一种成人远端肺动脉平滑肌细胞的培养方法转让专利
申请号 : CN200710033016.2
文献号 : CN101250500B
文献日 : 2010-10-06
发明人 : 王健 , 洪城 , 冉丕鑫 , 李冰 , 卢文菊 , 彭公永 , 胡锦兴 , 李晓岩
申请人 : 广州医学院
摘要 :
本发明公开了一种成人远端肺动脉平滑肌细胞的培养方法，包括以下步骤：(1)从获取的成人远端肺动脉平滑肌层中分离肺动脉平滑肌细胞，并进行原代细胞培养；(2)获取传代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞：当步骤(1)中的原代细胞长至对数生长期后，取出原代细胞用PBS溶液清洗后，加入0.3～0.5ml 0.1％～0.2％胰蛋白酶溶液35～37℃消化2～3分钟，当细胞出现回缩、细胞间隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液，加入3～5ml完全培养液，使之形成细胞悬液，接种于新的培养瓶中，每3天换液一次，即完成传代细胞培养，获得传代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞。该培养方法技术稳定，重复性好，培养的细胞形态均一，生长良好，且具有典型的平滑肌细胞的形态及特点。
权利要求 :
1.一种成人远端肺动脉平滑肌细胞的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)获取原代培养的成人肺动脉平滑肌细胞：从获取的成人远端肺动脉平滑肌层中分离肺动脉平滑肌细胞，并进行原代细胞培养，获得原代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞：
1>采用分次酶消化法，将分离并剥离了内外膜的血管中膜组织剪成小块，放入HBSS中4℃静置20～30min，然后放入无含钙的HBSS中室温静置10～20min；再将组织块放入离心管中加入消化液35～37℃消化35～45min；
2>吸出消化液，向离心管中加入完全培养基2～3ml，室温放置3～5min；广口巴氏吸管吹打10～15次，静置片刻使组织块沉淀，吸出细胞悬浮液收集于另一离心管中，再将原消化液加入原离心管中进行再次消化并按以上步骤收集细胞；将收集的细胞悬浮液离心，弃上清液，加入完全培养基调整细胞密度并以该密度种植于培养板中，置37℃、5％CO2培养箱内静置培养，3d后半量更换培养基；当细胞生长至对数生长期，便获得了原代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞；
所述的消化液：含125～135mol/L氯化钠、3～6mol/L氯化钾、1～1.5mol/L氯化镁、5～15mol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸、5～15mol/L无水葡萄糖、2.0～3.0mg/mlI型胶原酶、9～10U/ml木瓜蛋白酶、1～3mg/ml牛血清白蛋白、0.5～1.51mmol/L1，4-二硫代苏糖醇、90～105U/ml青霉素和90～105mg/ml链霉素的水溶液，该溶液的PH值为7～7.5；
(2)获取传代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞：当步骤(1)中的原代细胞长至对数生长期后，取出原代细胞用PBS溶液清洗后，加入0.3～0.5ml 0.1％～0.2％胰蛋白酶溶液35～37℃消化2～3分钟，当细胞出现回缩、细胞间隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液，加入3～5ml完全培养液，使之形成细胞悬液，接种于新的培养瓶中，每3天换液一次，即完成传代细胞培养，获得传代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述的步骤(2)中的胰蛋白酶溶液中含有0.1％乙二胺四乙酸，所述的细胞接种密度为2～3×105个/ml。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤2>中的细胞密度是2～3×105个/ml。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤1>的HBSS溶液：含125～135mol/L氯化钠、3～6mol/L氯化钾、1～1.5mol/L氯化镁、5～15mol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸、15～25μmol/L氯化钙、5～15mol/L无水葡萄糖、90～105U/ml青霉素和90～105mg/ml链霉素的水溶液，该溶液的PH值为7～7.5。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤1>的无钙的HBSS溶液是：含125～135mol/L氯化钠、3～6mol/L氯化钾、1～1.5mol/L氯化镁、5～15mol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸、5～15mol/L无水葡萄糖、90～105U/ml青霉素和90～105mg/ml链霉素的水溶液，该溶液的PH值为7～7.5。
6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤2>中依据组织消化的情况，重复收集细胞操作2～4次。
说明书 :
技术领域
本发明涉及一种细胞培养方法，尤其是一种成人远端肺动脉平滑肌细胞的培养方法，属生物技术领域。
背景技术
成人远端肺动脉平滑肌细胞，是研究肺循环相关疾病、尤其是肺动脉高压等疾病发病机制的重要细胞材料。目前培养肺动脉平滑肌细胞的方法包括酶消化法和组织块贴片法。动物来源多为大鼠，大鼠与人的种属不同细胞间差异较大，所以用成人的肺动脉平滑肌细胞进行肺动脉高压发病机制及相关研究的意义明显大于用动物的细胞。但由于取材困难，并且人类是高等进化的生物体其细胞在体外成功培养远远难于低等生物，同时因为成人细胞体外生长的潜伏期明显长于大鼠等动物所以体外成功培养更加困难。鉴于以上原因，目前国内用于实验研究培养的肺动脉平滑肌细胞多采用大鼠为材料；部分学者采用引产胎儿(18周内)的肺动脉主干进行实验。因为胎儿细胞增殖能力强易于培养，并且肺动脉主干平滑肌层厚细胞易于分离，但胎儿尚未发育成熟其细胞与成人细胞有所差异，而且肺动脉高压的主要病理改变部位位于肺远端动脉。所以采用胎儿肺动脉主干进行肺动脉高压机制研究的实验并不理想。而国外学者除采用动物为材料(大部分为大鼠)外；部分学者也购买成人的肺动脉平滑肌细胞株进行实验但细胞株价格昂贵并且非原代培养的细胞，细胞生物学特征有所改变影响实验结果；而少部分学者也培养成人远端肺动脉平滑肌细胞，但其采用的培养基为平滑肌细胞基础培养基(SMBM)这种培养基价格昂贵，国内一般的实验室难以接受。综上所述，寻找一种高效、简便、成本低的成人远端肺动脉平滑肌细胞原代培养的方法成为了实验成功的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种成人远端肺动脉平滑肌细胞的培养方法。该培养方法技术稳定，重复性好，培养的细胞形态均一，生长良好，且具有典型的平滑肌细胞的形态及特点。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种成人远端肺动脉平滑肌细胞的培养方法，它包括以下步骤组成：
(1)获取原代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞：从取得的成人远端肺动脉平滑肌层中分离远端肺动脉平滑肌细胞，并进行原代细胞培养。以获得原代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞；
(2)获取传代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞：当步骤(1)中的原代细胞长至对数生长期后，取出原代细胞用PBS(磷酸盐缓冲液)溶液清洗后，加入0.3～0.5ml 0.1％～0.2％胰蛋白酶溶液35～37℃消化2～3分钟，当细胞出现回缩、细胞间隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液，加入3～5ml完全培养液，使之形成细胞悬浮液，接种于新的培养瓶中，每3天换液一次，即完成传代细胞培养，获得传代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞。
所述的步骤(2)中的完全培养液为；胰蛋白酶溶液中含有0.1％EDTA(乙二胺四乙酸)，所述的细胞接种密度为2～3×105个/ml，以保持细胞生长有足够的空间、营养。
步骤(2)中所述的完全培养基是：含90～105U/ml青霉素、90～105mg/ml链霉素的低糖DMEM(Dulbcco′s Modifed Eagle Medium)和胎牛血清的混合溶液，所述的胎牛血清占培养基总体积的10～20％。
所述的HBSS(Hank’s平衡盐溶液)：含125～135mol/L氯化钠、3～6mol/L氯化钾、1～1.5mol/L氯化镁、5～15mol/LHEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)、15～25μmol/L氯化钙、5～15mol/L无水葡萄糖、90～105U/ml青霉素和90～105mg/ml链霉素的水溶液，该溶液的PH值为7～7.5。
所述的步骤(1)获取原代培养的成人肺动脉平滑肌细胞的具体步骤为：
1>采用分次酶消化法，将分离并剥离了内外膜的血管中膜组织剪成小块，放入HBSS中4℃静置20～30min，然后放入无含钙的HBSS中室温静置10～20min；再将组织块放入离心管中加入消化液35～37℃消化35～45min，可见组织块松软、边缘发毛。
2>吸出消化液，向离心管中加入完全培养基2～3ml，室温放置3～5min；广口巴氏吸管吹打10～15次，静置片刻使组织块沉淀，吸出细胞悬浮液收集于另一离心管中，再将原消化液加入原离心管中进行再次消化并按以上步骤收集细胞；将收集的细胞悬浮液离心，弃上清液，加入完全培养基调整细胞密度并以该密度种植于培养板中，置37℃、5％CO2培养箱内静置培养，3d后半量更换培养基；当细胞生长至对数生长期，便获得了原代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞。
所述步骤2>中依据组织消化的情况，重复收集细胞操作2～4次。
所述步骤2>中的细胞密度是2～3×105细胞/ml。
所述的无钙的HBSS溶液是：含125～135mol/L氯化钠、3～6mol/L氯化钾、1～1.5mol/L氯化镁、5～15mol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、5～15mol/L无水葡萄糖、90～105U/ml青霉素和90～105mg/ml链霉素的水溶液，该溶液的PH值为7～7.5。
所述的消化液：含125～135mol/L氯化钠、3～6mol/L氯化钾、1～1.5mol/L氯化镁、5～15mol/LHEPES、5～15mol/L无水葡萄糖、2.0～3.0mg/mlI型胶原酶、9～10U/ml木瓜蛋白酶、1～3mg/ml牛血清白蛋白、0.5～1.51mmol/L DTT(1，4-二硫代苏糖醇)、90～105U/ml青霉素和90～105mg/ml链霉素的水溶液，该溶液的PH值为7～7.5。
步骤2>中所述的完全培养基是：含90～105U/ml青霉素、90～105mg/ml链霉素的低糖DMEM(Dulbcco′s Modifed Eagle Medium)和胎牛血清的混合溶液，所述的胎牛血清占培养基总体积的10～20％。
本发明所使用的试剂均用0.2～0.22μm滤膜过滤除菌。
本发明方法与现有技术相比具有以下有益效果：
1、借助显微镜、显微镊、显微剪等精细工具突破了运用酶消化法培养出高纯度的成人远端肺动脉平滑肌细胞的技术难关，填补了该领域空白。
2、培养方法技术稳定，重复性好，培养的细胞形态均一，生长良好。
3、获得的细胞经过显微镜观察及细胞免疫化学鉴定具有典型的远端肺动脉平滑肌细胞形态及特点，而且肺动脉平滑肌细胞的取材部位位于远端肺动脉，该部分细胞对研究肺动脉高压发病机制更有意义。为进一步深入研究肺循环相关疾病、小血管相关疾病，尤其是肺动脉高压等疾病的发病机制奠定了条件，提供了丰富的材料来源。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种成人远端肺动脉平滑肌细胞的培养方法，它包括以下步骤组成：
(1)获取原代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞：从取得的成人远端肺动脉平滑肌层中分离远端肺动脉平滑肌细胞，并进行原代细胞培养。以获得原代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞；
(2)获取传代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞：当步骤(1)中的原代细胞长至对数生长期后，取出原代细胞用PBS(磷酸盐缓冲液)溶液清洗后，加入0.3～0.5ml 0.1％～0.2％胰蛋白酶溶液35～37℃消化2～3分钟，当细胞出现回缩、细胞间隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液，加入3～5ml完全培养液，使之形成细胞悬浮液，接种于新的培养瓶中，每3天换液一次，即完成传代细胞培养，获得传代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞。
所述的步骤(2)中的完全培养液为；胰蛋白酶溶液中含有0.1％EDTA(乙二胺四乙酸)，所述的细胞接种密度为2～3×105个/ml，以保持细胞生长有足够的空间、营养。
步骤(2)中所述的完全培养基是：含90～105U/ml青霉素、90～105mg/ml链霉素的低糖DMEM(Dulbcco′s Modifed Eagle Medium)和胎牛血清的混合溶液，所述的胎牛血清占培养基总体积的10～20％。
所述的HBSS(Hank’s平衡盐溶液)：含125～135mol/L氯化钠、3～6mol/L氯化钾、1～1.5mol/L氯化镁、5～15mol/LHEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)、15～25μmol/L氯化钙、5～15mol/L无水葡萄糖、90～105U/ml青霉素和90～105mg/ml链霉素的水溶液，该溶液的PH值为7～7.5。
所述的步骤(1)获取原代培养的成人肺动脉平滑肌细胞的具体步骤为：
1>采用分次酶消化法，将分离并剥离了内外膜的血管中膜组织剪成小块，放入HBSS中4℃静置20～30min，然后放入无含钙的HBSS中室温静置10～20min；再将组织块放入离心管中加入消化液35～37℃消化35～45min，可见组织块松软、边缘发毛。
2>吸出消化液，向离心管中加入完全培养基2～3ml，室温放置3～5min；广口巴氏吸管吹打10～15次，静置片刻使组织块沉淀，吸出细胞悬浮液收集于另一离心管中，再将原消化液加入原离心管中进行再次消化并按以上步骤收集细胞；将收集的细胞悬浮液离心，弃上清液，加入完全培养基调整细胞密度并以该密度种植于培养板中，置37℃、5％CO2培养箱内静置培养，3d后半量更换培养基；当细胞生长至对数生长期，便获得了原代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞。
所述步骤2>中依据组织消化的情况，重复收集细胞操作2～4次。
所述步骤2>中的细胞密度是2～3×105细胞/ml。
所述的无钙的HBSS溶液是：含125～135mol/L氯化钠、3～6mol/L氯化钾、1～1.5mol/L氯化镁、5～15mol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、5～15mol/L无水葡萄糖、90～105U/ml青霉素和90～105mg/ml链霉素的水溶液，该溶液的PH值为7～7.5。
所述的消化液：含125～135mol/L氯化钠、3～6mol/L氯化钾、1～1.5mol/L氯化镁、5～15mol/LHEPES、5～15mol/L无水葡萄糖、2.0～3.0mg/mlI型胶原酶、9～10U/ml木瓜蛋白酶、1～3mg/ml牛血清白蛋白、0.5～1.51mmol/L DTT(1，4-二硫代苏糖醇)、90～105U/ml青霉素和90～105mg/ml链霉素的水溶液，该溶液的PH值为7～7.5。
步骤2>中所述的完全培养基是：含90～105U/ml青霉素、90～105mg/ml链霉素的低糖DMEM(Dulbcco′s Modifed Eagle Medium)和胎牛血清的混合溶液，所述的胎牛血清占培养基总体积的10～20％。
本发明所使用的试剂均用0.2～0.22μm滤膜过滤除菌。
本发明方法与现有技术相比具有以下有益效果：
1、借助显微镜、显微镊、显微剪等精细工具突破了运用酶消化法培养出高纯度的成人远端肺动脉平滑肌细胞的技术难关，填补了该领域空白。
2、培养方法技术稳定，重复性好，培养的细胞形态均一，生长良好。
3、获得的细胞经过显微镜观察及细胞免疫化学鉴定具有典型的远端肺动脉平滑肌细胞形态及特点，而且肺动脉平滑肌细胞的取材部位位于远端肺动脉，该部分细胞对研究肺动脉高压发病机制更有意义。为进一步深入研究肺循环相关疾病、小血管相关疾病，尤其是肺动脉高压等疾病的发病机制奠定了条件，提供了丰富的材料来源。
附图说明
图1是倒置相差显微镜(100×)下原代培养20天成人远端肺动脉平滑肌细胞照片；
图2是倒置相差显微镜(100×)下原代培养35天成人远端肺动脉平滑肌细胞照片；
图3是倒置相差显微镜(100×)下传代培养3天成人远端肺动脉平滑肌细胞照片；
图4是倒置相差显微镜(100×)下传代培养7天成人远端肺动脉平滑肌细胞照片；
图5是激光扫描共聚焦显微镜(200×)下原代培养成人远端肺动脉平滑肌细胞经细胞免疫荧光染色照片；
FITC标记的细胞浆α-Actin抗原发绿色荧光、DAPI标记的细胞核发红色荧光；
图6是激光扫描共聚焦显微镜(600×)下原代培养成人远端肺动脉平滑肌细胞经细胞免疫荧光染色照片；
图7是激光扫描共聚焦显微镜(200×)下原代培养成人远端肺动脉平滑肌细胞经细胞免疫荧光染色照片；
阴性对照无加α-Actin单克隆抗体，仅用DAPI标记细胞核，可见细胞核发红色荧光；
图8是激光扫描共聚焦显微镜(100×)下原代培养成人远端肺动脉平滑肌细胞经细胞免疫荧光染色照片；
图9是透射电镜(28000×)下原代培养成人远端肺动脉平滑肌细胞，可见胞浆中肌丝(↑)、密体(△)、密斑()。
图2是倒置相差显微镜(100×)下原代培养35天成人远端肺动脉平滑肌细胞照片；
图3是倒置相差显微镜(100×)下传代培养3天成人远端肺动脉平滑肌细胞照片；
图4是倒置相差显微镜(100×)下传代培养7天成人远端肺动脉平滑肌细胞照片；
图5是激光扫描共聚焦显微镜(200×)下原代培养成人远端肺动脉平滑肌细胞经细胞免疫荧光染色照片；
FITC标记的细胞浆α-Actin抗原发绿色荧光、DAPI标记的细胞核发红色荧光；
图6是激光扫描共聚焦显微镜(600×)下原代培养成人远端肺动脉平滑肌细胞经细胞免疫荧光染色照片；
图7是激光扫描共聚焦显微镜(200×)下原代培养成人远端肺动脉平滑肌细胞经细胞免疫荧光染色照片；
阴性对照无加α-Actin单克隆抗体，仅用DAPI标记细胞核，可见细胞核发红色荧光；
图8是激光扫描共聚焦显微镜(100×)下原代培养成人远端肺动脉平滑肌细胞经细胞免疫荧光染色照片；
图9是透射电镜(28000×)下原代培养成人远端肺动脉平滑肌细胞，可见胞浆中肌丝(↑)、密体(△)、密斑()。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
实施例一：
具体步骤：
1、主要实验材料
(1)试剂配制：
1、HBSS：含130mol/L氯化钠、5mol/L氯化钾、1.2mol/L氯化镁、10mol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、20μmol/L氯化钙、10mol/L无水葡萄糖、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素水溶液，该溶液的PH值为7.4。
2、无钙的HBSS：含130mol/L氯化钠、5mol/L氯化钾、1.2mol/L氯化镁、10mol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、10mol/L无水葡萄糖、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素水溶液，该溶液的PH值为7.4。
3、预消化液：含130mol/L氯化钠、5mol/L氯化钾、1.2mol/L氯化镁、10mol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、10mol/L无水葡萄糖、1.5mg/mlI型胶原酶、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素水溶液，该溶液的PH值为7.4。
4、消化液：含130mol/L氯化钠、5mol/L氯化钾、1.2mol/L氯化镁、10mol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、10mol/L无水葡萄糖、2.5mg/mlI型胶原酶、9.5U/ml木瓜蛋白酶、2mg/ml牛血清白蛋白、1mmol/L DTT、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素水溶液，该溶液的PH值为7.4。
5、胰蛋白酶溶液：含0.2％(m/v)胰蛋白酶和0.1％(m/v)的EDTA。
6、完全培养基是：含100/ml青霉素、100mg/ml链霉素的低糖DMEM和胎牛血清的混合溶液，所述的胎牛血清占培养基总体积的10％
以上试剂经0.22μm滤膜过滤除菌。
(2)组织来源：无肺动脉高压的病人因肺癌等疾病行肺叶切除术，取切除肺叶的远端肺组织。
2、操作步骤
(1)获取成人肺动脉平滑肌：
1)在无菌条件下，用剪刀、镊子切取肺叶外周组织，放入冷的HBSS中，置入冰盒中低温保存并尽快于4小时内送入实验室超净台进行实验。
2)将肺组织送入超净台内操作，用冷HBSS清洗去除血污；置于体式显微镜下，用显微镊和显微剪刀于显微镜观察下小心分离远端肺动脉；在分离过程中需要不断更换冷HBSS；分离得到的肺动脉组织置于冷HBSS中清洗去除血液。
3)将肺动脉组织放入预消化液中25℃温度下进行预消化10min，将血管放入冷HBSS中以洗去预消化液，于显微镜观察下用显微镊和显微剪刀小心剥离血管外膜；将剥离外膜的血管条纵向剪开，内面朝上用弯头小镊子自上而下刮除内膜，留中膜平滑肌层；
(2)获取原代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞：
1)将中膜组织剪成小块约2×3mm，放入HBSS中4℃静置30min，然后放入无含钙的HBSS中室温静置20min；
2)再将组织块放入离心管中加入消化液37℃消化45min，可见组织块松软、边缘发毛；
3)轻轻吸出消化液，加入完全培养基3ml，室温放置3min。广口巴氏吸管吹打10次，可见液体中有絮状物；
4)静置片刻使组织块沉淀于离心管底部，吸出细胞悬浮液收集于另一离心管中。原消化液加回组织块中继续消化5min，按上述步骤收集细胞。再重复5min消化操作2次；
5)将收集的细胞悬浮液离心(800rpm，5min)，弃上清液，加入培养基调整细胞密度以3×105个/ml的密度种植于6孔培养板中(其中2孔放入盖玻片，鉴定时用)。置37℃、5％CO2培养箱内静置培养，10～14天后换培养基。当细胞生长至对数生长期，即完成原代细胞培养，获得原代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞。
(3)获取传代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞：
当原代细胞长满瓶壁后，即可传代。届时，用2mlPBS溶液清洗细胞2次，加入0.5ml0.2％(m/v)胰蛋白酶溶液(含0.1％EDTA)37℃消化3分钟，当细胞出现回缩、细胞间隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液，加入5ml培养液，轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之形成细胞悬浮液，以2×105个/ml的细胞密度接种于新的培养瓶中，置于37℃、5％二氧化碳孵箱中培养，每2天换液一次，至细胞生长至对数生长期，获得传代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞。
3、培养结果
(1)、倒置相差显微镜下观察，刚种植的细胞呈圆形、透亮、单个均匀分布。原代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞潜伏期长、生长缓慢14天左右可见部分细胞贴壁、展开细胞形态多样，呈棱形、多角形、星形或不规则形，大小略有差异；胞浆丰富；胞核多为卵圆形多数细胞为单核，少数细胞有双核或三核，有一个或多个核仁。20～25天后细胞数量明显增多呈积聚性生长(图1)，细胞间常有突起相连。30～35天细胞生长达到对数期生长，部分区域细胞重叠堆积生长形成“峰”，“峰”与“峰”之间细胞层数渐少，形成“谷”。当细胞生长至融合后，细胞间相互平行排列成束，高低起伏，形成典型的平滑肌细胞生长特征“峰”“谷”状生长(图2)。
(2)倒置相差显微镜下观察，传代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞。细胞生长速度较原代培养细胞明显加快。传代后1天细胞贴壁、展开可见细胞呈棱形、多角形、星形或不规则形，3天后细胞数量明显增多呈积聚性生长，细胞间常有突起相连(图3)。7天后细胞生长至融合，形成典型的平滑肌细胞生长特征“峰”“谷”状生长(图4)。原代培养的细胞与传代细胞形态一致。
(3)平滑肌α-Actin抗原的免疫荧光检测：采用平滑肌α-Actin单克隆抗体对培养的细胞进行鉴定，并采用国际常用的复染法进行染色，用DAPI对所有细胞核进行染色，保证细胞纯度计算的可靠性。在激光扫描共聚焦显微镜下观察，可见FITC标记的细胞浆平滑肌α-Actin抗原发绿色荧光，DAPI标记的细胞核发红色荧光(图5)。高倍镜下观察，平滑肌细胞胞浆中的肌丝平行于细胞长轴呈细丝状表达(图6)。阴性对照无加一抗，仅检测到DAPI标记的细胞核没有检测FITC标记的平滑肌α-Actin，所以仅见发红色荧光(图7)。低倍镜计算细胞纯度，每张片随机取5个视野，每个视野至少检测200个细胞。计算每个视野中α-Actin表达阳性细胞占该视野总细胞数的比例，为平滑肌细胞纯度。平均达98％以上(图8)。
(4)透射电镜检测：透射电镜下观察到远端肺动脉平滑肌胞浆中有与细胞长轴平行的肌丝及与其相连的有密体、密斑(图9)，显典型的收缩表形结构特征。
实施例二：
具体步骤：
1、主要实验材料
(1)试剂配制：
1、HBSS：含125mol/L氯化钠、6mol/L氯化钾、1mol/L氯化镁、5mol/LHEPES、15μmol/L氯化钙、15mol/L无水葡萄糖、105U/ml青霉素和105mg/ml链霉素水溶液，该溶液的PH值为7.4。
2、无钙的HBSS：含125mol/L氯化钠、6mol/L氯化钾、1mol/L氯化镁、5mol/LHEPES、15mol/L无水葡萄糖、105U/ml青霉素和105mg/ml链霉素水溶液，该溶液的PH值为7.4。
3、预消化液：含125mol/L氯化钠、6mol/L氯化钾、1mol/L氯化镁、5mol/LHEPES、15mol/L无水葡萄糖、1.3mg/mlI型胶原酶、105U/ml青霉素和105mg/ml链霉素水溶液，该溶液的PH值为7.4。
4、消化液：含125mol/L氯化钠、6mol/L氯化钾、1mol/L氯化镁、5mol/LHEPES、15mol/L无水葡萄糖、2.0mg/ml I型胶原酶、10U/ml木瓜蛋白酶、1mg/ml牛血清白蛋白、0.5mmol/L DTT、105U/ml青霉素和105mg/ml链霉素水溶液，该溶液的PH值为7.4。
5、胰蛋白酶溶液：含0.1％(m/v)胰蛋白酶和0.1％(m/v)EDTA。
6、培养基：：含90U/ml青霉素、90mg/ml链霉素的低糖DMEM和FBS(胎牛血清)混合溶液，所述的胎牛血清占培养基总体积的20％。
以上试剂经0.2μm滤膜过滤除菌。
(2)组织来源：无肺动脉高压的病人因肺癌等疾病行肺叶切除，取切除的肺叶的远端肺组织。
2、操作步骤
(1)获取成人肺动脉平滑肌：
1)在无菌条件下，用剪刀、镊子切取肺叶外周组织，放入冷的HBSS中，置入冰盒中低温保存并尽快于4小时内送入实验室超净台进行实验。
2)将肺组织送入超净台内操作，用冷HBSS清洗去除血污；置于体式显微镜下，用显微镊和显微剪刀于显微镜观察下小心分离远端肺动脉；在分离过程中需要不断更换冷HBSS；分离得到的肺动脉组织置于冷HBSS中清洗去除血液。
3)将肺动脉组织放入预消化液中20℃温度下进行预消化8min，将血管放入冷HBSS中以洗去预消化液，于显微镜观察下用显微镊和显微剪刀小心剥离血管外膜；将剥离外膜的血管条纵向剪开，内面朝上用弯头小镊子自上而下刮除内膜，留中膜平滑肌层；
(2)获取原代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞：
1)将中膜组织剪成小块约2×3mm，放入HBSS中4℃静置20min，无含钙的HBSS中室温静置15min；
2)再将组织块放入离心管中加入消化液35℃消化35min，可见组织块松软、边缘发毛；
3)轻轻吸出消化液，加入培养基2.5ml，室温放置4min。广口巴氏吸管吹打数次，可见液体中有絮状物；
4)静置片刻使组织块沉淀于离心管底部，吸出细胞悬浮液收集于另一离心管中。原消化液加回组织块中继续消化5min，按上述步骤收集细胞。再重复5min消化操作3次；
5)将收集的细胞悬浮液离心(800rpm，5min)，弃上清液，加入培养基调整细胞密度以2×105个/ml的密度种植于6孔培养板中(其中2孔放入盖玻片，鉴定时用)。置37℃、5％CO2培养箱内静置培养，10～14天后换培养基。当细胞生长至对数生长期，即完成原代细胞培养，获得原代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞。
(3)获取传代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞：
当原代细胞长满瓶壁后，即可传代。届时，用2mlPBS溶液清洗细胞2次，加入0.5ml0.1％(m/v)胰蛋白酶溶液(含0.1％EDTA)35℃消化3分钟，当细胞出现回缩、细胞间隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液，加入5ml培养液，轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之形成细胞悬浮液，以2×105个/ml的细胞密度接种于新的培养瓶中，置于37℃、5％二氧化碳孵箱中培养，每2天换液一次，至细胞生长至对数生长期，获得传代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞。
3、培养结果
结果与实施例一相同。
实施例三：
具体步骤：
1、主要实验材料
(1)试剂配制：
1、HBSS：含135mol/L氯化钠、3mol/L氯化钾、1.5mol/L氯化镁、15mol/LHEPES、25μmol/L氯化钙、5mol/L无水葡萄糖、90U/ml青霉素和90mg/ml链霉素水溶液，该溶液的PH值为7.4。
2、无钙的HBSS：含135mol/L氯化钠、3mol/L氯化钾、1.5mol/L氯化镁、15mol/LHEPES、5mol/L无水葡萄糖、90U/ml青霉素和90mg/ml链霉素水溶液，该溶液的PH值为7.4。
3、预消化液：含135mol/L氯化钠、3mol/L氯化钾、1.5mol/L氯化镁、15mol/LHEPES、5mol/L无水葡萄糖、1.0mg/ml I型胶原酶、90U/ml青霉素和90mg/ml链霉素水溶液，该溶液的PH值为7.4。
4、消化液：含135mol/L氯化钠、3mol/L氯化钾、1.5mol/L氯化镁、15mol/LHEPES、5mol/L无水葡萄糖、3.0mg/mlI型胶原酶、9U/ml木瓜蛋白酶、3mg/ml牛血清白蛋白、1.5mmol/L DTT、90U/ml青霉素和90mg/ml链霉素水溶液，该溶液的PH值为7.4。
5、胰蛋白酶溶液：含0.15％(m/v)胰蛋白酶和0.1％(m/v)EDTA。
6、培养基：：含105U/ml青霉素、105mg/ml链霉素的低糖DMEM和FBS(胎牛血清)混合溶液，所述的胎牛血清占培养基总体积的15％。
以上试剂经0.21μm滤膜过滤除菌。
(2)组织来源：无肺动脉高压的病人因肺癌等疾病行肺叶切除，取切除的肺叶的远端肺组织。
2、操作步骤
(1)获取成人肺动脉平滑肌：
1)在无菌条件下，用剪刀、镊子切取肺叶外周组织，放入冷的HBSS中，置入冰盒中低温保存并于4小时内送入实验室超净台进行实验。
2)将肺组织送入超净台内操作，用冷HBSS清洗去除血污；置于体式显微镜下，用显微镊和显微剪刀于显微镜观察下小心分离远端肺动脉；在分离过程中需要不断更换冷HBSS；分离得到的肺动脉组织置于冷HBSS中清洗去除血液。
3)将肺动脉组织放入预消化液中23℃温度下进行预消化5min，将血管放入冷HBSS中以洗去预消化液，于显微镜观察下用显微镊和显微剪刀小心剥离血管外膜；将剥离外膜的血管条纵向剪开，内面朝上用弯头小镊子自上而下刮除内膜，留中膜平滑肌层；
(2)获取原代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞：
1)将中膜组织剪成小块约2×3mm，放入HBSS中4℃静置25min，无含钙的HBSS中室温静置10min；
2)再将组织块放入离心管中加入消化液36℃消化38min，可见组织块松软、边缘发毛；
3)轻轻吸出消化液，加入培养基2ml，室温放置5min。广口巴氏吸管吹打20次，可见液体中有絮状物；
4)静置片刻使组织块沉淀于离心管底部，吸出细胞悬浮液收集于另一离心管中。原消化液加回组织块中继续消化5min，按上述步骤收集细胞。再重复5min消化操作4次；
5)将收集的细胞悬浮液离心(800rpm，5min)，弃上清液，加入培养基调整细胞密度以2.5×105细胞/ml的密度种植于6孔培养板中(其中2孔放入盖玻片，鉴定时用)。置37℃、5％CO2培养箱内静置培养，10～14天后换培养基。当细胞生长至对数生长期，即完成原代细胞培养，获得原代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞。
(3)获取传代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞：
当原代细胞长满瓶壁后，即可传代。届时，用2mlPBS溶液清洗细胞2次，加入0.4ml0.15％(m/v)胰蛋白酶溶液36℃消化3分钟，当细胞出现回缩、细胞间隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液，加入5ml培养液，轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之形成细胞悬浮液，以2.5×105个/ml的细胞密度接种于新的培养瓶中，置于37℃、5％二氧化碳孵箱中培养，每2天换液一次，至细胞生长至对数生长期，获得传代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞。
3、培养结果
结果与实施例一相同。
实施例一：
具体步骤：
1、主要实验材料
(1)试剂配制：
1、HBSS：含130mol/L氯化钠、5mol/L氯化钾、1.2mol/L氯化镁、10mol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、20μmol/L氯化钙、10mol/L无水葡萄糖、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素水溶液，该溶液的PH值为7.4。
2、无钙的HBSS：含130mol/L氯化钠、5mol/L氯化钾、1.2mol/L氯化镁、10mol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、10mol/L无水葡萄糖、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素水溶液，该溶液的PH值为7.4。
3、预消化液：含130mol/L氯化钠、5mol/L氯化钾、1.2mol/L氯化镁、10mol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、10mol/L无水葡萄糖、1.5mg/mlI型胶原酶、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素水溶液，该溶液的PH值为7.4。
4、消化液：含130mol/L氯化钠、5mol/L氯化钾、1.2mol/L氯化镁、10mol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、10mol/L无水葡萄糖、2.5mg/mlI型胶原酶、9.5U/ml木瓜蛋白酶、2mg/ml牛血清白蛋白、1mmol/L DTT、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素水溶液，该溶液的PH值为7.4。
5、胰蛋白酶溶液：含0.2％(m/v)胰蛋白酶和0.1％(m/v)的EDTA。
6、完全培养基是：含100/ml青霉素、100mg/ml链霉素的低糖DMEM和胎牛血清的混合溶液，所述的胎牛血清占培养基总体积的10％
以上试剂经0.22μm滤膜过滤除菌。
(2)组织来源：无肺动脉高压的病人因肺癌等疾病行肺叶切除术，取切除肺叶的远端肺组织。
2、操作步骤
(1)获取成人肺动脉平滑肌：
1)在无菌条件下，用剪刀、镊子切取肺叶外周组织，放入冷的HBSS中，置入冰盒中低温保存并尽快于4小时内送入实验室超净台进行实验。
2)将肺组织送入超净台内操作，用冷HBSS清洗去除血污；置于体式显微镜下，用显微镊和显微剪刀于显微镜观察下小心分离远端肺动脉；在分离过程中需要不断更换冷HBSS；分离得到的肺动脉组织置于冷HBSS中清洗去除血液。
3)将肺动脉组织放入预消化液中25℃温度下进行预消化10min，将血管放入冷HBSS中以洗去预消化液，于显微镜观察下用显微镊和显微剪刀小心剥离血管外膜；将剥离外膜的血管条纵向剪开，内面朝上用弯头小镊子自上而下刮除内膜，留中膜平滑肌层；
(2)获取原代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞：
1)将中膜组织剪成小块约2×3mm，放入HBSS中4℃静置30min，然后放入无含钙的HBSS中室温静置20min；
2)再将组织块放入离心管中加入消化液37℃消化45min，可见组织块松软、边缘发毛；
3)轻轻吸出消化液，加入完全培养基3ml，室温放置3min。广口巴氏吸管吹打10次，可见液体中有絮状物；
4)静置片刻使组织块沉淀于离心管底部，吸出细胞悬浮液收集于另一离心管中。原消化液加回组织块中继续消化5min，按上述步骤收集细胞。再重复5min消化操作2次；
5)将收集的细胞悬浮液离心(800rpm，5min)，弃上清液，加入培养基调整细胞密度以3×105个/ml的密度种植于6孔培养板中(其中2孔放入盖玻片，鉴定时用)。置37℃、5％CO2培养箱内静置培养，10～14天后换培养基。当细胞生长至对数生长期，即完成原代细胞培养，获得原代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞。
(3)获取传代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞：
当原代细胞长满瓶壁后，即可传代。届时，用2mlPBS溶液清洗细胞2次，加入0.5ml0.2％(m/v)胰蛋白酶溶液(含0.1％EDTA)37℃消化3分钟，当细胞出现回缩、细胞间隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液，加入5ml培养液，轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之形成细胞悬浮液，以2×105个/ml的细胞密度接种于新的培养瓶中，置于37℃、5％二氧化碳孵箱中培养，每2天换液一次，至细胞生长至对数生长期，获得传代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞。
3、培养结果
(1)、倒置相差显微镜下观察，刚种植的细胞呈圆形、透亮、单个均匀分布。原代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞潜伏期长、生长缓慢14天左右可见部分细胞贴壁、展开细胞形态多样，呈棱形、多角形、星形或不规则形，大小略有差异；胞浆丰富；胞核多为卵圆形多数细胞为单核，少数细胞有双核或三核，有一个或多个核仁。20～25天后细胞数量明显增多呈积聚性生长(图1)，细胞间常有突起相连。30～35天细胞生长达到对数期生长，部分区域细胞重叠堆积生长形成“峰”，“峰”与“峰”之间细胞层数渐少，形成“谷”。当细胞生长至融合后，细胞间相互平行排列成束，高低起伏，形成典型的平滑肌细胞生长特征“峰”“谷”状生长(图2)。
(2)倒置相差显微镜下观察，传代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞。细胞生长速度较原代培养细胞明显加快。传代后1天细胞贴壁、展开可见细胞呈棱形、多角形、星形或不规则形，3天后细胞数量明显增多呈积聚性生长，细胞间常有突起相连(图3)。7天后细胞生长至融合，形成典型的平滑肌细胞生长特征“峰”“谷”状生长(图4)。原代培养的细胞与传代细胞形态一致。
(3)平滑肌α-Actin抗原的免疫荧光检测：采用平滑肌α-Actin单克隆抗体对培养的细胞进行鉴定，并采用国际常用的复染法进行染色，用DAPI对所有细胞核进行染色，保证细胞纯度计算的可靠性。在激光扫描共聚焦显微镜下观察，可见FITC标记的细胞浆平滑肌α-Actin抗原发绿色荧光，DAPI标记的细胞核发红色荧光(图5)。高倍镜下观察，平滑肌细胞胞浆中的肌丝平行于细胞长轴呈细丝状表达(图6)。阴性对照无加一抗，仅检测到DAPI标记的细胞核没有检测FITC标记的平滑肌α-Actin，所以仅见发红色荧光(图7)。低倍镜计算细胞纯度，每张片随机取5个视野，每个视野至少检测200个细胞。计算每个视野中α-Actin表达阳性细胞占该视野总细胞数的比例，为平滑肌细胞纯度。平均达98％以上(图8)。
(4)透射电镜检测：透射电镜下观察到远端肺动脉平滑肌胞浆中有与细胞长轴平行的肌丝及与其相连的有密体、密斑(图9)，显典型的收缩表形结构特征。
实施例二：
具体步骤：
1、主要实验材料
(1)试剂配制：
1、HBSS：含125mol/L氯化钠、6mol/L氯化钾、1mol/L氯化镁、5mol/LHEPES、15μmol/L氯化钙、15mol/L无水葡萄糖、105U/ml青霉素和105mg/ml链霉素水溶液，该溶液的PH值为7.4。
2、无钙的HBSS：含125mol/L氯化钠、6mol/L氯化钾、1mol/L氯化镁、5mol/LHEPES、15mol/L无水葡萄糖、105U/ml青霉素和105mg/ml链霉素水溶液，该溶液的PH值为7.4。
3、预消化液：含125mol/L氯化钠、6mol/L氯化钾、1mol/L氯化镁、5mol/LHEPES、15mol/L无水葡萄糖、1.3mg/mlI型胶原酶、105U/ml青霉素和105mg/ml链霉素水溶液，该溶液的PH值为7.4。
4、消化液：含125mol/L氯化钠、6mol/L氯化钾、1mol/L氯化镁、5mol/LHEPES、15mol/L无水葡萄糖、2.0mg/ml I型胶原酶、10U/ml木瓜蛋白酶、1mg/ml牛血清白蛋白、0.5mmol/L DTT、105U/ml青霉素和105mg/ml链霉素水溶液，该溶液的PH值为7.4。
5、胰蛋白酶溶液：含0.1％(m/v)胰蛋白酶和0.1％(m/v)EDTA。
6、培养基：：含90U/ml青霉素、90mg/ml链霉素的低糖DMEM和FBS(胎牛血清)混合溶液，所述的胎牛血清占培养基总体积的20％。
以上试剂经0.2μm滤膜过滤除菌。
(2)组织来源：无肺动脉高压的病人因肺癌等疾病行肺叶切除，取切除的肺叶的远端肺组织。
2、操作步骤
(1)获取成人肺动脉平滑肌：
1)在无菌条件下，用剪刀、镊子切取肺叶外周组织，放入冷的HBSS中，置入冰盒中低温保存并尽快于4小时内送入实验室超净台进行实验。
2)将肺组织送入超净台内操作，用冷HBSS清洗去除血污；置于体式显微镜下，用显微镊和显微剪刀于显微镜观察下小心分离远端肺动脉；在分离过程中需要不断更换冷HBSS；分离得到的肺动脉组织置于冷HBSS中清洗去除血液。
3)将肺动脉组织放入预消化液中20℃温度下进行预消化8min，将血管放入冷HBSS中以洗去预消化液，于显微镜观察下用显微镊和显微剪刀小心剥离血管外膜；将剥离外膜的血管条纵向剪开，内面朝上用弯头小镊子自上而下刮除内膜，留中膜平滑肌层；
(2)获取原代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞：
1)将中膜组织剪成小块约2×3mm，放入HBSS中4℃静置20min，无含钙的HBSS中室温静置15min；
2)再将组织块放入离心管中加入消化液35℃消化35min，可见组织块松软、边缘发毛；
3)轻轻吸出消化液，加入培养基2.5ml，室温放置4min。广口巴氏吸管吹打数次，可见液体中有絮状物；
4)静置片刻使组织块沉淀于离心管底部，吸出细胞悬浮液收集于另一离心管中。原消化液加回组织块中继续消化5min，按上述步骤收集细胞。再重复5min消化操作3次；
5)将收集的细胞悬浮液离心(800rpm，5min)，弃上清液，加入培养基调整细胞密度以2×105个/ml的密度种植于6孔培养板中(其中2孔放入盖玻片，鉴定时用)。置37℃、5％CO2培养箱内静置培养，10～14天后换培养基。当细胞生长至对数生长期，即完成原代细胞培养，获得原代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞。
(3)获取传代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞：
当原代细胞长满瓶壁后，即可传代。届时，用2mlPBS溶液清洗细胞2次，加入0.5ml0.1％(m/v)胰蛋白酶溶液(含0.1％EDTA)35℃消化3分钟，当细胞出现回缩、细胞间隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液，加入5ml培养液，轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之形成细胞悬浮液，以2×105个/ml的细胞密度接种于新的培养瓶中，置于37℃、5％二氧化碳孵箱中培养，每2天换液一次，至细胞生长至对数生长期，获得传代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞。
3、培养结果
结果与实施例一相同。
实施例三：
具体步骤：
1、主要实验材料
(1)试剂配制：
1、HBSS：含135mol/L氯化钠、3mol/L氯化钾、1.5mol/L氯化镁、15mol/LHEPES、25μmol/L氯化钙、5mol/L无水葡萄糖、90U/ml青霉素和90mg/ml链霉素水溶液，该溶液的PH值为7.4。
2、无钙的HBSS：含135mol/L氯化钠、3mol/L氯化钾、1.5mol/L氯化镁、15mol/LHEPES、5mol/L无水葡萄糖、90U/ml青霉素和90mg/ml链霉素水溶液，该溶液的PH值为7.4。
3、预消化液：含135mol/L氯化钠、3mol/L氯化钾、1.5mol/L氯化镁、15mol/LHEPES、5mol/L无水葡萄糖、1.0mg/ml I型胶原酶、90U/ml青霉素和90mg/ml链霉素水溶液，该溶液的PH值为7.4。
4、消化液：含135mol/L氯化钠、3mol/L氯化钾、1.5mol/L氯化镁、15mol/LHEPES、5mol/L无水葡萄糖、3.0mg/mlI型胶原酶、9U/ml木瓜蛋白酶、3mg/ml牛血清白蛋白、1.5mmol/L DTT、90U/ml青霉素和90mg/ml链霉素水溶液，该溶液的PH值为7.4。
5、胰蛋白酶溶液：含0.15％(m/v)胰蛋白酶和0.1％(m/v)EDTA。
6、培养基：：含105U/ml青霉素、105mg/ml链霉素的低糖DMEM和FBS(胎牛血清)混合溶液，所述的胎牛血清占培养基总体积的15％。
以上试剂经0.21μm滤膜过滤除菌。
(2)组织来源：无肺动脉高压的病人因肺癌等疾病行肺叶切除，取切除的肺叶的远端肺组织。
2、操作步骤
(1)获取成人肺动脉平滑肌：
1)在无菌条件下，用剪刀、镊子切取肺叶外周组织，放入冷的HBSS中，置入冰盒中低温保存并于4小时内送入实验室超净台进行实验。
2)将肺组织送入超净台内操作，用冷HBSS清洗去除血污；置于体式显微镜下，用显微镊和显微剪刀于显微镜观察下小心分离远端肺动脉；在分离过程中需要不断更换冷HBSS；分离得到的肺动脉组织置于冷HBSS中清洗去除血液。
3)将肺动脉组织放入预消化液中23℃温度下进行预消化5min，将血管放入冷HBSS中以洗去预消化液，于显微镜观察下用显微镊和显微剪刀小心剥离血管外膜；将剥离外膜的血管条纵向剪开，内面朝上用弯头小镊子自上而下刮除内膜，留中膜平滑肌层；
(2)获取原代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞：
1)将中膜组织剪成小块约2×3mm，放入HBSS中4℃静置25min，无含钙的HBSS中室温静置10min；
2)再将组织块放入离心管中加入消化液36℃消化38min，可见组织块松软、边缘发毛；
3)轻轻吸出消化液，加入培养基2ml，室温放置5min。广口巴氏吸管吹打20次，可见液体中有絮状物；
4)静置片刻使组织块沉淀于离心管底部，吸出细胞悬浮液收集于另一离心管中。原消化液加回组织块中继续消化5min，按上述步骤收集细胞。再重复5min消化操作4次；
5)将收集的细胞悬浮液离心(800rpm，5min)，弃上清液，加入培养基调整细胞密度以2.5×105细胞/ml的密度种植于6孔培养板中(其中2孔放入盖玻片，鉴定时用)。置37℃、5％CO2培养箱内静置培养，10～14天后换培养基。当细胞生长至对数生长期，即完成原代细胞培养，获得原代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞。
(3)获取传代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞：
当原代细胞长满瓶壁后，即可传代。届时，用2mlPBS溶液清洗细胞2次，加入0.4ml0.15％(m/v)胰蛋白酶溶液36℃消化3分钟，当细胞出现回缩、细胞间隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液，加入5ml培养液，轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之形成细胞悬浮液，以2.5×105个/ml的细胞密度接种于新的培养瓶中，置于37℃、5％二氧化碳孵箱中培养，每2天换液一次，至细胞生长至对数生长期，获得传代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞。
3、培养结果
结果与实施例一相同。