三七标准提取物P1237，其药物组合物，其制备方法和其用途

摘要

提供一种用于治疗癌症的三七标准提取物P1237，以该提取物为活性成分组成的药物组合物，及其口服液和注射剂，其制备方法，以及三七标准提取物P1237及其药物组合物作为治疗癌症药物的医药用途。本发明三七标准提取物P1237口服剂制剂以人参皂苷Rh4(ginsenoside Rh4，)，人参皂苷Rh1(ginsenoside Rh1，)，三七皂苷T5(notoginsenoside T5)为主要成分，经抗肿瘤活性及诱导HL-60细胞凋亡的研究，三七标准提取物P1237能抑制体外人肿瘤细胞株K562、HL-60、BGC-823、COC1、MCF-7的增殖，具有较明显的体外抗肿瘤活性，三七标准提取物P1237未显示明显毒性，提示其安全性较高。

权利要求

1.三七标准提取物P1237，由下述方法得到：

取三七根茎4.8kg，加入三七根茎10倍量70％的乙醇，回流提取3次，每次2小时，合并乙醇提取液，回收溶剂，干燥得乙醇提取物1.9kg；乙醇提取物用少量水溶解后，通过

15kg，Φ20cm×80cm的D101大孔吸附树脂柱层析，先用20kg水洗脱弃去，再用80％乙醇

25kg洗脱，合并乙醇洗脱液，回收溶剂，干燥得到三七总皂苷750g；所得三七总皂苷用95％乙醇3L加热溶解，吸附于1.5kg的200～300目硅胶上，室温挥干，粉碎，过60目筛备用；

取4.5kg200～300目硅胶装Φ12cm×120cm柱，进行柱层析分离；以9∶1∶0.1体积比的氯仿-甲醇-水混合溶剂洗脱，4L为一个流份，分别收集各流份，第4～5流份合并，回收溶剂，干燥得到标准提取物P1237淡黄色粉末15g。

2.根据权利要求1所述的三七标准提取物P1237，其中人参皂苷Rh4、人参皂苷Rh1和三七皂苷T5三种成分含量不低于50％。

3.治疗癌症的中药组合物，由权利要求1所述的三七标准提取物P1237和/或药学上可接受的载体组成。

4.治疗癌症的药物，以三七为原料，由下述方法制成的口服液或注射剂：

取三七根茎4.8kg，加入三七根茎10倍量70％的乙醇，回流提取3次，每次2小时，合并乙醇提取液，回收溶剂，干燥得乙醇提取物1.9kg；乙醇提取物用少量水溶解后，通过15kg，Φ20cm×80cm的D101大孔吸附树脂柱层析，先用20kg水洗脱弃去，再用80％乙醇25kg洗 脱，合并乙醇洗脱液，回收溶剂，干燥得到三七总皂苷750g；所得三七总皂苷用95％乙醇3L加热溶解，吸附于1.5kg的200～300目硅胶上，室温挥干，粉碎，过60目筛备用；取

4.5kg200～300目硅胶装Φ12cm×120cm柱，进行柱层析分离；以9∶1∶0.1体积比的氯仿-甲醇-水混合溶剂洗脱，4L为一个流份，分别收集各流份，第4～5流份合并，回收溶剂，干燥得到标准提取物P1237淡黄色粉末15g，然后加上药学上可接受的载体按常规制剂方法制成口服液或注射剂。

5.权利要求1所述的三七标准提取物P1237的制备方法，取三七根茎4.8kg，加入三七根茎10倍量70％的乙醇，回流提取3次，每次2小时，合并乙醇提取液，回收溶剂，干燥得乙醇提取物1.9kg；乙醇提取物用少量水溶解后，通过15kg，Φ20cm×80cm的D101大孔吸附树脂柱层析，先用20kg水洗脱弃去，再用80％乙醇25kg洗脱，合并乙醇洗脱液，回收溶剂，干燥得到三七总皂苷750g；所得三七总皂苷用95％乙醇3L加热溶解，吸附于1.5kg的200～

300目硅胶上，室温挥干，粉碎，过60目筛备用；取4.5kg200～300目硅胶装Φ12cm×120cm柱，进行柱层析分离；以9∶1∶0.1体积比的氯仿-甲醇-水混合溶剂洗脱，4L为一个流份，分别收集各流份，第4～5流份合并，回收溶剂，干燥得到标准提取物P1237淡黄色粉末

15g。

6.权利要求1所述的三七标准提取物P1237在制备治疗癌症疾病的药物中的应用。

7.权利要求3所述的中药组合物在制备治疗癌症疾病的药物中的应用。

说明书

三七标准提取物P1237，其药物组合物，其制备方法和其用途

[0001] 技术领域：本发明涉及药物领域，具体地，涉及一种用于治疗癌症的三七标准提取物P1237，以该提取物为活性成分组成的药物组合物，其制备方法，以及三七标准提取物P1237及其药物组合物作为治疗癌症药物的医药用途。

[0002] 背景技术：三七为我国有名的中药材，在临床上的应用十分广泛，但用三七根茎提取分离出的三七标准提取物P1237开发成用于治疗癌症的药品，现有技术中未见报道。

[0003] 发明内容：本发明的目的在于提供一种用于治疗癌症的三七标准提取物P1237，以该提取物为活性成分组成的药物组合物，及其口服液和注射剂，其制备方法，以及三七标准提取物P1237及其药物组合物作为治疗癌症药物的医药用途。

[0004] 为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

[0005] 三七标准提取物P1237，可由下述方法得到：

[0006] 取三七根茎，加入10倍量70％的乙醇(V/W)，回流提取3次，每次2小时，合并乙醇提取液，回收溶剂，干燥得乙醇提取物，用少量水溶解后，通过D101大孔吸附树脂柱层析，先用水洗脱，再用80％乙醇洗脱，合并乙醇洗脱液，回收溶剂，干燥得到三七总皂苷，再用95％乙醇加热溶解，吸附于200~300目的硅胶上，室温挥干，粉碎，过60目筛备用；取200~300目硅胶装柱，进行柱层析分离；以9∶1∶0.1V/V的氯仿-甲醇-水混合溶剂洗脱，4L为一个流份，分别收集各流份，第4~5流份合并，回收溶剂，干燥得到标准提取物P1237。

[0007] 本发明的三七标准提取物P1237，其中人参皂苷Rh4、人参皂苷Rh1和三七皂苷T5的含量不低于50％。

[0008] 本发明同时提供一种治疗癌症的中药组合物，由三七标准提取物P1237和/或药学上可接受的载体组成。

[0009] 本发明一种治疗癌症的药物，以三七为原料，可由下述方法制成的口服液或注射剂：

[0010] 取三七根茎，加入10倍量70％的乙醇(V/W)，回流提取3次，每次2小时，合并乙醇提取液，回收溶剂，干燥得乙醇提取物，用少量水溶解后，通过D101大孔吸附树脂柱层析，先用水洗脱，再用80％乙醇洗脱，合并乙醇洗脱液，回收溶剂，干燥得到三七总皂苷，再用95％乙醇加热溶解，吸附于200~300目的硅胶上，室温挥干，粉碎，过60目筛备用；取200~300目硅胶装柱，进行柱层析分离；以9∶1∶0.1V/V的氯仿-甲醇-水混合溶剂洗脱，4L为一个流份，分别收集各流份，第4~5流份合并，回收溶剂，干燥得到标准提取物P1237，然后加上药学上可接受的载体按常规制剂方法制成口服液或注射剂。

[0011] 另外，本发明提供了三七标准提取物P1237的制备方法，取三七根茎，加入10倍量70％的乙醇(V/W)，回流提取3次，每次2小时，合并乙醇提取液，回收溶剂，干燥得乙醇提取物，用少量水溶解后，通过D101大孔吸附树脂柱层析，先用水洗脱，再用80％乙醇洗脱，合并乙醇洗脱液，回收溶剂，干燥得到三七总皂苷，再用95％乙醇加热溶解，吸附于200~300目的硅胶上，室温挥干，粉碎，过60目筛备用；取200~300目硅胶装柱，进行柱层析分离；以
9∶1∶0.1V/V的氯仿-甲醇-水混合溶剂洗脱，4L为一个流份，分别收集各流份，第4~5流份合并，回收溶剂，干燥得到标准提取物P1237。

[0012] 本发明的三七标准提取物P1237及其为有效成分的中药组合物在制备治疗癌症疾病的药物中的应用，以及在制备治疗癌症疾病的药物中的应用。

[0013] 本发明用三七根茎提取分离出的三七标准提取物P1237中以人参皂苷Rh4(ginsenoside Rh4，)，人参皂苷Rh1(ginsenoside Rh1)和三七皂苷T5(notoginsenoside T5).为主要成份，三种物质结构图如下，以三七标准提取物P1237为有效成分制成用于治疗癌症的三七标准提取物P1237口服剂或注射剂制剂。

[0014]

[0015] 三七标准提取物P1237具体的分离方法步骤为：

[0016] ①取三七根茎4.8kg，加入10倍量70％的乙醇(V/W)，回流提取3次，每次2小时，合并乙醇提取液，回收溶剂，干燥得乙醇提取物1.9kg。

[0017] ②乙醇提取物用少量水溶解后，通过D101大孔吸附树脂(15kg，Φ20cm×80cm)柱层析，先用20kg水洗脱弃去，再用80％乙醇25kg洗脱，合并乙醇洗脱液，回收溶剂，干燥得到三七总皂苷750g。

[0018] ③所得三七总皂苷用95％乙醇3L加热溶解，吸附于1.5kg的硅胶(200~300目)上，室温挥干，粉碎，过60目筛备用。

[0019] ④取4.5kg硅胶(200~300目)装柱(Φ12cm×120cm)，进行柱层析分离。

[0020] ⑤以氯仿-甲醇-水(9∶1∶0.1V/V)混合溶剂洗脱，4L为一个流份，分别收集各流份，第4~5流份合并，回收溶剂，干燥得到标准提取物P1237淡黄色粉末15g。

[0021] 生产工艺流程图见附图1。

[0022] 以人参皂苷Rh4(ginsenoside Rh4)，人参皂苷Rh1(ginsenosideRh1，)，三七皂苷T5(notoginsenoside T5).为主要成分的三七标准提取物P1237用于制备治疗癌症的口服剂制剂和注射剂等。

[0023] 本发明三七标准提取物P1237用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1-99％，优选为0.5-90％的本发明提取物，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

[0024] 所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。提取物的药用组合物采用制药领域公认的方法制备成各种剂型，如液体制剂(注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂等)、固体制剂(片剂、胶囊剂、颗粒剂，冲剂等)、喷剂、气雾剂等。本发明的药物可经注射(静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射)和口服、舌下给药、粘膜透析等给药途径进行抗癌药物的治疗。附图说明：

[0025] 图1为本发明三七标准提取物P1237制备工艺流程图；

[0026] 图2为本发明以三七标准提取物P1237制为有效成分制成的第一批次药物Pn4对S180的生长抑制作用示意图；

[0027] 图3为本发明以三七标准提取物P1237制为有效成分制成的第二批次药物Pn4对H22的生长抑制作用示意图；

[0028] 图4为本发明以三七标准提取物P1237制为有效成分制成的第三批次药物Pn4对H22的生长抑制作用示意图；

[0029] 图5为本发明以三七标准提取物P1237制为有效成分制成的第四批次药物Pn4对H22的生长抑制作用示意图；

[0030] 图6为本发明以三七标准提取物P1237制为有效成分制成的第五批次药物Pn4对H22的生长抑制作用示意图；

[0031] 图7为本发明三七标准提取物P1237对小鼠移植性肝癌H22瘤体的影响；

[0032] 图8阴性对照组HL-60的细胞形态；

[0033] 图9 100ug/ml三七标准提取物P1237作用HL-60细胞，24h；

[0034] 图10 200ug/ml三七标准提取物P1237作用HL-60细胞，24h；

[0035] 图11POD检测到的凋亡的HL-60细胞

[0036] 图12阴性对照

[0037] 图13 100μg/ml三七标准提取物P1237对HL-60细胞周期分布的影响及细胞凋亡的定量检测；

[0038] 图14 200μg/ml三七标准提取物P1237对HL-60细胞周期分布的影响及细胞凋亡的定量检测；

[0039] 图15阳性对照vp-16对HL-60细胞周期分布的影响及细胞凋亡的定量检测。具体实施方式：

[0040] 以下通过试验例来进一步阐述本发明所述三七标准提取物P1237的及其药物组合物和药物的有益效果，这些试验例包括了本发明提取物和药物的药效学试验和毒理试验等。

[0041] 三七标准提取物P1237的抗肿瘤活性及诱导HL-60细胞凋亡试验：

[0042] 恶性肿瘤严重威胁人类健康，每年全球的死亡人数已达600万以上。进入21世纪有些肿瘤的发病率仍在增加，控制癌症的任务仍然十分艰巨。现在人们仍在努力寻找着更好的抗肿瘤药物。近年来，随着分子生物学和基因工程学等学科的飞速发展，人们从器官、细胞、分子及基因水平对恶性肿瘤有了更加深入的认识，给抗肿瘤药物的研究开发带来了新的思路。尤其是计算机辅助药物设计、组合化学与高通量药物筛选技术相结合，使得抗肿瘤活性物质的提取、筛选、结构改造和全合成更加合理快捷，各种新的药物、制剂相继问世。特别是针对恶性肿瘤发生发展的某些关键环节研发出的新类型抗癌药如新生血管生成抑制剂、单抗药、分化诱导剂及促凋亡药等都相继问世，使抗肿瘤药物的研究进入了一个新的时代。但已开发的抗肿瘤药物也在不同程度上存在着选择性差、毒副作用大、耐药性等问题，因此从自然界中寻找选择性高、毒副作用小、结构新颖的抗肿瘤新药仍然是值得关注的问题。

[0043] 三七为五加科多年生草本植物三七(Panax notoginseng)的根，主产于云南、广西等地，别名参三七、田七。中医认为，三七性味微甘，性平，入肝、肾、胃经，有活血化淤，行气止痛之功，适用于淤血疼痛、跌打损伤等。近代研究表明，三七的主要活性成分是三七皂苷(Panax notoginoside，PNS)，其在块根中的含量约为12％，目前已经从三七各部位分离出20种达玛烷型皂苷，其中的主要成分与人参一致，即人参二醇型皂苷Rb1、人参三醇型皂苷Rg1，但含量较人参高。药理研究表明，三七皂苷具有止血作用，能缩短凝血时间及凝血酶原时间，并可降低毛细血管通透性；能明显增加冠状动脉血流量，减少心肌耗氧，减慢心率，并能对抗脑垂体后叶素的作用，产生迅速而持久的降压作用；能兴奋心肌而有强心作用；能促进肝糖原的积累而有护肝作用。其水提物对病毒及多种皮肤真菌有不同程度的抑制作用。三七所含的五加皂苷A尚有明显的利尿作用，此外，皂苷尚有溶血作用。另报道三七皂苷可增加小鼠脾细胞内cAMP含量，从而提高脾细胞杀伤力，增强免疫功能。三七复方制剂常用于治疗肿瘤如胃癌，对肝肾纤维化及化疗后出血亦有一定疗效。采用细胞形态学、细胞化学、细胞表面膜抗原检测技术等研究表明，三七皂苷R1能诱导早幼粒白血病HL-60细胞向粒细胞转化，H3TdR、H3UR掺入实验显示三七皂苷R1能抑制细胞DNA、RNA的合成，可能是其抗肿瘤作用的机制之一。

[0044] 细胞凋亡(apoptosis)又称细胞程序性死亡(programmed cell death)，是细胞一种特殊的死亡形式，具有重要的生理学和病理学意义，其调节功能的紊乱在恶性肿瘤的发生中发挥重要作用。许多抗癌药均具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，其抗癌效应与其诱导肿瘤细胞凋亡的能力有关。细胞凋亡发生与否与其凋亡相关基因表达的调节有关，后者从功能上可分为凋亡促进和抑制两种基因。凋亡促进基因包括c-myc、RP-8：TRPM-2、bax、bcl-xs、bad、bak、野生型P53等，抑制性基因包括bcl-2、bcl-XL、raf、突变型p53等。Bax诱导细胞色素C的释放，激活Caspase-3，引起膜泡形成、核碎裂和细胞死亡；而Bcl-2可能与凋亡促进基因Bax拮抗，抑制细胞色素C自线粒体释放至胞质，阻止细胞色素C对Caspase蛋白酶的激活。Bcl-2不能促进谷胱甘肽进入细胞核，从而改变细胞核内氧化还原反应，阻止caspase蛋白酶的激活，抑制细胞凋亡。通常Bcl-2与Bax蛋白水平的比值决定了细胞凋亡发生与否。

[0045] 三七标准提取物PP1237是从三七中分离得到的一类标准提取物，为3种达玛烷配糖。皂苷的抗肿瘤活性受母核和糖基的影响。通过对皂苷Rh系列的活性对比，可以推断出皂苷Rh的细胞毒作用随着糖基的消失及双键的出现而增强。三七，为五加科人参属植物，为中国特有物种，具有悠久的药用历史和极高的药用价值。现代药理研究表明，三七多糖具有抗肿瘤作用。由于三七标准提取物P1237在人参中提取的困难及含量甚微，国内外有关三七标准提取物P1237药理作用的报道非常有限。本研究评价了来源于三七的三七标准提取物P1237的体内外抗肿瘤活性及是否诱导HL-60细胞凋亡，初步考察了其抗肿瘤的作用机制，并对其急性毒性进行了初步探索。

[0046] 试验例1：

[0047] 三七标准提取物P1237体外对人肿瘤细胞生长增殖的影响：

[0048] 随着浓度的增加，三七标准提取物P1237对K562、HL-60、COC1、BGC-823和MCF-7细胞生长增殖的抑制作用增强，且呈现剂量效应关系，其IC50值分别为22.65、28.03±0.37、18.27±12.07、36.20±2.85、27.12±7.19μg/ml。结果见表1。

[0049] 表1.三七标准提取物P1237对肿瘤细胞生长的抑制率(％)和半数抑制浓度IC50(μg/ml)

[0050]

[0051] 试验例2：

[0052] 三七标准提取物P1237对小鼠移植性肿瘤生长的影响：

[0053] (一)第一批次结果见表2

[0054] 由表2结果显示：与阴性灌胃对照组相比，经灌胃给药后各剂量组(0.5、1.5、4.5mg/kg)的平均瘤重均与有不同程度的减轻，抑瘤率分别为18.64％(P＞0.05)、17.32％(P＞0.05)

[0055] 表2.三七标准提取物P1237对S180生长的抑制作用

[0056]

[0057] 注：与po给药阴性对照组比较：**P＜0.01

[0058] 与ip给药阴性对照组比较：△P＜0.05，△△P＜0.01和47.84％(P＜0.01)。与阴性腹腔注射组比较，腹腔注射低剂量、中剂量和高剂量(0.2mg/kg、0.6和1.8mg/kg)组的平均瘤重均明显减轻，抑瘤率分别为28.05％(P＜0.05)，32.43％(P＜0.05)和37.46％(P＜0.05)，统计学处理差异有显著性。

[0059] 三七标准提取物P1237各试验组的脾(胸腺)指数与其相应的阴性组比较差异无显著性。试验后各试验组动物的体重都有不同程度的增加。

[0060] 顺铂作为阳性对照，与阴性腹腔注射组比较，抑瘤率为77.59％(P＜0.01)，差异有显著性。试验后动物的体重与试验前比较明显减轻，脾(胸腺)指数明显降低。

[0061] (二)第二批次结果见表3

[0062] 表3.三七标准提取物P1237对小鼠移植性肝癌H22生长的抑制作用(po)[0063]

[0064] 注：与肿瘤接种前给药阴性对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；

[0065] 与肿瘤接种后给药阴性对照组比较：△△P＜0.01

[0066] 根据第一批试验的结果，对本次试验进行了调整，即采取了接种前给药和接种后给药两种给药方式，设定了1、4、7mg/kg三个剂量组。结果显示，三七标准提取物P1237在1、4、7mg/kg各剂量组，对H22接种前给药组的抑制率分别为36.83％，46.01％，49.12％，接种后给药的抑制率分别为38.46％，41.10％，46.47％，抑制率随浓度的增加而增加，呈剂量依赖性。与相应阴性对照组比较，P值均＜0.01，差异有显著性。

[0067] 三七标准提取物P1237各试验组的脾(胸腺)指数与其相应的阴性组比较差异无显著性，且试验后动物的体重都有不同程度的增加。

[0068] VP-16作为阳性对照，与阴性对照组比较，抑瘤率为60.38％(P＜0.01)，差异有显著性。试验后动物的脾(胸腺)指数降低。

[0069] (三)第三批次结果见表4

[0070] 根据几次试验结果，本次实验将剂量设为0.4，2，10mg/kg三个剂量组，拉大组距。又由于上次实验采用接种前、后给药两种方式，也无明显差异。故本次仅采取接种后给药，设po和ip两种给药途径。结果显示po给药组的抑制率分别为16.51％(P＞0.05)，18.59％(P＞0.05)，45.19％(P＜0.01)；而

[0071] 表4.三七标准提取物P1237对小鼠移值性肝癌H22生长的抑制作用

[0072]

[0073] 注：与po给药阴性对照组比较：**P＜0.01；

[0074] 与ip给药阴性对照组比较：△△P＜0.01ip给药组抑制率分别18.69％(P＞0.05)，34.02％(P＜0.01)，53.71％(P＜0.01)，明显优于po给药组，且抑制率随浓度的增加而增加，呈剂量依赖性。

[0075] 三七标准提取物P1237各试验组的脾(胸腺)指数与其相应的阴性组比较差异无显著性。

[0076] 顺铂作为阳性对照，与阴性ip给药组比较，抑瘤率为50.49％(P＜0.01)，差异有显著性。与试验前比较，试验后动物的脾(胸腺)指数明显降低。

[0077] (四)第四批次结果见表5

[0078] 表5.三七标准提取物P1237对小鼠移植性肝癌H22生长的抑制作用

[0079]* **

[0080] 注：与po给药阴性对照组比较：P＜0.05，P＜0.01△△

[0081] 与ip给药阴性对照组比较： P＜0.01

[0082] 根据前几次试验的结果，本次实验增加了一个最高剂量组，以测试多大剂量的三七标准提取物P1237能达到最大抑瘤率。结果显示po给药组(0.4，2，10，20mg/kg)的抑瘤率分别为17.69％(P＞0.05)，20.23％(P＜0.05)，45.09％(P＜0.01)，45.31％(P＜0.01)；ip给药组(0.4，2，10，20mg/kg)抑瘤率分别22.02％，38.62％，53.94％，55.23％，明显优于po给药组，且抑制率随浓度的增加而增加，呈剂量依赖性，并且P值均＜0.01。20mg/kg与10mg/kg组的抑瘤率相比，增加不明显。

[0083] 三七标准提取物P1237各试验组的脾(胸腺)指数与其相应的阴性组比较差异无显著性。

[0084] 该次实验阳性对照DDP组设为1.5mg/kg，对肿瘤的抑制作用非常明显，抑制率达86.59％(P＜0.01)，但其毒副作用也非常明显。表现为体重明显下降，脾指数，胸腺指数也明显降低。

[0085] 试验例3：

[0086] 三七标准提取物P1237对HL-60细胞凋亡的诱导作用：

[0087] (一)细胞形态学变化

[0088] 经100、200μg/ml三七标准提取物P1237作用的HL-60细胞，倒置显微镜下(200倍，20×10)，可见部分细胞呈现凋亡的形态学改变，表现为细胞形态不规则，部分出现膜皱缩，细胞核固缩，核浆比例缩小，部分细胞核核膜消失，细胞核断裂呈小块或碎片状。对照组细胞大小较均一，无明显增殖抑制和形态学变化。且给药组细胞数量明显少于阴性对照组。

[0089] (二)三七标准提取物P1237诱导HL-60细胞DAN断裂

[0090] 三七标准提取物P1237 100μg/ml作用72h的HL-60细胞，细胞核中有棕黄色颗粒出现。

[0091] (三)三七标准提取物P1237对HL-60细胞周期分布的影响及细胞凋亡的定量检测(见表7及图11-14)。

[0092] 表7三七标准提取物P1237对HL-60细胞周期分布的影响及细胞凋亡率[0093]细胞周期分布 空白对照 三七标准 三七标准 阳性对照
及凋亡率(％) 提取物P1237 提取物P1237 (VP-16)
(100μg/m1) (200μg/m1)
G0/G1 55.3 92.5 76.4 72.5
S 31.7 4.5 17.5 24.5
G2/M 13.0 3.0 6.1 3.0
APO 0 8.2 17.6 18.8

[0094] 与空白对照组比较，三七标准提取物P1237各剂量组和VP-16阳性对照的G0/G1期细胞增多，S期及G2/M期细胞减少，并有一定数量的细胞发生凋亡，且随三七标准提取物P1237浓度的增加而增加。空白对照的细胞S期31.7％，G2/M期13.0％，而G0/G1期占55.3％，说明HL-60细胞处于增殖旺盛状态。HL-60细胞经三七标准提取物P1237 100ug/ml作用24h，细胞G0/G1期占92.5％，S期4.5％，G2/M期3.0％；三七标准提取物P1237 200μg/ml作用24h，细胞G0/G1期占76.4％，S期17.5％，G2/M期6.1％。

[0095] (四)三七标准提取物P1237对HL-60细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bax表达的影响(见表8)。

[0096] 表8三七标准提取物P1237对HL-60细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bax表达的影响[0097]Bcl-2 Bax
阴性 4.6 3.6
三七标准提取物 3.5 7.8

P1237(100μg/ml)
三七标准提取物 2.8 9.0
P1237(200μg/ml)

[0098] 与阴性对照组比较，三七标准提取物P1237下调Bcl-2基因的表达，且随着浓度的增加，表达Bcl-2细胞的百分率逐渐下降；同时三七标准提取物P1237上调Bax基因的表达，且随着浓度的增加，表达Bax细胞的百分率逐渐升高，并且Bax/Bcl-2＞1。

[0099] 试验例4：

[0100] 三七标准提取物P1237小鼠经口及腹腔注射给药的急性毒性试验结果。

[0101] (一)实验前后小鼠体重变化见表9：

[0102] 表9实验前后小鼠体重变化

[0103]剂量 给药 实验前体重(g) 实验后体重(g)
(g/kg) 途径
雌性 雄性 雌性 雄性
2.0 ip 21.08 21.63 22.51 23.89

6.08 po 20.14 21.42 23.52 25.07
10.0 po 20.78 20.49 23.31 24.71

[0104] (二)给药后小鼠一般情况的观察：

[0105] 小鼠给药当天饮水及活动减少，停药12h后进食、饮水及活动恢复正常。经观察14d，小鼠体重增长正常，皮毛顺滑有光泽，呼吸平稳，活动正常，未发生死亡。

[0106] 从上述试验结果可以得出结论：

[0107] 1、三七标准提取物P1237能抑制体外人肿瘤细胞株K562、HL-60、BGC-823、COCl、MCF-7的增殖，具有较明显的体外抗肿瘤活性。

[0108] 2、三七标准提取物P1237对S180和H22的生长均有明显的抑制作用，且显示了一定的量效关系，腹腔注射给药优于经口给药；三七标准提取物P1237改变给药方式，即在肿瘤接种前和接种后给药对肿瘤生长的抑制作用无明显区别；在H22模型，经口给药20mg/kg体重剂量的三七标准提取物P1237与10mg/kg体重剂量相比较，其活性无明显增强，提示在H22模型，10mg/kg体重剂量可能是其最大有效剂量；提示三七标准提取物P1237具有一定的体内抗肿瘤活性。

[0109] 3、三七标准提取物P1237能阻滞HL-60细胞于G0/G1期，并能诱导HL-60细胞凋亡，对细胞周期的阻滞及诱导细胞凋亡可能是其抗肿瘤作用的机制之一，而凋亡的发生与下调细胞凋亡相关基因Bcl-2和上调Bax的表达有关。

[0110] 4、三七标准提取物P1237未显示明显毒性，提示其安全性较高。

[0111] 下面用本发明的实施例进一步说明本发明的内容，但不以此来限定本发明。

[0112] 实施例1：

[0113] 三七标准提取物P1237的制备：

[0114] 取三七根茎4.8kg，加入10倍量70％的乙醇(V/W)，回流提取3次，每次2小时，合并乙醇提取液，回收溶剂，干燥得乙醇提取物1.9kg；乙醇提取物用少量水溶解后，通过D101大孔吸附树脂(15kg，Φ20cm×80cm)柱层析，先用20kg水洗脱弃去，再用80％乙醇25kg洗脱，合并乙醇洗脱液，回收溶剂，干燥得到三七总皂苷750g；所得三七总皂苷用95％乙醇3L加热溶解，吸附于1.5kg的硅胶(200～300目)上，室温挥干，粉碎，过60目筛备用；取4.5kg硅胶(200～300目)装柱(Φ12cm×120cm)，进行柱层析分离；以氯仿-甲醇-水(9∶1∶0.1V/V)混合溶剂洗脱，4L为一个流份，分别收集各流份，第4～5流份合并，回收溶剂，干燥得到标准提取物P1237淡黄色粉末15g。

[0115] 实施例2：

[0116] 将实施例1所分离得到的三七标准提取物P1237与赋形剂重量比为9∶1的比例加入赋形剂，制成粉剂。

[0117] 实施例3：

[0118] 按实施例1的方法先制得三七标准提取物P1237，按其与赋形剂重量比为1∶5-1∶10的比例加入赋形剂，制粒压片。

[0119] 实施例4：

[0120] 先制得三七标准提取物P1237，按常规口服液制法制成口服液。

[0121] 实施例5：

[0122] 按实施例1的方法先制得三七标准提取物P1237，按其与赋形剂重量比为5∶1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。

[0123] 实施例6(取下述成分，按本领域常规方法制成片剂)：

[0124] 三七标准提取物P1237 50mg

[0125] 乳糖 70mg

[0126] 硬脂酸镁 3mg

[0127] 聚乙烯吡咯烷酮 7mg

[0128] 合计 130mg

[0129] 如果需要，片剂可用羟丙基甲基纤维素、滑石和着色剂进行膜包覆。

[0130] 实施例7：

[0131] 按照本领域已知的方法制备胶囊剂，每个胶囊中含有下述成分：

[0132] 三七标准提取物P1237 50mg

[0133] 乳糖 70mg

[0134] 玉米淀粉 25mg

[0135] 硬脂酸镁 1mg

[0136] 聚乙烯吡咯烷酮 4mg

[0137] 合计 150mg

[0138] 实施例8：

[0139] 注射剂的制备：按实施例1或2或3的方法先制得本发明三七标准提取物P1237，按本领域已知的方法制备注射剂，加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。