添加α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂实现α-酮戊二酸过量积累的方法

摘要

一种添加α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂实现α-酮戊二酸过量积累的方法，属于蛋白质水平的代谢调控优化发酵过程技术领域。本发明利用多重维生素营养缺陷型的光滑球拟酵母CCTCC M202019为生产菌株，通过在培养基中添加α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂：过氧化氢、甲氨蝶呤、次氯酸钠或羟基硫氨，调节α-酮戊二酸脱氢酶活性，有目的的降低α-酮戊二酸脱氢酶活性，减少代谢过程中α-酮戊二酸的降解，达到过量积累α-酮戊二酸的目的。本发明利用调控工业微生物中碳代谢和碳代谢流流向分布，使碳代谢流截止在α-酮戊二酸这一节点上，其中α-酮戊二酸最大产量达到23.2g/L，比对照提高了12.2％。本发明为TCA循环中间代谢产物的发酵研究提供了一个新的思路。

权利要求

1.一种添加α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂实现α-酮戊二酸过量积累的方法，其特征是利用多重维生素营养缺陷型的光滑球拟酵母(T.glabrata)CCTCCM202019为生产菌株，通过在培养基中添加α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂：过氧化氢、甲氨蝶呤、次氯酸钠或羟基硫氨，调节α-酮戊二酸脱氢酶活性，有目的的减少α-酮戊二酸的降解，使碳流截止在α-酮戊二酸这一节点上，实现α-酮戊二酸过量积累；调控方法为：发酵40h，在发酵培养基中添加过氧化氢达5mM时，α-酮戊二酸积累量达到23.2g/L；

或发酵初期0h，在发酵培养基中添加甲氨蝶呤达0.08μM时，α-酮戊二酸积累量达到

22.7g/L；

或发酵初期0h，在发酵培养基中添加次氯酸钠达0.4mM时，α-酮戊二酸积累量达到

22.2g/L；

或发酵初期0h，在发酵培养基中添加羟基硫氨达0.48μM时，α-酮戊二酸积累量达到

22.0g/L；

所述发酵培养基：葡萄糖100g/L；NH4Cl 7g/L；KH2PO45g/L；MgSO4·7H2O0.8g/L；烟酸

8mg/L；盐酸吡哆醇0.4mg/L；硫胺素0.02mg/L；生物素0.04mg/L；CaCO360g/L。

说明书

添加α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂实现α-酮戊二酸过量积

累的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种添加α-酮戊二酸脱氢酶(KGDH)抑制剂实现α-酮戊二酸(KG)过量积累的方法。通过研究KGDH抑制剂对代谢流流向及相应的代谢通量的影响，达到α-酮戊二酸的大量积累。属于蛋白质水平的代谢调控优化发酵过程技术领域。

背景技术

[0002] α-酮戊二酸，又称α-胶酮酸，2-氧代戊二酸或α-羰基戊二酸，是三羧酸(TCA)循环中重要的中间产物之一，在微生物细胞的代谢中起着重要的作用，也是合成多种氨基酸、蛋白质的重要前体物质。其结构式为：

[0003]

[0004] α-酮戊二酸结构式

[0005] α-酮戊二酸在医药、有机合成、营养强化剂等领域有着重要的应用前景，目前主要应用领域为：作为运动营养饮料的成分；有机中间体；生化试剂和测肝功能的配套试剂；体格增强补剂；降低术后患者和长期病人的机体损耗；在脑部作为酪氨酸和谷氨酸的前体；同时研究还表明，α-酮戊二酸具有抗氰作用，与亚硝酸钠、硫代硫酸钠配合使用可提高抗氰能力，且有抗惊厥作用。α-酮戊二酸目前主要消费于医疗机构，用来诊断和对神经疾病进行治疗。

[0006] 过氧化氢、甲氨蝶呤、次氯酸钠和羟基硫氨对KGDH的抑制作用在人类神经和心脏疾病中的研究广泛，而在微生物尤其是酵母中的研究鲜见报道。本研究确定了这四种物质对KGDH的抑制作用，同时明确了抑制浓度和添加时间，为TCA循环中间代谢产物的发酵研究提供了一个新的思路。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种添加α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂实现α-酮戊二酸过量积累的方法。利用多重营养缺陷型的光滑球拟酵母(T.glabrata)CCTCCM202019发酵生产KG，在发酵过程中添加适量的KGDH抑制剂，有目的的抑制KGDH活性，达到大量积累KG的目的。

[0008] 本发明的技术方案：一种添加α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂实现α-酮戊二酸过量积累的方法，是利用多重维生素营养缺陷型的光滑球拟酵母(T.glabrata)CCTCC M202019为生产菌株，通过在培养基中添加KGDH抑制剂：过氧化氢、甲氨蝶呤、次氯酸钠或羟基硫氨调节KGDH活性，有目的的减少KG的降解，使碳流截止在KG这一节点上，实现α-酮戊二酸过量积累；调控方法为：

[0009] 发酵40h，在发酵培养基中添加过氧化氢达5mM时，α-酮戊二酸积累量达到23.2g/L，比对照提高了12.2％；

[0010] 或发酵初期0h，在发酵培养基中添加甲氨蝶呤达0.08μM时，α-酮戊二酸积累量达到22.7g/L，比对照提高了10.1％；

[0011] 或发酵初期0h，在发酵培养基中添加次氯酸钠达0.4mM时，α-酮戊二酸积累量达到22.2g/L，比对照提高了7.5％；

[0012] 或发酵初期0h，在发酵培养基中添加羟基硫氨达0.48μM时，α-酮戊二酸积累量达到22.0g/L，比对照提高了6.1％。

[0013] 1、菌种

[0014] 光滑球拟酵母(T.glabrata)CCTCC NO.M 202019，为烟酸、生物素、硫胺素、盐酸吡哆醇4种维生素营养缺陷型菌株，且丙酮酸脱羧酶活性组成型降低，为本研究室选育菌株，专利号：ZL 02113142.2。

[0015] 2、培养基和培养方法

[0016] 种子培养基：种子和斜面培养基(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨10，KH2PO4 1，MgSO4·7H2O 0.5；琼脂20(斜面培养基)，pH 5.5。

[0017] 发酵培养基：葡萄糖100g/L；NH4Cl 7g/L；KH2PO4 5g/L；MgSO4·7H2O 0.8g/L；烟酸8mg/L；盐酸吡哆醇0.4mg/L；硫胺素0.02mg/L；生物素0.04mg/L；CaCO3 60g/L；根据实验要求添加不同浓度的KGDH抑制剂。

[0018] 摇瓶培养：将30℃、200rpm下培养24h的种子以10％的接种量转入发酵培养基于30℃、200rpm条件下培养72h。

[0019] 3、分析方法

[0020] 葡萄糖的测定：3，5-二硝基水杨酸法。

[0021] 丙酮酸(PYR)和α-酮戊二酸(KG)的测定：采用高效液相色谱(HPLC)测定。参考Agillent有机酸测定方法。色谱条件为：ZORBAX SB-Aq反相柱，柱温：35℃，检测器：UV210nm，流动相：19.7g/L Na2HPO4+1.2％H3PO4+1％乙腈，pH2.0，流速：1.0mL/min，进样体积：
5μL。

[0022] 细胞干重(DCW)测定：根据细胞干重和对应OD值绘制标准曲线，得

[0023] 1OD＝0.29g/L DCW。

[0024] 本发明的有益效果：本发明利用调控工业微生物中碳代谢和碳代谢流流向分布，使碳代谢流截止在KG这一节点上，其中KG最大产量达到23.2g/L，比对照提高了12.2％。

具体实施方式

[0025] 实施例1添加过氧化氢对对T.glabrata CCTCC NO.M 202019发酵产酸的影响[0026] 发酵初期添加过氧化氢，随着过氧化氢添加量的增加，丙酮酸产量呈现上升趋势，当过氧化氢添加量为5mM时，KG产量达到最大为21.8g/L，比对照增加了5.6％，此时CKG/CPYR值为0.73。考察发酵不同阶段添加5mM过氧化氢对产酸的影响，KG产酸初期(40h)添加过氧化氢，KG的积累量增加最大，为23.2g/L，比对照提高了12.2％。

[0027] 由此得出过氧化氢的最佳添加量为5mM，添加时间为KG产酸初期(40h)。

[0028] 实施例2添加甲氨蝶呤对CCTCC NO.M 202019发酵产酸的影响