一种茭白总蛋白质的提取纯化方法

摘要

本发明提供了一种茭白与菰黑粉菌互作过程中茭白蛋白质的提取方法，所述方法是模拟茭白植株与菰黑粉菌二者之间的互作，提取到不相互混杂的茭白植物基因组和蛋白。利用本发明方法，制得茭白总蛋白产品不混杂有菰黑粉菌的蛋白质，且蛋白含量高，杂质少，核酸含量低，能满足双向电泳对蛋白质纯度的要求。

权利要求

1.一种茭白总蛋白质的提取纯化方法，所述方法包括：

(1)菰黑粉菌的分离及培养：将菰黑粉菌冬孢子在PSA平板上培养3～5d，挑取特征菌落再次接种到PSA平板上纯化培养15～20d后，用4～5mm打孔器于生长活跃的菌落边缘打孔，将圆形菌块接种到PSA平板上，培养条件为：24～28℃，相对湿度75～85％；

(2)茭白组织培养：以茭白中雄茭茎部的互生侧芽为培养材料，接种在愈伤诱导培养基上，培养室温度控制在25±2℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为15～18h/d；

(3)互作培养：选取步骤(2)得到的生长良好的茭白愈伤组织，转移到中间挖孔的水琼2

脂培养基上；将步骤(1)中分离培养的1～1.5cm 菰黑粉菌菌落接种到覆盖有赛璐玢膜的PSA培养基上培养3～4天后，将赛璐玢膜及菰黑粉菌菌落一起移到培养着茭白愈伤组织的水琼脂培养基上；

(4)取互作培养10～20天的茭白愈伤组织碎片、液氮研磨，得粉末；

(5)取步骤(4)所得粉末，用蛋白提取液1于-20～-10℃悬浮沉淀0.5～2小时，离心，弃上清液，得沉淀1；所述蛋白提取液1为含有10％三氯乙酸和0.07％β-巯基乙醇的丙酮溶液；

(6)取步骤(5)所得沉淀1，用蛋白提取液2于-20～10℃悬浮清洗0.5～2小时，离心，弃去上清液，取沉淀重复上述悬浮清洗和离心步骤1～4次，得沉淀2；所述蛋白提取液

2为含0.07％β-巯基乙醇的丙酮溶液；

(7)将步骤(6)所得沉淀2干燥，用蛋白裂解液室温下裂解0.5～2小时；裂解产物离心，取上清液，即为含有所述茭白总蛋白质的溶液；所述蛋白裂解液组成如下：尿素6.8～

7.2mol/L，硫脲1.9～2.1mol/L，CHAPS 3.5～4.3％，花萼海绵诱癌素4.8～5.2％，DTT0.7～1.2％，PMSF 0.8～1.1mmol/L，溶剂为水。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中研磨步骤为：取剪碎的茭白愈伤组织碎片，加入组织研磨剂PVP-40和石英砂、液氮研磨成粉末。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述PVP-40与茭白愈伤组织碎片质量之比为

1∶8～12。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述蛋白提取液1为终浓度为10％三氯乙酸和终浓度为0.07％β-巯基乙醇的丙酮溶液，加入量为3.0～3.5mL/g茭白愈伤组织碎片。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述蛋白提取液2为终浓度为0.07％β-巯基乙醇的丙酮溶液，加入量为3.0～3.5mL/g茭白愈组织伤碎片。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(7)中蛋白裂解液组成如下：尿素

7mol/L，硫脲2mol/L，CHAPS 4％，花萼海绵诱癌素5％，DTT 1％，PMSF 1mmol/L，溶剂为水；

所述蛋白裂解液加入量为25mL/g沉淀2。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(4)～(7)方法如下：(a)取互作培养10～20天的茭白愈伤组织，清洗、剪碎，加入质量为茭白愈伤组织质量

10％的PVP-40和适量石英砂，液氮研磨成粉末；

(b)取步骤(a)所得粉末，用蛋白提取液1于-20℃悬浮沉淀1小时，4℃、13000rpm离心20～30min，弃上清液，得沉淀1；所述蛋白提取液1为终浓度为10％三氯乙酸和终浓度为0.07％β-巯基乙醇的丙酮溶液；

(c)取步骤(b)所得沉淀1，用蛋白提取液2于-20℃悬浮清洗1小时，4℃、13000rpm离心20～30min，弃去上清液，取沉淀；所述蛋白提取液2为终浓度为0.07％β-巯基乙醇的丙酮溶液；

(d)重复步骤(c)操作3次，得沉淀2；

(e)将步骤(d)所得沉淀2干燥，用蛋白裂解液溶解，室温下放置裂解1小时；裂解产物离心，取上清液，即为含有所述茭白总蛋白质的溶液；所述蛋白裂解液组成如下：尿素

7mol/L，硫脲2mol/L，CHAPS4％，花萼海绵诱癌素5％，DTT 1％，PMSF 1mmol/L，溶剂为水。

说明书

一种茭白总蛋白质的提取纯化方法

(一)技术领域

[0001] 本发明涉及一种模拟茭白与黑粉菌互作培养进行茭白植物总蛋白质提取纯化的方法，尤其是一种不混杂菰黑粉菌蛋白质，能用于固相双向电泳的茭白植物总蛋白质的提取纯化方法。(二)背景技术

[0002] 茭白(zizania latifolia Turcz)又名茭笋，为禾本科菰属，多年生水生宿根性草本植物，无性繁殖，原产中国和东南亚，是我国重要的水生蔬菜。我国茭白的品种资源相当丰富，是仅次于莲藕的第二大水生蔬菜种类，其肉质茎含蛋白质、脂肪、碳水化合物、粗纤维等，茭笋在未老熟前，有机氮以氨基酸状态存在，营养价值较高，深受消费者喜爱。因此进行茭白优良种质资源、茭白肉质茎膨大的分子发育和蛋白质组学研究显得十分重要。 [0003] 茭 白 是 菰 黑 粉 菌 (Ustilago esculenta P.Henn.) 与 茭 白 植 株(Zizanialatifolia(Griseb)Turcz)互作使得肉质茎膨大而形成。茭白植株与菰黑粉菌长期共生与协同进化过程中有可能发生基因渗透或基因平移现象。且目前尚无有效的方法能够分离共生体系中二者的蛋白质、基因组。目前，关于茭白的相关研究均是针对离体培养的黑粉菌或二者混杂状态的实验材料。所以，设计一种良好的模拟体系既能够提取到不相互混杂的茭白植物基因组和蛋白，又能很好地模拟二者之间的互作，对于深入开展茭白的分子生物学研究和蛋白质组研究具有重要的意义。

[0004] 蛋白质组学是当今生命科学领域的研究热点。而双向电泳技术是研究 蛋白质的重要关键技术。但是双向电泳对于蛋白质的制备以及蛋白质的纯度要求均比较严格。因此提取高含量高纯度的蛋白质成为双向电泳技术的前提和保障。

[0005] 植物组织中含有大量的蛋白质，另外还含有多糖、色素、脂肪、核酸等，这些物质的存在影响了双向电泳的正常进行。另外，植物蛋白质提取过程中加入的盐离子也是影响双向电泳正常进行的重要因素，只有将这些离子去除，才能保证电泳过程中的高电压，使双向电泳正常进行。

[0006] 在植物中，目前植物蛋白提取方法有许多种，例如(1)甲醇沉淀法；(2)顺序抽提法；(3)PEG法；(4)Mg/NP-40法，这些方法各有优缺点。不同的植物材料，同一材料的不同组织又有不同的特点，因此需要根据植物不同种类以及同一植物组织的不同进行多次试验，从而找到一种最适宜的方法。

[0007] 目前，已有关于番茄、拟南芥总蛋白质双向电泳的报道，但是水生植物茭白的固相双向电泳的总蛋白的提取纯化方法还未见报道。(三)发明内容

[0008] 本发明目的是提供一种在模拟茭白植物与菰黑粉菌相互作用的前提下，提取纯化不混杂菰黑粉菌蛋白质，可用于固相双向电泳的茭白植物总蛋白的方法。 [0009] 本发明采用的技术方案是：

[0010] 一种茭白植物总蛋白质的提取纯化方法，所述方法包括：

[0011] (1)菰黑粉菌的分离及培养：从灰茭的新鲜切面上挑取少量菰黑粉菌冬孢子，将其均匀铺在PSA平板上(1升PSA包含：马铃薯(去皮)200g，蔗糖20g，琼脂20g，加水至1000mL，pH值， 自然)培养3～5d。挑取特征菌落再次接种到PSA平板上纯化培养15～
20d后用4～5mm打孔器于生长活跃的菌落边缘打孔，将圆形菌块接种到PSA平板(每皿
10ml，培养皿直径为90mm，pH6.0)上。其它培养条件为：25～28℃，相对湿度75-85％。 [0012] (2)茭白组织培养：以茭白茎部的互生侧芽为培养材料，接种在茭白组织培养基上，培养室温度控制在(25±2)℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为15～18h/d。 [0013] (3)互作培养：选取步骤(2)中诱导的生长良好的茭白愈伤组织，转移到中间挖孔
2
的水琼脂培养基(皿直径15cm)上；将步骤(1)中分离培养的1-1.5cm 菰黑粉菌菌落接种到覆盖有CM(cellophane membrane，赛璐玢)膜的PSA培养基上培养3-4天后，将CM膜及菰黑粉菌菌落一起移到培养着茭白愈伤组织的水琼脂培养基上(水琼脂培养基中包含：
3％蔗糖，0.65％琼脂，IAA(吲哚乙酸)1.0mg/L，pH5.8，溶剂为水)。

[0014] (4)取互作培养10-20天的茭白愈伤组织碎片，研磨，得粉末； [0015] (5)取步骤(4)所得粉末，用蛋白提取液1于-20～-10℃悬浮沉淀0.5～2小时，离心，弃上清液，得沉淀1；所述蛋白提取液1为常规用于蛋白质提取的含有10％三氯乙酸和0.07％β-巯基乙醇的丙酮溶液；

[0016] (6)取步骤(5)所得沉淀1，用蛋白提取液2于-20～-10℃悬浮清洗0.5～2小时，离心，弃去上清液，取沉淀重复上述悬浮清洗和离心步骤1～4次，得沉淀2；所述蛋白提取液2为常规用于蛋白质提取的含有0.07％β-巯基乙醇的丙酮溶液； [0017] (7)将步骤(6)所得沉淀2干燥，用蛋白裂解液室温下裂解0.5～2小时；裂解产物离心，取上清液，即为含有所述茭白总蛋白质的溶液；所述蛋白裂解液组成如下：尿素6.8～7.2mol/L，硫脲1.9～2.1mol/L，CHAPS 3.5～4.3％，CA 4.8～5.2％，DTT 0.7～
1.2％，PMSF 0.8～1.1mmol/L，溶剂为水。

[0018] 所述步骤(4)中研磨步骤为：取剪碎的茭白愈伤组织碎片，加入组织研磨剂PVP-40和石英砂，液氮研磨成粉末。所述PVP-40与茭白组织质量之比为1∶8～12。 [0019] 所述蛋白提取液1为终浓度为10％三氯乙酸和终浓度0.07％β-巯基乙醇的丙酮溶液，加入量为3.0～3.5mL/g茭白愈伤组织。

[0020] 所述蛋白提取液2为终浓度为0.07％β-巯基乙醇的丙酮溶液，加入量为3.0～3.5mL/g茭白愈伤组织。

[0021] 步骤(7)中蛋白裂解液组成如下：尿素7mol/L，硫脲2mol/L，CHAPS4％，CA 5％，DTT 1％，PMSF 1mmol/L，溶剂为水；所述蛋白裂解液加入量为25mL/g沉淀2。 [0022] 具体的，所述方法如下：

[0023] (1)取互作培养10～20天的茭白愈伤组织，清洗、剪碎，加入质量为茭白愈伤组织质量10％的PVP-40和适量石英砂，液氮研磨成粉末(灰绿色)；

[0024] (2)取步骤(1)所得粉末，用蛋白提取液1于-20℃悬浮沉淀1小时，4℃、13000rpm离心20～30min，弃上清液，得沉淀1(上清液为墨绿色，沉淀1为浅绿色)；所述蛋白提取液1为终浓度为20％三氯乙酸和0.07％β-巯基乙醇的丙酮溶液；

[0025] (3)取步骤(2)所得沉淀1，用蛋白提取液2于-20℃悬浮清洗1小时， 4℃、13000rpm离心20～30min，弃去上清液，取沉淀(上清液为浅绿色或绿色，沉淀2为白色稍绿)；所述蛋白提取液2为终浓度0.07％β-巯基乙醇的丙酮溶液；

[0026] (4)重复步骤(3)操作3次，得白色沉淀2；

[0027] 将步骤(4)所得沉淀2干燥，用蛋白裂解液溶解，室温下放置裂解1小时(裂解期间不断涡旋，5～6次/h)；裂解产物离心，取上清液，即为含有所述茭白总蛋白质的溶液；所述蛋白裂解液组成如下：尿素7mol/L，硫脲2mol/L，CHAPS(3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)4％，CA(花萼海绵诱癌素)5％，DTT(二硫苏糖醇)1％，PMSF(苯甲基磺酰氟)1mmol/L，溶剂为水。

[0028] 本发明的有益效果主要体现在：利用本发明方法，制得茭白总蛋白产品不混杂有菰黑粉菌的蛋白质，且蛋白含量高，杂质少，核酸含量低，能满足双向电泳对蛋白质纯度的要求。(四)附图说明

[0029] 图1为茭白植物与菰黑粉菌的互作培养示意图；

[0030] 图2为茭白总蛋白双向电泳结果图。(五)具体实施方式

[0031] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

[0032] 实施例1：互作培养

[0033] (1)菰黑粉菌的分离及培养：

[0034] 从灰茭的新鲜切面上挑取少量菰黑粉菌冬孢子，将其均匀铺在PSA平板 (配制：马铃薯(去皮)200g，蔗糖20g，琼脂20g，加水至1000mL，pH值自然)，培养4d。挑取特征菌落再次接种到PSA平板上纯化培养18d后用4-5mm打孔器于生长活跃的菌落边缘打孔，将圆形菌块接种到PSA平板(每皿10ml，皿直径为90mm，pH6.0)上。其它培养条件为：
24-28℃，相对湿度75-85％。

[0035] (2)茭白组织培养：

[0036] 以雄茭茎部的互生侧芽为培养材料，接种在愈伤诱导培养基上(愈伤诱导培养基配制：MS培养基1000mL(青岛高科园海博生物技术有限公司)+IAA 1.0mg)，培养室温度控制在(25±2)℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为15-18h/d左右，在茭白愈伤诱导培养基上进行诱导培养。

[0037] (3)互作培养(见图1)：

[0038] 选取步骤(2)诱导的生长良好的茭白愈伤组织，转移到中间挖孔的水琼脂培养基(皿直径15cm)(水琼脂培养基配制：蔗糖30g，琼脂6.5g，IAA(吲哚-3-乙酸)1.0mg，2
加水至1000mL，pH5.8)上；将步骤(1)中分离培养的1～1.5cm 菰黑粉菌菌落接种到覆盖有CM(cellophanemembrane)膜的PSA培养基上培养3～4天后，将CM膜及菰黑粉菌菌落一起移到培养着茭白愈伤组织的水琼脂培养基上，进行互作培养(培养室温度控制在(25±2)℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为15～18h/d左右)。

[0039] 实施例2：茭白总蛋白质的提取

[0040] (1)称取互作培养12天后的茭白愈伤3g左右，剪碎，加入0.3g组织研磨剂PVP-40(Amresco)及少量石英砂，液氮研磨成粉末状(灰绿 色)。

[0041] (2)将研磨好的茭白样品装入50ml具塞离心管中，加入10ml三氯乙酸浓度10％(w/w)、β-巯基乙醇浓度0.07％(w/w)的丙酮溶液，轻微振荡，置于-20℃沉淀1h。 [0042] (3)具塞离心管置于超速离心机中在4℃，13000rpm条件下，离心20min，(上清液为墨绿色，沉淀为浅绿色)。

[0043] (4)倒掉上清液，加入10ml含有β-巯基乙醇浓度0.07％(w/w)的丙酮溶液，振荡，置于-20℃沉淀1h.(上清液为浅绿色或绿色，沉淀为白色稍绿)。

[0044] (5)将其置于超速离心机中在4℃，13000rpm条件下，离心20min(上清液为浅绿色，沉淀为白色稍绿)。

[0045] (6)倒掉上清液，加入10mlβ-巯基乙醇浓度0.07％(w/w)的丙酮溶液，重复步骤(4)和(5)3次，得到白色沉淀。

[0046] (7)真空抽干45min，所得干粉贮存于-20℃备用。

[0047] (8)用蛋白裂解液8.5ml溶解沉淀，并在室温下放置1h(裂解期间不断涡旋，6次/h)；所述蛋白裂解液组成如下：尿素7mol/L，硫脲2mol/L，CHAPS 4％(w/w)，CA 5％(w/w)，DTT 1％(w/w)，PMSF 1mmol/L，溶剂为水。

[0048] (9)20℃下13000rpm离心25min，取上清液，弃沉淀不溶物，将上清液分装于1.5ml离心管中储存，-80℃备用。

[0049] 实施例3：茭白总蛋白质的提取

[0050] (1)称取互作培养15天的茭白愈伤3g左右，剪碎，加入0.3g组织研磨剂PVP-40及少量石英砂，液氮研磨成粉末状(灰绿色)。

[0051] (2)将研磨好的茭白样品装入50ml具塞离心管中，加入9.6ml三氯乙酸浓度10％、β-巯基乙醇浓度0.07％的丙酮溶液，轻微振荡，置于-20℃沉淀1.5h。 [0052] (3)具塞离心管置于超速离心机中在4℃，13000rpm条件下，离心20min，(上清液为墨绿色，沉淀为浅绿色)。

[0053] (4)倒掉上清液，加入9.8mlβ-巯基乙醇浓度0.07％的丙酮溶液，振荡，置于-20℃沉淀2h(上清液为浅绿色或绿色，沉淀为白色稍绿)。

[0054] (5)将其置于超速离心机中在4℃，13000rpm条件下，离心20min(上清液为浅绿色，沉淀为白色稍绿)。

[0055] (6)倒掉上清液，加入9.8mlβ-巯基乙醇浓度0.07％的丙酮溶液，重复步骤(4)和(5)2次，得到白色沉淀。

[0056] (7)真空抽干60min，所得干粉贮存于-20℃备用。

[0057] (8)用蛋白裂解液8.5ml溶解沉淀，并在室温下放置2h(裂解期间不断涡旋，6次/h)；所述蛋白裂解液组成如下：尿素7mol/L，硫脲2mol/L，CHAPS 4％(w/w)，CA 5％(w/w)，DTT 1％(w/w)，PMSF 1mmol/L，溶剂为水。

[0058] (9)20℃下13000rpm离心25min，取上清液，弃沉淀不溶物，将上清液分装于1.5ml离心管中储存，-80℃备用。

[0059] 实施例3：茭白总蛋白质的提取

[0060] (1)称取互作培养18天的茭白愈伤3g左右，剪碎，加入0.3g组织研磨剂PVP-40及少量石英砂，液氮研磨成粉末状(灰绿色)。

[0061] (2)将研磨好的茭白样品装入50ml具塞离心管中，加入10.2ml三氯乙酸浓度10％、β-巯基乙醇浓度0.07％的丙酮溶液，轻微振荡，置于 -20℃沉淀1h。 [0062] (3)具塞离心管置于超速离心机中在4℃，13000rpm条件下，离心20min，(上清液为墨绿色，沉淀为浅绿色)。

[0063] (4)倒掉上清液，加入10.5mlβ-巯基乙醇浓度0.07％的丙酮溶液，振荡，置于-20℃沉淀1h.(上清液为浅绿色或绿色，沉淀为白色稍绿)。

[0064] (5)将其置于超速离心机中在4℃，13000rpm条件下，离心20min(上清液为浅绿色，沉淀为白色稍绿)。

[0065] (6)倒掉上清液，加入10.5mlβ-巯基乙醇浓度0.07％的丙酮溶液，重复步骤(4)和(5)4次，得到白色沉淀。

[0066] (7)真空抽干50min，所得干粉贮存于-20℃备用。

[0067] (8)用蛋白裂解液9.0ml溶解沉淀，并在室温下放置1h(裂解期间不断涡旋，6次/h)；所述蛋白裂解液组成如下：尿素7mol/L，硫脲2mol/L，CHAPS 4％(w/w)，CA 5％(w/w)，DTT 1％(w/w)，PMSF 1mmol/L，溶剂为水。

[0068] (9)20℃下13000rpm离心25min，取上清液，弃沉淀不溶物，将上清液分装于1.5ml离心管中储存，-80℃备用。

[0069] 实施例4：蛋白质及核酸含量的测定

[0070] 对上述实施例1～3提取的茭白总蛋白的溶液1ul加10ml蒸馏水稀释后，在可见紫外分光光度计上测定核酸含量，同时用考马斯亮蓝法测定其蛋白质含量，由表1可见，利用本发明方法提取得到的茭白总蛋白，蛋白含量高，杂质少，核酸含量低，能满足双向电泳对蛋白质纯度的要求。

[0071] 表1：茭白总蛋白的蛋白质及核酸含量的测定

[0072]实施例 OD260/OD280 OD595nm 蛋白质ug/ml 核酸ug/ml
1 0.65 0.89 4588 15.88
2 0.59 0.92 4655 19.87
3 0.68 0.62 4108 7.58

[0073] 实施例5：双向电泳

[0074] 对上述实施例2提取的茭白愈伤蛋白质进行双向电泳，按照等电聚焦系统操作指南进行，具体操作步骤为：

[0075] (一)第一向等电聚焦

[0076] 1.从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液(8M尿素，2％(w/w)CHAPS，50mM DTT，0.2％(w/v)Bio-Lyte 3/10两性电解质(厦门世德行实业有限公司)，0.001％(w/w)溴酚蓝(南京凯基生物科技发展有限公司)，溶剂为MilliQ水(碧云天生物技术研究所))置室温溶解。

[0077] 2.从小管中取出400ml水化上样缓冲液，加入100ml样品(按实施例2方法制得的稀释液)，充分混匀。

[0078] 3.从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条(17cm pH 4～7)(众磊(北京)生物科技发展有限公司)，室温中放置10分钟。

[0079] 4.沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。

[0080] 5.当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。

[0081] 6.分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极。

[0082] 7.在每根胶条上覆盖2～3ml矿物油(sigama公司)，防止胶条水化过程中液体的蒸发。

[0083] 8.对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。

[0084] 9.聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳。

[0085] (二)第二向SDS-PAGE电泳

[0086] 所用试剂(Amersham公司)：

[0087] 1.胶条平衡缓冲液母液：尿素36g，SDS 2g，pH8.8Tris-HCl 25ml，甘油20ml，MilliQ水定容至100ml，分装成10管，每管10ml，-20℃冰箱保存。

[0088] 2.胶条平衡缓冲液I：胶条平衡缓冲液母液10ml，DTT 0.2g，充分混匀，用时现配。 [0089] 3.胶条平衡缓冲液II：胶条平衡缓冲液母液10ml，碘乙酰胺0.25g，充分混匀，用时现配。

[0090] 4.低熔点琼脂糖封胶液：低熔点琼脂糖(北京毕博生物技术有限公司)0.5g，Tris 0.303g，甘氨酸1.44g，10％(w/w)SDS 1ml，1％(w/w)溴酚蓝100μl，MilliQ水定容至100ml，加热溶解至澄清，室温保存。

[0091] 研究步骤：

[0092] 1.配制10％的丙烯酰胺凝胶，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留1cm的空间，用水、封面，保持胶面平整。聚合30分钟。

[0093] 2.待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。

[0094] 3.从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其溶解。 [0095] 4.配制胶条平衡缓冲液I。

[0096] 5.聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。 [0097] 6.将胶条转移至溶涨盘中，在槽中加入5ml胶条平衡缓冲液I，在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

[0098] 7.第一次平衡结束后，彻底吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。再加入胶条平衡缓冲液II，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

[0099] 8.第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。并用滤纸吸取多余的平衡液。

[0100] 9.将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸没在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。

[0101] 10.将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液封胶。

[0102] 11.用镊子轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。 [0103] 12.在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后，将凝胶转移至电泳槽中。 [0104] 13.加入电泳缓冲液(25mM Tris，192mM甘氨酸，0.1％(w/w)SDS，溶剂为MilliQ水，pH8.3)，接通电源，起始时用低电流(5mA/gel/17cm)或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流(或电压)(20～30mA/gel/17cm)，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

[0105] 14.电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号。 [0106] 15.进行染色，结果见图2。结论：采用本方法制备的茭白植物总蛋白浓度高，能满足双向电泳的要求。