蚕)核型多角
体病毒(BmNPV)。
述宿主细胞的细胞核中大的环形杆状病毒DNA(80-200kb)包装成杆状核壳体。用于外源
基因表达的分离体的实例为苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(Autographa californica
multiple nuclearpolyhedrosis virus(AcMNPV))和家蚕蛾(Bombyx mori)(蚕)核型多角
体病毒(BmNPV)。
[0226] 杆状病毒来源的启动子意指包含在杆状病毒基因组中的基因的启动子。在它们当中，用于表达外源基因的杆状病毒启动子的实例包括多角体蛋白基因的启动子，和p10基
因的启动子(Harris和Polayes(1997).Focus(焦点)19，6-8)。
因的启动子(Harris和Polayes(1997).Focus(焦点)19，6-8)。
[0227] 多角体蛋白(多角体)基因的启动子是编码多角体蛋白的基因的启动子，所述多角体蛋白是当杆状病毒感染昆虫细胞时所产生的细胞核内内含体的主要成分。多角体蛋白
不是复制病毒必需的蛋白，并且通过用目的蛋白的基因取代它的基因，可以表达数量达到
细胞蛋白50％的目的蛋白。
不是复制病毒必需的蛋白，并且通过用目的蛋白的基因取代它的基因，可以表达数量达到
细胞蛋白50％的目的蛋白。
[0228] 在本发明中，“可操作性地连接”意指将包含目的基因的多聚核苷酸连接到包含启动子序列的多聚核苷酸的下游，以便目的基因可以在所用的转录系统中进行转录。具体地，例如，当使用后来描述的多角体蛋白基因的启动子时，包含目的基因的多聚核苷酸可以连接到多角体蛋白基因启动子的下游。另外，例如，当使用除多角体蛋白基因启动子之外的启动子时，还可以将包含目的基因的多聚核苷酸连接到包含除多角体蛋白基因启动子以外的
启动子序列的多聚核苷酸的下游。更具体地，例如，当使用利用多角体蛋白基因启动子的质粒pFastbacHT(由Invitrogen制备)载体时，可以通过将目的基因连接到位于多角体蛋白
基因启动子下游的限制酶位点如BamHI，EcoRI，SalI，SpeI，NotI，XbaI，PstI，XhoI，SphI，KpnI和HindIII而可 操作性地连接多聚核苷酸。
启动子序列的多聚核苷酸的下游。更具体地，例如，当使用利用多角体蛋白基因启动子的质粒pFastbacHT(由Invitrogen制备)载体时，可以通过将目的基因连接到位于多角体蛋白
基因启动子下游的限制酶位点如BamHI，EcoRI，SalI，SpeI，NotI，XbaI，PstI，XhoI，SphI，KpnI和HindIII而可 操作性地连接多聚核苷酸。
[0229] 在本发明中，“环形多聚核苷酸”是通过将多聚核苷酸链的末端结合而制成环形的多聚核苷酸，并且实例包括除了质粒DNA、杆状病毒穿梭载体DNA等以外的许多细菌的染色体DNA。
[0230] 质粒DNA是相对低分子量的环形多聚核苷酸，并且实例包括pET(由Takara Mirus生物有限公司制备)和pBluescriptII(由Stratagene制备)，其用于在大肠杆菌(E.coli)
中克隆和表达。其它实例包括pFastBac1，pFastBac HTA，pFastBac HT B，pFastBac HT C，pFastBac Dual，pBlueBacII(由Invitrogen制备)，pAcSG2(由Pharmingen制备)等，其
包含杆状病毒表达盒。
中克隆和表达。其它实例包括pFastBac1，pFastBac HTA，pFastBac HT B，pFastBac HT C，pFastBac Dual，pBlueBacII(由Invitrogen制备)，pAcSG2(由Pharmingen制备)等，其
包含杆状病毒表达盒。
[0231] 杆状病毒穿梭载体是由BAC(细菌人工染色体)组成的高分子量DNA，所述BACTM
包含完整的杆状病毒基因组，例如在DH10Bac 大肠杆菌细胞(invitrogen)中存在的
bMON14272(136kb)。杆状病毒穿梭载体DNA在大肠杆菌细胞中作为大质粒增殖，并且可以
包含用于在杆状病毒启动子控制下表达外源基因的表达盒。
包含完整的杆状病毒基因组，例如在DH10Bac 大肠杆菌细胞(invitrogen)中存在的
bMON14272(136kb)。杆状病毒穿梭载体DNA在大肠杆菌细胞中作为大质粒增殖，并且可以
包含用于在杆状病毒启动子控制下表达外源基因的表达盒。
[0232] 在其中将包含编码在组B中所示的氨基酸序列的核苷酸序列的多聚核苷酸可操作性地连接到杆状病毒来源的启动子上的环形多聚核苷酸特异地为，例如，包含含有与杆
状病毒的多角体蛋白启动子可操作性地连接的棉蚜肽基-二肽酶A基因的DNA的环形多聚
核苷酸，并且例如，可以按照下述方法制备并且获得。
状病毒的多角体蛋白启动子可操作性地连接的棉蚜肽基-二肽酶A基因的DNA的环形多聚
核苷酸，并且例如，可以按照下述方法制备并且获得。
[0233] 将包含按照前文提及的方法克隆的棉蚜肽基-二肽酶A基因的质粒DNA用EcoRI和XhoI消化，并且将得到的包含棉蚜肽基-二肽酶A基因的约1.9kbp DNA片段与预先用
EcoRI和XhoI消化的质粒载体pFastBac HT B(由Invitrogen制备)连接。所获得的质
粒是包含含有与杆状病毒多角体蛋白启动子可操作性连接的棉蚜肽基-二肽酶A基因的
DNA的环形多聚核苷酸的一个实例。另外，按照附在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(由
Invitrogen制备)上的手册，这一质粒可以引入到大肠杆菌(Escherichia coli)DH10Bac
中，并且包含多角体蛋白基因启动子和棉蚜肽基-二肽酶A基因的DNA可以通过在细胞中
重组而插入到杆状病毒穿梭载体DNA中。例如，通过前文提及的方法，可以制备并且获得包含含有与杆状病毒的多角体蛋白启动子可操作性地连接的棉蚜肽基-二肽酶A基因的DNA
的环形多聚核苷酸。
EcoRI和XhoI消化的质粒载体pFastBac HT B(由Invitrogen制备)连接。所获得的质
粒是包含含有与杆状病毒多角体蛋白启动子可操作性连接的棉蚜肽基-二肽酶A基因的
DNA的环形多聚核苷酸的一个实例。另外，按照附在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(由
Invitrogen制备)上的手册，这一质粒可以引入到大肠杆菌(Escherichia coli)DH10Bac
中，并且包含多角体蛋白基因启动子和棉蚜肽基-二肽酶A基因的DNA可以通过在细胞中
重组而插入到杆状病毒穿梭载体DNA中。例如，通过前文提及的方法，可以制备并且获得包含含有与杆状病毒的多角体蛋白启动子可操作性地连接的棉蚜肽基-二肽酶A基因的DNA
的环形多聚核苷酸。
[0234] 类似地，环形多聚核苷酸可以通过将编码在组B中所示的氨基酸序列的核苷酸连接到载体上而制备。
[0235] 在本发明中，“复制起点”是对于自身在宿主细胞中复制所必需的特异的DNA序列。复制起点的实例包括用于细菌质粒的colE1和f1。另外，同源重复(hrs)区域和非-hr区
域存在于杆状病毒穿梭载体DNA中(Pijlman等.(2003)Journal of General Virology(普
通病毒学杂志)84，2669-2678)。
域存在于杆状病毒穿梭载体DNA中(Pijlman等.(2003)Journal of General Virology(普
通病毒学杂志)84，2669-2678)。
[0236] 所述环形多聚核苷酸的一个实例是杆状病毒穿梭载体。在此处，杆状病毒穿梭载体意指杆状病毒穿梭载体(bacmid)DNA。杆状病毒穿梭载体DNA可以增殖并且遗传加工到
大肠杆菌中。当从大肠杆菌分离并且引入到昆虫宿主细胞中时，杆状病毒穿梭载体可以作
为病毒增殖。例如，在bMON14272(invitrogen)情形中，可以在大肠杆菌中产生重组杆状病TM
毒穿梭载体，其通过将包含来自pFastBac 供体质粒的杆状病毒表达盒的mini-Tn7元件转
座到杆状病毒穿梭载体上的mini-attTn7附着位点上而产生。
大肠杆菌中。当从大肠杆菌分离并且引入到昆虫宿主细胞中时，杆状病毒穿梭载体可以作
为病毒增殖。例如，在bMON14272(invitrogen)情形中，可以在大肠杆菌中产生重组杆状病TM
毒穿梭载体，其通过将包含来自pFastBac 供体质粒的杆状病毒表达盒的mini-Tn7元件转
座到杆状病毒穿梭载体上的mini-attTn7附着位点上而产生。
[0237] 用作杆状病毒增殖的宿主并且用于通过重组杆状病毒的方式而表达外源蛋白的宿主的昆虫细胞包括来源于Spodoptera frugiperda或来源于Trichoplusia ni的细胞
系。所述细胞系的实例为Sf21细胞，Sf9细胞，Tn-368或High Five细胞或Mimic Sf9昆
虫细胞(Invitrogen)。
系。所述细胞系的实例为Sf21细胞，Sf9细胞，Tn-368或High Five细胞或Mimic Sf9昆
虫细胞(Invitrogen)。
[0238] 转化体是通过向细胞中引入外源多聚核苷酸而遗传改变的真核细胞或原核细胞。转化体的实例包括通过引入包含杆状病毒表达盒的质粒如质粒载体pFastBac(由
Invitrogen制备)等而转化的大肠杆菌细胞等。另外，将DNA引入宿主细胞的技术的实例
包括转化、转染、原生质体融合、脂转染、电穿孔等。
Invitrogen制备)等而转化的大肠杆菌细胞等。另外，将DNA引入宿主细胞的技术的实例
包括转化、转染、原生质体融合、脂转染、电穿孔等。
[0239] 其中引入编码组B所示的氨基酸序列的多聚核苷酸的转化体的实例包括转化的大肠杆菌，在其中引入包含与杆状病毒多角体蛋白启动子可操作性地连接的棉蚜肽基-二
肽酶A基因的DNA。具体地，所述转化体可以按照下述方法进行制备。
肽酶A基因的DNA。具体地，所述转化体可以按照下述方法进行制备。
[0240] 转化体可以这样制备，即通过按照在“分子克隆：实验室手册第二版”(1989)，冷泉港实验室出版社中所述的方法，将在EcoRI位点和XhoI位点之间插入包含棉蚜肽基-二肽酶A基因的DNA的质粒载体pFastBac HT B (由Invitrogen制备)引入到大肠杆菌细胞中
而制备。另外，转化体还可以通过按照附在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(由Invitrogen
制备)上的手册所述的方法将相同的质粒载体引入到大肠杆菌DH10Bac中而制备。
而制备。另外，转化体还可以通过按照附在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(由Invitrogen
制备)上的手册所述的方法将相同的质粒载体引入到大肠杆菌DH10Bac中而制备。
[0241] 备选地，转化体还可以通过按照附在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(由Invitrogen制备)上的手册所述的方法将其中插入包含多角体蛋白基因启动子和棉蚜肽
基-二肽酶A基因的片段的杆状病毒穿梭载体DNA转染到昆虫细胞中而获得。
基-二肽酶A基因的片段的杆状病毒穿梭载体DNA转染到昆虫细胞中而获得。
[0242] 重组杆状病毒是在其中通过遗传-加工技术而改变杆状病毒基因组序列的杆状病毒。
[0243] 重组杆状病毒的具体的实例包括，包含含有与杆状病毒的多角体蛋白启动子可操作性地连接的棉蚜肽基-二肽酶A基因的DNA片段的重组杆状病毒。重组杆状病毒可以这
样制备，例如，通过杆状病毒DNA和转移载体DNA在昆虫细胞中的同源重组(Kitts(1996)
Cytotechnology(细胞技术学)20，111-123)而制备。备选地，重组杆状病毒还可以这样制
备，例如，通过将按照前文提及的方法制备的包含含有与杆状病毒的多角体蛋白启动子可
操作性地连接的棉蚜肽基-二肽酶A基因的DNA片段的重组杆状病毒穿梭载体DNA引入到
昆虫细胞中而制备。具体地，重组杆状病毒可以通过按照附在Bac-to-Bac杆状病毒表达
系统(由Invitrogen制备)上的手册所述的方法，将包含含有与前文提及的杆状病毒的多
角体蛋白启动子可操作性地连接的棉蚜肽基-二肽酶A基因的DNA片段的重组杆状病毒
穿梭载体DNA转染到昆虫细胞中而制备。更具体地，按照附在Bac-to-Bac杆状病毒(商标
名)表达系统(由Invitrogen制备)上的手册，将所述重组杆状病毒穿梭载体DNA转染
到Sf9细胞(ATCC：CRL-1711)中，以获得重组的杆状病毒。对于转染，使用cellfectin(由
Invitrogen制备)，补充L-氨基酸的格雷丝昆虫细胞培养基(Grace’s Insect Cell
Culture Medium)(由Invitrogen，Gibco制备)，10％胎牛血清(由Clontech制备)，和青
霉素/链霉素(由生命技术制备)。另外，对于转染，使用2μg杆状病毒穿梭载体DNA和
7μlcellfectin。按照附在Bac-to-Bac杆状病毒(商标名)表达系统(由Invitrogen制
备)上的手册，在8天后复苏P1重组杆状病毒储液。例如，0.5ml的这一杆状病毒储液可以
6
进一步增殖，其通过接种在1×10 个细胞/ml的300ml Sf9 细胞培养物上而进行。按照附
在Bac-to-Bac杆状病毒(商标名)表达系统(由Invitrogen制备)上的手册，在4天后收
集扩增的杆状病毒储液。将Sf9细胞在Erlenmeyer烧瓶中在27℃和135 rpm悬浮培养。用
于这种培养的培养基的成分包括补充L-氨基酸的格雷丝昆虫细胞培养基(由Invitrogen，
Gibco制备)，10％胎牛血清(由Clontech制备)，青霉素/链霉素(由生命技术制备)，和
终浓度0.1％的普卢兰尼克F-68(Pluronic F-68，由Sigma-aldrich制备)。
样制备，例如，通过杆状病毒DNA和转移载体DNA在昆虫细胞中的同源重组(Kitts(1996)
Cytotechnology(细胞技术学)20，111-123)而制备。备选地，重组杆状病毒还可以这样制
备，例如，通过将按照前文提及的方法制备的包含含有与杆状病毒的多角体蛋白启动子可
操作性地连接的棉蚜肽基-二肽酶A基因的DNA片段的重组杆状病毒穿梭载体DNA引入到
昆虫细胞中而制备。具体地，重组杆状病毒可以通过按照附在Bac-to-Bac杆状病毒表达
系统(由Invitrogen制备)上的手册所述的方法，将包含含有与前文提及的杆状病毒的多
角体蛋白启动子可操作性地连接的棉蚜肽基-二肽酶A基因的DNA片段的重组杆状病毒
穿梭载体DNA转染到昆虫细胞中而制备。更具体地，按照附在Bac-to-Bac杆状病毒(商标
名)表达系统(由Invitrogen制备)上的手册，将所述重组杆状病毒穿梭载体DNA转染
到Sf9细胞(ATCC：CRL-1711)中，以获得重组的杆状病毒。对于转染，使用cellfectin(由
Invitrogen制备)，补充L-氨基酸的格雷丝昆虫细胞培养基(Grace’s Insect Cell
Culture Medium)(由Invitrogen，Gibco制备)，10％胎牛血清(由Clontech制备)，和青
霉素/链霉素(由生命技术制备)。另外，对于转染，使用2μg杆状病毒穿梭载体DNA和
7μlcellfectin。按照附在Bac-to-Bac杆状病毒(商标名)表达系统(由Invitrogen制
备)上的手册，在8天后复苏P1重组杆状病毒储液。例如，0.5ml的这一杆状病毒储液可以
6
进一步增殖，其通过接种在1×10 个细胞/ml的300ml Sf9 细胞培养物上而进行。按照附
在Bac-to-Bac杆状病毒(商标名)表达系统(由Invitrogen制备)上的手册，在4天后收
集扩增的杆状病毒储液。将Sf9细胞在Erlenmeyer烧瓶中在27℃和135 rpm悬浮培养。用
于这种培养的培养基的成分包括补充L-氨基酸的格雷丝昆虫细胞培养基(由Invitrogen，
Gibco制备)，10％胎牛血清(由Clontech制备)，青霉素/链霉素(由生命技术制备)，和
终浓度0.1％的普卢兰尼克F-68(Pluronic F-68，由Sigma-aldrich制备)。
[0244] 肽基-二肽酶A可以通过培养由前文提及的方法制备的转化体并且回收所生产的来源于昆虫的肽基-二肽酶A而制备。
[0245] 例如，肽基-二肽酶A蛋白可以通过重组杆状病毒/Sf9细胞表达系统生产。这一系统是一种最有力和通用的可用真核表达系统，并且可以用来表达来自许多不同来源包括
真菌、植物、细菌和病毒的异源基因。
真菌、植物、细菌和病毒的异源基因。
[0246] 备选地，肽基-二肽酶A蛋白可以通过重组大肠杆菌表达系统生产。这一系统是用于异源蛋白高水平生产的最常用的原核表达系统。大肠杆菌是已知的遗传和生理上最有
特征的生物体，容易操作，许多工具可用，它能够非常快速地生长，它在廉价的复合物或很好确定的基本培养基上生长，并且它具有极高的合成异源蛋白的能力。
特征的生物体，容易操作，许多工具可用，它能够非常快速地生长，它在廉价的复合物或很好确定的基本培养基上生长，并且它具有极高的合成异源蛋白的能力。
[0247] 另外，将通过培养转化体而生产的昆虫来源的肽基-二肽酶A通过诸如超声、弗氏压碎器和Dyno碾碎机的方法进行裂解，并且以包含在细胞粗提物中的形式回收，并且通过
使用通常在酶纯化中所用的方法诸如离子交换柱层析、反相柱层析、凝胶过滤柱层析等而
获得纯化的蛋白。备选地，当设计来源于昆虫的肽基-二肽酶A以具有His-标记的形式生
产时，可以通过特异性识别并且结合His-标记的亲和柱层析快速从细胞粗提物中获得纯
化的蛋白。通过所述方法，可以制备来源于昆虫的肽基-二肽酶A。
使用通常在酶纯化中所用的方法诸如离子交换柱层析、反相柱层析、凝胶过滤柱层析等而
获得纯化的蛋白。备选地，当设计来源于昆虫的肽基-二肽酶A以具有His-标记的形式生
产时，可以通过特异性识别并且结合His-标记的亲和柱层析快速从细胞粗提物中获得纯
化的蛋白。通过所述方法，可以制备来源于昆虫的肽基-二肽酶A。
[0248] 例如，来源于昆虫的肽基-二肽酶A可以这样制备，即通过培养用含有与杆状病毒的多角体蛋白启动子可操作性地连接的棉蚜肽基-二肽酶A基因的DNA片段转化的昆虫细
胞，并且用弗氏压碎器将细胞碾碎，然后用柱层析纯化而制备。
胞，并且用弗氏压碎器将细胞碾碎，然后用柱层析纯化而制备。
[0249] 更具体地，例如，将4×108个Sf9细胞悬浮在30ml包含重组杆状病毒穿梭载体DNA的重组杆状病毒储液中，所述重组杆状病毒穿梭载体DNA含有包含与杆状病毒多角体
蛋白启动子可操作性地连接的棉蚜肽基-二肽酶 A基因的DNA片段，将混悬液在125ml
Erlenmeyer中在135rpm在27C旋转培养1小时。然后，将每1/3的细胞混悬液置于3个
25ml的Erlenmeyer烧瓶中，向每个烧瓶中加入培养基，以便培养溶液的体积达到100ml，加入1ml的10％普卢兰尼克溶液，并且将这继续培养。48小时后，通过以290×g离心5分钟而
收集感染杆状病毒的Sf9细胞。将缓冲液A(50mM Hepes-HaOHpH7.5，0.5m NaCl，10mM咪唑)加入到所收集的Sf9细胞中，以将它们悬浮，并且使用弗氏压碎器(由Thermo Spectronic
制备)按照在附加的手册中所述的方法在1，500psi的压力下将细胞裂解。将这一弗氏-加
压的溶液在4℃以13,000xg离心20分钟，并且将得到的上层清液通过0.45mm过滤器过滤。
然后，将这注射到用缓冲液A(50mM Hepes-HaOH pH7.5，0.5m NaCl，10mM咪唑)平衡的串联连接的两个HiTrap/HisTrap亲和柱(柱体积5ml，由Amersham生物科学制备)上，并且用
100ml缓冲液A洗涤柱。然后，用150ml通过混合93％的缓冲液A和7％的缓冲液B(50mM
Hepes-HaOHpH7.5，0.5m NaCl，500mM咪唑)而获得的缓冲液洗涤柱。最后，将60ml通过混
合50％的缓冲液A和50％的缓冲液B而获得的缓冲液注射到柱上。分离每1ml的洗脱级
分，并且保存，并且用SDS-PAGE分析等分物，以鉴定含有75Kda肽基-二肽酶A的级分。这
些级分是以最大量含有肽基-二肽酶A的溶液。此外，将每1.5ml的含有肽基-二肽酶A的
溶液注射到用缓冲液C(50mM Hepes-HaOH，pH7.5，0.5m NaCl)平衡的HiTrap脱盐柱(柱体
积5ml，由Amersham生物科学制备)上，然后注射4.5ml的缓冲液C，回收洗脱的级分。这
一级分包含溶解在缓冲液C中的目的肽基-二肽酶A。通过用SDS-PAGE分析这一级分的等
分物，可以证实包含75Kda的肽基-二肽酶A。
蛋白启动子可操作性地连接的棉蚜肽基-二肽酶 A基因的DNA片段，将混悬液在125ml
Erlenmeyer中在135rpm在27C旋转培养1小时。然后，将每1/3的细胞混悬液置于3个
25ml的Erlenmeyer烧瓶中，向每个烧瓶中加入培养基，以便培养溶液的体积达到100ml，加入1ml的10％普卢兰尼克溶液，并且将这继续培养。48小时后，通过以290×g离心5分钟而
收集感染杆状病毒的Sf9细胞。将缓冲液A(50mM Hepes-HaOHpH7.5，0.5m NaCl，10mM咪唑)加入到所收集的Sf9细胞中，以将它们悬浮，并且使用弗氏压碎器(由Thermo Spectronic
制备)按照在附加的手册中所述的方法在1，500psi的压力下将细胞裂解。将这一弗氏-加
压的溶液在4℃以13,000xg离心20分钟，并且将得到的上层清液通过0.45mm过滤器过滤。
然后，将这注射到用缓冲液A(50mM Hepes-HaOH pH7.5，0.5m NaCl，10mM咪唑)平衡的串联连接的两个HiTrap/HisTrap亲和柱(柱体积5ml，由Amersham生物科学制备)上，并且用
100ml缓冲液A洗涤柱。然后，用150ml通过混合93％的缓冲液A和7％的缓冲液B(50mM
Hepes-HaOHpH7.5，0.5m NaCl，500mM咪唑)而获得的缓冲液洗涤柱。最后，将60ml通过混
合50％的缓冲液A和50％的缓冲液B而获得的缓冲液注射到柱上。分离每1ml的洗脱级
分，并且保存，并且用SDS-PAGE分析等分物，以鉴定含有75Kda肽基-二肽酶A的级分。这
些级分是以最大量含有肽基-二肽酶A的溶液。此外，将每1.5ml的含有肽基-二肽酶A的
溶液注射到用缓冲液C(50mM Hepes-HaOH，pH7.5，0.5m NaCl)平衡的HiTrap脱盐柱(柱体
积5ml，由Amersham生物科学制备)上，然后注射4.5ml的缓冲液C，回收洗脱的级分。这
一级分包含溶解在缓冲液C中的目的肽基-二肽酶A。通过用SDS-PAGE分析这一级分的等
分物，可以证实包含75Kda的肽基-二肽酶A。
[0250] 包含组B中所示的氨基酸序列的昆虫肽基-二肽酶A可以用作研究工具。例如，它可以用作进行诸如检测杀虫能力、筛选具有杀虫能力的化学物质等的研究的研究工具。另
外，例如，在分析作用为肽基-二肽酶A的试剂的作用和机制的研究中，肽基-二肽酶A也
可以用作研究工具。
外，例如，在分析作用为肽基-二肽酶A的试剂的作用和机制的研究中，肽基-二肽酶A也
可以用作研究工具。
[0251] 另外，编码在组B中所示的氨基酸序列的多聚核苷酸和具有与它们有互补性的核苷酸序列的多聚核苷酸，以及编码在组B中所示的氨基酸序列的多聚核苷酸的部分核苷酸
序列，或具有与所述部分核苷酸序列有互补性 的核苷酸序列的多聚核苷酸，和包含由SEQ ID NO：3或4代表的核苷酸序列的多聚核苷酸，可以用作研究工具。例如，它们中的一部分作用为用于上文所述的制备肽基-二肽酶A的方法的多聚核苷酸。另外，部分可以用作重
要的研究工具，用于进行使用PCR获得在多聚核苷酸组B中所示的多聚核苷酸，或者使用杂
交获得在多聚核苷酸组B中所示的多聚核苷酸，如上文所述。
序列，或具有与所述部分核苷酸序列有互补性 的核苷酸序列的多聚核苷酸，和包含由SEQ ID NO：3或4代表的核苷酸序列的多聚核苷酸，可以用作研究工具。例如，它们中的一部分作用为用于上文所述的制备肽基-二肽酶A的方法的多聚核苷酸。另外，部分可以用作重
要的研究工具，用于进行使用PCR获得在多聚核苷酸组B中所示的多聚核苷酸，或者使用杂
交获得在多聚核苷酸组B中所示的多聚核苷酸，如上文所述。
[0252] 特别地，当进行杀虫剂的筛选时，它们可以用作对于筛选所进行的实验的实验工具。具体地，它们可以用作在进行检测杀虫能力、筛选具有杀虫能力的化学物质等时进行的实验的实验工具。
[0253] 此外，本发明还包括这样的系统，所述系统包括输入、存储和管理测试物质的能力的数据信息的装置，其中所述能力是调控昆虫肽基-二肽酶A活性的能力(以下，在一些情形中，叫作装置a)，基于需要的标准查询并且回传数据信息的装置(以下，在一些情形中，叫作装置b)，和显示并且输出查询和回传的结果的装置(以下，在一些情形中，叫作装置c)(以下，在一些情形中叫作本系统)。
[0254] 首先，将阐释装置a。装置a意指，当输入关于测试物质具有的调控来源于昆虫的肽基-二肽酶A活性的能力的数据信息之后，存储并且管理所输入的信息，如上文所述。信
息通过输入装置1输入，并且通常以记忆装置2记忆。输入装置的实例包括可以输入信息
的装置诸如键盘和鼠标。当完成信息输入和存储、管理时，程序进展到下一种装置b。对于存储、管理所述信息，可以通过使用硬件如计算机和软件如OS和数据库管理而输入具有数
据结构的信息，并且将所述信息存储到适当的记忆装置中，例如计算机可读的记录介质如
软盘、光磁盘、CD-ROM、DVD-ROM和硬盘，而有效地存储和管理大量的信息。
息通过输入装置1输入，并且通常以记忆装置2记忆。输入装置的实例包括可以输入信息
的装置诸如键盘和鼠标。当完成信息输入和存储、管理时，程序进展到下一种装置b。对于存储、管理所述信息，可以通过使用硬件如计算机和软件如OS和数据库管理而输入具有数
据结构的信息，并且将所述信息存储到适当的记忆装置中，例如计算机可读的记录介质如
软盘、光磁盘、CD-ROM、DVD-ROM和硬盘，而有效地存储和管理大量的信息。
[0255] 将阐释装置b。装置b是一种通过基于获得需要的结果的标准的a的方式查询并且回传所存储和管理的数据信息的装置，如上文所述。对于所述信息，当将关于查询和回传的标准通过输入装置1输入，并且在通常记忆在记忆装置2中的信息中选择符合所述标准
的信息时，程序进展到下一装置c。选择的结果通常记忆在记忆装置2中，并且可以进一步
通过显示输出装置3显示。
的信息时，程序进展到下一装置c。选择的结果通常记忆在记忆装置2中，并且可以进一步
通过显示输出装置3显示。
[0256] 将阐释装置c。装置c是显示并且输出查询和回传的结果的装置，如上文所述。显示输出装置3的实例包括显示器、打印机等，并且所述结果可以在计算机的显示装置上显
示，或者可以通过打印在纸上输出。
示，或者可以通过打印在纸上输出。
[0257] 实施例
[0258] 下面将通过实施例的方式更详细地阐释本发明，但是本发明不限于这些具体的实例。
[0259] 实施例1(从棉蚜和德国蟑螂提取总RNA)
[0260] (1)从棉蚜提取总RNA
[0261] 将在盆栽黄瓜的叶片上培养的一群棉蚜(Aphis gossypii)的成虫和卵用小刷子从叶片表面刮下，并且将630mg得到的群体用研钵和研棒在液氮中压成粉末。从得到的冷
冻压碎的粉末中使用RNA提取试剂ISOGEN(由Nippon基因制备)如下分离RNA。在将10ml
ISOGEN加入到在研钵中冷冻压碎的粉末中后，将所述压碎的粉末碾磨10分钟，同时保持在
冰上。碾磨后，将流体样品用移液管转移到15ml试管中，并且向其中加入2ml氯仿(由Wako
纯化学工业有限公司(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)制备)。立即将混合物用力
振荡15秒，然后在室温静置3分钟，然后，将得到的混合物在4℃以12,000xg离心15分钟，
并且将每5ml水相层转移到两个新管中。在将5ml ISOGEN加入到每一管中后，将混合物立
即用力振荡15秒，并且然后在室温静置3分钟。然后，将得到的混合物在4℃以12,000xg
离心15分钟，并且将每10ml水相层分别转移到新的50ml管中。随后，将10ml异丙醇(由
Wako纯化学工业有限公司制备)加入到每一管中，并且将混合物在冰上放置30分钟。将得
到的混合物在4℃以12,000xg离心10分钟以沉淀RNA。去除上清后，向剩余物中加入20ml
70％乙醇将得到的混合物在4℃以10,000xg离心5分钟。去除上清后，将总RNA的沉淀稍
微干燥，并且然后溶解在1ml商购的不含RNA酶的水(Nacalai Tesque有限公司)中。制
备的总RNA的浓度(从在260nm的吸收计算)为6.9mg/ml。
冻压碎的粉末中使用RNA提取试剂ISOGEN(由Nippon基因制备)如下分离RNA。在将10ml
ISOGEN加入到在研钵中冷冻压碎的粉末中后，将所述压碎的粉末碾磨10分钟，同时保持在
冰上。碾磨后，将流体样品用移液管转移到15ml试管中，并且向其中加入2ml氯仿(由Wako
纯化学工业有限公司(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)制备)。立即将混合物用力
振荡15秒，然后在室温静置3分钟，然后，将得到的混合物在4℃以12,000xg离心15分钟，
并且将每5ml水相层转移到两个新管中。在将5ml ISOGEN加入到每一管中后，将混合物立
即用力振荡15秒，并且然后在室温静置3分钟。然后，将得到的混合物在4℃以12,000xg
离心15分钟，并且将每10ml水相层分别转移到新的50ml管中。随后，将10ml异丙醇(由
Wako纯化学工业有限公司制备)加入到每一管中，并且将混合物在冰上放置30分钟。将得
到的混合物在4℃以12,000xg离心10分钟以沉淀RNA。去除上清后，向剩余物中加入20ml
70％乙醇将得到的混合物在4℃以10,000xg离心5分钟。去除上清后，将总RNA的沉淀稍
微干燥，并且然后溶解在1ml商购的不含RNA酶的水(Nacalai Tesque有限公司)中。制
备的总RNA的浓度(从在260nm的吸收计算)为6.9mg/ml。
[0262] (2)从德国蟑螂提取总RNA
[0263] 提供人工培养的德国蟑螂(德国小蠊(Blattella germanica))的成虫、幼虫和卵囊作为样品。10只雄性成虫和10只雌性成虫(来自每一只已经去除卵囊的个体)用作
1.1g的成虫样品，将10只雄性幼虫和10只雌性幼虫用作1.0g的幼虫样品，并且将26只卵
囊用作1.0g的卵囊样品。将这三种样品使用独立的研钵和研棒独立地在液氮中压成粉末。
从每一份得到的冷冻压碎的粉末中使用RNA提取试剂ISOGEN(由Nippon基因制备)如下
分离RNA。在将10ml ISOGEN加入到在研钵中冷冻压碎的粉末中后，将所述压碎的粉末碾磨
10分钟，同时保持在冰上。碾磨后，将流体样品用移液管转移到15ml试管中，并且向其中
加入2ml氯仿(由Wako纯化学工业有限公司(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)制
备)。立即将混合物用力振荡15秒，然后在室温静置3分钟，然后，将得到的混合物在4℃
以12,000xg离心15分钟，并且将每5ml水相层转移到两个新管中。在将5ml ISOGEN加入
到每一管中后，将混合物立即用力振荡15秒，并且然后在室温静置3分钟。然后，将得到的混合物在4℃以12,000xg离心15分钟，并且将每10ml水相层分别转移到新的50ml管中。
随后，将10ml异丙醇(由Wako纯化学工业有限公司制备)加入到每一管中，并且将混合物
在冰上放置30分钟。将得到的混合物在4℃以12,000xg离心10分钟以沉淀RNA。去除上
清后，向剩余物中加入20ml 70％乙醇。将得到的混合物在4℃以10,000xg离心5分钟。去
除上清后，将总RNA的沉淀稍微干燥，并且然后溶解在1ml商购的不含RNA酶的水(Nacalai
Tesque有限公司)中。制备的总RNA的浓度(从在260nm的吸收计算)在来源于成虫的
总RNA的情形中为1.1mg/ml，在来源于幼虫的总RNA的情形中为2.5mg/ml，并且在来源于
卵囊的总RNA的情形中为1.4mg/ml。
1.1g的成虫样品，将10只雄性幼虫和10只雌性幼虫用作1.0g的幼虫样品，并且将26只卵
囊用作1.0g的卵囊样品。将这三种样品使用独立的研钵和研棒独立地在液氮中压成粉末。
从每一份得到的冷冻压碎的粉末中使用RNA提取试剂ISOGEN(由Nippon基因制备)如下
分离RNA。在将10ml ISOGEN加入到在研钵中冷冻压碎的粉末中后，将所述压碎的粉末碾磨
10分钟，同时保持在冰上。碾磨后，将流体样品用移液管转移到15ml试管中，并且向其中
加入2ml氯仿(由Wako纯化学工业有限公司(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)制
备)。立即将混合物用力振荡15秒，然后在室温静置3分钟，然后，将得到的混合物在4℃
以12,000xg离心15分钟，并且将每5ml水相层转移到两个新管中。在将5ml ISOGEN加入
到每一管中后，将混合物立即用力振荡15秒，并且然后在室温静置3分钟。然后，将得到的混合物在4℃以12,000xg离心15分钟，并且将每10ml水相层分别转移到新的50ml管中。
随后，将10ml异丙醇(由Wako纯化学工业有限公司制备)加入到每一管中，并且将混合物
在冰上放置30分钟。将得到的混合物在4℃以12,000xg离心10分钟以沉淀RNA。去除上
清后，向剩余物中加入20ml 70％乙醇。将得到的混合物在4℃以10,000xg离心5分钟。去
除上清后，将总RNA的沉淀稍微干燥，并且然后溶解在1ml商购的不含RNA酶的水(Nacalai
Tesque有限公司)中。制备的总RNA的浓度(从在260nm的吸收计算)在来源于成虫的
总RNA的情形中为1.1mg/ml，在来源于幼虫的总RNA的情形中为2.5mg/ml，并且在来源于
卵囊的总RNA的情形中为1.4mg/ml。
[0264] 实施例2(分离棉蚜肽基-二肽酶A基因)
[0265] 使用来自棉蚜的总RNA，用于RT-PCR的随机引物(Invitrogen)和SuperscriptIII(Invitrogen)按照Superscript III的生产商的方法而制备第一链cDNA。
[0266] 通过使用包含核苷酸序列SEQ ID NO：3的寡核苷酸和包含核苷酸序列SEQ ID NO：4的寡核苷酸，其为对所述基因特异的引物，和PfuUltra高 保真度聚合酶(由Stratagene
制备)按照生产商的方法进行PCR而扩增棉蚜肽基-二肽酶A的全长cDNA。将如上述制备
的第一链cDNA用作模板。应用的PCR条件如下：起始变性在94℃10分钟；然后40个PCR
循环，一个循环为94℃ 15秒，60℃15秒和72℃3分钟；接着在72℃7分钟。得到的PCR
产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以将包含核苷酸SEQ ID NO：2的1921bp的目的
DNA克隆到pCR-blunt载体(Invitrogen)中。从所述核苷酸序列推定的氨基酸序列为氨基
酸序列SEQ ID NO：1。得到的质粒命名为在pGAT1。
制备)按照生产商的方法进行PCR而扩增棉蚜肽基-二肽酶A的全长cDNA。将如上述制备
的第一链cDNA用作模板。应用的PCR条件如下：起始变性在94℃10分钟；然后40个PCR
循环，一个循环为94℃ 15秒，60℃15秒和72℃3分钟；接着在72℃7分钟。得到的PCR
产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以将包含核苷酸SEQ ID NO：2的1921bp的目的
DNA克隆到pCR-blunt载体(Invitrogen)中。从所述核苷酸序列推定的氨基酸序列为氨基
酸序列SEQ ID NO：1。得到的质粒命名为在pGAT1。
[0267] 实施例3(分离德国蟑螂肽基-二肽酶A基因)
[0268] 为了从其它昆虫物种如德国蟑螂(德国小蠊)分离肽基-二肽酶A基因的同系物，应用Codehop程序(在由Fred Hutchinson癌症研究中心管理的Blocks蛋白质分析
服务器(Blocks Protein Analysis Server)的网址 http://blocks.fhcrc.org/blocks/
codehop.html公共可用)，并且基于前文提及的来源于棉蚜的肽基-二肽酶A基因序列和
先前已知的蚕基因(NCBI登记号AB026110.1)，刚比亚按蚊基因(AAAB01008980)，黑腹果蝇
基因(NP_477046.1，AAN10856，AAF52693)，和西方角蝇基因(Q10715)的核苷酸序列，设计简并引物。
服务器(Blocks Protein Analysis Server)的网址 http://blocks.fhcrc.org/blocks/
codehop.html公共可用)，并且基于前文提及的来源于棉蚜的肽基-二肽酶A基因序列和
先前已知的蚕基因(NCBI登记号AB026110.1)，刚比亚按蚊基因(AAAB01008980)，黑腹果蝇
基因(NP_477046.1，AAN10856，AAF52693)，和西方角蝇基因(Q10715)的核苷酸序列，设计简并引物。
[0269] 在选择的昆虫物种中的肽基-二肽酶A基因同系物的部分序列通过一系列PCR扩增，所述PCR使用来源于昆虫物种的第一链cDNA作为模板。在此处，所述作为模板的第一
链cDNA通过前文提及的方法使用Superscript III制备。PCR扩增使用作为正向引物和
反向引物的一套简并引物以及Amplitaq Gold(由应用生物系统(Applied Biosystems)制
备)按照附在所述试剂上的生产商的方法而进行。PCR条件为在94℃10分钟；然后是40
个PCR循环，一个循环为94℃30秒，45℃1分钟和72℃每1kb长度的预计扩增产物1分钟；
并且接着在72℃7分钟。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以获得目的DNA。
此外，将获得的DNA克隆到pCR-XL-TOPO载体(由Invitrogen制备)中，并且测序。
链cDNA通过前文提及的方法使用Superscript III制备。PCR扩增使用作为正向引物和
反向引物的一套简并引物以及Amplitaq Gold(由应用生物系统(Applied Biosystems)制
备)按照附在所述试剂上的生产商的方法而进行。PCR条件为在94℃10分钟；然后是40
个PCR循环，一个循环为94℃30秒，45℃1分钟和72℃每1kb长度的预计扩增产物1分钟；
并且接着在72℃7分钟。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以获得目的DNA。
此外，将获得的DNA克隆到pCR-XL-TOPO载体(由Invitrogen制备)中，并且测序。
[0270] 因此，获得分别包含核苷酸序列SEQ ID NO：12，14，16，18或20的德国小蠊肽基-二肽酶A基因的部分序列。从这些所述部分序列的每一个推 定的氨基酸序列分别为
氨基酸序列SEQ ID NO：13，15，17，19或21。
氨基酸序列SEQ ID NO：13，15，17，19或21。
[0271] 然后，设计对所得到的肽基-二肽酶A基因的昆虫同系物的部分序列特异的引物，并且进行3’RACE PCR或5’RACE PCR，以获得所述基因的全长序列。3，和5’RACE PCRs这样进行，即，应用从昆虫总RNA制备的第一链cDNA作为模板，并且使用SMART PCR cDNA合
成试剂盒(由Clontech制备)按照附在所述试剂盒上的生产商的用法指导而进行。
成试剂盒(由Clontech制备)按照附在所述试剂盒上的生产商的用法指导而进行。
[0272] 在3’RACE和5’RACE反应中，在SMART PCR cDNA合成试剂盒中包含的通用引物混合物(UPM)与对目的序列特异的正向引物或反向引物组合使用。PCR条件为在94℃10分
钟1个循环；然后40个PCR循环，一个循环为94℃15秒，63℃15秒和72℃每1kb长度的
预计扩增产物1分钟；并且接着在72℃7分钟1个循环。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶
电泳进行分析和纯化，以获得目的DNA。此外，将获得的DNA克隆到pCR-XL-TOPO载体(由
Invitrogen制备)中，并且测序。
钟1个循环；然后40个PCR循环，一个循环为94℃15秒，63℃15秒和72℃每1kb长度的
预计扩增产物1分钟；并且接着在72℃7分钟1个循环。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶
电泳进行分析和纯化，以获得目的DNA。此外，将获得的DNA克隆到pCR-XL-TOPO载体(由
Invitrogen制备)中，并且测序。
[0273] 当通过第一轮PCR没有获得明显的扩增产物时，使用第一轮PCR产物作为模板进行嵌套式PCR。关于引物，在SMART PCR cDNA合成试剂盒中包含的NUP引物与特异的正向
引物或特异的反向引物组合使用，所述特异的正向引物或特异的反向引物设计成与第一轮
目的PCR产物的内部序列结合。PCR条件为在94℃10分钟1个循环；然后40个PCR循环，
一个循环为94℃15秒，63℃15秒和72℃2分钟；并且接着在72℃7分钟1个循环。得到
的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以获得目的DNA。此外，将获得的DNA克
隆到pCR-XL-TOPO载体(由Invitrogen制备)中，并且测序。
引物或特异的反向引物组合使用，所述特异的正向引物或特异的反向引物设计成与第一轮
目的PCR产物的内部序列结合。PCR条件为在94℃10分钟1个循环；然后40个PCR循环，
一个循环为94℃15秒，63℃15秒和72℃2分钟；并且接着在72℃7分钟1个循环。得到
的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以获得目的DNA。此外，将获得的DNA克
隆到pCR-XL-TOPO载体(由Invitrogen制备)中，并且测序。
[0274] 上述测序结果显示5’-端序列和3’-端序列，每一个分别编码昆虫肽基-二肽酶A的N-端区域和C-端区域。
[0275] 实施例4(构建重组杆状病毒穿梭载体)
[0276] (1)将肽基-二肽酶A cDNA克隆到基因表达载体pFastBac(注册商标名)HTb中
[0277] 将通过用EcoRI和XhoI消化在实施例2中获得的pGAT1而得到的1916bp DNA片段分离并且纯化，并且连接到基因表达载体pFastBac(注册 商标名)HTb的EcoRI/XhoI克
隆位点。以下，得到的载体命名为pGAT3。
隆位点。以下，得到的载体命名为pGAT3。
[0278] 然后，将编码His-标记的核苷酸序列引入到棉蚜肽基-二肽酶cDNA的3’末端。即，分离并且纯化克隆AC301的207bp的SfuI/XhoI DNA片段，并且连接到pGAT3的6519bp
的SfuI/XhoI DNA片段中。得到的载体命名为pGAT6。克隆AC301通过PCR产生，如下所述。
通过使用棉蚜总RNA作为模板，并且使用PfuUltra高保真度聚合酶(由Strategene制备)，
合成第一链cDNA。PCR按照附在所述试剂上的手册进行，并且包含核苷酸序列SEQID NO：5
的寡核苷酸和包含核苷酸序列SEQ ID NO：6的寡核苷酸用作引物。PCR条件如下：在94℃2
分钟1个循环；然后35个PCR循环，一个循环为94℃15秒，60℃15秒和72℃25秒；接着
在72℃7分钟1个循环。然后，通过对得到的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化
而得到目的DNA片段。此外，将获得的DNA片段克隆到pCR-blunt载体(由Invitrogen制
备)中，并且确定克隆的DNA片段的核苷酸序列。这样得到的质粒命名为AC301。
的SfuI/XhoI DNA片段中。得到的载体命名为pGAT6。克隆AC301通过PCR产生，如下所述。
通过使用棉蚜总RNA作为模板，并且使用PfuUltra高保真度聚合酶(由Strategene制备)，
合成第一链cDNA。PCR按照附在所述试剂上的手册进行，并且包含核苷酸序列SEQID NO：5
的寡核苷酸和包含核苷酸序列SEQ ID NO：6的寡核苷酸用作引物。PCR条件如下：在94℃2
分钟1个循环；然后35个PCR循环，一个循环为94℃15秒，60℃15秒和72℃25秒；接着
在72℃7分钟1个循环。然后，通过对得到的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化
而得到目的DNA片段。此外，将获得的DNA片段克隆到pCR-blunt载体(由Invitrogen制
备)中，并且确定克隆的DNA片段的核苷酸序列。这样得到的质粒命名为AC301。
[0279] pGAT6的N端His-标记通过用RsrI/EcoRI消化而去除，并且用接头代替，其中所述接头通过将包含核苷酸序列SEQ ID NO：7的寡核苷酸和包含核苷酸序列SEQ ID NO：8的
寡核苷酸退火而产生。得到的载体为这样的载体，即，其中具有C端His-标记的编码全长
棉蚜肽基-二肽酶A的核苷酸序列插入到pFastBac(注册商标)HTb中，并且在下文命名为
pGAT14。
寡核苷酸退火而产生。得到的载体为这样的载体，即，其中具有C端His-标记的编码全长
棉蚜肽基-二肽酶A的核苷酸序列插入到pFastBac(注册商标)HTb中，并且在下文命名为
pGAT14。
[0280] (2)产生重组的杆状病毒穿梭载体DNA
[0281] 使用获得的pGAT14，转化大肠杆菌DH10Bac的感受态细胞。从转化的大肠杆菌DH10Bac分离关于棉蚜肽基-二肽酶A的重组杆状病毒穿梭载体DNA。所有的步骤按照附
在Bac-to-Bac杆状病毒(商标名)表达系统(由Invitrogen制备)上的手册。
在Bac-to-Bac杆状病毒(商标名)表达系统(由Invitrogen制备)上的手册。
[0282] 通过PCR分析验证目的基因在重组杆状病毒穿梭载体中的存在或不存在。由于所述杆状病毒穿梭载体包含M13正向(-40)和M13反向引发位点，所以使用M13正向(-40)
和M13反向引物。此外，还使用M13正向(-40)或M13反向引物与对目标特异的引物的组
合。每一操作按照附在Bac-to-Bac杆状病毒(商标名)表达系统(由Invitrogen制备)
上的手册而进 行。每一PCR条件如下：
和M13反向引物。此外，还使用M13正向(-40)或M13反向引物与对目标特异的引物的组
合。每一操作按照附在Bac-to-Bac杆状病毒(商标名)表达系统(由Invitrogen制备)
上的手册而进 行。每一PCR条件如下：
[0283] (a)在包含核苷酸序列SEQ ID NO：9的寡核苷酸和包含核苷酸序列SEQID NO：10的寡核苷酸的情形中：
[0284] (i)94℃5分钟；接着
[0285] (ii)20个循环：94℃15秒，60℃15秒，和72℃4分钟30秒；接着
[0286] (iii)25个循环：94℃ 15秒，和63℃15秒，和72℃4分钟30秒(每+1个循环增加5秒)；并且接着
[0287] (iv)72℃7分钟。
[0288] (b)在包含核苷酸序列SEQ ID NO：10的寡核苷酸和包含核苷酸序列SEQID NO：11的寡核苷酸的情形中：
[0289] (i)94℃ 5分钟；接着
[0290] (ii)20个循环：94℃15秒，60℃15秒，和72℃4分钟30秒；接着
[0291] (iii)25个循环：94℃15秒，和63℃15秒，和72℃4分钟30秒(每+1个循环增加5秒)；并且接着
[0292] (iv)72℃7分钟。
[0293] 基于扩增的DNA片段的大小，选择两种重组杆状病毒穿梭载体pGAT15和pGAT16。从两种杆状病毒穿梭载体扩增的DNA片段具有正确的大小。因此，表明pFastBac(注册商
标名)表达构建体到杆状病毒穿梭载体DNA的转座已经发生。
标名)表达构建体到杆状病毒穿梭载体DNA的转座已经发生。
[0294] 实施例5(制备重组杆状病毒穿梭载体储液)
[0295] (1)重组的杆状病毒穿梭载体的转染
[0296] 按照附在Bac-to-Bac杆状病毒(商标名)表达系统(由Invitrogen制备)上的手册，将重组的杆状病毒穿梭载体pGAT15转染到Sf9细胞(ATCC：CRL-1711)中，以产生重
组的杆状病毒。对于转染，使用下述材料：cellfectin(由Invitrogen制备)，补充L-氨基
酸的格雷丝昆虫细胞培养基(由Invitrogen，Gibco制备)，10％胎牛血清(由Clontech
制备)，和青霉素/链霉素(由生命技术制备)。使用2μg杆状病毒穿梭载体DNA和7μl
cellfectin。按照附在Bac-to-Bac杆状病毒(商标名)表达系统(由Invitrogen制备)
上的手册，在8天后收集P1重组杆状病毒储液。
组的杆状病毒。对于转染，使用下述材料：cellfectin(由Invitrogen制备)，补充L-氨基
酸的格雷丝昆虫细胞培养基(由Invitrogen，Gibco制备)，10％胎牛血清(由Clontech
制备)，和青霉素/链霉素(由生命技术制备)。使用2μg杆状病毒穿梭载体DNA和7μl
cellfectin。按照附在Bac-to-Bac杆状病毒(商标名)表达系统(由Invitrogen制备)
上的手册，在8天后收集P1重组杆状病毒储液。
[0297] <重组杆状病毒的大规模制备>
[0298] 通过将0.5ml的P1病毒储液或后来产生的病毒储液接种在1×106个细胞/ml的300ml Sf9细胞培养物上，而扩增棉蚜肽基-二肽酶A杆状病毒储液。按照附在Bac-to-Bac
杆状病毒(商标名)表达系统(由Invitrogen制备)上的手册，在培养4天后收集扩增的
杆状病毒储液。将Sf9细胞培养物在Erlenmeyer(Elscolab)中在135rpm和27℃悬浮培
养。培养基成分如下：补充L-氨基酸的格雷丝昆虫细胞培养基(由Invitrogen，Gibco制
备)，10％胎牛血清(由Clontech制备)，青霉素/链霉素(由生命技术制备)，和终浓度
0.1％的普卢兰尼克F-68(Pluronic F-68，由Sigma-aldrich制备)。
杆状病毒(商标名)表达系统(由Invitrogen制备)上的手册，在培养4天后收集扩增的
杆状病毒储液。将Sf9细胞培养物在Erlenmeyer(Elscolab)中在135rpm和27℃悬浮培
养。培养基成分如下：补充L-氨基酸的格雷丝昆虫细胞培养基(由Invitrogen，Gibco制
备)，10％胎牛血清(由Clontech制备)，青霉素/链霉素(由生命技术制备)，和终浓度
0.1％的普卢兰尼克F-68(Pluronic F-68，由Sigma-aldrich制备)。
[0299] 杆状病毒储液的滴度通过蚀斑检测按照附在Bac-to-Bac杆状病毒(商标名)表达系统(由Invitrogen制备)上的手册确定，但是对于蚀斑检测的培养基，使用2％琼脂糖
代替4％琼脂糖。
代替4％琼脂糖。
[0300] 实施例6(肽基-二肽酶A在昆虫细胞中的表达)
[0301] 将4×108个Sf9细胞悬浮在30ml引入棉蚜肽基-二肽酶A基因的重组杆状病毒储液中，并且在125ml Erlenmeyer(由Elscolab制造)中在27℃，135rpm旋转培养1小时。
然后，将细胞混悬液等分到3个250ml的Erlenmeyer(由Elscolab制造)中，并且加入实施
例5中所述的细胞培养基，直到在每个Erlenmeyer中培养溶液的体积达到100ml。将Sf9细
胞在135rpm在27℃在制备的培养溶液中旋转培养48小时。将培养的溶液以1200rpm离心
以收集感染杆状病毒的Sf9细胞。将收集的Sf9细胞在液氮中快速冷冻，并且保存在-80℃
以备将来应用。
然后，将细胞混悬液等分到3个250ml的Erlenmeyer(由Elscolab制造)中，并且加入实施
例5中所述的细胞培养基，直到在每个Erlenmeyer中培养溶液的体积达到100ml。将Sf9细
胞在135rpm在27℃在制备的培养溶液中旋转培养48小时。将培养的溶液以1200rpm离心
以收集感染杆状病毒的Sf9细胞。将收集的Sf9细胞在液氮中快速冷冻，并且保存在-80℃
以备将来应用。
[0302] 实施例7(肽基-二肽酶A的纯化)
[0303] (1)制备粗提物
[0304] 将冷冻的转染杆状病毒的Sf9细胞重悬在30ml缓冲液A(50mMHepes pH7.5，0.5mNaCl，10mM咪唑)中，并且随后通过弗氏压碎器(由Thermo Spectronic制备)的方式在缓
冲液A中裂解。在破碎细胞步骤过 程中，压力保持在1300-1500psi。将弗氏加压的溶液在
2℃以13,000xg离心20分钟以获得上清液。得到的上层清液通过0.45μm过滤器过滤并
且保存在冰上。
冲液A中裂解。在破碎细胞步骤过 程中，压力保持在1300-1500psi。将弗氏加压的溶液在
2℃以13,000xg离心20分钟以获得上清液。得到的上层清液通过0.45μm过滤器过滤并
且保存在冰上。
[0305] (2)纯化
[0306] 将蚜虫肽基-二肽酶A以在6×His标记阅读框内克隆到pFastBacHTb中。重组蛋白使用金属亲和层析纯化，其使用HiTrap鳌合HP(Amersham生物科学)或HisTrap
HP(Amersham生物科学)柱，按照生产商(Amersham生物科学)的用法说明进行。纯化步骤
在AKTA-FPLC(Amersham生物科学)上进行。
HP(Amersham生物科学)柱，按照生产商(Amersham生物科学)的用法说明进行。纯化步骤
在AKTA-FPLC(Amersham生物科学)上进行。
[0307] 按照生产商的方法(Amersham生物科学)制备HiTrap/HisTrap亲和柱。缓冲液A，其为结合缓冲液，由50mM Hepes pH7.5，0.5M NaCl，10mM咪唑制成；和缓冲液B，其为洗脱缓冲液，由50mM Hepes pH7.5，0.5MNaCl，500mM咪唑制成。纯化蚜虫肽基-二肽酶A的
纯化流程包括下述步骤：
纯化流程包括下述步骤：
[0308] (i)样品注射，
[0309] (ii)用13个柱体积(CV)的缓冲液A洗掉未结合的蛋白，
[0310] (iii)用15个的CV 7％缓冲液B(35mM咪唑)洗涤，以平衡柱，
[0311] (iv)用6个CV 50％缓冲液B(250mM咪唑)洗脱纯化的蛋白，和
[0312] (v)用5个CV 100％缓冲液B(500mM咪唑)洗涤柱。
[0313] 分析获得的洗脱级分，以通过SDS-PAGE和蛋白质印迹的标准技术的方式检验重组棉蚜肽基-二肽酶A的存在。由于肽基-二肽酶A蛋白的分子量为75kDa，所以使用8％
聚丙烯酰胺凝胶用于肽基-二肽酶A蛋白的最佳凝胶电泳分析(resolution)。对于蛋白质
印迹分析，将1∶500稀释的抗-His(H15)sc-803兔多克隆IgG抗体(由tebubio制备)
用作一级抗体。二级抗体是1∶10000稀释的山羊抗-兔-HRP(由Pierce制备)。
聚丙烯酰胺凝胶用于肽基-二肽酶A蛋白的最佳凝胶电泳分析(resolution)。对于蛋白质
印迹分析，将1∶500稀释的抗-His(H15)sc-803兔多克隆IgG抗体(由tebubio制备)
用作一级抗体。二级抗体是1∶10000稀释的山羊抗-兔-HRP(由Pierce制备)。
[0314] 在通过SDS-PAGE和蛋白质印迹对凝胶分析之后，将目的级分收集在一起，并且加入甘油至终浓度10％。蛋白浓度通过使用预先稀释的蛋白测定标准物：牛血清白蛋白级分
V系列，按照生产商(Bio-Rad)的方法用Bradford分光光度法确定。然后将收集的级分分
成几等份，并且立即 在液氮中快速冷冻，并且保存在-80℃。
V系列，按照生产商(Bio-Rad)的方法用Bradford分光光度法确定。然后将收集的级分分
成几等份，并且立即 在液氮中快速冷冻，并且保存在-80℃。
[0315] (3)脱盐
[0316] 在纯化的棉蚜肽基-二肽酶A级分中的咪唑通过使用5ml HiTrap脱盐柱(由Amersham生物科学制备)通过缓冲液交换而去除。缓冲液交换步骤在AKTA-FPLC(Amersham
生物科学)上如下进行。缓冲液C，其为平衡和洗脱缓冲液，由50mM Hepes pH7.5和0.5M
NaCl制成。从棉蚜肽基-二肽酶A级分去除咪唑的流程包括下述步骤：
生物科学)上如下进行。缓冲液C，其为平衡和洗脱缓冲液，由50mM Hepes pH7.5和0.5M
NaCl制成。从棉蚜肽基-二肽酶A级分去除咪唑的流程包括下述步骤：
[0317] (i)注射1.5ml样品；
[0318] (ii)用4.5ml缓冲液C平衡柱；
[0319] (iii)用9ml缓冲液C洗脱纯化的蛋白，和
[0320] (iv)用20ml缓冲液C洗涤柱。
[0321] 分析得到的洗脱级分，以通过如上述的SDS-PAGE和蛋白质印迹的标准技术的方式检验重组棉蚜肽基-二肽酶A的存在。蛋白浓度通过使用预先稀释的蛋白测定标准物：
牛血清白蛋白级分V系列，按照生产商(Bio-Rad)的方法用Bradford分光光度法确定。洗
脱的级分补充甘油(10％终浓度)，在液氮中快速冷冻，并且保存在-80℃。
牛血清白蛋白级分V系列，按照生产商(Bio-Rad)的方法用Bradford分光光度法确定。洗
脱的级分补充甘油(10％终浓度)，在液氮中快速冷冻，并且保存在-80℃。
[0322] 实施例8(选择抑制肽基-二肽酶A活性的化合物)
[0323] 调控肽基-二肽酶A活性的化合物的选择在这样的系统中进行，即，在所述系统中，检测并且评估肽基-二肽酶A的活性，其通过将测试化合物添加到使用在实施例7中制
备的蚜虫肽基-二肽酶A的体外反应系统中而受到调控。
备的蚜虫肽基-二肽酶A的体外反应系统中而受到调控。
[0324] 蚜虫肽基-二肽酶A活性的检测这样进行，其按照在先前报道的文献(Carmel等，(1979)Clinica Chimica Acta，93，215-220)中所述的方法，应用Abz-Gly-对-硝
基-Phe-Pro-OH(由Bachem制备，M-1100)作为底物。
基-Phe-Pro-OH(由Bachem制备，M-1100)作为底物。
[0325] 对于活性检测，当包含溶解在DMSO中的测试化合物至终浓度10μM时，检测蚜虫肽基-二肽酶A的活性。另外，当包含DMSO代替测试化合物时，检测蚜虫肽基-二肽酶A
的活性。然后，计算包含溶解在DMSO中的测试化合物时蚜虫肽基-二肽酶A活性的测定值
相对于在包含DMSO代 替测试化合物时蚜虫肽基-二肽酶A活性的测定值的比例(％)，并
且将通过从100％减去所计算的值而得到的值作为抑制程度(％)。在每一测试化合物中的
结果与实施例9的结果一起显示在实施例9中的表4中。
的活性。然后，计算包含溶解在DMSO中的测试化合物时蚜虫肽基-二肽酶A活性的测定值
相对于在包含DMSO代 替测试化合物时蚜虫肽基-二肽酶A活性的测定值的比例(％)，并
且将通过从100％减去所计算的值而得到的值作为抑制程度(％)。在每一测试化合物中的
结果与实施例9的结果一起显示在实施例9中的表4中。
[0326] 当包含溶解在DMSO中的测试化合物至每一浓度100μM，30μM，10μM，3μM，1μM，0.3μM，0.1μM或0.03μM的终浓度时，检测蚜虫肽基-二肽酶A的活性。使用浓
度-依赖性检测分析软件XL fit(由idbs制备)从每一测试化合物每一浓度的结果计算
IC50(μM)。结果与实施例9的结果一起显示在实施例10的表5中，
度-依赖性检测分析软件XL fit(由idbs制备)从每一测试化合物每一浓度的结果计算
IC50(μM)。结果与实施例9的结果一起显示在实施例10的表5中，
[0327] 实施例9(杀虫活性检测)
[0328] 制备具有下述组成(表3)的无菌人工饲料，然后，按照与在昆虫饲养手册(Handbook of Insect Rearing)第1卷(Elsevier科学出版社1985)第35-36页中所述的
方法相同的方法，除了将溶解在DMSO中至终浓度640μM的测试化合物以0.5％体积加入到
所述人工饲料中以外，并且混和成分，培养棉蚜。培养后6天，研究存活的棉蚜数目，并且通过用下述方程获得控制值而确定表现出显著控制值(例如，30％或更大的控制值)的实体
具有杀虫活性：
方法相同的方法，除了将溶解在DMSO中至终浓度640μM的测试化合物以0.5％体积加入到
所述人工饲料中以外，并且混和成分，培养棉蚜。培养后6天，研究存活的棉蚜数目，并且通过用下述方程获得控制值而确定表现出显著控制值(例如，30％或更大的控制值)的实体
具有杀虫活性：
[0329] 控制值(％)＝{1-(Cb×Tai)/(Cai×Tb)}×100
[0330] 在所述方程中的字母代表下述意义。
[0331] Cb：在未处理部分中在处理之前存活的虫子数目
[0332] Cai：在未处理部分中在观察时存活的虫子数目
[0333] Tb：在处理部分中在处理之前存活的虫子数目
[0334] Tai：在处理部分中在观察时存活的虫子数目
[0335] 结果与实施例8的结果一起显示在实施例9中的表4中。
[0336] 表3
[0337]氨基酸 (mg/100ml) 维生素(mg/100ml)
L-丙氨酸 100.0 维生素C 100.0
L-精氨酸 275.0 生物素 0.1
L-天冬酰胺 550.0 泛酸钙 5.0
L-天冬氨酸 140.0 氯化胆碱 50.0
L-半胱氨酸(氢氯 化物) 40.0 肌醇 50.0
L-谷氨酸 140.0 烟酸 10.0
L-谷氨酰胺 150.0 硫胺 2.5
L-甘氨酸 80.0
L-组氨酸 80.0 其它 (mg/100ml)
L-异亮氨酸 80.0 蔗糖 12500.0
L-亮氨酸 80.0 磷酸氢二钾 1500.0
L-赖氨酸 (氢氯化物) 120.0 硫酸镁 123.0
L-甲硫氨酸 80.0 氯化铜 0.2
L-苯丙氨酸 40.0 氯化铁 11.0
L-脯氨酸 80.0 氯化锰 0.4
L-丝氨酸 80.0 硫酸锌(无水) 0.8
L-苏氨酸 140.0
L-色氨酸 80.0 调整到pH6.8
L-酪氨酸 40.0
L-缬氨酸 80.0
L-丙氨酸 100.0 维生素C 100.0
L-精氨酸 275.0 生物素 0.1
L-天冬酰胺 550.0 泛酸钙 5.0
L-天冬氨酸 140.0 氯化胆碱 50.0
L-半胱氨酸(氢氯 化物) 40.0 肌醇 50.0
L-谷氨酸 140.0 烟酸 10.0
L-谷氨酰胺 150.0 硫胺 2.5
L-甘氨酸 80.0
L-组氨酸 80.0 其它 (mg/100ml)
L-异亮氨酸 80.0 蔗糖 12500.0
L-亮氨酸 80.0 磷酸氢二钾 1500.0
L-赖氨酸 (氢氯化物) 120.0 硫酸镁 123.0
L-甲硫氨酸 80.0 氯化铜 0.2
L-苯丙氨酸 40.0 氯化铁 11.0
L-脯氨酸 80.0 氯化锰 0.4
L-丝氨酸 80.0 硫酸锌(无水) 0.8
L-苏氨酸 140.0
L-色氨酸 80.0 调整到pH6.8
L-酪氨酸 40.0
L-缬氨酸 80.0
[0338] [0338] 表4
[0339]
[0340] 实施例10(杀虫活性检测)
[0341] 除了加入溶解在DMSO中至终浓度50ppm的测试化合物之外，按照与实施例9的方法相同的方法，进行杀虫活性检测，并且结果与实施例8的结果一起显示在实施例10中的
表5中。
表5中。
[0342] 表5
[0343]
[0344] 工业适用性
[0345] 按照本发明，可以提供筛选农业化学品的更基于靶点的途径，其中针对已经鉴定为与化学干扰目标位点以控制昆虫或其它害虫生物体的目的生物学和/或生理学相关的
特异的靶点筛选化合物。
特异的靶点筛选化合物。
[0346] 序列表中的文本(free text)
[0347] SEQ ID NO：3
[0348] 设计的PCR寡核苷酸引物
[0349] SEQ ID NO：4
[0350] 设计的PCR寡核苷酸引物
[0351] SEQ)ID NO：5
[0352] 设计的PCR寡核苷酸引物
[0353] SEQ ID NO：6
[0354] 设计的PCR寡核苷酸引物
[0355] SEQ ID NO：7
[0356] 设计的用于连接的寡核苷酸接头
[0357] SEQ ID NO：8
[0358] 设计的用于连接的寡核苷酸接头
[0359] SEQ ID NO：9
[0360] 设计的PCR寡核苷酸引物
[0361] SEQ ID NO：10
[0362] 设计的PCR寡核苷酸引物
[0363] SEQ ID NO：11
[0364] 设计的PCR寡核苷酸引物