皮肤老化标记物及其利用技术转让专利
申请号 : CN200680031061.8
文献号 : CN101248192B
文献日 : 2013-02-20
发明人 : 宫田智 , 宫崎香 , 安田知永 , 岩松明彦
申请人 : 株式会社芳珂 , 宫崎香
摘要 :
本发明以探索可成为皮肤老化标记物的物质为目的，涉及包括测定皮肤细胞及/或皮肤组织中分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质的表达及/或其基因表达的判定皮肤老化度的方法，上述方法中，上述分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质因皮肤老化其表达发生改变。本发明还提供用于判定皮肤老化度的试剂盒及鉴定具有防止皮肤老化作用的物质的方法。
权利要求 :
1.激肽释放酶7的抗体在制备检测皮肤老化的制剂中的应用。
2.激肽释放酶7的抗体在制备检测皮肤老化的试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述激肽释放酶7的抗体为兔抗-激肽释放酶7多克隆抗体。
说明书 :
皮肤老化标记物及其利用技术
技术领域
[0001] 本发明涉及皮肤老化标记物及其利用技术。
背景技术
[0002] 皮肤的增龄变化一般从外表所见的皱纹、松弛等来识别，皮肤年龄的推断，一直以来都在尝试基于外观变化使用机器的客观评价。实际使用的方法，已报道的有从皱纹、松弛的程度推断实际年龄，或通过纤维内镜等测定皮肤外表肌理的细致程度，或通过使振动器接触皮肤时的振动变化判断皮肤年龄的方法(专利文献1～3)。
[0003] 曾有人提出老化的主要原因是细胞老化，但始终未能确证细胞老化是个体老化的原因。最近，终于有报道确证了细胞老化是个体老化的原因的结果(非专利文献1)。认为皮肤的增龄变化在皱纹、松弛等外表变化出现之前已在细胞水平发生了增龄变化。例如，伴随皮肤老化，会引起细胞外基质蛋白(ECM)即胶原蛋白等减少、ECM降解蛋白酶的表达增加等各种因子的表达变化(非专利文献2～4)。接受了生物体内产生的氧化修饰等的异常蛋白质虽被蛋白酶体降解，但增龄的同时皮肤中的蛋白酶体表达降低，所以会引起氧化胶原蛋白的积累(非专利文献5)。因此要准确测定皮肤老化度，基于外表变化的评价并不充分，而从细胞水平测定生物化学形式的增龄变化非常重要。
[0004] 至今为止，作为皮肤细胞的老化标记物，已鉴定出衰老相关之β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase(SA-β-Gal))，并证明SA-β-Gal在最终分化的细胞中不表达而只在老化的细胞中特异性表达，与人体皮肤组织的老化密切相关(非专利文献6)。除此之外的皮肤老化标记物，已报导的有丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor)之一的Maspin、半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cysteine protease inhibitor)之一的胱抑素A(Cystatin A)等(非专利文献7、8)。
[0005] 作为探索皮肤老化的生物标记物的方法，特定的细胞置于特定的条件下时，将该细胞内存在的全蛋白质[蛋白质组(proteome)]通过二维电泳分离，再通过质谱仪鉴定的方法(蛋白质组学(proteomics))行之有效。实际上，从年轻人和老年人的皮肤组织中提取蛋白质，通过蛋白质组学(proteomics)研究，发现了因皮肤老化而发生显著变化的蛋白质有真核翻译起始因子-5A(eIF-5A)、环孢霉素A(Cyclophilin A)、蛋白酶体蛋白(Proteasomal protein)、蛋白酶体激活因子28-α(PA28-α)、色氨酸-tRNA合成酶(Tryptophanyl-tRNA synthetase)、热休克蛋白60(HSP60)、膜连蛋白I(Annexin I)、NM23 H2(核苷二磷酸酶激酶(nucleoside diphosphatasekinase))、磷酯酰肌醇3激酶的调节亚单位β亚型(PI3K p85βisoform)、锰-超氧化物歧化酶(Mn-superoxide dismutase)、纤溶酶原激活剂抑制剂-2(PAI-2)、Mx-A蛋白(Mx-A protein)(非专利文献9)。但是，至今为止对皮肤进行的蛋白质组学(proteomics)研究是使用皮肤组织的提取物或细胞提取物的分析，还没有着眼于大量含有微量分泌蛋白质的细胞培养上清液进行蛋白质组学(proteomics)研究的先例。用经鉴定的皮肤老化标记物对人体皮肤的检测是对通过活检取出的皮肤组织进行免疫染色等实用性低的方法，还没有使用下述实用性高的方法进行测试的先例，即使用可非侵袭、安全、简便地采集角质层的角质测试仪(checker)采集角质层，从中提取蛋白质测定皮肤老化标记物表达。
[0006] 专利文献1：日本特开2002-330943号公报
[0007] 专利文献2：日本特开2002-360544号公报
[0008] 专利文献3：日本特开2001-212087号公报
[0009] 非专利文献1：J.Clinic.Invest.，114，1299-1307，2004
[0010] 非专利文献2：Mol.Cell.Biochem.1999 Apr，194(1-2)：99-108
[0011] 非专利文献3：J.Investig.Dermatol.Symp.Proc.，3(2)，172-179，1998[0012] 非专利文献4：Mech.Ageing Dev.，123(7)，801-810，2002.
[0013] 非专利文献5：J.Gerontology，55(5)，220-227，2000
[0014] 非专利文献6：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，9363-9367，1995
[0015] 非专利文献7：Cancer Research，64，2956-2961，2004
[0016] 非专利文献8：Dermatology，188，21-24，1994
[0017] 非专利文献9：Mol.Cell.Proteomics，2(2)，70-84，2003
发明内容
[0018] 本发明的目的是探索可成为皮肤老化标记物的物质。
[0019] 本发明者着眼于大量含有微量分泌蛋白质的细胞培养上清液，对伴随表皮角化细胞老化其表达发生改变的蛋白质进行蛋白质组学(proteomics)研究。即制备人体正常表皮角化细胞的第2代(年轻细胞)～第5代(老化细胞)的培养上清液，通过二维电泳和质谱仪进行蛋白质组(proteome)分析。本发明的特征在于尝试使用可鉴定超微量蛋白质(1 femto-mol以下)的技术{实验医学，20(16)，2367-2370，2002}进行鉴定。
[0020] 其结果，鉴定出19个伴随表皮角化细胞的老化而表达减少的蛋白质(表1)，49个表达增加的蛋白质(表2)。这些蛋白质中，除已知的皮肤老化标记物以外，还含有β2-微球蛋白(β2-microglobulin)、纤溶酶原激活剂抑制剂-1(Plasminogen activator inhibitor(PAI)-1)、激肽释放酶7(Kallikrein7)等新型皮肤老化标记物。此外，将通过蛋白质组(proteome)分析鉴定出的蛋白质的表达用一维Western印迹法确认，鉴定出与表皮角化细胞的老化相关的数个蛋白质(表3)。且通过蛋白质组(proteome)分析鉴定出细胞骨架蛋白的2种Keratin，由此也测定了伴随表皮角化细胞老化的各种角蛋白(Keratin)的表达变化。其结果，伴随表皮角化细胞老化，8种角蛋白(Keratin)(角蛋白10、13、14、15、
16、18、19及20)的表达增加，角蛋白7(Keratin 7)的表达减少。除表达发生改变的蛋白质以外，还鉴定出β2-微球蛋白(β2-microglobulin)，其是作为伴随表皮角化细胞老化、相对于通过蛋白酶切割的切割型来说不切割型的比例增加的蛋白质。
16、18、19及20)的表达增加，角蛋白7(Keratin 7)的表达减少。除表达发生改变的蛋白质以外，还鉴定出β2-微球蛋白(β2-microglobulin)，其是作为伴随表皮角化细胞老化、相对于通过蛋白酶切割的切割型来说不切割型的比例增加的蛋白质。
[0021] 另外，为了分析如前所述发现的皮肤老化标记物与人体皮肤老化度之间的相关性，使用可非侵袭、安全、简便地采集角质层的角质测试仪(checker)从20～69岁志愿者采集角质层，从中提取蛋白质，通过Western印迹法测定皮肤老化标记物的表达。结果证明角蛋白7(Keratin 7)、角蛋白15(Keratin 15)及激肽释放酶7(Kallikrein 7)与已知的作为皮肤老化指标的皮肤弹性及皱纹体积率密切相关。
[0022] 本发明的主要内容如下所示。
[0023] (1)判定皮肤老化度的方法，其包括测定皮肤细胞及/或皮肤组织中分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质的表达及/或其基因表达，所述方法中，所述分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质因皮肤老化其表达发生改变。
[0024] (2)(1)中所述 的方法，其中，分 泌蛋白 质及/或 细胞内 蛋白质 从激 肽 释 放 酶 7(Kallikrein 7)、纤 溶 酶 原 激 活 剂 抑 制 剂 -1(Plasminogen activatorinhibitor(PAI)-1)、尿 激 酶 型 纤 溶 酶 原 激 活 物 (Urokinase plasminogenactivator，uPA)、蛋 白 裂 解 酶(Matriptase)、葡 萄 糖 调 节 蛋 白94(Urokinaseplasminogen activator(GRP)94)、热休克蛋白70(HSP 70)、热休克蛋白
90(HSP 90)、半乳糖凝集素-1(Galectin-1)、半乳糖凝集素-3(Galectin-3)、半乳糖凝集素-7(Galectin-7)、胰岛素生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3、)、烯醇化酶-1(Enolase-1)、膜连蛋白II(Annexin II)、埃兹蛋白(Ezrin)、根蛋白(Radixin)、膜突蛋白(Moesin)、凝溶胶蛋白(Gelsolin)、角蛋白7(Keratin 7)、角蛋白10(Keratin 10)、角蛋白13(Keratin
13)、角蛋白14(Keratin 14)、角蛋白15(Keratin 15)、角蛋白16(Keratin 16)、角蛋白18(Keratin 18)、角蛋白19(Keratin 19)、角蛋白20(Keratin 20)及β2-微球蛋白(β2-microglobulin)所组成的组中选择。
90(HSP 90)、半乳糖凝集素-1(Galectin-1)、半乳糖凝集素-3(Galectin-3)、半乳糖凝集素-7(Galectin-7)、胰岛素生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3、)、烯醇化酶-1(Enolase-1)、膜连蛋白II(Annexin II)、埃兹蛋白(Ezrin)、根蛋白(Radixin)、膜突蛋白(Moesin)、凝溶胶蛋白(Gelsolin)、角蛋白7(Keratin 7)、角蛋白10(Keratin 10)、角蛋白13(Keratin
13)、角蛋白14(Keratin 14)、角蛋白15(Keratin 15)、角蛋白16(Keratin 16)、角蛋白18(Keratin 18)、角蛋白19(Keratin 19)、角蛋白20(Keratin 20)及β2-微球蛋白(β2-microglobulin)所组成的组中选择。
[0025] (3)(1)或(2)中所述的方法，其在蛋白质水平上测定分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质的表达。
[0026] (4)(1)或(2)中所述的方法，其在RNA水平上测定分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质的基因表达。
[0027] (5)用于判定皮肤老化度的试剂盒，其含有可特异性识别因皮肤老化其表达发生改变的分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质的抗体。
[0028] (6)(5)中所述的试剂盒，其中，分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质从激肽释放酶7(Kallikrein 7)、纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)、尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)、蛋白裂解酶(Matriptase)、葡萄糖调节蛋白94(GRP 94)、热休克蛋白70(HSP 70)、热休克蛋白90(HSP 90)、半乳糖凝集素-1(Galectin-1)、半乳糖凝集素-3(Galectin-3)、半乳糖凝集素-7(Galectin-7)、胰岛素生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)、烯醇化酶-1(Enolase-1)、膜连蛋白II(Annexin II)、埃兹蛋白(Ezrin)、根蛋白(Radixin)、膜突蛋白(Moesin)、凝溶胶蛋白(Gelsolin)、角蛋白7(Keratin7)、角蛋白10(Keratin 10)、角蛋白13(Keratin
13)、角蛋白14(Keratin14)、角蛋白15(Keratin 15)、角蛋白16(Keratin 16)、角蛋白
18(Keratin18、)、角蛋白19(Keratin 19)、角蛋白20(Keratin 20)及β2-微球蛋白(β2-microglobulin)所组成的组中选择。
13)、角蛋白14(Keratin14)、角蛋白15(Keratin 15)、角蛋白16(Keratin 16)、角蛋白
18(Keratin18、)、角蛋白19(Keratin 19)、角蛋白20(Keratin 20)及β2-微球蛋白(β2-microglobulin)所组成的组中选择。
[0029] (7)用于判定皮肤老化度的试剂盒，其含有可与因皮肤老化其表达发生改变的分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质的mRNA特异性杂交的核酸探针。
[0030] (8)(7)中所述的试剂盒，其中，分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质从激肽释放酶7(Kallikrein 7)、纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)、尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)、蛋白裂解酶(Matriptase)、葡萄糖调节蛋白94(GRP 94)、热休克蛋白70(HSP 70)、热休克蛋白90(HSP 90)、半乳糖凝集素-1(Galectin-1)、半乳糖凝集素-3(Galectin-3)、半乳糖凝集素-7(Galectin-7)、胰岛素生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3、)、烯醇化酶-1(Enolase-1)、膜连蛋白II(Annexin II)、埃兹蛋白(Ezrin)、根蛋白(Radixin)、膜突蛋白(Moesin)、凝溶胶蛋白(Gelsolin)、角蛋白7(Keratin 7)、角蛋白10(Keratin 10)、角蛋白13(Keratin
13)、角蛋白14(Keratin14)、角蛋白15(Keratin 15、)、角蛋白16(Keratin 16)、角蛋白18(Keratin18)、角蛋白19(Keratin 19)、角蛋白20(Keratin 20)及β2-微球蛋白(β2-microglobulin)所组成的组中选择。
13)、角蛋白14(Keratin14)、角蛋白15(Keratin 15、)、角蛋白16(Keratin 16)、角蛋白18(Keratin18)、角蛋白19(Keratin 19)、角蛋白20(Keratin 20)及β2-微球蛋白(β2-microglobulin)所组成的组中选择。
[0031] (9)用于判定皮肤老化度的试剂盒，其含有可与因皮肤老化其表达发生改变的分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质的mRNA特异性杂交的核酸引物及可与以所述mRNA为模板合成的cDNA特异性杂交的核酸引物所组成的1对核酸引物。
[0032] (10)(9)中所述的试剂盒，其中，分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质从激肽释放酶7(Kallikrein 7)、纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)、尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)、蛋白裂解酶(Matriptase)、葡萄糖调节蛋白94(GRP 94)、热休克蛋白70(HSP 70)、热休克蛋白90(HSP 90)、半乳糖凝集素-1(Galectin-1)、半乳糖凝集素-3(Galectin-3)、半乳糖凝集素-7(Galectin-7)、胰岛素生长因子结合蛋白-3(Insulin growth factor bindingprotein(IGFBP)-3)、烯醇化酶-1(Enolase-1)、膜连蛋白II(Annexin II)、埃兹蛋白(Ezrin)、根蛋白(Radixin)、膜突蛋白(Moesin)、凝溶胶蛋白(Gelsolin)、角蛋白7(Keratin 7)、角蛋白10(Keratin 10)、角蛋白13(Keratin 13)、角蛋白14(Keratin
14)、角蛋白15(Keratin 15)、角蛋白16(Keratin 16)、角蛋白18(Keratin 18)、角蛋白
19(Keratin 19)、角蛋白20(Keratin 20)及β2-微球蛋白(β2-microglobulin)所组成的组中选择。
14)、角蛋白15(Keratin 15)、角蛋白16(Keratin 16)、角蛋白18(Keratin 18)、角蛋白
19(Keratin 19)、角蛋白20(Keratin 20)及β2-微球蛋白(β2-microglobulin)所组成的组中选择。
[0033] (11)鉴定具有防止皮肤老化作用的物质的方法，其包括以下工序：
[0034] (a)使皮肤细胞及/或皮肤组织与被测物质接触的工序，
[0035] (b)在规定时间内培养工序(a)中与被测物质接触过的皮肤细胞及/或皮肤组织的工序，
[0036] (c)测定工序(b)中培养的皮肤细胞及/或皮肤组织中分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质的表达及/或其基因表达的工序，所述工序中，所述分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质因皮肤老化其表达发生改变，以及
[0037] (d)通过比较工序(c)中测定的分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质的表达及/或其基因表达与对照的皮肤细胞及/或皮肤组织中分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质的表达及/或其基因表达，评价被测物质对于皮肤细胞及/或皮肤组织中分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质的表达及/或其基因表达的作用的工序。
[0038] (12)(11)中所述的方法，其中，分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质从激肽释放酶7(Kallikrein 7)、纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)、尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)、蛋白裂解酶(Matriptase)、葡萄糖调节蛋白94(GRP 94)、热休克蛋白70(HSP 70)、热休克蛋白90(HSP 90)、半乳糖凝集素-1(Galectin-1)、半乳糖凝集素-3(Galectin-3)、半乳糖凝集素-7(Galectin-7)、胰岛素生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3、)、烯醇化酶-1(Enolase-1)、膜连蛋白II(Annexin II)、埃兹蛋白(Ezrin)、根蛋白(Radixin)、膜突蛋白(Moesin)、凝溶胶蛋白(Gelsolin)、角蛋白7(Keratin7)、角蛋白10(Keratin 10)、角蛋白13(Keratin
13)、角蛋白14(Keratin14)、角蛋白15(Keratin 15)、角蛋白16(Keratin 16)、角蛋白18(Keratin18)、角蛋白19(Keratin 19)、角蛋白20(Keratin 20)及β2-微球蛋白(β2-microglobulin)所组成的组中选择。
13)、角蛋白14(Keratin14)、角蛋白15(Keratin 15)、角蛋白16(Keratin 16)、角蛋白18(Keratin18)、角蛋白19(Keratin 19)、角蛋白20(Keratin 20)及β2-微球蛋白(β2-microglobulin)所组成的组中选择。
[0039] 通过本发明，可确立以皮肤老化中细胞水平的增龄变化为指标的评价系统。使用此评价系统，与以往方法相比，可更详细、准确地判定皮肤的老化度。本发明还提供用于判定皮肤老化度的试剂盒及鉴定具有防止皮肤老化作用的物质的方法。
附图说明
[0040] 图1表示通过表皮角化细胞的继代的增殖变化(a)及形态变化(b)。
[0041] 图2表示表皮角化细胞各继代数中衰老相关之β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色的细胞的染色图像(a)及衰老相关之β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色的细胞的比例(b)。
[0042] 图3表示通过从表皮角化细胞的第2代及第5代继代数中提取的蛋白质的二维电泳分析得到的表达模式。
[0043] 图4表示通过一维Western印迹法分析伴随表皮角化细胞老化层粘蛋白5(Laminin 5)及纤维粘连蛋白(Fibronectin)的表达变化的结果。
[0044] 图5(a)(b)表示通过一维Western印迹法分析伴随表皮角化细胞老化蛋白酶及蛋白酶抑制剂的表达变化的结果。
[0045] 图6表示通过一维Western印迹法分析伴随表皮角化细胞老化热休克蛋白的表达变化的结果。
[0046] 图7表示通过一维Western印迹法分析伴随表皮角化细胞老化细胞内蛋白质及细胞骨架蛋白的表达变化的结果。
[0047] 图8表示通过一维Western印迹法分析伴随表皮角化细胞老化半乳糖凝集素(Galectin)及胰岛素生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)的表达变化的结果。
[0048] 图9表示通过一维Western印迹法分析伴随表皮角化细胞老化角蛋白(Keratin)的表达变化的结果。
[0049] 图10表示从眼角角质层提取的角蛋白15(Keratin 15)的表达和年龄的相关关系。
[0050] 图11表示从眼角角质层提取的角蛋白10(Keratin 10)的表达和年龄的相关关系。
[0051] 图12表示年龄和眼角弹性的相关关系。
[0052] 图13表示年龄和眼角皱纹体积率的相关关系。
[0053] 图14表示从眼角角质层提取的角蛋白7(Keratin 7)的表达和眼角弹性的相关关系。
[0054] 图15表示从眼角角质层提取的角蛋白15(Keratin 15)的表达和眼角弹性的相关关系。
[0055] 图16表示从眼角角质层提取的角蛋白7(Keratin 7)的表达和眼角皱纹体积率的相关关系。
[0056] 图17表示从眼角角质层提取的角蛋白15(Keratin 15)的表达和眼角皱纹体积率的相关关系。
[0057] 图18表示从眼角角质层提取的激肽释放酶7(Kallikrein 7)的表达和眼角弹性的相关关系。
[0058] 图19表示从眼角角质层提取的激肽释放酶7(Kallikrein 7)的表达和眼角皱纹体积率的相关关系。
具体实施方式
[0059] 以下更详细地说明本发明的实施方式。
[0060] 本发明提供一种判定皮肤老化度的方法，其包括测定皮肤细胞及/或皮肤组织中分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质的表达。分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质因皮肤老化其表达发生改变。“表达发生改变”的方式可以是蛋白质及/或其基因的表达的有无发生改变、表达量发生增减、已表达的蛋白质中通过蛋白酶作用的切割型和不切割型的比例发生改变等。用于判定皮肤老化度的分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质优选从激肽释放酶7、纤溶酶原激活剂抑制剂-1、尿激酶型纤溶酶原激活物、蛋白裂解酶、葡萄糖调节蛋白94、热休克蛋白70、热休克蛋白90、半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7、胰岛素生长因子结合蛋白-3、烯醇化酶-1、膜连蛋白II、埃兹蛋白、根蛋白、膜突蛋白、凝溶胶蛋白、角蛋白
7、角蛋白10、角蛋白13、角蛋白14、角蛋白15、角蛋白16、角蛋白18、角蛋白19、角蛋白20及β2-微球蛋白所组成的组中选择。所选蛋白质可以是1种也可以是多种。
7、角蛋白10、角蛋白13、角蛋白14、角蛋白15、角蛋白16、角蛋白18、角蛋白19、角蛋白20及β2-微球蛋白所组成的组中选择。所选蛋白质可以是1种也可以是多种。
[0061] 激肽释放酶7(Kallikrein 7)是分子质量为27,525Da的分泌蛋白质，具有通过切割角质层的细胞之间的结合部分促进皮肤表面的细胞落屑的作用。在皮肤组织中大量表达的同时，在脑、乳腺、脊髓、肾脏的组织中也进行表达。基因序列信息(Stratum comeum chymotrytic enzyme，J.Biol.Chem.269：19420-19426，1994，L33404)。氨基酸序列信息(Kallikrein 7precursor，J.Biol.Chem.269：19420-19426，1994，P49862)。
[0062] 纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)是分子质量为45,060Da的分泌蛋白质，是丝氨酸蛋白酶的一种，阻断组织型纤溶酶原激活酶(tPA(tissueplasminogen activator))，尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)，蛋白C(proteinC)等的活性。纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)是对酸稳定的糖蛋白质，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)家族。存在于血浆、血小板、内皮细胞、肝细胞、纤维肉瘤细胞。基因序列信息(Plasminogen activator inhibitor-1，J.Clin.Invest.78：1673-1680，1986，M16006)。氨基酸序列信息(Plasminogen activator inhibitor-1，FEBS Lett.210：11-16，1987，P05121)。
[0063] 尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)是分子质量为48,525Da的分泌蛋白质。尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)是将纤维蛋白溶酶原转换成纤维蛋白溶酶的丝氨酸蛋白酶的一种。作为前体蛋白(55kDa)向细胞外分泌，为切割型(35kDa)，显示蛋白酶活性。在乳腺癌中大量表达。基因序列信息(Urokinase-type plasminogen activator，Nucleic Acids Res.13：
2759-2771，1985，BC013575)。氨基酸序列信息(Urokinase-type plasminogen activator，Hoppe-Seyler’s Z.Physiol.Chem.363：1043-1058，1982，P00749)。
2759-2771，1985，BC013575)。氨基酸序列信息(Urokinase-type plasminogen activator，Hoppe-Seyler’s Z.Physiol.Chem.363：1043-1058，1982，P00749)。
[0064] 蛋白裂解酶(Matriptase)是分子质量为75,626Da的分泌蛋白质，是分解细胞外基质的酶。有报道其参与乳腺癌的浸润和转移。显示胰蛋白酶样的酶活性。进一步表示与蛋白裂解酶(matriptase)的抑制剂即肝细胞生长因子活性抑制物(HAI-1(Hepatocyte growth factor activationinhibitor 1))的复合物。且已知剔除此基因的小鼠因不能控制皮肤的水分蒸发而致死。基因序列信息(Membrane-type serin protease 1，J.Biol.Chem.274：18231-18236，1999，AF188224)。氨基酸序列信息(Membrane-typeserin protease 1，J.Biol.Chem.274：18237-18242，1999，Q9BS01)。
[0065] 葡萄糖调节蛋白94(GRP94)是分子质量为92,469Da的分泌蛋白质，是热休克蛋白的一种，是在分泌蛋白质的切割、输送中起作用的分子伴侣。因具有信号肽，有的向细胞外分泌，有的定位于ER。基因序列信息(tumor rejection antigen(gp96)1，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87：5658-5662，1990，BC066656)。氨基酸序列信息(Endoplasmin，Nat.Biotechnol.21：566-569，2003，P14625)。
[0066] 热休克蛋白70(HSP70)是分子质量为70,052Da的细胞内蛋白质。通常在细胞内作为分子伴侣起作用，参与蛋白质的折叠、输送、聚集和降解等。且HSP70在线粒体、ER中的作用是使蛋白质正常转移。还与HSP90协同参与细胞内的信号传递。基因碱基序列信息(heat shock 70kDa protein1A，Immunogenetics 32：242-251，1990，BC002453)。氨基酸序列信息(Heatshock 70 kDa protein 1，P08107)。
[0067] 热休克蛋白90(HSP90)是分子质量为85,453Da的细胞内蛋白质。通常通过与类固醇激素受体等复合物结合·解离而在信号传递系统中起重要作用。细胞遭遇高温时，热休克蛋白70(HSP90)改变结构，作为防止蛋白质的不可逆损伤的分子伴侣起作用。基因碱基序列信息(Heat shockprotein 90，Nucleic Acids Res.17：7108-7110，1989，X15183)。氨基酸序列信息(Heat shock protein 90，J.Biol.Chem.264：2431-2437，1989，P07900)。
[0068] 半乳糖凝集素-1(Galectin-1)是分子质量为14,585Da的细胞内蛋白质，也向细胞外分泌，存在于心脏、胃、骨骼肌、神经、胸腺、肾脏、胎盘等中。与β-半乳糖苷、CD45，CD3，CD4等结合。已知其影响细胞的增殖促进作用、细胞死亡的诱导及免疫应答。与层粘蛋白、整合素等的细胞外基质的组成成分、细胞受体特异性结合，对细胞粘附、移动产生很大的影响。基因序列信息(Galectin-1，J.Biol.Chem.264：1310-1316，1989，BT006775)。氨基酸序列信息(Galectin-1，J.Biochem.104：1-4，1988，P09382)。
[0069] 半乳糖凝集素-3(Galectin-3)是分子质量为35,678Da的细胞内蛋白质，是与IgE结合的半乳糖特异性凝集素。主要的表达可见于大肠的上皮、活化巨噬细胞中。据报道，半乳糖凝集素3(Galectin-3)由表皮角化细胞产生，存在于皮肤的胰岛细胞表面，与IgE结合，调节免疫系统。基因序列信息(Galectin-3，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87：7324-7328，1990，AB006780)。氨基酸序列信息(Galectin-3，P17931)。
[0070] 半乳糖凝集素-7(Galectin-7)是分子质量为14,944Da的细胞内蛋白质。一般地，在细胞之间、细胞和细胞外基质间控制细胞的增殖。是与细胞凋亡有关的蛋白质，控制JNK的活性、细胞色素C的释放。也向细胞质、核、细胞外分泌。是在人体表皮最早被克隆的半乳糖凝集素亚家族的成员，从培养表皮角化细胞的研究中得知，半乳糖凝集素7(Galectin-7)不受角质化程度的影响，在所有的表皮细胞中表达。基因序列信息(Galectin-7，Dev.Biol.168：259-271，1995，L07769)，氨基酸序列信息(Galectin-7，J.Biol.Chem.270：5823-5829，1995，P47929)。
[0071] 胰岛素生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)是分子质量为31,660Da的分泌蛋白质。一般通过与胰岛素生长因子(IGF)结合，延长半衰期的时间。在细胞培养中抑制或促进细胞增殖。在细胞表面与胰岛素生长因(IGF)受体结合。胰岛素生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)与胰岛素生长因子-2(IGF-2)的结合力比与胰岛素生长因子-1(IGF-1)的结合力高。在组织中，在大部分组织中均有表达。基因序列信息(Insulin-like growth factorbinding protein-3，J.Biol.Chem.265，12642-12649，1990，M35878)。氨基酸序列信息(Insulin-like growth factor binding protein-3，J.Biol.Chem.265，14892-14898，1990，P17936)。
[0072] 烯醇化酶-1(Enolase-1)是分子质量为47,038Da的细胞内蛋白质，具有2-磷酸-D-甘油酸酯(2-phospho-D-glycerate)＝磷酸烯醇丙酮酸酯(phosphoenolpyruvate)+水(H2O)的酶活性，在糖酵解中起作用。且据报道，一部分与细胞增殖、过敏有关。在白血球、神经中，控制细胞表面的纤维蛋白溶酶原的活化，参与纤维蛋白的形成。具有稳定的二聚体结构时需要镁。定位于细胞质内，而只有同源二聚体存在于细胞膜中。α-烯醇化酶(α-enolase)在大部分的组织中表达，β-烯醇化酶(β-enolase)只在肌肉组织中表达，γ-烯醇化酶(γ-enolase)只在神经组织中表达。基因序列信息(Alpha enolase，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.83：6741-6745，1986，M14328)。氨基酸序列信息(Alpha enolase，Enzyme Protein，48：37-44，1995，P06733)。
[0073] 膜连蛋白II(Annexin II)是分子质量为38,473Da的细胞内蛋白质。据报道，其一部分向细胞外分泌。是受钙控制的膜结合蛋白质，在此蛋白质中结合两个钙离子。定位于细胞膜附近。2组膜连蛋白(annexin)重复子中1个与钙结合，1个与磷脂结合。此蛋白质与细胞膜上具有的磷脂结合，与肌动蛋白、细胞骨架蛋白交联，通过组织纤维蛋白溶酶原激活物(tPA)激活纤维蛋白溶酶原。基因碱基序列信息(Annexin A2，Gene 95：243-251，1990，BC015834)。氨基酸序列信息(Annexin A2，J.Biol.Chem.266：5169-5176，1991，P07355)。
[0074] 埃兹蛋白(Ezrin)是分子质量为69,268Da的细胞内蛋白质。下述根蛋白(Radixin)、膜突蛋白(Moesin)是同族分子。主要起连接细胞骨架蛋白和细胞膜的作用。定位于细胞膜的被称为微绒毛(microvilli)的丝状突起的内侧。构成肠上皮细胞的微绒毛(microvilli)。由酪氨酸激酶磷酸化。基因序列信息(Ezrin，J.Biol.Chem.264：
16727-16732，1989，X51521)。氨基酸序列信息(Ezrin，Biochem.Biophys.Res.Commun.224：
666-674，1996，P15311)。
16727-16732，1989，X51521)。氨基酸序列信息(Ezrin，Biochem.Biophys.Res.Commun.224：
666-674，1996，P15311)。
[0075] 根蛋白(Radixin)是分子质量为68,564Da的细胞内蛋白质。主要起连接细胞骨架蛋白和细胞膜的作用。基因序列信息(Radixin，Genomics.16：199-206，1993，L02320)。氨基酸序列信息(Radixin，P35241)。
[0076] 膜突蛋白(Moesin)是分子质量为67,689Da的细胞内蛋白质。主要起连接细胞骨架蛋白和细胞膜的作用。据报道，在异常分化的表皮角化细胞中表达降低。基因序列信息(Moesin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88：8297-8301，1991，M69066)。氨基酸序列信息(Moesin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88：8297-8301，1991，P26038)。
[0077] 凝溶胶蛋白(Gelsolin)是分子质量为85,698Da的分泌蛋白质。有向细胞外分泌和在细胞内起作用这2种类型。向细胞外分泌的凝溶胶蛋白(Gelsolin)与纤维连接蛋白结合。凝溶胶蛋白具有以下3种调节肌动蛋白聚合的功能：通过聚合成核促进肌动蛋白纤维伸长、肌动蛋白纤维的切割及其末端保护。通过此两面性的功能，控制聚合-脱聚合这两种局面，在细胞运动中起重要作用。在血小板、纤维芽细胞中大量表达。基因序列信息(Gelsolin，Nat.323，455-458，1986，X04412)。氨基酸序列信息(Gelsolin，Nat.Biotechnol.21.566-569，2003，P06396)。
[0078] 角蛋白7(Keratin 7)是分子质量为51,287Da的细胞骨架蛋白，是中间丝的成分。在包含腺细胞的多种上皮细胞中表达。在输尿管的移行上皮、胆管、肺、乳腺上皮中也有表达。一部分作为肿瘤标记物使用。基因序列信息(Keratin 7，J.Cell Biol.107：1337-1350，
1988，AF509887)。氨基酸序列信息(Keratin，type II cytoskeletal 7，P08729)。
1988，AF509887)。氨基酸序列信息(Keratin，type II cytoskeletal 7，P08729)。
[0079] 角蛋白10(Keratin 10)是分子质量为59,519Da的细胞骨架蛋白，与Keratin1形成异四聚体，是中间丝的成分。存在于所有皮肤中，特别是大量存在于棘细胞层。基因序列信息(Keratin 10，J.Mol.Biol.204：841-856，1988，M19156)。氨基酸序列信息(Keratin，type I cytoskeletal 10，Electrophoresis 13：960-969，1992，P13645)。
[0080] 角蛋白13(Keratin 13)是分子质量为49,586Da的细胞骨架蛋白，与角蛋白4形成异四聚体，是中间丝的成分。在舌、食道、上皮、尿道上皮等处表达。基因序列信息(Keratin 13，Gene 215：269-279，1998，X52426)。氨基酸序列信息(Keratin，type I cytoskeletal 13，P13646)。
[0081] 角蛋白14(Keratin 14)是分子质量为51,490Da的细胞骨架蛋白，与角蛋白5形成异四聚体，是中间丝的成分。存在上皮，特别在接近基底层处大量表达。作为上皮系统的未分化标记物使用。基因序列信息(Keratin14，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82：1609-1613，1985，BC002690)。氨基酸序列信息(Keratin，type I cytoskeletal 14，P02533)。
[0082] 角蛋白15(Keratin 15)是分子质量为49,167Da的细胞骨架蛋白，是中间丝的成分，主要定位于上皮基底层。基因序列信息(Keratin 15，J.Cell Biol.106：1249-1261，1988，X07696)。氨基酸序列信息(Keratin，type Icytoskeletal 15，P19012)。
[0083] 角蛋白16(Keratin 16)是分子质量为51,136Da的细胞骨架蛋白。与Keratin6形成异四聚体，是中间丝的成分。在毛囊、指甲、口腔的扁平上皮层、上皮的基底层、手掌的上皮、汗腺处表达。参与细胞的增殖、分化。基因序列信息(Keratin 16，Biochem.Biophys.Res.Commun.215：517-523，1995，AF061812)。氨基酸序列信息(Keratin，type I cytoskeletal 16，Electrophoresis 13：960-969，1992，P08779)。
[0084] 角蛋白18(Keratin 18)是分子质量为47,926Da的细胞骨架蛋白。与角蛋白8(Keratin 8)形成异四聚体，是中间丝的成分。存在于大部分的单层腺上皮中。缺失角蛋白18(Keratin 18)的患者有患突发性肝病的可能性。基因序列信息(Keratin18，Differentiation 33：61-68，1986，M26325)。氨基酸序列信息(Keratin，type I cytoskeletal 18，Electrophoresis18：605-613，1997，P05783)。
[0085] 角蛋白19(Keratin 19)是分子质量为44,106Da的细胞骨架蛋白。在角蛋白中分子量最小。是中间丝的成分。在大部分单层上皮、非角质化型复层上皮中大量表达。且在所有的腺癌中表达。基因序列信息(Keratin19，J.Invest.Dermatol.92：707-716，1989，Y00503)。氨基酸序列信息(Keratin，type I cytoskeletal 19，Electrophoresis 13：960-969，1992，P08727)。
[0086] 角蛋白20(Keratin 20)是分子质量为48,486Da的细胞骨架蛋白，是中间丝的成分。正常细胞的情况下，其存在于肠道上皮、消化道上皮、胃幽门上部的内分泌细胞和尿道上皮、皮肤的Merkel细胞中。作为大肠癌等的特异性蛋白质标记物应用。基因序列信息(Keratin 20，Differentiation53：75-93，1993，BC031559)。氨基酸序列信息(Keratin，type I cytoskeletal20，P35900)。
[0087] β2-微球蛋白(β2-microglobulin)是分子质量为13,175Da的分泌蛋白质。是HLA class I抗原(组织相容性抗原)的L链。存在于许多细胞的表面。用作肾功能障碍、各种恶性肿瘤等的诊断指标。发现有一部分切割型，但其意义不太明确。基因序列信息(Beta-2-microglobulin，J.Immunol.139：3132-3138，1987，AB021288)。氨基酸序列信息(Beta-2-microglobulin，Biochemistry 12：4811-4822(1973)，P61769)。
[0088] 上述蛋白质可以是前体蛋白，也可以是成熟蛋白，可以是切割型，也可以是不切割型。前体蛋白可以是原蛋白质、前原蛋白质等。原蛋白质、前原蛋白质等中，有的也具有作为分泌蛋白质的特征性序列的信号肽。
[0089] 本发明的方法，可以测定皮肤细胞及/或皮肤组织中分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质的表达，也可以测定其基因表达。例如，可用Northern印迹法、PCR法、Western印迹法、免疫组织化学分析法等测定。或也可利用cDNA微阵列、ELISA法、抗体阵列等测定。
[0090] 为在蛋白质水平测定分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质的表达，可使用特异性识别作为测定对象的蛋白质的抗体。抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体中的任一种。这些抗125
体可用公知方法制造，也可为市售品。用Western印迹法测定时，抗体可用 I蛋白质标记物A、过氧化物酶结合的IgG等进行二次检测。用免疫组织化学分析法测定时，抗体可用荧光色素、铁蛋白、酶等标记。
体可用公知方法制造，也可为市售品。用Western印迹法测定时，抗体可用 I蛋白质标记物A、过氧化物酶结合的IgG等进行二次检测。用免疫组织化学分析法测定时，抗体可用荧光色素、铁蛋白、酶等标记。
[0091] 为在RNA水平测定分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质的基因表达，可使用可与作为测定对象的蛋白质的mRNA特异性杂交的核酸探针(用Northern印迹法测定时)。或也可使用可与作为测定对象的蛋白质的mRNA特异性杂交的核酸引物及可与以上述mRNA为模板合成的cDNA特异性杂交的核酸引物所组成的一对核酸引物(用PCR法测定时)。核酸探针及核酸引物可根据作为测定对象的蛋白质的基因信息设计。核酸探针通常以约15～1500碱基为宜。核酸探针可用放射性元素、荧光色素、酶等标记。核酸引物通常以约15～30碱基为宜。
[0092] 本发明中，可以检测皮肤细胞及/或皮肤组织中有无分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质的表达及/或其基因表达，也可以测定表达量。有无蛋白质及/或其mRNA的表达，可通过在规定位置有无出现斑点、条带来确认。蛋白质及/或其mRNA的表达量可通过斑点、条带的染色强度来测定。或也可对蛋白质及/或其mRNA定量。为了同时检测多数基因表达、多数蛋白质表达，可优选使用DNA阵列(将探针固定在基板上)(NATUREREVIEWS，DRUG DISCOVERY，VOLUME 1，DECEMBER 2002，951-960)、蛋白质芯片(将抗体固定在基板上)(NATURE REVIEWS，DRUG DISCOVERY，VOLUME 1，SEPTEMBER 2002，683-695)、流式点阵仪(Luminex)(NATURE REVIEWS，DRUG DISCOVERY，VOLUME 1，JUNE 2002，447-456)等的检测方法。
[0093] 皮肤细胞及皮肤组织可以来自任何生物，可来自人、猪、猴、大猩猩、狗、牛、兔、大鼠、小鼠等哺乳动物等。为判定人体皮肤的老化度时，需使用来自人体的组织。
[0094] 本发明的方法中，为判定皮肤老化度，可使用皮肤活检样品或由其中获得的皮肤培养细胞、皮肤培养组织等。
[0095] 皮肤细胞可列举为表皮角化细胞、皮肤纤维芽细胞、胰岛细胞、黑色素细胞、肥胖细胞、内皮细胞、皮脂细胞、毛乳头细胞、毛母细胞等。皮肤细胞由日本国内的人类科学研究资源库(日语原文：「ヒユ一マンサイエンス研究資源バンク」)、理化学研究所细胞银行(日语原文：「理化学研究所細胞銀行」)提供、海外的the American Type Culture Collection提供。且可从Clontech公司、Kurabo公司、PromoCell公司购入。也可通过公知的方法从皮肤采集[(用于分子生物学研究的新细胞培养实验法，p57-71，羊土社，1999)日语原文：「分子生物学研究のための新細胞培養実験法，p57-71，羊土社，1999」]。
[0096] 皮肤组织可列举为皮肤的角质层、表皮、真皮等。皮肤组织可从Biochain公司、Super Bio Chips公司购入。且可通过公知的方法从皮肤采集(Acta.Derm.Venereol.，85，389-393，2005)。
[0097] 皮肤模型可使用Kurabo公司、TOYOBO公司等的市售品。也可通过公知方法{J.Invest.Dermatol.，104(1)，107-112，1995}制备。
[0098] 皮肤活检样品可以是细胞，也可以是组织。皮肤活检样品，如后述实施例中所述，可使用角质层测试仪(checker)等的胶带采集的皮肤角质层等。角质层测试仪(checker)一直以来被用于采集角质层样品，该角质层样品用于测定角质层的不完全角化度和细胞面积、评价肌肤的粗糙程度和角质层的更新速度[(化妆品的有用性·评价技术的进步和未来展望，日本化妆品技术者会，药事日报社，p95-96)。日语原文：「化粧品の有用性·評価技術の道步と将来展望，日本化粧品技術者会，薬事日報社，p95-96」]。作为可在咨询(counseling)店、自家内简单、安全地采集角质层样品、从角质层非侵袭地获得蛋白质的方法非常有效。
[0099] 皮肤的老化度是指因增龄而产生的皱纹、松弛等皮肤老化现象的程度。已证明皱纹、松弛随增龄而更严重。除增龄外，暴露在紫外线下也使皱纹、松弛、暗淡、斑点加速发展。皱纹、松弛可通过公知方法测定[(化妆品的有用性·评价技术的进步和未来展望，日本化妆品技术者会，药事日报社，154-158，169-175，179-182，187-190，2001。日语原文：「化粧品の有用性·評価技術の道步と将来展望，日本化粧品技術者会，薬事日報社，154-158，
169-175，179-182，187-190，2001」]。
169-175，179-182，187-190，2001」]。
[0100] 已知伴随增龄而形成皱纹、松弛时，皮肤内部的表皮细胞及皮肤纤维芽细胞等皮肤细胞的增殖能力降低。因此，可将皮肤细胞增殖能力的降低作为指标判定皮肤的老化度。例如，据报道，反复继代而发生细胞老化的表皮角化细胞及皮肤纤维芽细胞中衰老相关之β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase(SA-β-Gal))增加，衰老相关之β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)的增加与人体皮肤老化相关(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，92，9363-9367，1995)。因此，本试验中，使用反复继代而发生细胞老化的表皮角化细胞所发现的各种蛋白质，作为人体皮肤老化标记物利用的可能性高。
[0101] 作为本发明的例子之一，皮肤的老化度可用如下标准判定。
[0102] 如实施例2所示的角蛋白7(Keratin 7)、角蛋白15(Keratin 15)及激肽释放酶7(Kallikrein 7)的分析例，从各年龄层的志愿者获得皮肤样品，测定特定的蛋白质标记物的表达量，制作其表达量和已知的作为皮肤老化指标的皮肤弹性及皱纹的程度的标准曲线。从标准样品和分析样品的表达量的比较中判定分析样品的皮肤老化度。对于β2-微球蛋白(β2-microglobulin)，从各年龄层的志愿者获得皮肤样品，算出切割型和不切割型的比率的平均值，制作其表达量和已知的作为皮肤老化指标的皮肤弹性及皱纹的程度的标准曲线。从标准样品和分析样品的表达量的比较中判定分析样品的皮肤老化度。
[0103] 本发明也提供用于判定皮肤老化度的试剂盒。
[0104] 例如，本发明的试剂盒中包含可特异性识别因皮肤老化其表达发生改变的分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质的抗体。分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质优选从激肽释放酶7、纤溶酶原激活剂抑制剂-1、尿激酶型纤溶酶原激活物、蛋白裂解酶、葡萄糖调节蛋白94、热休克蛋白70、热休克蛋白90、半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7、胰岛素生长因子结合蛋白-3、烯醇化酶-1、膜连蛋白II、埃兹蛋白、根蛋白、膜突蛋白、凝溶胶蛋白、角蛋白7、角蛋白10、角蛋白13、角蛋白14、角蛋白15、角蛋白16、角蛋白18、角蛋白19、角蛋白20及β2-微球蛋白所组成的组中选择。试剂盒中还可包括用于采集皮肤组织的胶带、免疫化学方法检测胶带上的蛋白质的全套试剂、使用说明书等。使用说明书中除记载试剂盒的使用方法以外，还可记载皮肤老化度的判定标准等。
[0105] 另外还有一例，例如，本发明的试剂盒包含可与因皮肤老化其表达发生改变的分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质的mRNA特异性杂交的核酸探针。分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质优选从激肽释放酶7、纤溶酶原激活剂抑制剂-1、尿激酶型纤溶酶原激活物、蛋白裂解酶、葡萄糖调节蛋白94、热休克蛋白70、热休克蛋白90、半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7、胰岛素生长因子结合蛋白-3、烯醇化酶-1、膜连蛋白II、埃兹蛋白、根蛋白、膜突蛋白、凝溶胶蛋白、角蛋白7、角蛋白10、角蛋白13、角蛋白14、角蛋白15、角蛋白16、角蛋白18、角蛋白19、角蛋白20及β2-微球蛋白所组成的组中选择。试剂盒中还可包括用于采集皮肤组织的胶带、用于从胶带上的皮肤组织中提取RNA的试剂类、用Northem印迹法分析RNA的试剂类、使用说明书等。使用说明书中，除记载试剂盒的使用方法以外，还可记载皮肤老化度的判定标准等。
[0106] 还有一例，本发明的试剂盒包含可与因皮肤老化其表达发生改变的分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质的mRNA特异性杂交的核酸引物及可与以上述mRNA为模板合成的cDNA特异性杂交的核酸引物所组成的一对核酸引物。分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质优选从激肽释放酶7、纤溶酶原激活剂抑制剂-1、尿激酶型纤溶酶原激活物、蛋白裂解酶、葡萄糖调节蛋白94、热休克蛋白70、热休克蛋白90、半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7、胰岛素生长因子结合蛋白-3、烯醇化酶-1、膜连蛋白II、埃兹蛋白、根蛋白、膜突蛋白、凝溶胶蛋白、角蛋白7、角蛋白10、角蛋白13、角蛋白14、角蛋白15、角蛋白16、角蛋白18、角蛋白19、角蛋白20及β2-微球蛋白所组成的组中选择。试剂盒中还可包括用于采集皮肤组织的胶带、用于从胶带上的皮肤组织中提取RNA的试剂类、用RT-PCR法分析RNA的试剂类、使用说明书等。使用说明书中，除记载试剂盒的使用方法以外，还记载皮肤老化度的判定标准等。
[0107] 本发明还提供鉴定具有防止皮肤老化作用的物质的方法，此方法包括以下工序：
[0108] (a)使皮肤细胞及/或皮肤组织与被测物质接触的工序，
[0109] (b)在规定时间内培养工序(a)中与被测物质接触过的皮肤细胞及/或皮肤组织的工序，
[0110] (c)测定工序(b)中培养的皮肤细胞及/或皮肤组织中分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质的表达的工序，所述工序中，所述分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质因皮肤老化其表达发生改变，以及
[0111] (d)通过比较工序(c)中测定的分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质的表达与对照的皮肤细胞及/或皮肤组织中分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质的表达，评价被测物质对于皮肤细胞及/或皮肤组织中分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质表达的作用的工序。
[0112] 被测物质可以是任何物质，可列举为蛋白质、肽、维生素、激素、多糖、低聚糖、单糖、低分子化合物、核酸(DNA、RNA、寡核苷酸、单核苷酸等)、脂质、除上述以外的天然化合物、合成化合物、上述物质的混合物等。
[0113] 皮肤细胞及皮肤组织如上所述。
[0114] 被测物质与皮肤细胞及/或皮肤组织的接触可使用任何方法，例如，可以是将被测物质添加到皮肤细胞及/或皮肤组织的培养液中的方法，在涂布或固定有被测物质的培养容器或培养层(sheet)上培养皮肤细胞及/或皮肤组织的方法等。也可以是使用人或人以外的哺乳动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猪等)的生物体，直接将被测物质涂布在皮肤上的方法、经口投与被测物质的方法。
[0115] 皮肤细胞及/或皮肤组织的培养时间无特别限制，只要是可确认出被测物质对皮肤细胞及/或皮肤组织中分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质的表达及/或其基因表达有无效果的时间即可。例如，皮肤细胞使用人体正常表皮角化细胞时，以12～48小时为宜，优选为12～24小时。此处，“培养皮肤细胞及/或皮肤组织”是指使皮肤细胞及/或皮肤组织生长发育·增殖之意，其中，除了使单离后的皮肤细胞及/或皮肤组织生长发育·增殖以外，还包括使具有皮肤细胞、皮肤组织的生物体自身生存、饲育和养殖具有皮肤细胞、皮肤组织的生物体等。
[0116] 作为比较对照的皮肤细胞及/或皮肤组织，可为与被测物质接触前的皮肤细胞及/或皮肤组织，也可为除不与被测物质接触以外、进行相同处理的皮肤细胞及/或皮肤组织。
[0117] 分泌蛋白质及/或细胞内蛋白质优选从激肽释放酶7、纤溶酶原激活剂抑制剂-1、尿激酶型纤溶酶原激活物、蛋白裂解酶、葡萄糖调节蛋白94、热休克蛋白70、热休克蛋白90、半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7、胰岛素生长因子结合蛋白-3、烯醇化酶-1、膜连蛋白II、埃兹蛋白、根蛋白、膜突蛋白、凝溶胶蛋白、角蛋白7、角蛋白10、角蛋白13、角蛋白14、角蛋白15、角蛋白16、角蛋白18、角蛋白19、角蛋白20及β2-微球蛋白所组成的组中选择。
[0118] 作为本发明的一例，因伴随表皮角化细胞的老化葡萄糖调节蛋白94、热休克蛋白70、热休克蛋白90、半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7、胰岛素生长因子结合蛋白-3、烯醇化酶-1、膜连蛋白II、埃兹蛋白、根蛋白、膜突蛋白、凝溶胶蛋白、角蛋白
10、角蛋白13、角蛋白14、角蛋白15、角蛋白16、角蛋白18、角蛋白19及角蛋白20的表达量增加，所以当在与被测物质接触过的皮肤细胞及/或皮肤组织中上述蛋白质标记物的表达量与对照相比减少，可评价为被测物质具有使上述蛋白质标记物的表达减少的作用时，该被测物质即可鉴定为是具有防止皮肤老化作用的物质。
10、角蛋白13、角蛋白14、角蛋白15、角蛋白16、角蛋白18、角蛋白19及角蛋白20的表达量增加，所以当在与被测物质接触过的皮肤细胞及/或皮肤组织中上述蛋白质标记物的表达量与对照相比减少，可评价为被测物质具有使上述蛋白质标记物的表达减少的作用时，该被测物质即可鉴定为是具有防止皮肤老化作用的物质。
[0119] 本发明的另外一例，因伴随表皮角化细胞的老化激肽释放酶7(Kallikrein7)、纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)、尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)、蛋白裂解酶(Matriptase)、角蛋白7(Keratin 7)的表达量减少，所以当在与被测物质接触过的皮肤细胞及/或皮肤组织中上述蛋白质标记物的表达量与对照相比增加，可评价为被测物质具有使上述蛋白质标记物的表达增加的作用时，该被测物质即可鉴定为是具有防止皮肤老化作用的物质。
[0120] 此外，本发明的另外一例，因伴随表皮角化细胞的老化β2-微球蛋白(β2-microglobulin)的不切割型对切割型的比率增加，所以当在与被测物质接触过的皮肤细胞及/或皮肤组织中，相对于β2-微球蛋白(β2-microglobulin)的切割型其不切割型的比率与对照相比减少，可评价为被测物质具有使β2-微球蛋白(β2-microglobulin)的不切割型对切割型的比率减少的作用时，该被测物质即可鉴定为是具有防止皮肤老化作用的物质。
[0121] 实施例
[0122] 以下，根据实施例详细说明本发明，但本发明不限于下述实施例。
[0123] 实施例1
[0124] 实验方法
[0125] 1.细胞培养
[0126] 正常表皮角化细胞(NHEK，Cambrex Corporation)使用在无血清基础培养基(KBM，Cambrex Corporation)中添加添加因子(0.1ng/ml表皮生长因子(EGF)、0.03mg/ml牛垂体提取物(bovine pituitary medium)、5μg/ml胰岛素(insulin)、0.5μg/ml氢化可的松(hydrocortisone)、GA-1000)的培养基KGM(+)，在37℃、5％CO2培养箱内培养。用于回收培养液上清液(CM；Conditioned medium)及细胞提取物(CL；Cell lysates)时，将细5
胞以5×10 个/150mm播种于培养皿中，每隔2天更换培养基，培养至饱和。用于继代时，
5
将细胞以1×10 个/60mm播种于培养皿中，每隔2天更换培养基，继代培养至80％饱和阶段。NHEK大约可继代培养至第5代，此次实验中将第5代作为老化细胞使用。
胞以5×10 个/150mm播种于培养皿中，每隔2天更换培养基，培养至饱和。用于继代时，
5
将细胞以1×10 个/60mm播种于培养皿中，每隔2天更换培养基，继代培养至80％饱和阶段。NHEK大约可继代培养至第5代，此次实验中将第5代作为老化细胞使用。
[0127] 2.正常人体表皮角化细胞(NHEK)的各继代数中SA-β-Gal的测定将NHEK的各继代数中的衰老相关之β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)使用衰老细胞染色试剂盒(Senescent Cells Staining Kit(Sigma Corporation))测定。除继代用以外，另外将细5
胞以1×10 个/60mm播种于培养皿中，播种3盘，培养至80％饱和阶段时将细胞在2％甲醛/0.2％戊二醛水溶液中室温固定7分钟。进一步用1×PBS(-)洗涤3次后，加入染色液(StainingSolution)，37℃下、染色过夜(over night)。计算测定各自3盘中每100个细胞的衰老相关之β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色细胞数。
胞以1×10 个/60mm播种于培养皿中，播种3盘，培养至80％饱和阶段时将细胞在2％甲醛/0.2％戊二醛水溶液中室温固定7分钟。进一步用1×PBS(-)洗涤3次后，加入染色液(StainingSolution)，37℃下、染色过夜(over night)。计算测定各自3盘中每100个细胞的衰老相关之β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色细胞数。
[0128] 3.CM及CL的制备
[0129] 3-1.CM的制备
[0130] 将NHEK饱和的培养皿用KBM洗2次，更换为KBM培养1天，完全去除添加因子。进一步交换KBM，2天后回收CM。回收的CM用130×g离心10分钟除去浮游细胞后，用10,000×g离心30分钟，回收其上清液。在此CM中加入硫酸铵(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)直至80％饱和，边搅拌边使其完全溶解，4℃放置一夜。其后，用25,000×g离心30分钟使蛋白质沉淀。将沉淀物用20mM Tris-HCl(pH7.4)溶解，使浓缩至
500倍，浓缩CM。进一步将此浓缩的CM用20mM Tris-HCl(pH7.4)透析。
500倍，浓缩CM。进一步将此浓缩的CM用20mM Tris-HCl(pH7.4)透析。
[0131] 使用DC蛋白浓度测定试剂盒(DC protein assay kit)(Bio-RadLoboratories Inc.)通过Bradford法对蛋白质定量，作为Western印迹法的样品使用。用于二维电泳时，冷冻干燥经调节的CM，将干燥粉末溶解于用于二维电泳的样品制备液{6.5M尿素(urea)(ICN Biomedicals，Inc.)、1.5M硫脲(thiourea)(Sigma Corporation)、0.15％十二烷基硫酸钠(SDS)(WakoPure Chemical Industries，Ltd.)、0.85％曲拉通X-100(Triton X-100)(WakoPure Chemical Industries，Ltd.)、0.4％CHAPS(Dojindo Loboratories)、2.5mM三丁基磷(tributyl phosphine)(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)}中，使其最终浓缩至500倍，通过点印迹法对蛋白质定量。
[0132] 3-2.CL的调制
[0133] 将回收CM后的培养皿用PBS(-)洗涤3次后，在-30℃下冷冻，破坏细胞膜。其后，使用细胞刮(Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.)回收细胞后，超声波处理30秒。加入1％Triton X-100后在4℃下放置30分钟。其后，15，000×g、离心30分钟，去除不溶物，将上清液作为样品。通过点印迹法对蛋白质定量，作为Western印迹法的样品使用。
[0134] 4.蛋白质的二维电泳(2-DE)分析
[0135] 4-1.第一维等电点电泳
[0136] 将60μg的蛋白质混合在凝胶膨胀液{5M尿素(urea)(Wako PureChemical Industries，Ltd.)、2M硫脲(thiourea)(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)、0.5％两性电解质(ampholytes)(pH 3.5～10)(Amersham Biosciences)、0.0025％橙黄G(orange G)(Wako Pure Chemical Industries，Ltd)、2.5mM三丁基磷(tributyl phosphine)(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)、1％曲拉通X-100(Triton X-100)}中，使总量为340μl后，添加于Immobiline干胶条凝胶(Immobiline Dry-Strip gel)(18cm、pH3～10、NL)(AmershamBiosciences)中，20℃膨胀一夜。使用电泳装置(Anatech Corporation)，第一维用20℃、500V-2小时、700V-1小时、1000V-1小时、1500V-1小时、2000V-1小时、3000V-1小时、3500V-10小时的程序进行等电点电泳。电泳后，将凝胶浸入SDS平衡缓冲液{5.8M尿素(urea)、0.06M硫脲(thiourea)、0.5％二硫苏糖醇(dithiothereitol)(DTT，Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)、25％甘油(glycerol)(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)、0.0025％溴酚蓝(BPB)(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)}中，室温下平衡1小时。
[0137] 4-2.第二维SDS-PAGE
[0138] 第二维是使用Tris-Tricine系统的缓冲液{阴极缓冲液：0.05M三羟甲基氨基甲烷(Tris)、0.05M三羟甲基氨基甘氨酸(Tricine)(Bio-Rad LoboratoriesInc.)、0.05％十二烷基硫酸钠(SDS)、阳极缓冲液：1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)(pH8.8)}，通过18cm×18cm 7.5％丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE。
[0139] 4-3.电泳印迹法
[0140] 将结束SDS-PAGE后的凝胶使用半干式转移装置(Nihon Eido Co.，Ltd.)，在20cm×20cm的PVDF膜{ProBlot Membranes(Applied Biosystems)}上用150mA的恒定电流转移2小时。转移缓冲液使用阳极1液：0.3MTris-HCl(pH10.4)、20％甲醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)}，阳极2液：25mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)(pH10.4)、20％甲醇，阴极液：25mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)(pH10.4)、20％甲醇、40mM 6-氨基己酸(6-amino hexanoic acid)(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)。转移后用TTBS缓冲液{20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)(pH7.5)(Bio-Rad Loboratories Inc.)、500mM NaCl氯化钠(Wako PureChemical Industries，Ltd.)、0.3％吐温-20(Tween-20)(Bio-Rad LoboratoriesInc.)20分钟洗涤3次后，用纯水2分钟洗涤3次。然后将PVDF膜用塑料膜封好后浸入50ml的胶体金溶液{Colloidal Gold Total Protein Staine(Bio-Rad Loboratories Inc.)}中，振荡1～2小时后使蛋白质染色。之后，去除胶体金溶液，用纯水1分钟洗涤5次后，使其干燥。
[0141] 5.蛋白质的鉴定
[0142] 5-1.转移到PVDF膜的蛋白质的还原S-烷基化和蛋白酶酶切
[0143] 切取转移到PVDF膜的蛋白质点，放入试管中，加入100～300μl的还原用缓冲液{8M盐酸胍(guanidine-HCl)(pH8.5)(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)、0.5M Trisbase(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)、0.3％乙二胺四乙酸-2钠(EDTA-2Na)(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)、5％乙腈(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)}。加入溶解在还原用缓冲液中的DTT 1mg，氮气置换到试管内，室温静置1小时，还原蛋白质。其后，加入在1M NaCl氯化钠(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)中溶解的碘乙酸(Monoiodoacetic Acid)(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)3mg在遮光状态下持续搅拌15～20分钟，进行S-羧甲基化。取出PVDF膜，用纯水搅拌洗涤5分钟后，在2％乙腈(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)中同样方法搅拌。取出PVDF膜，移至装有Lvs-C酶切缓冲液{70％乙腈/20mMTris-HCl(pH9.0)}的试管内清洗2～3次后，浸入Lys-C酶切缓冲液，进行1小时蛋白酶酶切。
[0144] 5-2.质量分析和肽质量指纹谱
[0145] 将蛋白酶酶切的溶液用蒸馏水稀释7倍使乙腈浓度为10％。作为前处理，为了活化Zip Tipc18移液器吸头(Millipore Corporation)的充填剂部分，反复用50％乙腈/0.1％三氟乙酸(trifluoro-acetic acid)(TFA，Wako PureChemical Industries，Ltd.)多次、用2％乙腈/0.1％TFA多次吸入、排出。然后用经活化的Zip Tipc18移液器吸头将蛋白酶酶切液多次吸入、排出，使片段化后的肽吸附在充填部分上。再将2％乙腈/0.1％TFA多次吸入、排出，去除盐类。吸入在50％乙腈/0.1％TFA中溶解的饱和基质溶液0.5～1.0μl，放置10秒左右后，滴入到质谱仪附属的靶探针中。使样品干固，用质谱仪(MALDI-TOF MS)测定。基于得到的质量值，使用数据库(MS-Fit，MascotSearch)进行蛋白质鉴定。
[0146] 6.Western印迹法
[0147] 使用用于Western印迹法的样品，通过Laemmli的Tris-Glycin系统进行2
SDS-PAGE。进行SDS-PAGE后，将凝胶中的蛋白质用每1cm、0.8mA的恒定电流转移至PVDF膜(Millipore Corporation)，然后浸入5％脱脂奶/PBS(-)中，用4℃封闭过夜(overnight)。
将PVDF膜用0.1％Tween20/PBS(-)洗涤3次后，浸入1次抗体溶液，在室温下振荡1小时。
SDS-PAGE。进行SDS-PAGE后，将凝胶中的蛋白质用每1cm、0.8mA的恒定电流转移至PVDF膜(Millipore Corporation)，然后浸入5％脱脂奶/PBS(-)中，用4℃封闭过夜(overnight)。
将PVDF膜用0.1％Tween20/PBS(-)洗涤3次后，浸入1次抗体溶液，在室温下振荡1小时。
[0148] 使用的1次抗体的种类和稀释率如下所示：兔抗-maspin多克隆抗体(rabbit anti-maspin polyclonal antibody)(Santa Cruz Biotechnology)(稀释1000倍)、小鼠抗-胱抑素A单克隆抗体(mouse anti-cystatin A monoclonalantibody)(Sigma)(稀释1000倍)、兔抗-激肽释放酶7多克隆抗体(rabbit anti-kallikrein 7 polyclonal antibody)(Santa Cruz Biotechnology)(稀释1000倍)、绵羊抗纤溶酶原激活剂抑制剂-1多克隆抗体(sheep anti-PAI-1polyclonal antibody)(Biopool)(稀释1000倍)、小鼠抗-纤溶酶原激活剂抑制剂-2多克隆抗体(mouse anti-PAI-2 monoclonal antibody)(AmericanDiagnostica)(稀释1000倍)、兔抗-尿激酶型纤溶酶原激活物多克隆抗体(rabbit anti-uPA polyclonal antibody)(Santa Cruz Biotechnology)( 稀 释 1000倍)、兔抗-蛋白裂解酶多克隆抗体(rabbit anti-matriptase polyclonalantibody)(Calbiochem)(稀释1000倍)、大鼠抗-葡萄糖调节蛋白94单克隆抗体(rat anti-GRP94 monoclonal antibody)(Stressgeen)(稀释1000倍)、小鼠抗-热休克蛋白70单克隆抗 体 (mouse anti-HSP 70 monoclonalantibody)(Santa Cruz Biotechnology)( 稀释1000倍)、小鼠抗-热休克蛋白90单克隆抗体(mouse anti-HSP 90 monoclonal antibody)(Santa CruzBiotechnology)(稀释1000倍)、兔抗-烯醇化酶-1多克隆抗体(rabbitanti-enolase-1 polyclonal antibody)(Santa Cruz Biotechnology)(稀释1000倍)、兔抗-膜连蛋白II多克隆抗体(rabbit anti-annexin II polyclonalantibody)(Santa Cruz Biotechnology)(稀释1000倍)、兔抗-埃兹蛋白/膜突蛋白/根蛋白多克 隆 抗体 (rabbit anti-ezrin/radixin/moesin polyclonalantibody)(Chemicon)(稀释1000倍)、小鼠抗-凝溶胶蛋白单克隆抗体(mouseanti-gelsolin monoclonal antibody)(Sigma Corporation)(稀释1000倍)、小鼠抗-半乳糖凝集素-1单克隆抗体(mouse anti-galectin-1 monoclonalantibody)(R&D Systems)(稀释1000倍)、小鼠抗-半乳糖凝集素-3单克隆抗体(mouse anti-galectin-3 monoclonal antibody)(Novocastra Laboratories)(稀释1000倍)、小鼠抗-半乳糖凝集素-7单克隆抗体(mouse anti-galectin-7 monoclonal antibody)(R&D Systems)(稀释1000倍)、山羊抗-胰岛素生长因子结合蛋白-3多克隆抗体(goat anti-IGFBP-3 polyclonalantibody)(Santa Cruz Biotechnology)(稀释1000倍)、兔抗-蛋白裂解酶多克隆抗体(rabbit anti-matriptase polyclonal antibody)(Calbiochem)(稀释1000倍)、小鼠抗-β2-微球蛋白单克隆抗体 (mouse anti-β2-microglobulinmonoclonal antibody)(Sigma)( 稀 释 1000 倍 )、小鼠抗-角蛋白3单克隆抗体(mouse anti-keratin3 monoclonal antibody)(Cymbus Biotechnology)(稀释1000倍)、小鼠抗-角蛋白5单克隆抗体(mouse anti-keratin5 monoclonalantibody)(Chemicon International Inc.)(稀释1000倍)、小鼠抗 -角蛋白7单克隆抗体(mouse anti-keratin7 monoclonal antibody)(Chemicon)(稀释1000倍)、小鼠抗-角蛋白8单克隆抗体(mouse anti-keratin8 monoclonalantibody)(Chemicon)(稀释1000倍)、小鼠抗-角蛋白10单克隆抗体(mouseanti-keratin10 monoclonal antibody)(Chemicon)(稀释1000倍)、小鼠抗-角蛋白13单克隆抗体(mouse anti-keratin 13 monoclonal antibody)(CymbusBiotechnology)(稀释500倍)、小鼠抗-角蛋白14单克隆抗体(mouse anti-keratin 14 monoclonal antibody)(Cymbus Biotechnology)(稀释500倍)、小鼠抗-角蛋白15单克隆抗体(mouse anti-keratin 15 monoclonalantibody)(Cymbus Biotechnology)(稀释500倍)、小鼠抗-角蛋白16单克隆抗体(mouse anti-keratin 16 monoclonal antibody)(Cymbus Biotechnology)(稀释
500倍)、小鼠抗-角蛋白17单克隆抗体(mouse anti-keratin 17monoclonal antibody)(Chemicon)(稀释1000倍)、小鼠抗-角蛋白18单克隆抗体(mouse anti-keratin 18 monoclonal antibody)(Chemicon)(稀释1000倍)、小鼠抗-角蛋白19单克隆抗体(mouse anti-keratin 19 monoclonalantibody)(Cymbus Biotechnology公司)(稀释500倍)、小鼠抗-角蛋白20单克隆抗体(mouse anti-keratin 20 monoclonal antibody)(CymbusBiotechnology)(稀释500倍)。
500倍)、小鼠抗-角蛋白17单克隆抗体(mouse anti-keratin 17monoclonal antibody)(Chemicon)(稀释1000倍)、小鼠抗-角蛋白18单克隆抗体(mouse anti-keratin 18 monoclonal antibody)(Chemicon)(稀释1000倍)、小鼠抗-角蛋白19单克隆抗体(mouse anti-keratin 19 monoclonalantibody)(Cymbus Biotechnology公司)(稀释500倍)、小鼠抗-角蛋白20单克隆抗体(mouse anti-keratin 20 monoclonal antibody)(CymbusBiotechnology)(稀释500倍)。
[0149] 1次抗体使用绵羊抗纤溶酶原激活剂抑制剂-1多克隆抗体(sheepanti-PAI-1 polyclonal antibody)、小鼠抗纤溶酶原激活剂抑制剂-2多克隆抗体(mouse anti-PAI-2 monoclonal antibody)、兔抗-尿激酶型纤溶酶原激活物多克隆抗体(rabbit anti-uPA polyclonal antibody)、兔抗-蛋白裂解酶多克隆抗体(rabbit anti-matriptase polyclonal antibody)时，2次抗体使用生物素化抗-山羊IgG(biotinylated anti-goat IgG)(Vector Laboratories)(稀释1000倍)或生物素化抗-绵羊IgG(biotinylated anti-sheep IgG)(VectorLaboratories)(稀释1000倍)。浸入2次抗体溶液后，在室温下振荡1小时。然后，浸入碱性磷酸酶连接的抗生物素蛋白D(alkalinephosphatase-conjugated avidin D)(Vector Laboratories)(稀释1000倍)溶液，在室温下反应1小时。然后，用0.6mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate)(Vector Laboratories)、1.2mg/ml硝基四唑兰(nitrobluetetrazolium)(Vector Laboratories)、0.1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)(pH9.5)、5mM氯化镁(MgCl2)(Wako chemicals，Japan)显色。
[0150] 使用上述以外的1次抗体时，2次抗体使用辣根过氧化物标记的抗-小鼠IgG(Horseradish peroxidase labeled anti-mouse IgG)(AmershamBioscience)(稀释5000倍)、辣根过氧化物标记的抗-兔IgG(Horseradishperoxidase labeled anti-rabbit IgG)(Amersham Bioscience)(稀释5000倍)、辣根过氧化物标记的抗-大鼠 IgG(Horseradish peroxidase labeled anti-ratIgG)(Amersham Bioscience)( 稀释5000倍)或辣根过氧化物标记的抗-山羊IgG(Horseradish peroxidase labeled anti-goat IgG)(Santa Cruz)(稀释5000倍)。然后使用增强化学发光(Enhanced chemiluminescence(ECL))试剂盒(Amersham Bioscience)检测。
[0151] 7.皮肤老化标记物的判定
[0152] 将通过Western印迹法检测的蛋白质表达量通过NIH image数值化，算出第5代蛋白质表达量除以第2代蛋白质表达量的值。算出的值为2.0以上时，则判定为伴随表皮角化细胞的老化，表达量显著增加，不足0.5时，则判定为伴随表皮角化细胞的老化，表达量显著减少。另一方面，算出的值为0.5以上但不足2.0时，则判定为伴随表皮角化细胞的老化，表达无变化。
[0153] 实验结果
[0154] 1.伴随表皮角化细胞老化的形态变化
[0155] 人体正常细胞分裂一定次数后即停止增殖。此现象称为细胞老化，但此分裂次数因细胞种类不同而不同。此次实验中使用的人体表皮角化细胞通过反复继代，大约第5代时停止增殖。图1(a)表示各继代数对应于150mm培养皿达到饱和时的天数的图。培养皿达到饱和的天数，第1代为6天，第5代为28天，第1代～第5代的增殖速度呈指数函数式减慢。且第6代时增殖完全停止。此外，在细胞形态上，与第2代相比，第5代细胞的大小也增大了2倍左右，显示出细胞老化时可观察到的扁平肥大化的形态{图1(b)}。
[0156] 且反复继代后的表皮角化细胞增殖降低的原因，可能是细胞老化或最终分化。因此，为判定实际上表皮角化细胞是否老化，测定了作为表皮角化细胞的老化和皮肤组织的老化标记物而被鉴定的衰老相关之β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)的活性，并已知衰老相关之β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)在最终分化时不表达而只在细胞老化时表达(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，9363-9367，1995)。第2代中未发现表示衰老相关之β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)的被染成蓝色的细胞，但第5代中被染成蓝色的细胞约增加到一半(图2)。
[0157] 由以上结果，将第2代细胞用作年轻细胞、第5代细胞用作老化细胞，进行细胞老化标记物的探索。
[0158] 2.伴随表皮角化细胞老化而变化的分泌蛋白质的二维电泳分析
[0159] 制备第2～5代的CM，通过二维电泳分析表达发生改变的蛋白质(图3)。比较年轻细胞(第2代)和老化细胞(第5代)的细胞培养上清液(CM)的斑点，鉴定出伴随细胞老化其表达减少的蛋白质19个(表1)，伴随细胞老化其表达增加的蛋白质49个(表2)。所鉴定的蛋白质中包含Maspin、胱抑素A(Cystatin A)及热休克蛋白27(HSP 27)等已知的皮肤老化标记物，可认为本试验实施的二维电泳分析是鉴定伴随皮肤老化其发生变化的蛋白质的适宜方法。本试验中因使用可鉴定超微量蛋白质(1 femto-mol以下)的技术，所以，除已知的皮肤老化蛋白质标记物以外，还鉴定出新型皮肤老化蛋白质标记物。作为伴随表皮角化细胞老化其表达减少的主要分泌蛋白质，鉴定出β-2微球蛋白(β-2 microglobulin)、纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)及激肽释放酶7(Kallikrein 7)等。另外，作为伴随表皮角化细胞的老化其表达增加的分泌蛋白质，鉴定出膜突蛋白(Moesin)、角蛋白1(Keratin1)及角蛋白9(Keratin 9)等。
[0160] 通过二维电泳分析，伴随表皮角化细胞的老化其表达减少的蛋白质如表1所示。
[0161] 表1
[0162]
[0163] *；通过本试验新鉴定出的作为表皮角化细胞的老化标记物
[0164] 通过二维电泳分析，伴随表皮角化细胞的老化其表达增加的蛋白质如表2所示。
[0165] 表2
[0166]
[0167]
[0168] *；通过本试验新鉴定出的作为表皮角化细胞的老化标记物
[0169] 3.伴随表皮角化细胞的老化其表达发生改变的分泌蛋白质及细胞内蛋白质的Westem印迹法分析
[0170] 为进一步确认上述蛋白质伴随老化而出现的表达变化，使用各自的抗体进行Westem印迹法。通过二维电泳的分析，汇总蛋白质的量进行比较分析。但是，表皮角化细胞在老化的同时形态也发生变化，出现扁平肥大化，所以即使同样是饱和状态细胞数也不同。实际上计算每个细胞的分泌蛋白质的量，即可知在细胞培养上清液(CM)、细胞裂解液(CL)、细胞外基质(ECM)的任一样品中，伴随表皮角化细胞老化蛋白质的量均增加。
[0171] 因此，对于以细胞数为基准的样品和以蛋白质的量为基准的样品的2组样品，通过Westem印迹法测定各蛋白质表达量的变化。为检验以细胞数为基准的样品和以蛋白质的量为基准的样品中哪一个更适于分析表皮角化细胞的老化，测定了作为伴随皮肤老化损伤积累的皮肤基底膜的主要组成成分、保护基底膜的重要成分的层粘蛋白5(Laminin 5)(层粘蛋白α3(Laminin α3)、层粘蛋白β3(Laminin β3)、层粘蛋白γ2(Laminin γ2)的三聚体){J.Soc.Cosmet.Chem.Jpn.，总说，35(1)，1-7，2001}以及已知伴随皮肤老化表达降低的纤维粘连蛋白(Fibronectin){Ann Pathol.，4(3)，185-94，1984}的表达变化。其结果，CM中Laminin 5的表达在以细胞数为基准的样品中无变化，但在以蛋白质的量为基准的样品中表达量减少(图4)。同样，CM中纤维连接蛋白(Fibronectin)的表达在以细胞数为基准的样品中增加，但在以蛋白质的量为基准的样品中表达量减少。以上结果可表明，用以蛋白质的量为基准的样品分析表达变化的方法更适合。
[0172] 在此，作为使用各种抗体的Western印迹法分析的结果表示了以细胞数为基准的样品、以蛋白质的量为基准的样品，基于上述结果，用以蛋白质的量为基准的样品的结果判断与表皮角化细胞的老化有无相关性。
[0173] 首先，蛋白酶及蛋白酶抑制剂中，丝氨酸蛋白酶抑制剂Maspin、纤溶酶原激活剂抑制剂-2(PAI-2)、胱蛋白酶抑制剂胱抑素A(CystatinA)伴随老化表达量增加{图5(a)(b)}。而丝氨酸蛋白酶激肽释放酶7(Kallikrein7)、尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)、膜结合型丝氨酸蛋白酶蛋白裂解酶(Matriptase)、丝氨酸蛋白酶抑制剂纤溶酶原激活剂抑制物-1(PAI-1)伴随老化表达量减少。此外，已知β2-微球蛋白(β2-microglobulin)被酸性蛋白酶切割，但伴随老化切割型(13kDa)减少，不切割型(14kDa)增加{图5(a)}。
[0174] 作为细胞内蛋白质的热休克蛋白之一的热休克蛋白70(HSP 70)、热休克蛋白90(HSP 90)、葡萄糖调节蛋白94(GRP 94)(只有葡萄糖调节蛋白94具有信号肽)伴随老化向CM的分泌增多，但在CL中的表达量无变化(图6)。
[0175] 细胞内的糖酵解酶烯醇化酶-1(Enolase-1)、与细胞膜的磷脂结合的膜连蛋白II(Annexin II)、细胞骨架蛋白埃兹蛋白(Ezrin)/膜突蛋白(Moesin)/根蛋白(Radixin)伴随老化向CM的分泌量增加(图7)。细胞骨架蛋白凝溶胶蛋白(Gelsolin)向CM的分泌量无变化，但在CL中的表达量增加(图7)。
[0176] 作为凝集素家族中一员的半乳糖凝集素-1(Galectin-1)、半乳糖凝集素-3(Galectin-3)、半乳糖凝集素-7(Galectin-7)及胰岛素生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)伴随表皮角化细胞的老化向细胞外分泌的蛋白质的表达量显著增加(图
8)。另外，在CL中未检测出半乳糖凝集素-1(Galectin-1)、半乳糖凝集素-3(Galectin-3)、半乳糖凝集素-7(Galectin-7)及胰岛素生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)(图8)。
8)。另外，在CL中未检测出半乳糖凝集素-1(Galectin-1)、半乳糖凝集素-3(Galectin-3)、半乳糖凝集素-7(Galectin-7)及胰岛素生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)(图8)。
[0177] 对细胞骨架蛋白角蛋白(Keratin)中的13种(角蛋白3、5、7、8、10、13、14、15、16、17、18、19及20)进行测定。其结果，角蛋白10、13、14、15、16、18、19及20伴随表皮角化细胞老化其在细胞内的表达显著增加(图9)。另外，角蛋白7伴随表皮角化细胞老化其在细胞内的表达显著减少(图9)。角蛋白3、5、8及17的表达无变化。在CM中未检测出Keratin类。
[0178] 将通过一维Western印迹法分析、伴随表皮角化细胞老化其表达发生改变的蛋白质归纳于表3。
[0179] 通过一维Western印迹法分析、伴随表皮角化细胞老化其表达发生改变的蛋白质如表3所示。
[0180] 表3
[0181]
[0182]
[0183] ↑：表达增加↓：表达减少→：表达无变化ND：未检测出
[0184] CM；培养上清液CL；细胞提取液
[0185] [*]相对于切割型不切割型的比例增加
[0186] 实施例2
[0187] 实验方法
[0188] 1.眼角弹性及皱纹体积率的测定
[0189] 以20～69岁的女性59名为对象，测定眼角弹性及皱纹体积率。眼角皮肤弹性是通过Cutometer(Courage+Khazaka electronic GmbH)测定吸引弹性。吸引弹性是以皮肤弹性为指标的测定方法，已证明伴随增龄弹性下降。眼角皱纹体积率是使用二剂混合型复制(replica)剂即skin cast(YamadaCosmetic Laboratories)采集眼角皮肤的复制物(replica)，通过复制物(replica)图像分析计算测定皱纹体积率。复制物(replica)图像分析是使用反射用复制物(replica)分析系统ASA-03RXD进行。使用ASA-03RXD，通过对所采集的复制物(replica)照射30度角度的平行光，用CCD照相机拍摄对应于所得到的皱纹形状的阴影图像，输入电脑进行图像处理来计算测定复制物(replica)表面的皱纹体积率3 2
(μm/mm/100)。表明皱纹体积率伴随增龄而增加。
(μm/mm/100)。表明皱纹体积率伴随增龄而增加。
[0190] 2.从眼角角质层中的蛋白质的提取
[0191] 以20～69岁的女性59名为对象，使用角质层测试仪(checker)(Asahibiomed Co.，Ltd.)从眼角处剥离角质层，使用蛋白质提取溶液从中提取蛋白质。具体地说，在被测者的眼角处粘贴角质层测试仪(checker)，用指尖轻轻摩擦。如此反复3次。其后在粘贴于3枚角质层测试仪(checker)上的角质层中分别加入50μl蛋白质提取溶液{50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)(pH7.5)、120mM氯化钠(NaCl)、0.4％IgepalCA-630(Sigma-Aldrich Co.)}，使用细胞刮使角质层溶入蛋白质提取溶液后，将溶液回收到1.5ml的塑料管(EppendorfAG)中。
[0192] 10,000×g离心15分钟，使不溶物沉淀，将上清液回收到新的1.5ml塑料管中。将回收后样品的蛋白质的量用DC assay kit测定。
[0193] 3.皮肤老化标记物的测定
[0194] 使用从眼角角质层提取的蛋白质10μg，用实施例1中记载的角蛋白7、角蛋白15及激肽释放酶7(Kallikrein 7)的抗体通过Western印迹法检测。将检测出的条带强度通过光密度计(Molecular Dinamics Co.，Ltd.)测定，通过NIH image数值化。
[0195] 实验结果
[0196] 伴随表皮角化细胞的老化其表达发生改变的蛋白质中，测定了角蛋白7、角蛋白10、角蛋白15及激肽释放酶7(Kallikrein 7)是否与人体皮肤老化度具有相关性。
[0197] 在角蛋白中，已知角蛋白10伴随皮肤老化表达降低，由此测定角蛋白10和角蛋白7及角蛋白15中的哪种角蛋白与人体皮肤老化度有相关性。测定角蛋白10、角蛋白15与年龄之间的相关性的结果，发现角蛋白10与年龄无关，角蛋白15与年龄有关，由此表明与已有的皮肤老化标记物相比，角蛋白15是更适合的皮肤老化标记物(图10及图11)。
[0198] 作为人体皮肤老化度的指标，使用与增龄有明确相关性的眼角弹性及皱纹体积率。本试验中测定了皮肤老化度的20～69岁的女性59名中，伴随增龄，其眼角弹性显著减少，皱纹体积率显著增加(图12及13)。
[0199] 角蛋白7的表达量与眼角弹性的相关性如图14所示，角蛋白15的表达量与眼角弹性的相关性如图15所示。角蛋白7的表达量随眼角弹性的降低而显著减少，角蛋白15的表达量随眼角弹性的降低而显著增加。角蛋白7的表达量与皱纹体积率的相关性如图16所示，角蛋白15的表达量与皱纹体积率的相关性如图17所示。角蛋白7的表达量随眼角皱纹体积率的增加而显著减少，角蛋白15的表达量随眼角皱纹体积率的增加而显著增加。
[0200] 另外，测定激肽释放酶7(Kallikrein 7)的皮肤老化度与表达的相关性。激肽释放酶7(Kallikrein(上記と同様)7)的表达量与眼角弹性的相关性如图18所示，激肽释放酶7(Kallikrein(上記と同様)7)的表达量与眼角皱纹体积率的相关性如图19所示。激肽释放酶7(Kallikrein(上記と同様)7)的表达量随眼角弹性的降低而显著减少，随眼角皱纹体积率的增加也显著减少。
[0201] 以上结果表明，以表皮角化细胞的细胞老化为指标而发现的3种标记物(角蛋白7、角蛋白10及激肽释放酶7)与人体的皮肤老化度具有相关性。
[0202] 本发明发现了伴随细胞老化其表达增加或减少的蛋白质以及从切割型向不切割型转化的蛋白质。可期待将这些新发现的蛋白质作为皮肤老化的诊断标记物应用于化妆品的咨询系统等。还可期待以这些蛋白质表达为指标开发出更有效的化妆品、健康食品。