乳头瘤病毒检测与分型方法及其液相芯片

摘要

本发明公开了一种乳头瘤病毒检测与分型的液相芯片及其用于检测与分型乳头瘤病毒的方法。该液相芯片主要包括有：分别包被有特异的anti-tag标签序列的微球，anti-tag标签序列与微球连接中间还设有7-10个T的间隔臂序列；所述anti-tag标签序列选自SEQ IDNO.25～SEQ ID NO.47中的2种或2种以上的序列；针对每种型别的HPV分别设计的特异ASPE引物，所述ASPE引物选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.23中的2种或2种以上的序列；扩增出具有突变位点的目标序列的引物。本发明对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备的核酸探针微球集能适用于不同的检测项目，检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。

权利要求

1.一种乳头瘤病毒检测与分型的液相芯片，其特征是，主要包括有：(1)分别包被有特异的anti-tag标签序列的微球，anti-tag标签序列与微球连接中间还设有7-10个T的间隔臂序列；所述anti-tag标签序列选自SEQ ID NO.25～SEQID NO.47中的2种以上的序列；

(2)针对每种型别的HPV分别设计的特异ASPE引物，所述ASPE引物选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.23中的2种以上的序列；每种ASPE引物的3’端为针对检测的目的基因突变位点的特异序列，5’端为tag标签序列，该tag标签序列能与微球上相应的anti-tag标签序列互补配对；

(3)扩增出具有突变位点的目标序列的引物。

2.根据权利要求1所述的液相芯片，其特征是，所述扩增出具有突变位点的目标序列的引物为以下序列组成的通用引物：

5’-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3’

5’-GAAAAATAAACTGTAAATCA-3’。

说明书

乳头瘤病毒检测与分型方法及其液相芯片

技术领域

[0001] 本发明涉及医学体外诊断技术，具体的是涉及一种用于人乳头瘤病毒检测与分型的方法及其液相芯片。

背景技术

[0002] 人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)是一种小分子环状双链DNA病毒，通过性接触、直接或间接接触污染物品等途径在人群中广为传播，特异性地感染人体皮肤和粘膜的鳞状上皮细胞，引起多种良性或恶性病变，严重威胁着人类的健康。根据HPV基因的序列变异可将其分为多种类型。目前确定的HPV型别有100余种，其中约40种可以感染人生殖器官，约20种与肿瘤相关。依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低分为高危型和低危型，低危型HPV如HPV6、11、40、42、43、44、53和54等型别，常引起外生殖器湿疣等良性病变包括宫颈上皮内低度病变(CINI)，高危型HPV包括HPV16、18、26、31、33、35、39、45、
51、52、56、58、59、61、66、68、73、82及83等型别，与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变(CINII/III)的发生相关，尤其是HPV16和18型。

[0003] 大量流行病学和分子生物学研究资料表明HPV与宫颈癌及癌前病变密切相关，HPV感染是宫颈癌的主要病因。大约80％的低度宫颈癌前病变的病人体内可以分离出HPV，高度宫颈癌前病变的病人中有90％可以分离出HPV，几乎所有患浸润性宫颈癌的妇女体内都能分离出HPV。而宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率高居女性恶性肿瘤的第二位。全世界每年有45万的宫颈癌新发病例，导致死亡的接近25万例。因此，HPV DNA检测及分型对宫颈癌的早期诊断、判断预后以及指导治疗具有重要价值。

[0004] 由于HPV体外增殖非常困难，到目前为止尚无可靠的血清学分型方法。传统的HPV检测方法主要是通过形态学和免疫组化法对其进行检测，如巴氏涂片法，薄层液基细胞学检查，阴道镜检查，组织病理学检查，电镜直接观察HPV病毒颗粒，放射免疫沉淀法检测患者血清HPV16抗体水平，酶联免疫吸附法(ELISA)检测患者血清中HPV-E6，E7特异性抗体等。然而这些方法的检测灵敏度和特异性均不够理想，存在较高的假阳性率和假阴性率，同时无法做到早期诊断，更不能对HPV进行分型。HPV常用的分型方法有核酸杂交(包括
斑点杂交法、荧光原位杂交法、southern杂交法以及杂交捕获法)，聚合酶链反应(PCR)技术(直接测序法、限制性片段长度多态性分析、杂交法以及目前很具影响力的基因芯片法)等。Southern杂交法是HPV基因分型的金标准，但此方法敏感性低、耗时、需要大量高度纯化的DNA，而且需要新鲜样本，不能用于DNA已降解的组织，故不适合于临床HPV分型的检测应用。荧光原位杂交法(ISH)能够在组织病理中估计目的核酸或基因的表达，但ISH测
定HPV序列的敏感性很低。杂交捕获法(Digene公司HC II)是目前唯一通过FDA批准的
可在临床使用的HPV DNA检测技术。该技术敏感性较好，重复性高，但不能确定具体的HPV亚型，且存在交叉反应，影响其检测的准确性。PCR技术检测灵敏度高，操作简单，但具有样品易污染、假阳性率高等缺点，同时，普通PCR方法和荧光定量PCR由于检测通量的局限性不能满足临床的需要。随着越来越多高危型HPV种类的确定，必须建立一种能同时检测至少15种高危型HPV的方法。基因芯片技术用于HPV分型检测，能一次检测多种常见类型的
HPV，但传统的固相芯片价格昂贵，而且敏感性不高，检测结果的可重复性差。基于芯片的原理，美国Luminex公司开发出了以微球为载体的悬浮液相芯片技术。该项技术利用聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸和蛋白质等生物大分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的蛋白质或核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。
Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，其中红色激光检测微球表面红色分类荧光的强度，并根据微球中不同色彩而编号分类，从而确定反应的类型；
绿色激光检测样本中荧光标记物的荧光强度，再通过机器与计算机自动统计分析激光所检测到微球种类、数量，从而判定待测样本多种目标测试物各自的浓度。因此，液相芯片技术既满足了高通量检测的要求，同时具备了快速准确，灵敏度高，特异性好，结果重复性好等优点。将液相芯片技术应用于人乳头瘤病毒HPV检测与分型将具有极大的优势。

[0005] 公开号分别为CN1948503A及CN1814796A的中国专利申请分别公开了一种人乳头瘤病毒HPV检测与分型液相芯片。其主要步骤是：将针对不同HPV亚型核苷酸序列的特异性寡核苷酸探针包被在不同荧光编码的微球表面形成核酸探针微球集。同时，提取样本DNA，设计5’端生物素标记的HPV型特异的引物，进行多重PCR扩增。扩增产物与微球表面的特异性寡核苷酸探针进行杂交，反应后加入链霉亲和素-藻红蛋白，最后通过Luminex仪器检测信号。由于需要把特异性的寡核苷酸探针包被到微球上，增加了包被步骤，同时所包被的微球仅能用于乳头瘤病毒HPV分型。此外，现有的HPV检测液相芯片技术在PCR扩增时采
用5’端标记生物素的方式，因此荧光信号比较低，限制了检测的灵敏度。同时在PCR扩增以后没有对体系中多余的游离核苷酸(如生物素标记的引物及dNTP)进行处理，使得后续
的杂交反应存在更多非特异性结合的可能，从而使检测结果的信噪比差。

发明内容

[0006] 本发明的目的之一是提供一种乳头瘤病毒检测与分型的液相芯片。

[0007] 一种乳头瘤病毒检测与分型的液相芯片，包括有：

[0008] (1)分别包被有特异的anti-tag标签序列的微球，anti-tag标签序列与微球连接中间还设有7-10个T的间隔臂序列；所述anti-tag标签序列选自SEQ ID NO.25～SEQIDNO.47中的2种或2种以上的序列；

[0009] (2)针对每种型别的HPV分别设计的特异ASPE引物，所述ASPE引物选自SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.23中的2种或2种以上的序列；每种ASPE引物的3’端为针对检测的
目的基因突变位点的特异序列，5’端为tag标签序列，该tag标签序列能与微球上相应的anti-tag标签序列互补配对；

[0010] (3)扩增出具有突变位点的目标序列的引物。

[0011] 优选地，扩增出具有突变位点的目标序列的引物为通用引物：

[0012] 5’-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3’

[0013] 5’-GAAAAATAAACTGTAAATCA-3’。

[0014] 本发明的另一目的是使用上述液相芯片对乳头瘤病毒检测与分型的方法。

[0015] 一种使用上述液相芯片对乳头瘤病毒检测与分型的方法，主要包括以下步骤：

[0016] 1.提取样本中的DNA；

[0017] 2.PCR扩增待测样品；

[0018] 3.PCR反应产物用虾碱性磷酸酶及内切酶I进行酶切处理；

[0019] 4.酶切处理后的PCR反应产物用所述ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记；

[0020] 5.将对应ASPE引物的包被有特异的anti-tag标签序列的微球与上述延伸反应后的产物进行杂交反应；

[0021] 6.杂交反应后的产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应；

[0022] 7.通过荧光检测仪检测。

[0023] 本发明所制备的人乳头瘤病毒检测与分型液相芯片能对HPV进行准确的分型，与测序法的吻合率高达100％。所选择的每种微球与相应的扩增产物杂交的信号基本上都大于5000，同时所制备的人乳头瘤病毒检测与分型液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应。本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型别HPV的感染，并能够准确诊断HPV混合感染。

[0024] 利用本发明所提供的HPV检测与分型液相芯片系统能一次检测22种常见型别的HPV，大大提高了HPV的检测效率，克服了血清学和免疫组化检测方法对潜伏感染漏检的缺陷，真正实现对宫颈癌HPV病毒的早期检测。还可根据临床检测的实际需要，选择相应的ASPE型特异性引物进行所需型别的分型检测。本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不
高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备的核酸探针微球集能适用于不同的检测项目，检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。

附图说明

[0025] 图1是本发明检测分型的方法原理示意图。

具体实施方式

[0026] 实施例1人乳头瘤病毒HPV检测与分型液相芯片试剂盒，主要包括有：

[0027] 一、特异性引物序列(ASPE引物)

[0028] 针 对 HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、70、73、82、06、11、42、43、44共22种型别分别设计特异性的引物序列(18-22bp)，引物5’端分别加上一段24bp
的特异的tag标签序列，这些tag标签序列能分别与对应的微球上的anti-tag序列特异地
互补配对。ASPE序列如下表所示：

[0029] 表1ASPE引物序列

[0030]SEQ NO. 型别 NCBI序列号 Sequence(5’→3’)
1 HPV06 X00203 AATCTACAAATCCAATAATCTCATTCCGTAACTACATCTTCCA
2 HPV11 M14119 CAATTCAAATCACAATAATCAATCTCTGTGTCTAAATCTGCTAC
3 HPV16 K02718 CAATTCATTTCATTCACAATCAATTACCTACGACATGGGGAG
4 HPV18 X05015 TCAACAATCTTTTACAATCAAATCTGCTTCTACACAGTCTCCT
5 HPV31 J04353 TATATACACTTCTCAATAACTAACGCAATTGCAAACAGTGATAC
6 HPV33 M12732 ATTATTCACTTCAAACTAATCTACTGCACACAAGTAACTAGTGA
7 HPV35 M74117 CAATTTCATCATTCATTCATTTCACTGCTGTGTCTTCTAGTGA
8 HPV39 M62849 TAATCTTCTATATCAACATCTTACTACATTATCTACCTCTATAGA
9 HPV42 M73236 TTCAATCATTCAAATCTCAACTTTGCCACTGCAACATCTGGTG
10 HPV43 AJ620205 CTTTTACAATACTTCAATACAATCTCTACTGACCCTACTGTG
11 HPV44 U31788 CTACAAACAAACAAACATTATCAATACTAGTGAACAATATAAGCA
12 HPV45 X74479 TCAATTACCTTTTCAATACAATACTAATTTAACATTATGTGCCTC
13 HPV51 M62877 AATCCTTTTTACTCAATTCAATCATGCTGCGGTTTCCCCAA
14 HPV52 X74481 TACATCAACAATTCATTCAATACAGAATACCTTCGTCATGGC
15 HPV56 X74483 TACACAATCTTTTCATTACATCATGATGCACGAAAAATTAATCAG
16 HPV58 D90400 TACAAATCATCAATCACTTTAATCTATGCACTGAAGTAACTAAG
17 HPV59 X77858 CTACTAATTCATTAACATTACTACAGAATATGCCAGACATGTG
18 HPV66 U31794 TACACTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCGTGAAATCAATCAATACCTTC
19 HPV68 AJ831568 TTACTACACAATATACTCATCAATCTGAATCAGCTGTACCAAA
20 HPV70 U22461 CTACTTCATATACTTTATACTACATTTACATTGTCTGCCTGCA
21 HPV73 NC_006165 CAATATACCAATATCATCATTTACGTATGCCAACTCTAATTTTAA
22 HPV82 AB027021 CTTTATCAATACATACTACAATCAACTCCAACAAACTTTAAGCAGT
23 β-globin —— TCATTTACTCAACAATTACAAATCCCCTGACTTTTATGCCCAG
24 阴性对照 CGTTAGGTCGGAGCTTGATC

[0031] 每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列(如表2所示)，3’端为HPV型特异的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用ddH2O配制成
100pmol/mL的贮存液。

[0032] 二、anti-tag序列包被的微球

[0033] 根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag标签序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，选择的23种tag序列及其微球上相应的anti-tag序列如表2所示：

[0034] 表2ASPE特异性引物右端的Tag序列及微球上对应的anti-tag序列

[0035]HPV 微球 SEQ NO. 微球上对应的anti-tag序列
型别 编号
HPV06 LUA60 25 ATGAGATTATTGGATTTGTAGATT
HPV11 LUA05 26 GATTGATTATTGTGATTTGAATTG
HPV16 LUA36 27 ATTGATTGTGAATGAAATGAATTG
HPV18 LUA06 28 GATTTGATTGTAAAAGATTGTTGA
HPV31 LUA55 29 GTTAGTTATTGAGAAGTGTATATA
HPV33 LUA32 30 GTAGATTAGTTTGAAGTGAATAAT
HPV35 LUA35 31 TGAAATGAATGAATGATGAAATTG
HPV39 LUA09 32 GTAAGATGTTGATATAGAAGATTA
HPV42 LUA23 33 AAAGTTGAGATTTGAATGATTGAA
HPV43 LUA20 34 GATTGTATTGAAGTATTGTAAAAG
HPV44 LUA28 35 TTGATAATGTTTGTTTGTTTGTAG
HPV45 LUA24 36 GTATTGTATTGAAAAGGTAATTGA
HPV51 LUA22 37 TGATTGAATTGAGTAAAAAGGATT
HPV52 LUA46 38 TGTATTGAATGAATTGTTGATGTA
HPV56 LUA39 39 ATGATGTAATGAAAAGATTGTGTA
HPV58 LUA11 40 GATTAAAGTGATTGATGATTTGTA
HPV59 LUA58 41 GTAGTAATGTTAATGAATTAGTAG
HPV66 LUA12 42 AAAGAAAGAAAGAAAGAAAGTGTA
HPV68 LUA41 43 ATTGATGAGTATATTGTGTAGTAA
HPV70 LUA63 44 TGTAGTATAAAGTATATGAAGTAG
HPV73 LUA50 45 GTAAATGATGATATTGGTATATTG
HPV82 LUA02 46 TGATTGTAGTATGTATTGATAAAG
β LUA67 47 GATTTGTAATTGTTGAGTAAATGA
-globin

[0036] 选择的23种微球(FlexMAP微球)购白美国Luminex公司，也可自己合成tag序列，购买Luminex公司的羧基化微球进行包被。包被的过程如下：

[0037] 根据所选择的tag序列合成对应于每种微球的anti-tag序列，每个anti-tag序列前加上一段10个T的“TTTTTTTTTT”的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。微
球包被的过程如下：

[0038] 分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配
制 10ng/ml 的 EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)( 购 自 Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，避光孵育30分钟，再加
入2.5ul的EDC工作液，再避光孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一
次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul
的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0)，1mmol/L EDTA]中，2-8℃避光保存。

[0039] 三、扩增出具有突变位点的目标序列的引物(SEQ N0.48-49)：

[0040] GP5+：5’-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3’

[0041] GP6+：5’-GAAAAATAAACTGTAAATCA-3’。

[0042] 也可针对每一型别分别使用一对特异的引物进行多重PCR扩增，扩增出具有突变位点的目标序列，扩增产物混合后备用。

[0043] 实施例2运用HPV检测与分型液相芯片对临床样本的检测与分型

[0044] 所述各种溶液的配方如下：

[0045] 50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml)：

[0046]试剂 来源 终浓度 每250ml的用量
MES
(2[N-Morpholino]
Sigma M-2933 0.05M 2.44g
ethanesulfonic
acid)
5MNaOH Fisher SS256-500 --- 5滴

[0047] 2×Tm杂交缓冲液

[0048]试剂 来源 终浓度 每250ml的用量
1MTris-HCl，pH8.0 SigmaT3038 0.2M 50ml
5M NaCl Sigma S5150 0.4M 20ml
Triton X-100 Sigma T8787 0.16％ 0.4ml

[0049] 过滤后贮存于4℃

[0050] 生物素标记的dNTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

[0051] 一、样本的选择及样本的DNA提取

[0052] 选择20份经测序法进行HPV检测与分型的宫颈样本。其中8份为低危型HPV单型感染，包括3份HPV06型感染和5份HPV11型感染。10份为高危型HPV单型感染，包括4
份HPV16型感染，4份HPV18型感染以及1份HPV52型感染，1份HPV58型感染。另外2份
为混合型感染，其中1份为HPV06型与HPV18型混合感染，另外一份为HPV11型，HPV16型
以及HPV18型混合感染。待测组织样本的DNA提取方法如下：

[0053] 1.将宫颈脱落细胞的组织样本用pH7.4的PBS溶液洗涤2次；

[0054] 2.洗涤后的宫颈脱落细胞重悬于1ml的消化液(50mmol/L Tris，1mmo/L Na2EDTA，0.5％Tween-20，200ug/ml的蛋白酶K 200，pH 8.5)，55C水浴消化1小时，99℃水浴15min灭活蛋白酶K；

[0055] 3.12000转/分钟离心10分钟；

[0056] 4.取上清，通过酚-氯仿-异戊醇法抽提，乙醇沉淀法获得用于PCR反应的DNA样品。

[0057] 二、待测样品的PCR扩增

[0058] 利用通用型引物GP5+/GP6+用于扩增HPV L1片段的高度保守区，产物大小为150bp。通用引物序列(SEQ NO.50-51)如下：

[0059] GP5+：5’-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3’

[0060] GP6+：5’-GAAAAATAAACTGTAAATCA-3’

[0061] 反应体系如下：

[0062] 10×缓冲液 2ul

[0063] MgCl2 3ul

[0064] dNTP 1.5ul

[0065] Taq酶 0.5ul

[0066] 上游引物GP5+ 0.5ul

[0067] 下游引物GP6+ 0.5ul

[0068] 模板DNA 5ul

[0069] ddH2O 12ul

[0070] 共 25ul

[0071] PCR扩增程序为：95℃5min；95℃30s，55℃45s，72℃60s，30个循环；72℃5min；4℃保存备用。

[0072] 采用PC03/05通用引物对扩增β-globin基因，以验证DNA模板质量，并排除PCR反应体系中抑制因子的影响。引物序列如下：

[0073] PC03：5’-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3’

[0074] PC05：5’-GAAACCCAAGAGTCTTCTCT-3’

[0075] 人β-globin基因扩增的反应体系与扩增程序同HPV DNA的扩增，但引物分别替换为0.5uM的PC03和0.5uM的PC05。

[0076] 三、PCR产物的酶切处理

[0077] 1.取25ul PCR反应后的产物，加入2ul虾碱性磷酸酶(2u)和5ul的内切酶I(5U)

[0078] 2.37℃孵育30min。99℃孵育15min，使多余的酶灭活。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。

[0079] 四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)

[0080] 利用上述设计的位点特异性引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。

[0081] 首先配制混合的ASPE引物工作液：分别各取HPV06，HPV11，HPV16，HPV18，HPV33，HPV35，HPV45，HPV52，HPV58型以及β-globin相应的ASPE引物贮存液2ul于1.5ml微量离心管中，加入182ul的ddH2O补至200ul，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反
应的体系如下：

[0082] 10×缓冲液 2ul

[0083] MgCl2 3ul

[0084] Biotin-dCTP 5uM

[0085] dATP、dGTP、dTTP 各5uM

[0086] Tsp酶 0.5ul

[0087] 混合的ASPE引物工作液 2ul

[0088] PCR扩增产物 5ul

[0089] ddH2O 4ul

[0090] 共 20ul

[0091] 六、杂交反应

[0092] 1.根据设计的HPV型特异的ASPE引物以及β-globin的ASPE引物，选择相应的5
最优的9种FlexMAP微球(微球浓度均为2.5×10 个/ml)。每种微球分别带有不同颜色
编码，同时每种微球表面分别连接有一段24bp的特异性的寡核苷酸序列(anti-tag)，这些anti-tag序列能分别与对应的ASPE引物5’端的tag序列特异结合；本实施例每组样品检
测中都分别选择LUA60，LUA05，LUA36，LUA18，LUA32，LUA35，LUA46，LUA11，LUA67共9种微球；

[0093] 2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；

[0094] 3.微球于≥8000g离心1-2min；

[0095] 4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡漩震荡约20s，超声处理约20s；

[0096] 5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，空白孔加25ul的dH2O；

[0097] 6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH2O补足至50ul；

[0098] 7.用锡箔纸包住96孔板以避光，96℃90s，37℃30min孵育杂交；

[0099] 8.杂交后的微球于≥2250g离心3min；

[0100] 9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；

[0101] 10.微球于≥2250g离心3min；

[0102] 11.重复步骤9-10一次；

[0103] 12.将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链酶亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；

[0104] 13.37℃孵育15min；

[0105] 七、结果检测与数据分析

[0106] 反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测，Luminex仪器检测，红色激光检测微球的荧光编号，从而确定HPV的型别，绿色激光检测报告分子的荧光信号，从而确定各型别DNA片段的浓度。

[0107] 检测结果如表3和表4所示。

[0108] 实验结果表明，对于对应的HPV亚型，该样品的荧光值(MFI)都是最高的，要比其他型别ASPE特异性引物检测的MFI值高出250倍以上。以阴性对照的MFI值为标准，各种型别检测的MFI值除以阴性对照的MFI值得出一个比值R作为阳性判定值(cut-off值)。
高于cut-off值就视为该型的感染。以测序法检测与分型结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率(除去两个混合感染的样本，即样本号5和13，因为测序法分型技术本身存在缺陷，对于混合型感染，在测序过程中将遇到杂峰图形，因此无法准确地进行HPV混合型感染的判断)。以R≥200作为cut-off值，本方法检测20份样本的HPV分
型结果与测序结果吻合率达到100％；以R≥100作为cut-off值，本方法检测20份样本
的HPV分型结果与测序结果的吻合率仍为100％，以R≥50作为cut-off值，检测结果的吻
合率还是100％，可见本发明所提供的人乳头瘤病毒检测与分型液相芯片能够对HPV进行
准确的分型，且结果稳定可靠。而现有的HPV检测与分型液相芯片由于采用探针末端标上一个生物素的方法，因此荧光信号值比较低(MFI值通常在1000左右)，信噪比相对较差；
对于一些假阳性样本及混合感染型样本无法准确地进行判断，同时增加了分析结果判断过程中的主观因素。采用本发明的方法，则能够有效克服这些缺点，大大提高分型结果的可靠性。

[0109] 表3样本检测结果(MFI值)

[0110]

[0111] 表4、样本分型结果

[0112]样本号 测序分型结果 液相芯片分型结果
1 HPV06单型 HPV06单型
2 HPV16单型 HPV16单型
3 HPV16单型 HPV16单型
4 HPV52单型 HPV52单型
5 HPV06&？？混合型 HPV06&HPV18混合型
6 HPV18单型 HPV18单型
7 HPV11单型 HPV11单型
8 HPV11单型 HPV11单型
9 HPV06单型 HPV06单型
10 HPV18单型 HPV18单型
11 HPV18单型 HPV18单型
12 HPV11单型 HPV11单型
13 HPV11&？？混合型 HPV11&HPV16&HPV18混合型
14 HPV11单型 HPV11单型
15 HPV16单型 HPV16单型
16 HPV06单型 HPV06单型
17 HPV18单型 HPV18单型
18 HPV58单型 HPV58单型
19 HPV16单型 HPV16单型
20
HPV11单型 HPV11单型

[0113] 序列表

[0114] <110>广州益善生物技术有限公司

[0115] <120>乳头瘤病毒检测与分型方法及其液相芯片

[0116] <160>51

[0117] <170>PatentIn version 3.1

[0118] <210>1

[0119] <211>43

[0120] <212>DNA

[0121] <213>人工序列

[0122] <400>1

[0123] aatctacaaa tccaataatc tcattccgta actacatctt cca 43

[0124] <210>2

[0125] <211>44

[0126] <212>DNA

[0127] <213>人工序列

[0128] <400>2

[0129] caattcaaat cacaataatc aatctctgtg tctaaatctg ctac 44

[0130] <210>3

[0131] <211>42

[0132] <212>DNA

[0133] <213>人工序列

[0134] <400>3

[0135] caattcattt cattcacaat caattaccta cgacatgggg ag 42

[0136] <210>4

[0137] <211>43<212>DNA

[0138] <213>人工序列

[0139] <400>4

[0140] tcaacaatct tttacaatca aatctgcttc tacacagtct cct 43

[0141] <210>5

[0142] <211>44

[0143] <212>DNA

[0144] <213>人工序列

[0145] <400>5

[0146] tatatacact tctcaataac taacgcaatt gcaaacagtg atac 44

[0147] <210>6

[0148] <211>44

[0149] <212>DNA

[0150] <213>人工序列

[0151] <400>6

[0152] attattcact tcaaactaat ctactgcaca caagtaacta gtga 44

[0153] <210>7

[0154] <211>43

[0155] <212>DNA

[0156] <213>人工序列

[0157] <400>7

[0158] caatttcatc attcattcat ttcactgctg tgtcttctag tga 43

[0159] <210>8

[0160] <211>45

[0161] <212>DNA

[0162] <213>人工序列

[0163] <400>8

[0164] taatcttcta tatcaacatc ttactacatt atctacctct ataga 45

[0165] <210>9

[0166] <211>43

[0167] <212>DNA

[0168] <213>人工序列

[0169] <400>9

[0170] ttcaatcatt caaatctcaa ctttgccact gcaacatctg gtg 43

[0171] <210>10

[0172] <211>42

[0173] <212>DNA

[0174] <213>人工序列

[0175] <400>10

[0176] cttttacaat acttcaatac aatctctact gaccctactg tg 42

[0177] <210>11

[0178] <211>19

[0179] <212>DNA

[0180] <213>人工序列

[0181] <400>11

[0182] ctacaaacaa acaaacatta tcaatactag tgaacaatat aagca 45

[0183] <210>12

[0184] <211>45

[0185] <212>DNA

[0186] <213>人工序列

[0187] <400>12

[0188] tcaattacct tttcaataca atactaattt aacattatgt gcctc 45

[0189] <210>13

[0190] <211>41

[0191] <212>DNA

[0192] <213>人工序列

[0193] <400>13

[0194] aatccttttt actcaattca atcatgctgc ggtttcccca a 41

[0195] <210>14

[0196] <211>42

[0197] <212>DNA

[0198] <213>人工序列

[0199] <400>14

[0200] tacatcaaca attcattcaa tacagaatac cttcgtcatg gc 42

[0201] <210>15

[0202] <211>45

[0203] <212>DNA

[0204] <213>人工序列

[0205] <400>15

[0206] tacacaatct tttcattaca tcatgatgca cgaaaaatta atcag 45

[0207] <210>16

[0208] <211>44

[0209] <212>DNA

[0210] <213>人工序列

[0211] <400>16

[0212] tacaaatcat caatcacttt aatctatgca ctgaagtaac taag 44

[0213] <210>17

[0214] <211>43

[0215] <212>DNA

[0216] <213>人工序列

[0217] <400>17

[0218] ctactaattc attaacatta ctacagaata tgccagacat gtg 43

[0219] <210>18

[0220] <211>46

[0221] <212>DNA

[0222] <213>人工序列

[0223] <400>18

[0224] tacactttct ttctttcttt ctttcgtgaa atcaatcaat accttc 46

[0225] <210>19

[0226] <211>43

[0227] <212>DNA

[0228] <213>人工序列

[0229] <400>19

[0230] ttactacaca atatactcat caatctgaat cagctgtacc aaa 43

[0231] <210>20

[0232] <211>43

[0233] <212>DNA

[0234] <213>人工序列

[0235] <400>20

[0236] ctacttcata tactttatac tacatttaca ttgtctgcct gca 43

[0237] <210>21

[0238] <211>45

[0239] <212>DNA

[0240] <213>人工序列

[0241] <400>21

[0242] caatatacca atatcatcat ttacgtatgc caactctaat tttaa 45

[0243] <210>22

[0244] <211>46

[0245] <212>DNA

[0246] <213>人工序列

[0247] <400>22

[0248] ctttatcaat acatactaca atcaactcca acaaacttta agcagt 46

[0249] <210>23

[0250] <211>43

[0251] <212>DNA

[0252] <213>人工序列

[0253] <400>23

[0254] tcatttactc aacaattaca aatcccctga cttttatgcc cag 43

[0255] <210>24

[0256] <211>20

[0257] <212>DNA

[0258] <213>人工序列

[0259] <400>24

[0260] cgttaggtcg gagcttgatc 20

[0261] <210>25

[0262] <211>24

[0263] <212>DNA

[0264] <213>人工序列

[0265] <400>25

[0266] atgagattat tggatttgta gatt 24

[0267] <210>26

[0268] <211>24

[0269] <212>DNA

[0270] <213>人工序列

[0271] <400>26

[0272] gattgattat tgtgatttga attg 24

[0273] <210>27

[0274] <211>24

[0275] <212>DNA

[0276] <213>人工序列

[0277] <400>27

[0278] attgattgtg aatgaaatga attg 24

[0279] <210>28

[0280] <211>24

[0281] <212>DNA

[0282] <213>人工序列

[0283] <400>28

[0284] gatttgattg taaaagattg ttga 24

[0285] <210>29

[0286] <211>24

[0287] <212>DNA

[0288] <213>人工序列

[0289] <400>29

[0290] gttagttatt gagaagtgta tata 24

[0291] <210>30

[0292] <211>24

[0293] <212>DNA

[0294] <213>人工序列

[0295] <400>30

[0296] gtagattagt ttgaagtgaa taat 24

[0297] <210>31

[0298] <211>24

[0299] <212>DNA

[0300] <213>人工序列

[0301] <400>31

[0302] tgaaatgaat gaatgatgaa attg 24

[0303] <210>32

[0304] <211>24

[0305] <212>DNA

[0306] <213>人工序列

[0307] <400>32

[0308] gtaagatgtt gatatagaag atta 24

[0309] <210>33

[0310] <211>24

[0311] <212>DNA

[0312] <213>人工序列

[0313] <400>33

[0314] aaagttgaga tttgaatgat tgaa 24

[0315] <210>34

[0316] <211>24

[0317] <212>DNA

[0318] <213>人工序列

[0319] <400>34

[0320] gattgtattg aagtattgta aaag 24

[0321] <210>35

[0322] <211>24

[0323] <212>DNA

[0324] <213>人工序列

[0325] <400>35

[0326] ttgataatgt ttgtttgttt gtag 24

[0327] <210>36

[0328] <211>24

[0329] <212>DNA

[0330] <213>人工序列

[0331] <400>36

[0332] gtattgtatt gaaaaggtaa ttga 24

[0333] <210>37

[0334] <211>24

[0335] <212>DNA

[0336] <213>人工序列

[0337] <400>37

[0338] tgattgaatt gagtaaaaag gatt 24

[0339] <210>38

[0340] <211>24

[0341] <212>DNA

[0342] <213>人工序列

[0343] <400>38

[0344] tgtattgaat gaattgttga tgta 24

[0345] <210>39

[0346] <211>24

[0347] <212>DNA

[0348] <213>人工序列

[0349] <400>39

[0350] atgatgtaat gaaaagattg tgta 24

[0351] <210>40

[0352] <211>24

[0353] <212>DNA

[0354] <213>人工序列

[0355] <400>40

[0356] gattaaagtg attgatgatt tgta 24

[0357] <210>41

[0358] <211>24

[0359] <212>DNA

[0360] <213>人工序列

[0361] <400>41

[0362] gtagtaatgt taatgaatta gtag 24

[0363] <210>42

[0364] <211>24

[0365] <212>DNA

[0366] <213>人工序列

[0367] <400>42

[0368] aaagaaagaa agaaagaaag tgta 24

[0369] <210>43

[0370] <211>24

[0371] <212>DNA

[0372] <213>人工序列

[0373] <400>43

[0374] attgatgagt atattgtgta gtaa 24

[0375] <210>44

[0376] <211>24

[0377] <212>DNA

[0378] <213>人工序列

[0379] <400>44

[0380] tgtagtataa agtatatgaa gtag 24

[0381] <210>45

[0382] <211>24

[0383] <212>DNA

[0384] <213>人工序列

[0385] <400>45

[0386] gtaaatgatg atattggtat attg 24

[0387] <210>46

[0388] <211>24

[0389] <212>DNA

[0390] <213>人工序列

[0391] <400>46

[0392] tgattgtagt atgtattgat aaag 24

[0393] <210>47

[0394] <211>24

[0395] <212>DNA

[0396] <213>人工序列

[0397] <400>47

[0398] gatttgtaat tgttgagtaa atga 24

[0399] <210>48

[0400] <211>20

[0401] <212>DNA

[0402] <213>人工序列

[0403] <400>48

[0404] tttgttactg tggtagatac 20

[0405] <210>49

[0406] <211>20

[0407] <212>DNA

[0408] <213>人工序列

[0409] <400>49

[0410] gaaaaataaa ctgtaaatca 20

[0411] <210>50

[0412] <211>20

[0413] <212>DNA

[0414] <213>人工序列

[0415] <400>50

[0416] acacaactgt gttcactagc 20

[0417] <210>51

[0418] <211>20

[0419] <212>DNA

[0420] <213>人工序列

[0421] <400>51

[0422] gaaacccaag agtcttctct 20