用于治疗血管性痴呆症的药物

摘要

本发明提供一种药物，用于治疗以痰瘀阻络、肾虚精亏为主证的血管性痴呆症，以及制备该药物的方法。本发明提供的药物由以下重量配比的原料和银杏叶提取物制成：银杏叶提取物 0.1～10份，地龙 22～37份，淫羊藿 22～37份，川芎 11～25份，远志 11～25份。

权利要求

1.一种用于治疗血管性痴呆症的药物，其为由下述重量配比的原料制成的药剂：银杏叶提取物 1～5份地龙 27～33份淫羊藿 27～33份川芎 14～23份远志 14～23份。

2.根据权利要求1所述的药物，其为由下述重量配比的原料制成的药剂：银杏叶提取物 1.5份地龙 30份淫羊藿 30份川芎 18份远志 18份。

3.根据权利要求1或2所述的药物，其为片剂、丸剂、胶囊剂、囊片剂、粉剂、颗粒剂、悬浮剂、凝胶剂、糊剂中的任意一种。

4.根据权利要求3所述的药物，其为片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂中的任意一种。

5.权利要求1所述药物的制备方法，包括：(a)按比例取地龙、淫羊藿、川芎、远志四味药材，用60％～95％的乙醇水溶液浸泡提取1～10小时，次数为1～3次；

(b)回收乙醇，浓缩、干燥，粉碎成细粉；

(c)按比例取银杏叶提取物，与所述细粉混合均匀；

(d)加适量的赋形剂和/或其他添加剂，制成适宜的剂型。

6.根据权利要求5所述药物的制备方法，其中：提取时间为1～3小时，提取次数为2次。

说明书

用于治疗血管性痴呆症的药物

技术领域

[0001] 本发明涉及一种含有银杏叶提取物用于治疗血管性痴呆症的药物、含有其的药物组合物，以及制备其的方法。

背景技术

[0002] 随着世界人口的老龄化，老年痴呆的发病率也大大增加，已成为严重威胁老年人健康的四大疾病之一。据调查，血管性痴呆的发病率随年龄而直线上升，65岁以上的老年人年发病率在1.2％～4.2％，估计70岁以上老年人每年患病人数在6～12例/1000人。平均病程5年，死亡率为25.7％。我国是世界上老年人口最多的国家，又属发展中国家之一，因此研究和开发安全、有效、质量可控、价格低廉、长期服用方便的用于治疗血管性痴呆的药物，具有明显的社会效益，同时又能降低该病的防治成本，为社会带来显著的经济效益。

[0003] 血管性痴呆属于中医健忘、眩晕、呆病、癫狂、中风等病症范畴。中医认为其发病乃由风、火、痰、瘀阻滞脑络，上扰脑神，或肝、肾、心、脾亏虚，脑髓失充所致。其病位在脑络，影响脑髓、脑窍，与肝、肾、心、脾有关；其病性为本虚标实，虚在阴阳气血，实在风、火、痰、瘀，多以虚实兼夹为主。其治疗宜根据虚实相互夹杂的多少，或以补虚为主，兼顾其实，或以祛邪为主，兼补其虚。

[0004] 唐启盛认为肾虚是血管性痴呆发生与发展的根本原因，而痰浊停聚和脉络瘀阻后化毒为害，产生的内生之毒则为血管性痴呆发病过程中的基本病理环节(中国医药学报，1996，5)。

[0005] 宫洪涛从生理、病理两方面论述了肾精与血管性痴呆的关系，认为肾精是人体正常精神意识活动的基础，也是五脏六腑赖以濡养的源泉。肾精亏虚不仅可导致五脏所主的情志失常，而且是痴呆病理因素痰瘀产生的关键，并因此决定着痴呆的发生(浙江中医杂志，2005，11)。

[0006] 卫振华回顾了历代医家对痴呆的认识，综合现代医学理论，认为血管性痴呆多是在平台、波动、下滑三期交替更迭过程中呈阶梯进展，三期证候各不相同，肾精亏虚、痰瘀互结、阻滞络脉是血管性痴呆的发生基础，痰瘀蕴结、酿生浊毒、败坏脑络脑髓为血管性痴呆发展的关键(山西中医，2005，6)。

[0007] 苗桂芬等根据临床观察，认为老年血管性痴呆多属中医痰阻血瘀脑之清窍，元神为之迷蒙所致。认为涤痰开窍、化瘀通络为老年血管性痴呆治疗的重要治法(吉林中医药，2005，12)。

[0008] 综上可知，血管性痴呆的一个重要特征是痰瘀阻络、肾虚精亏。

[0009] 对于血管性痴呆有针对性的治疗西药，国内外均无研究成功的报道。

[0010] 以血管性痴呆为主治病症的中成药，仅有消栓通络片(《中华人民共和国药典》，2005年版第一部)：川芎、丹参、黄芪、泽泻、三七、槐花、桂枝、郁金、木香、冰片山楂。该药用于活血化瘀，温经通络，主治脑血栓引起的痴呆，已列入国家基本用药目录和基本医疗保险用药目录。

[0011] 主治病症不是血管性痴呆，但有临床应用报道的中成药，有华佗再造丸(中医药信息，1997，6)、丹参注射液(中国中西医结合杂志，1992，7)、清开灵注射液(北京中医学院学报，1992，3)、脉络宁注射液(浙江中医学院学报，1994，6)、乌鸡白丸(北京中医杂志，1993，6)、银杏叶片(实用中医内科杂志，2003，4)、二十五味珍珠丸(中国中医药信息杂志，
2003，10)等。

[0012] 目前正在研究的血管性痴呆治疗药物，有复方丹参片、脑脉泰胶囊等。

[0013] 以上治疗血管性痴呆的中成药，绝大多数以活血化瘀药物为主，少部分以清热解毒药为主，都不是血管性痴呆痰瘀阻络、肾虚精亏证的治疗药物。

[0014] 因此，市场对治疗以痰瘀阻络、肾虚精亏为主证的血管性痴呆的药物存在着需求。

发明内容

[0015] 本发明的目的是提供一种药物，用于治疗以痰瘀阻络、肾虚精亏为主证的血管性痴呆症。

[0016] 本发明的另一个目的是提供一种制备上述药物的方法。

[0017] 本发明提供的药物由以下重量配比的原料制成：

[0018] 银杏叶提取物 0.1～10份

[0019] 地龙 22～37份

[0020] 淫羊藿 22～37份

[0021] 川芎 11～25份

[0022] 远志(制) 11～25份。

[0023] 优选地，本发明提供的药物由以下重量配比的原料制成：

[0024] 银杏叶提取物 1～5份

[0025] 地龙 27～33份

[0026] 淫羊藿 27～33份

[0027] 川芎 14～23份

[0028] 远志(制) 14～23份。

[0029] 本发明提供的药物可以制成多种制剂：包括片剂、丸剂、胶囊剂、囊片剂、粉剂、颗粒剂、悬浮剂、凝胶剂、糊剂中的任意一种。

[0030] 制备上述药物的制备方法包括以下步骤：包括：

[0031] (a)按比例取地龙、淫羊藿、川芎、远志四味药材，用％60～95％的乙醇水溶液浸泡提取优选70％乙醇为溶剂回流提取1～10小时，次数为1～3次；

[0032] (b)回收乙醇，浓缩、干燥，粉碎成细粉；

[0033] (c)按比例取银杏叶提取物，与所述细粉混合均匀；

[0034] (d)加适量的赋形剂和/或其他添加剂，制成适宜剂型。

[0035] 本发明提供的药物能明显提高小鼠学习和记忆能力，改善各项相关指标：能显著改善急性血瘀大鼠全血粘度、血浆粘度和红细胞压积的异常；能明显改善小鼠的耳廓微循环；对可的松阳虚大鼠和甲减小鼠的血浆环核苷酸有很好的调节作用，能明显提高血浆cAMP水平，降低cGMP水平，升高cAMP/cGMP比值。

附图说明

[0036] 图1为小鼠假手术组海马CA1区病理切片(HE×400倍)。

[0037] 图2为小鼠模型组海马CA1区病理切片(HE×400倍)。

[0038] 图3为小鼠都可喜组海马CA1区病理切片(HE×400倍)。

[0039] 图4为小鼠复方银杏叶片高剂量组海马CA1区病理切片(HE×400倍)。

[0040] 图5为小鼠复方银杏叶片中剂量组海马CA1区病理切片(HE×400倍)。

[0041] 图6为小鼠复方银杏叶片低剂量组海马CA1区病理切片(HE×400倍)。

[0042] 图7为大鼠假手术组海马CA1区病理切片(HE×400倍)。

[0043] 图8为大鼠模型组海马CA1区病理切片(HE×400倍)。

[0044] 图9为大鼠都可喜组海马CA1区病理切片(HE×400倍)。

[0045] 图10为大鼠复方银杏叶片高剂量组海马CA1区病理切片(HE×400倍)。

[0046] 图11为大鼠复方银杏叶片中剂量组海马CA1区病理切片(HE×400倍)。

[0047] 图12为大鼠复方银杏叶片低剂量组海马CA1区病理切片(HE×400倍)。

[0048] 图13为大鼠假手术组海马CA1区海马SS染色(免疫组化×400倍)。

[0049] 图14为大鼠模型组海马CA1区海马SS染色(免疫组化×400倍)。

[0050] 图15为大鼠都可喜组海马CA1区海马SS染色(免疫组化×400倍)。

[0051] 图16为大鼠复方银杏叶片高剂量组海马CA1区海马SS染色(免疫组化×400倍)。

[0052] 图17为大鼠海马中剂量组CA1区海马SS染色(免疫组化×400倍)。

[0053] 图18为大鼠低剂量组海马CA1区海马SS染色(免疫组化×400倍)。

[0054] 图19为大鼠假手术组海马CA1区BAX染色(免疫组化×400)。

[0055] 图20为大鼠模型组海马CA1区BAX染色(免疫组化×400)。

[0056] 图21为大鼠都可喜组海马CA1区BAX染色(免疫组化×400)。

[0057] 图22为大鼠复方银杏叶片高剂量组海马CA1区BAX染色(免疫组化×400)。

[0058] 图23为大鼠复方银杏叶片中剂量组海马CA1区BAX染色(免疫组化×400)。

[0059] 图24为大鼠复方银杏叶片低剂量组海马CA1区BAX染色(免疫组化×400)。

具体实施方式

[0060] 本发明提供的用于治疗血管性痴呆症的中医配方由银杏叶提取物、地龙、淫羊藿、川芎、远志五味中药制成。该配方是本发明人根据多年的中医从业经验和对中医理论的深入理解而提出。配方中各成分的功用如下：

[0061] (1)银杏叶提取物，甘、苦、涩、平，归心、肺经，活血化瘀，促使脑脉恢复通畅，从而增加脑腑气血的供养，使脑窍复灵，其针对脑脉瘀阻这一起始病因起作用，是方中的君药。

[0062] (2)地龙，咸、寒，归肝、脾、膀胱经，清热息风，通络，其中地龙的通络作用能辅助君药银杏叶提取物增强其活血作用；淫羊，藿，辛、甘、温，归肝、肾经，补肾阳，强筋骨，祛风湿。淫羊藿的温肾壮阳、填精补脑对肾虚这一主要病机起作用。地龙的寒与淫羊藿的温相配，互相配合，相辅相成，共同作为方中的臣药。

[0063] (3)川芎，辛、温，归肝、胆、心包经，活血行气，祛风止痛。其活血行气，可佐助君药银杏叶提取物、臣药地龙以增强其活血化瘀作用，并且川芎兼入气分，配合银杏叶提取物专入血分，气血并治，是方中的佐药。

[0064] (4)远志，苦、辛、温，归心、肾、肺经，祛痰开窍，宁心安神，益智，既能祛痰，针对痰这一继发性病因起作用；又能开窍宁心、安神益智，佐助臣药淫羊藿以增强其益智健脑作用；还能“通调心气”(《本草正义》)，可作为上述各药的引经，故可为方中的佐使药。

[0065] 以上诸药配合，共同达到活血化瘀、祛痰通络、健脑益智的效果，具有标本同治以治标为主、寒温并用以平调为主、气血同调以治血为主的特点，切合血管性痴呆的以肾虚为本、以瘀痰为标、但标证较急的发病机制，故适宜于血管性痴呆的属痰瘀阻络、肾精亏虚证者。其立法、择药、组方，符合中医药理论及适应病症的病因病机。

[0066] 根据本发明的用于治疗血管性痴呆症的药物是由下述重量配比的原料制成：

[0067] 银杏叶提取物 0.1～10份

[0068] 地龙 22～37份

[0069] 淫羊藿 22～37份

[0070] 川芎 11～25份

[0071] 远志 11～25份。

[0072] 在本发明的一个典型的实施方式中，该用于治疗血管性痴呆症的药物是由下述重量配比的原料制成：

[0073] 银杏叶提取物 1～5份

[0074] 地龙 27～33份

[0075] 淫羊藿 27～33份

[0076] 川芎 14～23份

[0077] 远志 14～23份。

[0078] 在本发明的一个具体实施例中，该用于治疗血管性痴呆症的药物是由下述重量配比的原料制成：

[0079] 银杏叶提取物 1.5份

[0080] 地龙 30份

[0081] 淫羊藿 30份

[0082] 川芎 18份

[0083] 远志 18份。

[0084] 本发明中使用的银杏叶提取物在国内市场容易购得，一般采用符合2005版《中国药典》银杏叶提取物质量标准的市售产品为原料(例如来自常州神马药业有限公司的银杏叶提取物)。其通常通过乙醇回流提取，大孔树脂吸附，然后喷干、粉碎而制得。其通常为浅棕黄色至棕褐色粉末；味微苦。

[0085] 本发明使用的其他原料皆为草药，其可以是在药店出售的草药成品，也可以是新收获的草药，对于后者的情况，一般要将新草药进行烘干或晒干，以基本除去水份。作为优选，其中的远志已经过炮制。

[0086] 制备本发明的药物的方法是常规方法，一般地，按重量份称取地龙、淫羊藿、川芎、远志(制)，加60％～95％乙醇水溶液浸泡提取适当时间和适当次数，时间通常在1～10小时之间，次数为1～3次。然后回收乙醇，浓缩、干燥，粉碎成细粉。这些操作皆使用常规设备。将上述细粉与合适分量的银杏叶提取物细粉混匀，加入适宜的赋形剂。

[0087] 根据本发明的药物可以制成片剂。在确定剂型的基础上，根据处方药物性质与有效成分的药理作用，结合实验研究(包括提取溶剂、提取次数、及水提醇沉工艺的考察)，确定了本制剂的提取工艺路线，即：地龙、淫羊藿、川芎、远志(制)四味药材，以60％～95％、优选65％～80％的乙醇为溶剂回流提取二次；银杏叶提取物在制剂成型时直接入药。在醇提工艺条件研究中，以淫羊藿苷浸出量及浸膏得率为评价指标，采用正交试验法对浸泡时间、加醇量、提取时间进行了优选，确定醇提最优工艺条件为：加65-75％乙醇浸泡1.5小时，提取2次，加醇量分别为药材的10倍、8倍，提取时间分别为2.0小时、1.5小时。

[0088] 浓缩干燥工艺研究中，经对比试验，表明提取液浓缩至相对密度为1.30(60℃热测)后于60℃真空干燥(-0.08MPa)为佳。

[0089] 药用赋形剂是指对于制备药物组合物有用的赋形剂，通常它是安全、无毒并合乎需要的，且包括可应用于兽医学和人类药物学的赋形剂。这类赋形剂可以是固体、液体、半固体，或在气溶胶组成的情况下是气体。

[0090] 本发明的药物可以以干的口服制剂形式经口给予。本发明的药物可以以片剂、丸剂、胶囊剂、囊片剂、粉剂、颗粒剂、悬浮剂、凝胶剂、糊剂等经口给予。口服组合物可以包括常用载体、赋形剂和稀释剂。本发明药物组合物的口服剂型可以用本领域已知技术制备，并含有治疗上有效量的药物成分。对于本发明制剂的治疗有效的口服剂量根据从业医生的判断通过标准临床技术来确定。例如，除医学参考书和药物学文献提供的信息外，可以用熟知的体外或者体内化验来帮助确定最佳剂量。

[0091] 本发明的药物可以单独使用，或者在适当情况下，与其他药物结合使用。

[0092] 本发明的药物可以含有一种或多种药用赋形剂。赋形剂出于多种目的被加入到药物成分中。该药物成分可以方便地以单位剂量形式提供，并且由本领域已知的方法制备。这样的方法包括将提取物成分与载体相组合的步骤，其中载体本身可以包括一种或多种辅助成分。一般地，该剂型的制备是通过均匀而密切地使提取物成分与液体载体、或者粉末固体载体或者二者的结合相混合，然后必要时成形该产物。

[0093] 优选地，该药物制剂是干的口服剂型。优选地，该药物制剂是固体剂型。优选地，该药物组合物是选自由片剂、丸剂、胶囊剂、囊片剂、粉剂和颗粒剂构成的组的口服剂型。干的剂型可以包括药学可接受的添加剂，如赋形剂、载体、稀释剂、稳定剂、增塑剂、粘结剂、助流剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、塑化剂，着色剂、成膜剂、增味剂、防腐剂、给药载体(dosing vehicle)以及前述中的任意结合。这些皆是本领域技术人员所熟知的，在此不再赘述。

[0094] 赋形剂和用量的选择由制剂设计师根据经验并考虑标准工序和本领域参考资料很容易确定。本发明的固体药物包括粉末、颗粒、聚集体和压实组分。本发明的优选给药途径是口服。该剂量可以以单位剂型方便地提供，并用药学领域的任何熟知方法制备。剂型包括固体剂型，如片剂、丸剂、粉剂、胶囊、颗粒剂、囊片剂、小袋剂、药片和锭剂。本发明特别优选的剂型为片剂。

[0095] 糊剂溶液或冻干粉末的形式用于胃肠道外给药。使用前可向粉末中加入合适的稀释剂或其它药用载体而进行重配。液体配方通常是缓冲、等渗、水溶液。合适的稀释剂的例子有标准等渗盐水溶液、5％的葡萄糖水溶液。这类配方尤其适合胃肠道外给药，但也可口服。最好添加赋形剂，如聚乙烯吡咯烷酮、明胶、氧化纤维素、阿拉伯胶、聚乙二醇、甘露醇、氯化钠、或柠檬酸钠。

[0096] 可替换地，这些化合物可以是胶囊包被的、片剂的、或在乳剂或糖浆剂中配制，用于口服。为了加强或稳定组合物、或有利于组合物的制备，可以加入药用固体或液体载体。液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、甘油、盐水、醇类、或水。固体载体包括淀粉、乳糖、硫酸钙、二水合物、石膏粉、硬脂酸镁、或硬脂酸、滑石粉、果胶、阿拉伯胶、琼脂、或明胶。载体也可包括缓释物质，诸如甘油单硬脂酸或甘油二硬脂酸，单独或与蜡一起。固体载体的量各不相同，但是，优选地，每一剂量单位是在约20mg至约1g之间。

[0097] 药物配制遵循传统的药物制备方法，就制备片剂而言，涉及研磨、混合、成粒、和压缩(当必要时)；或就制备硬胶囊而言，涉及研磨、混合、和填充。当使用液体载体时，药物制剂为糖浆、酏剂、乳剂、或水性或非水性混悬液形式。对于这种液体剂型可直接口服(p.o.)给药或装填入软胶囊剂中。

[0098] 在本发明的一个具体实施方式中，所述药物被制成片剂。在制备该剂型时，可以将药粉与微晶纤维素按比例(3∶2)混匀，加入适量的含2％聚维酮(PVP)的95％乙醇溶液作为粘合剂制湿粒，40～50℃干燥，过20目筛整粒，然后加入1％的硬脂酸镁混匀，压片，并包薄膜衣。

[0099] 另外，考察了药物颗粒的吸湿性，结合生产经验，认为本品成型工艺过程控制相对湿度在50％以下进行较为适宜。

[0100] 制备实施例

[0101] 实施例1

[0102] 取地龙27份、淫羊藿27份、川芎15份、远志(制)15份(均为重量份，下同)，加65％乙醇水溶液浸泡1.5小时，提取2次，第一次加10倍量乙醇提取2小时，第二次加8倍量乙醇提取1.5小时，合并提取液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.30～1.35(60℃)，在0.08MPa和60℃下真空干燥，粉碎成细粉，备用。取银杏叶提取物细粉1.5重量份与上述细粉混匀，加入适量微晶纤维素和3％的交联聚维酮(PVPP)，混匀，用2％聚维酮K30(PVP)的95％乙醇溶液制软材，挤压过16目筛网，40～50℃干燥，整粒，加入3％的羧甲基淀粉钠(CMS-Na)和0.3％的硬脂酸镁混匀，压制成片(0.40g/片)，包薄膜衣，即得。

[0103] 实施例2

[0104] 取地龙33份、淫羊藿33份、川芎22份、远志(制)22份，加85％乙醇水溶液浸泡1.5小时，提取2次，第一次加5倍量乙醇2小时，第二次加3倍量乙醇1.5小时，合并提取液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.30～1.35(60℃)，在0.08MPa和60℃下真空干燥，粉碎成细粉，备用。取银杏叶提取物细粉5重量份与上述细粉混匀，加入适量微晶纤维素和3％的交联聚维酮(PVPP)，混匀，用2％聚维酮K30(PVP)的95％乙醇溶液制软材，挤压过16目筛网，40～50℃干燥，整粒，加入3％的羧甲基淀粉钠(CMS-Na)和0.3％的硬脂酸镁混匀，压制成片(0.40g/片)，包薄膜衣，即得。

[0105] 实施例3

[0106] 取地龙22份、淫羊藿22份、川芎11份、远志(制)11份，加5倍量90％乙醇水溶液浸泡3小时，提取1次，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.30～1.35(60℃)，在0.08MPa和60℃下真空干燥，粉碎成细粉，备用。取银杏叶提取物细粉10重量份与上述细粉混匀，加入适量微晶纤维素和3％的交联聚维酮(PVPP)，混匀，用2％聚维酮K30(PVP)的95％乙醇溶液制软材，挤压过16目筛网，40～50℃干燥，整粒，加入3％的羧甲基淀粉钠(CMS-Na)和
0.3％的硬脂酸镁混匀，压制成片(0.40g/片)，包薄膜衣，即得。

[0107] 实施例4

[0108] 取地龙37份、淫羊藿37份、川芎24份、远志(制)24份，加70％乙醇水溶液浸泡1.5小时，提取10小时，合并提取液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.30～1.35(60℃)，在
0.08MPa和60℃下真空干燥，粉碎成细粉，备用。取银杏叶提取物细粉0.5重量份与上述细粉混匀，加入适量微晶纤维素和3％的交联聚维酮(PVPP)，混匀，用2％聚维酮K30(PVP)的95％乙醇溶液制软材，挤压过16目筛网，40～50℃干燥，整粒，加入3％的羧甲基淀粉钠(CMS-Na)和0.3％的硬脂酸镁混匀，压制成片(0.40g/片)，包薄膜衣，即得。

[0109] 实施例5

[0110] 取地龙30份、淫羊藿30份、川芎18份、远志(制)18份，加70％乙醇水溶液浸泡1.5小时，提取2次，第一次加5倍量乙醇2小时，第二次加3倍量乙醇1.5小时，合并提取液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.30～1.35(60℃)，在0.08MPa和60℃下真空干燥，粉碎成细粉，备用。取银杏叶提取物细粉1.5重量份与上述细粉混匀，加入适量微晶纤维素和
3％的交联聚维酮(PVPP)，混匀，用2％聚维酮K30(PVP)的95％乙醇溶液制软材，挤压过16目筛网，40～50℃干燥，整粒，加入3％的羧甲基淀粉钠(CMS-Na)和0.3％的硬脂酸镁混匀，压制成片(0.40g/片)，包薄膜衣，即得。

[0111] 该药物处方来源于一位临床名老中医经验方，并用于痰瘀阻络、肾精亏虚所致智能减退，神呆健忘，眩晕头痛，腰膝酸软，舌暗苔滑等。血管性痴呆有上述见症者。用法用量：以实施例5制得的制剂为例，口服，1次3片，1日3次，3个月为一疗程。

[0112] 药效学试验

[0113] 1.实验材料与结果

[0114] 1.1药物与试剂

[0115] (1)复方银杏叶片：其为本发明的一种产品，其制备方法如实施例5所披露。成人临床日用生药量16.24g，实验用干浸膏浓度为9.31g(生药)/g。实验时用蒸馏水配成不同浓度的混悬液。

[0116] (2)都可喜(血管性痴呆模型试验阳性对照药)：为阿米三嗪和萝巴新组成的复方制剂。用于亚急性或慢性脑血管机能不全障碍症、脑缺血后遗症。血管性视网膜功能障碍以及缺血性耳蜗前庭功能失调等。40mg(有效成分)/片，临床用量为1片/次，2次/日。国药准字J20030019，法国施维雅药厂生产，批号：5A0153。实验时用蒸馏水配成混悬液。

[0117] (3)复方丹参片(活血化瘀试验阳性对照药)：成分为丹参、三七、冰片，具有活血化瘀，理气止痛的功效。用于气滞血瘀所致的胸痹，症见胸闷、心前区刺痛；冠心病心绞痛。0.3g(成药)/片，临床用量为3片/次，3次/日。国药准字Z44023372，广州白云山和计黄埔中药有限公司生产，批号：J5A006。实验时用蒸馏水配成混悬液。

[0118] (4)桂附地黄丸(阳虚试验阳性对照药)：成分为熟地黄、附子(制)、肉桂、山茱萸(制)、山药、泽泻、牡丹皮、茯苓。具有温补肾阳的功效，用于腰膝酸软，肢冷尿频，为虚证类非处方药。国药准字Z43020144，每8丸相当于3g生药。临床用量为一次8丸，一日3次。长沙九芝堂股份有限公司生产，批号：20060213。实验时用蒸馏水配成混悬液。

[0119] (5)盐酸肾上腺素注射液，1ml/1mg/支，批号：0510061，天津金耀氨基酸有限公司生产。

[0120] (6)液体石蜡，批号：20041014，湖南汇虹试剂有限公司生产，

[0121] (7)注射用硝普钠，批号：20051016，湖南中南科伦药业有限公司生产。

[0122] (8)硫酸庆大霉素注射液，批号：4050302-2，天津药业焦作有限公司生产。

[0123] (9)0.9％氯化钠注射液，批号：D050925，湖南科伦制药有限公司生产。

[0124] (10)氢化可的松注射液，2ml/10mg/支，批号：06010511，天津药业焦作有限公司生产。

[0125] (11)甲巯咪唑片，5mg/片，批号：050807，北京燕京制药厂生产。实验时用蒸馏水配成混悬液。

[0126] (12)考马斯亮兰蛋白测定试剂盒，批号：20060330，

[0127] (13)MDA测试试剂盒，批号：20060324，

[0128] (14)SOD测试试剂盒，批号：20060331，

[0129] (15)乙酰胆碱酯酶测试试剂盒，批号：20060328，

[0130] 以上(9)-(13)均由南京建成生物工程研究所提供。

[0131] (16)兔抗-Bax、兔抗-SSTR2抗体、SABC免疫组化试剂盒、DBA显色试剂盒，生产日期：2006年4月，武汉博士德生物工程公司提供。

[0132] (17)cAMP、cGMP测定试剂盒，批号：20060524，上海中医药大学核医学实验室提供。

[0133] 1.2动物

[0134] 昆明小鼠、SD大鼠，清洁级，由长沙市开福区东创实验动物科技服务部提供，合格证号：scxk(湘)2006-0001。

[0135] 1.3仪器

[0136] (1)FA1004上海电子分析天平：上海精科仪器有限公司

[0137] (2)ES-C-600电子天平：湘仪天平仪器厂

[0138] (3)DT-200小鼠跳台仪：成都泰盟科技有限公司

[0139] (4)生物显微镜(带显微测微尺，0.01mm)：江南光学仪器厂

[0140] (5)HHW-21CU-600电热恒温水槽：上海福玛实验设备有限公司

[0141] (6)TD4-II台式自动平衡离心机：湖南凯达实业发展有限公司

[0142] (7)UV-1600型分光光度计：北京瑞利公司

[0143] (8)LBY-N6型旋转式血液粘度计：北京普利生公司

[0144] (9)DM LB2型双目显微镜：德国LEICA公司

[0145] (10)325型石蜡切片机：英国Shandon公司

[0146] (11)XW-80A旋涡混合器：上海精科实业有限公司

[0147] (12)KDC-2046低温大容量离心机：中国科学技术大学科技实业总公司中佳光电仪器分公司

[0148] (13)GC-1200γ放射免疫计数器：中国科学技术大学开发实业总公司中佳光电仪器分公司

[0149] 1.4剂量设置(见表1和表2)

[0150] 表1.小鼠用药剂量

[0151]

[0152] 表2.大鼠用药剂量

[0153]*

[0154] 注：药物剂量：复方银杏叶片各组、桂附地黄丸剂量组为生药量，都可喜为有效成分含量，复方丹参片组为成药量

[0155] 2.对小鼠血管性痴呆模型的影响

[0156] 取25～30g昆明小鼠100只，雌雄各半，按性别体重分层，随机分为2组：假手术[2]组10只，其余为手术组90只。参考文献 ，手术组小鼠以1％水合氯醛300mg/kg腹腔注射，麻醉后，仰卧位固定于手术台上，75％酒精消毒颈前皮肤，行颈正中切口，分离双侧颈总动脉穿线备用，用无创动脉夹夹闭双侧颈总动脉10min，同时在尾尖断尾，放血0.3ml。松开动脉夹再通10min，再夹闭10min，撤线，缝合切口。手术中灯照保温。假手术组只分离颈总动脉30min后缝合，不阻断血流，尾部不放血。术后每日肌注庆大霉素5mg/kg，连续5天。
第3天将存活的手术组小鼠进行跳台测定，挑选手术组中反应时间相近的50只小鼠均匀分成5组(复方银杏低、中、高剂量组、都可喜组、模型组)，各组灌服相应药物。模型组和假手术组给等容量的蒸馏水，每天给药一次，给药14天后测定以下指标：

[0157] ①跳台法测定学习记忆能力：测试装置为被动回避反应箱，先让小鼠在反应箱内铜栅上(未通电)适应环境3min，然后给铜栅通电，记录小鼠首次受电击后跳上安全台所需时间(反应时间)，5min内跳下圆台次数(错误次数)，作为学习成绩。24小时后，先将铜栅通电，然后将小鼠放置在箱内安全台之上，记录小鼠首次从安全台跳至铜栅所需时间(潜伏时间)，5min内跳下圆台次数(错误次数)，作为记忆成绩。(测试时大鼠停留在平台上超过5min，其潜伏期以300s计)。结果见表3、表4。

[0158] 表3复方银杏叶片对血管性痴呆模型小鼠学习能力的影响

[0159]

[0160] 注：与模型组比较*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01。

[0161] 表4复方银杏叶片对血管性痴呆模型小鼠记忆能力的影响

[0162]

[0163] 注：与模型组比较：*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01。

[0164] ②血清丙二醛(MDA)测定：末次给药1小时后摘除眼球取血，严格按试剂盒说明进行测定。见表5。

[0165] ③脑组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)活力、乙酰胆碱酯酶(AchE)测定。取左半脑，称重后加9倍重量生理盐水制备匀浆，严格按试剂盒说明进行测定。见表5。

[0166] 表5 复方银杏叶片对血管性痴呆模型小鼠生化指标的影响

[0167]

[0168] 注：与模型组比较：*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01。

[0169] ④大脑海马区病理学检查。取右半脑，置于10％甲醛溶液中固定24h，修取海马组织，梯度酒精脱水，透明，浸蜡，石蜡包埋，连续冠状切片，片厚6μm，苏木素-伊红(HE)染色，400倍光镜下观察。见附图1-6。其中：

[0170] 图1为小鼠假手术组海马CA1区病理切片(HE×400倍)，锥体细胞排列整齐致密，胞浆清晰明朗，核仁明显，细胞质丰富。未见核固缩。

[0171] 图2为小鼠模型组海马CA1区病理切片(HE×400倍)，锥体细胞减少且变形皱缩，大小不一，排列紊乱，细胞核形状为三角形或多角形，结构不清，呈核固缩，胞质浓染，细胞周围间隙增宽。

[0172] 图3为小鼠都可喜组海马CA1区病理切片(HE×400倍)，锥体细胞较清晰，排列尚整齐，有少量核固缩，有的形成碎片。

[0173] 图4为小鼠复方银杏叶片高剂量组海马CA1区病理切片(HE×400倍)，锥体细胞排列整齐，胞浆清晰，核仁明显，偶见核固缩。

[0174] 图5为小鼠复方银杏叶片中剂量组海马CA1区病理切片(HE×400倍)，锥体细胞减少且有一些皱缩，核结构不清，可见部分核固缩，浓染。

[0175] 图6为小鼠复方银杏叶片低剂量组海马CA1区病理切片(HE×400倍)，锥体细胞减少，排列较紊乱，且部分皱缩，浓染。可见核固缩。

[0176] 由上述三个表中的统计结果可知用反复夹闭颈总动脉合并放血降压制造血管性痴呆模型小鼠造模成功，其模型组的各项所测指标与假手术组比较均有显著性差异(P＜0.01)。由表3、表4可见，复方银杏叶片各剂量组均能缩短反应时间、延长潜伏时间并减少错误次数，与模型组比较均有显著性差异(P＜0.05)，这说明复方银杏叶片能提高血管性痴呆小鼠的学习能力，增强小鼠的记忆能力，表明复方银杏叶片对由脑血管病造成的痴呆有一定的治疗作用。表5中，复方银杏叶片各剂量组血清MDA与模型组相比均降低，脑组织匀浆SOD活力均增强，这反映复方银杏叶片有一定的抗氧化作用，能增强脑组织SOD活力来清除过多的氧自由基，从而使损伤程度降低。同时复方银杏叶片各剂量组可抑制乙酰胆碱酯酶的升高，其中中剂量组与模型组比较有显著差异(P＜0.01)，这说明复方银杏叶片能改善胆碱系统功能，调节脑组织乙酰胆碱的生理代谢，治疗痴呆。由附图1-附图6可见，复方银杏叶片对脑海马锥体细胞的损伤有一定程度的修复作用。

[0177] 3.对大鼠血管性痴呆模型的影响

[0178] 取250～300g的雄性和200～250g的雌性SD大鼠各50只，按性别体重分层，随机分为2组：假手术组10只，其余为手术组90只。参考文献王蕊，杨秦飞，唐一鹏，等大鼠拟血管性痴呆模型的建立及中药9602防治作用初探[J].中国病理生理杂志，2000，16(10)：914-916，手术组大鼠以10％水合氯醛350mg/kg腹腔注射，麻醉后，仰卧位固定于手术台上，75％酒精消毒颈前皮肤，行颈正中切口，分离双侧颈总动脉并穿线，硝普钠按2.5mg/kg腹腔注射，立即用无创动脉夹夹闭双侧颈总动脉10min，松开动脉夹再通10min，再夹闭
10min，撤线，缝合切口，术中灯照保温。假手术组只分离颈总动脉，30min后缝合，不结扎。
术后每日肌注庆大霉素5mg/kg，连续5天。术后第3天观察存活的手术组大鼠进行敞箱实验。挑选敞箱得分相近的大鼠随机分为5组(复方银杏低、中、高剂量组、都可喜组、模型组)，各组灌服相应药物。模型组和假手术组给等容量的蒸馏水，每天给药一次，给药14天后测定以下指标：

[0179] ①血清丙二醛(MDA)测定。末次给药1小时后眼眶静脉取血，严格按试剂盒说明进行测定。见表6。

[0180] ②脑组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)活力，乙酰胆碱酯酶(AchE)测定。取左半脑，称重后加9倍重量生理盐水制备匀浆，严格按试剂盒说明进行测定。见表6。

[0181] 表6复方银杏叶片对血管性痴呆模型大鼠生化指标的影响

[0182]* ** ***

[0183] 注：与模型组比较：P＞0.05，P＜0.05， P＜0.01。

[0184] ③大脑海马CA1区病理学检查及Bax和海马SS阳性细胞数测定。取右半脑，置于4％多聚甲醛溶液中固定24h，修取海马组织，常规脱水，浸蜡，石蜡包埋，连续冠状切片，片厚6μm，分别作苏木素-伊红(HE)染色和SABC法免疫组化染色。按照试剂盒说明书步骤进行，显示Bax和海马SS阳性细胞，在400倍光镜下随机选取各张切片5个视野，用MIAS医学图像分析系统分析海马CA1区阳性细胞个数及光密度值。见表7和表8及附图7-24。

[0185] 表7 复方银杏叶片对血管性痴呆模型大鼠海马SS表达的影响

[0186]

[0187] 注：与模型组比较*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01。

[0188] 表8 复方银杏叶片对血管性痴呆模型大鼠Bax表达的影响

[0189]

[0190] 注：与模型组比较：*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01。

[0191] 在图7-24中：

[0192] 图7为大鼠假手术组海马CA1区病理切片(HE×400倍)，锥体细胞完整清晰，细胞排列整齐致密，胞浆明朗，核仁明显。未见核固缩。

[0193] 图8为大鼠模型组海马CA1区病理切片(HE×400倍)，锥体细胞明显减少且变形皱缩，大小不规则，排列紊乱，核结构消失，核固缩明显，胞质浓染，细胞周围间隙增宽。

[0194] 图9为大鼠都可喜组海马CA1区病理切片(HE×400倍)，锥体细胞较清晰，形状不太规则，排列整齐致密，可见少量核固缩。

[0195] 图10为大鼠复方银杏叶片高剂量组海马CA1区病理切片(HE×400倍)，锥体细胞清晰，排列整齐致密，核仁较明显，核固缩少。

[0196] 图11为大鼠复方银杏叶片中剂量组海马CA1区病理切片(HE×400倍)，锥体细胞排列较疏松，不整齐，大小不一，核固缩少。

[0197] 图12为大鼠复方银杏叶片低剂量组海马CA 1区病理切片(HE×400倍)，锥体细胞减少，排列不整齐，形状不规则，部分细胞核固缩，有的形成碎片。

[0198] 图13为大鼠假手术组海马CA1区海马SS染色(免疫组化×400倍)，锥体细胞排列整齐紧密，核仁清晰，可见大量细胞膜黄染，众多棕黄色颗粒密集，阳性表达细胞多。

[0199] 图14为大鼠模型组海马CA1区海马SS染色(免疫组化×400倍)，锥体细胞减少，稀疏散在，有部分空泡，未见明显棕黄色颗粒，阳性细胞表达弱。

[0200] 图15为大鼠都可喜组海马CA1区海马SS染色(免疫组化×400倍)，锥体细胞排列较稀疏，部分胞浆胞膜黄染，阳性表达细胞偏少。

[0201] 图16为大鼠复方银杏叶片高剂量组海马CA1区海马SS染色(免疫组化×400倍)，锥体细胞排列整齐，胞浆胞膜黄染，可见大量密集棕黄色颗粒，分布广泛，着色较深，阳性表达较强。

[0202] 图17为大鼠海马中剂量组CA1区海马SS染色(免疫组化×400倍)，锥体细胞密集但形状不规则，可见大量细胞胞浆胞膜胞核呈黄褐色，着色深，阳性表达细胞较多。

[0203] 图18为大鼠低剂量组海马CA1区海马SS染色(免疫组化×400倍)，锥体细胞较少，排列较松散，可见少量棕黄色颗粒，着色较浅，阳性表达细胞较少。

[0204] 图19为大鼠假手术组海马CA1区BAX染色(免疫组化×400)，锥体细胞完整清晰，排列整齐，核仁明显，未见明显的黄褐色胞浆，未见阳性表达细胞。

[0205] 图20为大鼠模型组海马CA1区BAX染色(免疫组化×400)，锥体细胞数目少，胞体较小，胞浆内阳性物质密集，染成深褐色，阳性表达强。

[0206] 图21为大鼠都可喜组海马CA1区BAX染色(免疫组化×400)，锥体细胞较清晰，核仁明显，部分细胞膜深染，阳性表达细胞略有增多。

[0207] 图22为大鼠复方银杏叶片高剂量组海马CA1区BAX染色(免疫组化×400)，锥体细胞清晰，核仁明显，排列整齐，少数胞膜胞浆呈浅淡黄褐色，阳性表达细胞较少。

[0208] 图23为大鼠复方银杏叶片中剂量组海马CA1区BAX染色(免疫组化×400)，锥体细胞清晰，可见多数黄褐色颗粒，部分胞膜胞浆染色较深，阳性表达较强。

[0209] 图24为大鼠复方银杏叶片低剂量组海马CA1区BAX染色(免疫组化×400)，锥体细胞清晰，核仁明显，排列较整齐，可见少数棕黄色颗粒，胞膜着色浅，阳性表达细胞较少。

[0210] 由上述三个表中的统计结果可知用反复夹闭颈总动脉合并降压制造血管性痴呆模型大鼠造模成功，其模型组的各项所测指标与假手术组比较均有显著性差异(P＜0.05)，表2中复方银杏叶片能显著降低MDA，提高SOD活力，并可抑制乙酰胆碱酯酶的升高，提示有抗氧化作用，并能改善胆碱系统功能。复方银杏叶片各剂量组与模型组比较均有显著性差异，且低剂量组有非常显著的差异(P＜0.01)。由表3可知，模型组的海马SS表达明显低于假手术组，阳性细胞个数和光密度值都减少(P＜0.01)，说明脑缺血可抑制脑组织SS的分泌。都可喜和复方银杏叶片各剂量组均能增强海马SS的表达，增加海马SS阳性细胞个数并增强光密度，与模型组比较均有显著性差异(P＜0.05)，提示复方银杏叶片可促进海马SS的分泌，有效调节脑内多种激素和神经递质的释放，促进智能恢复。由表4可知，模型组脑组织Bax表达明显高于假手术组(P＜0.01)，说明脑缺血可使促凋亡基因蛋白过多表达，从而加速脑细胞凋亡，都可喜和复方银杏叶片对脑组织Bax表达有一定的抑制作用，可使阳性细胞个数减少，并使光密度减弱，提示有对抗脑细胞凋亡的作用，但复方银杏叶片中剂量组与模型组比较无显著性差异(参见附图13-23，阳性细胞呈棕黄色，显色部位可见有胞膜、胞浆，胞核)。由附图7-附图12的HE染色中可见，复方银杏叶片对造模后脑组织的病理变化有改善作用，能促进缺血损伤的脑神经元的修复。

[0211] 4.活血化瘀试验，对血瘀型大鼠血液流变学的影响

[0212] 取180～220g，SD大鼠60只，雌雄各半，随机分成6组，每组10只，分别为空白组、复方丹参片组、复方银杏低、中、高剂量组。各组灌服相应药物每天1次，空白组给等容量蒸馏水，连续7天，末次给药后空白组大鼠皮下注射生理盐水，其余各组动物均皮下注射1mg/ml肾上腺素注射液(0.08ml/100g体重)两次，间隔4小时，在两次注射肾上腺素注射液之[5]间将大鼠浸于冰水中5min，造成血瘀模型 ，停食至次晨，剪开颈动脉采血测定血液流变学指标。每个标本取出后两小时内检测完毕。数据经成组t检验统计进行比较，结果见表9。

[0213] 表9 复方银杏叶片对血瘀型大鼠血液流变学的影响

[0214]

[0215] 注：与模型组比较：*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01。

[0216] 由表9可见，与空白组比较，模型组的全血粘度、血浆粘度及红细胞压积具有显著性差异，表明血瘀模型造模成功；与模型组比较，复方银杏叶片各剂量组均有显著性差异，表明复方银杏叶片能改善急性血瘀模型大鼠血液的浓、粘、凝状态，具有一定的活血化瘀的作用。阳性对照药复方丹参片也有较好的活血化瘀的作用。

[0217] 5.益肾实验，复方银杏叶片对可的松肾阳虚大鼠血浆环核苷酸的影响

[0218] 取200～220g，SD大鼠60只，雌雄各半，按性别体重分层，随机分成6组，每组10只，分别为空白组，模型组，桂附地黄丸组，复方银杏叶片低、中、高剂量组。空白组大鼠每日肌注生理盐水，其余各组每日肌注氢化可的松(2mg/100g体重)，使其出现明显阳虚症状(司卉良，陈友香，候安继，等补肾壮阳方对更年奇肾虚证大鼠的影响[J].2005，24(8)：
675)，10天后停止注射氢化可的松，各组灌服相应中药连续14天。于末次给药后称重，记录各组大鼠体重，30min后断头采血。按cAMP和cGMP放免试剂盒说明处理，并测定血浆cAMP、cGMP含量。数据经成组t检验统计进行比较，结果见表10、11。

[0219] 表10 复方银杏叶片对可的松肾阳虚大鼠血浆环核苷酸的影响

[0220]

[0221] 注：与模型组比较：*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01。

[0222] 表11复方银杏叶片对可的松肾阳虚大鼠体重的影响

[0223]

[0224] 注：与模型组比较：*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01。

[0225] 由表8可见，与空白组比较，模型组大鼠血浆cAMP明显降低，而cGMP明显升高，且cAMP/cGMP比值显著降低，提示阳虚模型大鼠复制成功。复方银杏叶片三个剂量组均能很好的调节血浆cAMP和cGMP水平，升高cAMP，降低cGMP。其中低剂量和高剂量与模型组比较差异显著(P＜0.05)，高剂量也有明显的趋势，表明复方银杏叶片有补肾阳的作用。由表9可见，模型组大鼠实验后体重明显低于空白组，且有显著性差异(P＜0.01)，说明模型大鼠生长受到严重抑制，反映了肾阳虚模型造模成功。复方银杏叶片三个剂量组的实验后体重均比模型组高，且中、高剂量组能显著增加大鼠体重(P＜0.05)，这提示复方银杏叶片能促进大鼠生长发育，有一定补肾益精的作用。

[0226] 通过对拟血管性痴呆大鼠及小鼠模型实验及活血化瘀、补肾阳等试验的研究，结果表明：复方银杏叶片能明显提高小鼠学习和记忆能力，改善各项相关指标：能显著改善急性血瘀大鼠全血粘度、血浆粘度和红细胞压积的异常；能明显改善小鼠的耳廓微循环；对可的松阳虚大鼠和甲减小鼠的血浆环核苷酸有很好的调节作用，能明显提高血浆cAMP水平，降低cGMP水平，升高cAMP/cGMP比值。

[0227] 本领域技术人员将会认识到，或者根据常规经验就可以确定很多本文所描述的本发明具体实施方式的等效替换。本申请引用的出版物的披露内容也以引用形式全部并入本文中，以作为参考。然而应该明白，本发明的范围不限于上述具体实施方式。在此特别指出，尽管在具体实施例中只列出了本发明药物的一种制剂(片剂)，但是本领域技术人员应该明白，本发明并不局限于此，本文中提到的其他剂型完全可以实施。因此本发明不按照这些具体描述也可以实施，并且仍然在所附的权利要求的范围之内。