可用来抵御并治疗HIV感染的去免疫化单克隆抗体

摘要

本发明涉及去免疫化抗体，所述去免疫化抗体是作为治疗人免疫缺陷病毒(HIV)和CD4-引起的自身免疫紊乱的有效免疫治疗药物。更确切地说，被如下抗体：含有重组基因B4DIVHv1/VK1CHO#7的7号克隆、含有重组基因B4DIVHv1/VK1#16的16号克隆以及含有重组基因B4DIVHv1/VK1#21的21号克隆所表达的抗体是来自于小鼠B4单克隆抗体(mAb B4)。这些抗体是通过去除可以被人免疫系统识别的特定鼠源决定簇而得到的。这些重组抗体是通过对小鼠单克隆抗体(mAb)B4 Fv区域的拼接和去免疫化得到的。为了提高抗体的安全性，编码序列可以进一步突变后得到去糖基化的IgG1抗体，从而无法与补体结合。去免疫化抗体保留了鼠源mAb B4抗体对于宿主T细胞表面含有CD4的受体复合物的特异性，并且保留了mAb B4抗体中和原代HIV分离物的特殊能力。

权利要求

1.一种重组宿主细胞，分泌去免疫化单克隆抗体，其特征在于，编码所述抗体的Fv抗体重链段的核酸是选自SEQ ID NOS：12-15之一；编码所述抗体的Fv抗体轻链段的核酸是选自SEQ ID NOS：16-18之一；编码所述抗体的六个互补决定区的核酸是SEQ IDNOS：19，

21，23，25，27和29；并且编码所述抗体的恒定区的核酸是人IgG恒定区的核酸。

2.如权利要求1所述的重组宿主细胞，其中，人IgG恒定区的重链Fc的核酸第297位Asn的密码子AAC被His密码子CAC代替从而被N-去糖基化。

说明书

可用来抵御并治疗HIV感染的去免疫化单克隆抗体

[0001] 本申请是基于以下中国专利申请的分案申请：

[0002] 原案申请日：2003年11月10日

[0003] 原案申请号：2003801087712(PCT/US2003/035758)

[0004] 原案申请名称：可用来抵御并治疗HIV感染的去免疫化单克隆抗体

技术领域

[0005] 本发明涉及去免疫化抗体，是作为治疗人类获得性免疫缺陷病毒(HIV)和CD4-引起的自身免疫紊乱的有效免疫治疗药物。

背景技术

[0006] 从发现HIV是机体获得性免疫功能缺乏综合症(AIDS)的致病源到现在已有20年，从克隆AIDS病毒并着手揭示它的各种特性开始，到现在已经有18年，尽管在这期间为了研制出有效的疫苗而进行了大量的科学研究，但是HIV的免疫治疗仍然存在着许多困难。这些困难主要包括：1型HIV病毒(主要的HIV病毒类型)的高变异性，HIV病毒传播途径和方式的多样化以及缺少针对HIV病毒的免疫应答的了解。

[0007] 摩尔等人的综述[1]报导，针对各种抗原决定簇的抗体只对自身同源病毒具有抑制活性，并分离密切相关的包膜蛋白。此外，识别包膜蛋白的保守区域越多的单克隆抗体，其潜在的免疫治疗靶向性越好，它们绝大多数不会很强地抑制多种主要的分离物。如何获得大量抗病毒抗体显得如此高深莫测，以至于针对HIV的疫苗学领域主要集中于一些可以提供针对该疾病的方法，最好提供一种希望[2]。

[0008] 原代HIV-1分离物是从限制性培养的患者外周血液单核细胞(PBMCs)或者含有未被感染的PBMCs患者血浆中获得的。它们非常类似于可以感染人的HIV野生病毒株[3]。原代分离物很容易和一般实验室常用的T-热带病毒区分开来，例如IIIb/LAI，SF2和MN，这些病毒已经得到繁殖，非常适合在人的T淋巴细胞系中生长。

[0009] 首先，大多数的HIV-1的原代分离物属于M热带病毒。它们在培养的T细胞系中不易生长，但是它们是单核细胞或者巨噬细胞，能够感染原代T细胞[4]。其次，原代分离物可以有效抵制各种可溶形式的受体蛋白CD4(rsCD4)重组造成的体外中和作用，而且，相对于中和作用而言，它需要的rsCD4的量要比实验室使用的品系多200到2700倍[5]。第三，原代分离物也可以抵制由gp120疫苗引起的抗体中和反应[6]。

[0010] 原代分离物包括在PBMC培养下的多核体诱导的分离物(SI)和非多核体诱导(NSI)的分离物。大多数SI原代分离物可以在HIV高敏性的MT2T细胞系中复制，但是很少能够在转化率不高的T细胞系中复制，比如通常用来培养实验室适用分离物的CEM或H9细胞系。非多核细胞诱导(NSI)的原代分离物只能在来自外周血液的原代T细胞中培养。

[0011] 早期错误的观点乐观地认为抗体可以对重组HIV-1包裹亚基疫苗产生有效的应答(比如gp120和gp160疫苗产物)，利用包裹依赖性疫苗对接种者血清进行临床实验，发现他们的血清能够在体外中和实验室HIV-1分离物[7，8]。当时，实验室适用的分离物和原代分离物之间的本质差异并不是很清楚，当发现接种者血清中的抗体大多无法有效地抑制HIV-1原始患者病毒分离物后，这种乐观的观点开始动摇[6，9]。

[0012] 早期的疫苗诱导有效抗体的乐观看法错误地来源于对猿类免疫缺乏病毒(SIV)灭活病毒预备物的研究。由于HIV-1和SIV两者在形态、遗传结构、感染及病变过程上的相似，感染SIV的恒河猴似乎可以被用作开发不同AIDS疫苗和抗HIV抗体的出色的模型。对于SIV模型的早期研究表明，在人T细胞上生长并且在辅助因子帮助下表达的SIV病毒的非活性预备物，能够使得接种各种高感染致病剂量的人细胞成熟SIV病毒的短尾猿免于感染[10]，出乎意料的是，将这种从同类猴细胞中培养出来的SIV病毒储液再次感染已经被免疫过的动物时，这种保护竟然消失了。

[0013] 稍后利用猴细胞成熟的SIV病毒和未感染的人细胞进行的研究表明，对于防止SIV感染的早期研究发现，可能是由于激发了对于异基因宿主细胞蛋白的免疫应答，而不是产生了对于病毒编码产生抗原的应答[11]。SIV被动免疫试验表明，一些针对细胞的抗体有可能引起在缺少细胞介导免疫的情况下对于SIV感染的保护作用[12]。

[0014] 针对细胞抗体提供对恢复性病毒感染的保护性免疫的机制仍然没有弄清。这种保护的一种模式可能是通过阻断一些免疫缺陷病毒在免疫细胞上的CD4结合位点来介导的。一直以来被人所知，抗CD4单克隆抗体防止感染，是通过依赖CD4的表面抗原决定部位的方式来实现的，而不是针对特定的病毒[13，14]。可以识别CD42区的单克隆抗体5A8，对于SIV感染的短尾猿具有一定的免疫功效[15]。抗CD4的单克隆抗体Leu3A和P1，能够识别在CD4区中类似CDR2的环结构，从而能够防止培养中的原代分离物的感染[5，14]。

[0015] 抗CD4的抗体可以抑制SI和NSI品系HIV1病毒的病毒到细胞或感染细胞到未感染细胞的转移[16]。宿主T细胞表面具有与CD4相关联的宿主细胞抗原复合体，它可以帮助病毒结合进入细胞，也可以作为保护性抗细胞抗体的作用靶位[17，18]。

[0016] 鼠单克隆抗体B4(mAb B4)[17，18]是一个使用CD4表达T淋巴细胞作为免疫原而发展起来的抗细胞抗体，其中T淋巴细胞有例如外周血液单核T细胞、胸腺细胞、脾细胞以及白血病或淋巴瘤分化来的T细胞系，如HPB-ALL或SUP-T1。MAb B4在体内和体外都具有抑制HIV-1和相关免疫缺陷病毒的原代分离物活性。特别地，mAb B4能够阻止HIV和CD4+宿主细胞的相互结合。它是一种入口抑制剂，一种新的治疗HIV的感染的抗回复病毒的类型，同时提供了一种具有潜力的高活力抗回复病毒治疗(HAART)的正交疗法。

[0017] MAb B4可以直接针对宿主细胞表面抗原复合体，该复合体包含与化学激活受体领域相关联的CD4蛋白，MAb B4通过结合区1中类似CDR2环的CD4外周区域结合位点来识别CD4，这与Leu3A的结合位点并不一致。美国专利No.5,912,176强有力地表明B4抗体可以广泛地抑制HIV-1所有进化分枝病毒的原代分离物、HIV-2的原代分离物以及SIV病毒的活性。而当各种针对细胞表面抗原的特异性抗体混合使用时，只有那些含有mAb B4的混合抗体显示出强烈的抑制HIV-1B分枝病毒的原代分离物活性(24卷，1-10行；47卷，5-10行)。此外，在针对HIV-2原代分离物(如HIV-2ROD)和SIV株系的中和作用检测中，尽管无法与抗N端V3MN抗体先前对于实验室适用的HIV-1MN的效果相比，mAb

[0018] B4还是可以对所有株系表现出强烈的抑制作用(45卷，19-35行)。

[0019] 另有研究证明在小鼠、猩猩和恒河猴体内，mAb B4均可与HIV-1、HIV-2的原代分离物以及SIV发生有效的抑制活性。例如，在病毒感染后，服用mAb B4可以阻断外周白细胞(PBL)急性结合的HIV-1感染小鼠造成免疫缺陷的过程[18]。同样，在猩猩体内，服用mAb B4也可以完全阻断HIV-1对于猩猩的感染[18]。此外，一定剂量的SIVmac251可以持久地感染恒河猴，而使用适量(4mg/kg)的mAb B4后，诱导产生的被动免疫可以使得75％的猴子不受SIV原代分离物的感染(美国专利No.5,912,176，50卷，15-22行)。

[0020] CD4作为HIV感染的受体预示着只要没有不适的免疫反应，CD4分子就可以作为抗细胞抗体mAb B4进行免疫治疗的很好靶位。

[0021] 但是，人体对鼠源抗体产生免疫排斥，会限制鼠源单克隆抗体如mAb B4在人体内进行治疗或诊断中的应用。在患者体内形成的“HAMA”(人抗鼠抗体)反应会影响鼠源抗体到达特异性抗原靶位，从而降低了这些抗体的疗效。

[0022] 抗体人源化技术可以降低HAMA反应。例如，鼠抗可以被改造成拼接的鼠/人抗体，其中编码产生小鼠免疫球蛋白的可变区整个DNA可以同编码人免疫球蛋白恒定区的DNA相拼接，表达这种抗体[19]。通过互补决定区(CDR)的拼接，小鼠DNA序列能够更好的人源化。通过删除大鼠重链和轻链可变区编码六个CDR的序列，并与人的重链和轻链的结构序列拼接，就完成了对大鼠Fv区域的改造，从而可以应用于人的临床治疗。改造过后的可变区序列就能与人的恒定区进行组装[20]。

[0023] 但是，经过拼接和嫁接的抗体仍然具有鼠源的可变区或CDR区域，所以仍有可能具有免疫原性。而且，CDR与不相关的结构嫁接会降低其与人源化抗体的亲和性。因此，将鼠源单克隆抗体人源化需要采用同源序列并进行分子模型化改造，才能够更具实用性。这些方法是用来为鼠源CDR筛选出更加同源的人的结构序列，从而能够保持较高的亲和力，降低鼠源残基的暴露[21]。

[0024] 既然使鼠源抗体人源化是为了降低其在人体内的免疫原性，那么去免疫也是一种有用的可选途径。去免疫化可以通过去除那些可能在人体内产生免疫原性的啮齿类抗体可变区的抗原决定基，来降低抗体在人体内的免疫原性。

[0025] 在实际操作中，对抗治疗性抗体的一种有效原始免疫应答包括：对于外来蛋白的处理、依赖MHC II型分子(T细胞抗原决定簇)的抗原肽的递呈以及辅助T细胞的激活。这些辅助T细胞激发并增强B细胞的与治疗抗体结合的抗体的表达产生。此外，如果治疗性抗体(B细胞抗原决定簇)内的一个或多个序列在一定的细胞因子作用下与未成熟B细胞表面免疫球蛋白(sIg)结合，B细胞能够被刺激分化增殖，提供出各种可溶形式的原始sIg，这些sIg可以与治疗性抗体形成复合体而限制其活性，并使之从患者体内被清除。所以为了避免对治疗性的mAb产生原始免疫应答，B细胞和T细胞在抗体内的抗原决定簇必须被去除或修饰。

[0026] 如果没有B细胞或T细胞应答，对于治疗性抗体的原始免疫应答可能会减弱或消失。由Biovation公司(阿伯丁，英国)[22，23]开发的去免疫化 技术主要是去除潜在免疫原性的B细胞和T细胞的抗原决定簇。mAb B4的去免疫化的发明就是应用了这种方法。去除B细胞表面抗原决定簇是使用一定的氨基酸来镶饰其表面的一些残基[24]。也成功的去除T细胞表面的抗原决定簇，对于这些决定簇的识别，是通过三维“肽链线化”方法呈现MHCII型分子结合域，分析出治疗性抗体可变区域的序列，然后从中找到抗原决定簇的[25]。最后的去免疫化抗体是通过化学方法将鼠源抗体的恒定区用人抗体恒定区域来代替完成的[19]。

[0027] 在人的被动免疫治疗中，人源化或去免疫化的抗体将会在HIV感染的治疗中发挥重要的作用。我们知道人的抗HIV单克隆抗体2F5和2G12能够中和HIV的原代分离物，并且已经被用来研究感染了HIV的人。同时也观察到病毒负载的短期降低以及CD4+T细胞的短期增加[26]。这些抗体也被用来在非人灵长类模型中研究对于母代向子代传染的免疫预防。无论这些抗体是在出生前通过静脉灌输进入胎盘、母体还是直接在出生后注入恒河猴婴儿，这些恒河猴婴儿能够抵御猴/人免疫缺陷型病毒(SHIV)的感染。作者认为利用重组的抗病毒单克隆抗体进行免疫预防来阻止母代HIV在人类中传播是很有前景的方法[27]。被动免疫也被提议用于偶然性感染HIV后的快速预防治疗[16，18]。

[0028] 既然一定的CD4特异性单克隆抗体能够有效地干扰HIV-1原代分离物的对于淋巴细胞和巨噬细胞的感染，并且比中和性抗HIV抗体作用更加广泛[5，18，28]，像mAb B4这样通过受体介导的定向单克隆抗体可能更适合于作为HIV的预防以及对于HIV感染的治疗。出于这种目的，通过CDR嫁接的方法，已经将单克隆抗体5A8(mAb 5A8)改造成为人源化的IgG4抗体[28]。作为IgG4的异构形式，人源化的mAb 5A8在辅助固定作用的CH2区域缺少了一个糖基化位点。这一特征有助于提高相似抗体的安全性，尽可能减少患者体内CD4+淋巴细胞的损失。人源化的5A8已经进入了对HIV感染患者进行的临床试验期[29]。

[0029] 除此之外，抗CD4的单克隆抗体已经在人风湿性关节炎的治疗中取得了良好的临床效果[30]。人单克隆抗体HuMax-CD4已经进入了治疗风湿性关节炎和牛皮癣的临床试验期[31]。这些应用实施例证实了去免疫化抗体的潜在用途，例如那些来自B4抗体的去免疫化抗体已经成为治疗HIV和CD4引起的自身免疫紊乱疾病的免疫治疗药物。

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发明内容

[0086] 本发明涉及去免疫化的抗体，所述去免疫化的抗体来源于对AIDS和其他CD4引起的紊乱进行免疫治疗的鼠源单克隆抗体B4。本发明同样包括使用去免疫化抗体的治疗方法。

[0087] 特别地，含有重组基因B4DIVHv1/VK1#7、B4DIVHv1/VK1#16、B4DIVHv1/VK1#21的克隆#7、#16和#21表达的抗体均来自小鼠单克隆B4抗体(美国专利No.5,912176，1999+年6月15日公布)。小鼠单克隆B4抗体具有两个主要特征：特异性针对CD4T细胞上的HIV受体；在体内和体外均能抑制HIV原代分离物和相关免疫缺陷病毒[17，18]。

[0088] 去免疫化的重组抗体通过编码mAb B4的Fv片段和人IgG1Fc片段的两者的cDNA或多聚核苷酸相互融合表达出来的。这一核苷序列中的鼠源Fv区域通过直接突变去除来自小鼠的重链(VH)和κ链(Vκ)可变区处的“人以外”B细胞和T细胞抗原决定基，进行去免疫化，这样就便于在人体内开展治疗。分别用四个和三个cDNA或多聚核苷酸序列来对VH链和Vκ链进行去免疫化。去免疫化抗体还需要通过定点突变改变一个糖基化位点来加工成N-去糖基化的IgG1的形式，这样使之无法与辅助物相结合。所以，去糖基化的去免疫+化抗体无法引起限制性CD4 细胞的辅助性调节裂解。

[0089] 这些新的去免疫化抗体仍然保持原来鼠源单克隆抗体的特异性和中和活性。

[0090] 这些由NS0小鼠骨髓瘤细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达的抗体能够在无血清培养条件下大规模生产，然后用于人。这些去免疫化的抗体同样能在转基因植物中大规模生产以降低成本。本发明中的抗体可以用于HIV感染的预防、HIV的免疫治疗以及CD4引起的自身免疫紊乱，比如风湿性关节炎的免疫治疗。

附图说明

[0091] 图1：鼠源单克隆抗体B4(序列号：1和2)重链的DNA序列、氨基酸序列以及限制性内切酶图谱

[0092] 图2：鼠源单克隆抗体B4(序列号：3和4)轻链(κ)的DNA序列、氨基酸序列以及限制性内切酶图谱

[0093] 图3：含有HV插入片断的重链表达载体pSVgptHuIgG1，用于在NS0细胞中表达由mAbB4小鼠VH和人CH1融合拼接而成的IgG1重链。Ig enh是重链的增强子。

[0094] 图4：含有Vκ的插入片段的轻链表达载体pSVhygHuK。用于在NS0细胞中表达由mAb B4小鼠Vκ与人Cκ融合拼接而成的IgG轻链。Ig enh和Kappa enh是重链和κ链的增强子。

[0095] 图5：鼠源B4VH区，即B4MoVH(序列号：2)与四个去免疫化抗体的VH区，即B4DIVH v.1-v.4(序列号NOS：5-8)的氨基酸序列比对。框出的区域是与B4MoVH不同的残基位置。

[0096] 图6：鼠源B4Vκ区，即B4MoVK(序列号：4)与三个去免疫化抗体的Vκ区，即B4DIVKv.1-v.3(序列号：9-11)的氨基酸序列比对。框出的区域是与B4MoVK不同的残基位置。

[0097] 图7：鼠源B4VH区，即B4MoVH(序列号：1)与四个去免疫化抗体的VH区，即B4DIVH v.1-v.4(序列号：12-15)的核苷酸序列比对。粗体和下划线区域是与B4MoVH不同的残基位置。

[0098] 图8：鼠源B4Vκ区，即B4MoVK(序列号：3)与三个去免疫化抗体的VK区，B4DIVHv.1-v.3(序列号：16-18)的核苷酸序列比对。粗体和下划线区域是与B4MoVK不同的残基位置。

[0099] 图9：B4拼接抗体和DIVH1/VK1-3去免疫化抗体与rsCD4结合的相对亲和力。

[0100] 图10：B4拼接抗体和DIVH2/VK1-3去免疫化抗体与rsCD4结合的相对亲和力。

[0101] 图11：B4拼接抗体和DIVH3/VK1-3去免疫化抗体与rsCD4结合的相对亲和力。

[0102] 图12：dhfr基因表达载体，pSI-DHFR。

[0103] 图13：去免疫化抗体的重链表达载体，pcDNA3.1(+)Neo-DeIg1-S，其中B4DIVHv.1-与人的CH结合，用来在CHOdhfr 细胞中进行表达。

[0104] 图14：去免疫化抗体的κ链表达载体，pcDNA3.1Zeo-HuK，其中B4DIVKv.1与人的-Cκ结合，用来在CHOdhfr 细胞中进行表达。

[0105] 图 15：去 免 疫 化 抗 体 的 κ 链 和 DHFR 表 达 载 体，pSI-DHFR/-pcDNA3.1zeo-HuK(DD11N)，其中B4DIVKv.1与人的Cκ结合，用来在CHOdhfr 细胞中与dhfr进行共表达。

[0106] 图16：SDS-PAGE分析糖苷酶调节的迁移率改变，以及考马斯亮兰斑点亮度的减小。

[0107] 图17：辅助固定测试。通过学生的T-检验得到：鼠源mAb B4和去免疫化B4抗体#16、#7相比较的P值分别为0.07和0.0001。

[0108] 图18：鼠源mAb B4的CDRs以及#7、#16和#21克隆的cDNA和氨基酸序列。

具体实施方式

[0109] 鼠源mAb B4的Fv片段的去免疫化作用是通过对潜在的具有免疫原性的鼠源T细胞和B细胞的抗原决定簇的鉴定和剔除来实现的。在从治疗性抗体可变区识别出抗原决定簇后去除了T细胞的抗原决定簇。通过三维“肽链线化”方法呈现MHC II型结合域，分析出治疗性抗体可变区域的氨基酸序列[22，25]。从可变区域去除B细胞表面至少一个或者全部抗原决定簇的方法是使用一定的氨基酸来镶饰细胞表面的一些残基，这样就不会干扰抗体的识别[22，24]。用化学方法将mAb B4可变区域DNA序列和人IgG1恒定区相互拼接，用人的IgG1恒定区来代替小鼠的恒定区，从而完全去除了鼠源抗体的恒定区(CH andCκ)。

[0110] 下面的实施例1详细描述了编码鼠源mAb B4重链和轻链可变区域的DNA的序列、复原及克隆。图1显示了鼠源B4抗体VH的DNA和氨基酸序列。图2显示了鼠源B4抗体Vκ的DNA和氨基酸序列。参照其他抗体的序列，确定了CDR在两条链上的位置[32]。B4的VH和Vκ两条链分别与小鼠重链亚型V(B)和Kappa链亚型III相对应[32]。如实施例2所述，如果希望的话，可以得到包含人全部恒定区和小鼠全部可变区的中间状态的合成抗体。通过将得到的合成抗体和重组可溶性CD4(rsCD4)相互结合可以证实得到了正确的可变区。

[0111] 编码鼠源B4VH和Vκ的cDNA或多聚核苷酸序列与人种系VH[33]和Vκ[34]的序列以及人种系J区域序列相近[35]。带有人JH6的DP14、B1以及人Jκ2被挑选出来分别作为B4VH、B4Vκ和J区域序列的人源结构框架参照。

[0112] 在特定的人结构框架序列参照确定后，B4的VH和Vκ框架内某些编码与参照序列不同的氨基酸残基的核苷酸序列被相应的改造为与人源参照序列相一致。对于抗体的结构与结合至关重要的氨基酸在这一过程中保持不变。在图18中列举了可识别B4VH和Vκ互补决定区(CDR)的序列，编号为：20、22、24、26、28和30。CDR残基以及CDR附近紧靠的框架结构，如N端的结构性区域仍然得以保留[24]。其他在这一阶段保留下来的鼠源残基主要是非表面的内部残基。

[0113] 通过这一过程得到的抗体非常类似于一种“镶饰”的抗体，其表面残基主要是人源序列，而包裹在内部的残基主要是最初的鼠源序列。把这些序列进行多肽线化处理，通过分析它们与人的18种不同的MHC II型同种异型抗免疫球蛋白的结合情况来鉴别潜在的T细胞抗原决定簇。初级去免疫化的VH和Vκ的序列已经被定义(B4DIVHv.1，B4DIVKv.1)。由于生产初级去免疫化序列需要少量的核苷酸序列替代物，这些替代物可能会影响去免疫分子的结合作用，所以设计了其它3种不同的VHs以及2种不同的Vκs。图5和图6分别列出了鼠源和去免疫化VH和Vκ区的氨基酸序列。图7和图8分别列出了鼠源和去免疫化的VH和Vκ区的核苷酸序列。

[0114] 实施例3详细叙述了构建包括5’端序列、先导信号肽、先导内含子和鼠源免疫球蛋白启动子、3’端序列、剪切位点和内含子序列在内的去免疫化抗体的可变区的核苷酸序列。

[0115] 一旦去免疫化抗体的重、轻链可变区基因构建好，就被转入带有人IgG1的CH或Cκ区的表达载体中。载体中还带有哺乳动物细胞(图3和图4)的筛选标记。重组的载体随后被转入NS0细胞中。然后将表达产生的去免疫化抗体从培养基中纯化出来，检测它和rsCD4的结合能力以及对HIV-1的中和活性。

[0116] 通过ELISA分析可知12个不同的mAb B4表现出与rsCD4具有不同的亲和性。这12个B4去免疫化抗体对HIV-1MNA、B、C、D、E亚基的SI原代分离物和采用MT-2微斑法从T细胞系中分离的HIV-1MN也表现出不同的中和能力[36]。比较四个重链的变异体(VHv.1-4)发现它们都能与去免疫化的κ链1(VKv.1)相结合；这表明带有重链1的抗体具有很高的中和所有HIV-1原代分离物的活性，而且活性接近于鼠源mAb B4对于HIV-1VL135、HIV-1UG029和HIV-1TH036的中和活性(表1)。

[0117] 去免疫化的B4抗体无法像鼠源亲代抗体那样有效抑制T细胞系适应的HIV-1MN病毒。去免疫化抗体含有2型或3型κ链，具有类似或稍低的中和活性(表2)。比较12个不同mAbB4，表明具有DIVHv.1重链以及IVKv.1链的抗体拥有较高的中和所有HIV-1原代分离物的活性，并接近于鼠源mAb B4对HIV-1的中和活性。

[0118] 任何合适的表达系统都可以生产去免疫化的B4单克隆抗体，其中包括真核细胞系统，如动物细胞(哺乳动物细胞系)、植物细胞。不过最好在哺乳动物细胞中表达，如NSO或CHO细胞。NSO是不产生免疫球蛋白的小鼠骨髓瘤细胞，可以从英国Porton的欧洲动物细胞培养库(European Collection of Animal Cell Culture，Porton UK(ECACC 85110505-号))中获得。二氢叶酸还原酶缺陷型的CHO细胞(CHOdfhr)可从美国模式细胞培养库(American TypeCulture Collection(ATCC no.CRL-9096))中获得。

[0119] 对于需要高表达的重组抗体，二氢叶酸还原酶缺陷型的CHO细胞是一种被广泛用于基因扩增的哺乳动物表达系统。这种细胞的生产效率随着基因拷贝数的增加而提高，并6
且生产效率可达到每天每10 个细胞能产生100μg特异性抗体[42]。

[0120] 同时，常用的启动子也被用于哺乳动物细胞中的表达，例如，带有人细胞巨化病毒早期启动子的病毒表达系统较为常用[37]，其它的适合基因表达的启动子也能在哺乳动物细胞中使用。这些启动子包括来自病毒的启动子，如逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒和猿病毒40(SV40)；或者哺乳动物细胞中的启动子，如人延伸因子1α启动子[38，39]。免疫球蛋白的启动子可被用于类似NS0细胞的淋巴细胞。实施例2叙述了如何设计构建含有Ig启动子、前导信号肽、前导内含子、剪切位点、内含子序列和适用于接入任何可变插入区域限制性酶切位点的载体。通过ELISA和生物活度测定方法，在NS0细胞中可以方便地筛选出表达的去免疫化抗体。

[0121] 重组蛋白在哺乳动物细胞中高水平的表达可以通过扩增转染的DNA进而筛选出稳定细胞株来获得。重组基因可以在DNA扩增过程中与筛选标记物一起扩增，因而-CHOdhfr 细胞和可扩增的筛选标记二氢叶酸还原酶基因(DHFR)可以用来建立稳定细胞系，来生产大量可用于临床的表达产物[40]。同样，谷氨酸合成酶(GS)基因也可以用来作为筛选标记物。由于内源性GS在骨髓瘤和杂交瘤细胞系中没有足够的活性，这些细胞系需要谷氨酸才能存活。转入细胞的GS基因能够使得细胞在缺少谷氨酸的培养基中正常生长。较-
为适合的是，CHOdfhr 细胞可以表达B4去免疫化抗体，并且dhfr又可以作为筛选和扩增的标记物。

[0122] 实施例5描述了如何在CHOdhfr-细胞中构建表达抗体以及DHFR的质粒。逐步增加氨甲叶酸(MTX)的浓度，可以增强DHFR和抗体基因的扩增，表达出大量的去免疫化的B4抗体[42]。

[0123] 逐步提高培养基中氨甲叶酸的含量，经过几轮的筛选，可以使得重组CHO细胞(rCHO)产生特异性抗体的产率达到10-30pg/细胞/天。

[0124] 尽管去免疫化抗体在哺乳动物细胞，如NS0或CHO细胞，可以有效的表达，但是为了降低大规模生产的成本，也可以使用转基因植物。见实施例10。

[0125] 所有的抗体均属于糖蛋白。IgG1在CH2区域中含有N端结合糖的双触角复合物[43]。这种糖类物质的存在对于作用因子行使功能具有重要作用，比如参与补体结合，以及可以消灭靶细胞的抗原依赖性的细胞毒素降解(ADCC)过程[44]。B4抗体靶向作用于CD4受体复合物，可以破坏CD4+细胞并且通过结合补体的IgG1因子的作用免疫抑制CD4+细胞的功能。因此，N端去糖基化的去免疫B4单克隆抗体与N端糖基化的IgG1抗体相比，对于CD4+细胞的破坏较少，产生较少的免疫毒副作用。通过突变去除IgG1 Fc区域的N端糖基化位点，可以破坏IgG1与人FcR1的结合，从而活化补体结合C1q[45]。

[0126] 主要有两种去糖基化的途径：用衣酶素处理生产抗体的细胞，使得糖基前体无法与天冬氨酸结合；或者通过突变使得297位的天冬酰胺变为其它的氨基酸。目前去免疫化抗体都是经过去除297位的天冬酰胺这一N端结合的糖基化位点进行修饰的。通过定点突变P

[0127] CR技术使得重链表达载体上编码297位天冬酰胺的密码子AAC变为编码组氨酸的密码子CAC；然后N端去糖基化的去免疫化抗体就能在CHO细胞中表达分泌。(图16)[0128] 作为用于人的治疗性药物，去免疫化的单克隆抗体功能性与安全性特征往往需要慎重考虑。在文章中，我们估计这些抗体在体外具有以下的功能：(1)中和抑制HIV-1病毒；(2)结合补体；(3)刺激人淋巴细胞诱发免疫应答。

[0129] 来自CHO克隆的去免疫化单克隆抗体对于HIV-1的中和活力与通过MT-2微斑法检测鼠源mAb B4配对物的活性相当[36]。在表3中列出的相关研究的结果表明由21号克隆表达的去免疫化抗体DH1DK1CHO#21具有与B4杂交瘤细胞产生的鼠源抗体相当的中和活力。很显然，这些单克隆抗体必须能够对于来自HIV-1五个进化分枝(A-E)的典型病毒有50％的中和能力。与鼠源B4抗体相比，去糖基化的去免疫化抗体DH1DK1CHO#7对于来自分枝B的病毒23135，来自分枝D的病毒UG046以及来自分枝E的病毒TH036表现出增强的中和抑制能力(表3)。

[0130] 使用补体消耗方法来评测去免疫化抗体对于它的原始配对物鼠源mAb B4的补体的结合能力(实施例7)。结果表明去免疫化的B4体的补体结合能力会降低[图17]。去免疫化抗体参与的反应混合物的上层中存在着比用鼠源单抗反应更多的补体。这一结果表明，去免疫化抗体同人CD4+细胞上的CD4复合物结合并启动补体结合反应的能力要低于原始鼠源抗体结合诱发补体结合反应的能力。所以使用鼠源B4抗体反应的混合物上清中含有较少的补体去裂解激活的SRBC。这样的结果意味着在降低补体结合反应方面，去免疫化抗体DH1DK1CHO#7和DH1DK1CHO#16比鼠源mAb B4抗体更加安全；同时，与预期中的一样，N端去糖基化的去免疫化抗体有着最低的补体结合能力。

[0131] 作为用于人的治疗性药物，鼠源单克隆抗体的免疫原性会使人体产生T细胞和B细胞反应直接对抗治疗性抗体。诱导的T细胞反应可能会导致细胞分裂素的产生，从而调整人的免疫应答机制，对抗特定的感染源或肿瘤。由于鼠源抗体诱发的细胞分裂素造成的对机体的影响，可能会破坏机体的自身平衡性，干扰免疫应答机制对抗侵入的病原体或肿瘤。

[0132] 诱导的B细胞反应可能会在人体中形成人抗鼠的抗体。这将会导致形成抗原-抗体免疫复合物，并在人体其它组织中沉积，进而引起炎症反应和/或病发条件。此外，这些人抗鼠的抗体会结合治疗药物，降低药物的有效浓度，从而阻止治疗药物到达目标靶点，如CD4+细胞。

[0133] 考虑到上述情况，我们在体外，使用人的外周血液单核细胞(PBMC)的培养体系，检测了去免疫单克隆抗体和mAb B4抗体的免疫原性(见实施例8)。表4显示了研究结果。发现纯化的鼠源B4抗体可以刺激人的PBMC产生IL-10和TNF-α；而通常会由抗原激活的Th1 CD4分泌的IFN-γ和IL-2以及由Th2 CD4细胞产生的细胞分裂素IL-4并没有被检测到。

[0134] 相反，由于去免疫化抗体DH1DK1CHO#16以及去糖基化抗体DH1DK1CHO#7没有诱导人PBMC分泌检测到的5种细胞分裂素中的任何一种，因此认为它们不具有免疫原性。这一发现提高了去免疫化抗体作为治疗性药物的安全系数。

[0135] 已经建立好了便于调控而且较为经济的无血清细胞培养基。如果在细胞培养中使用动物血清，容易引入外来的抗原，如病毒和其它可以遗传的物质(如疯牛病病原体)[47]。除此之外，在大规模细胞培养的过程中使用动物血清作为原材料花费较大。总之，由于哺乳动物细胞会将产生的具有生物治疗活性的蛋白质分泌到培养基中，使用无血清的培养基能够显著地简化之后蛋白的纯化过程。

[0136] 由于rCHO具有依赖血清生长的特性，所以需要能够获得适于大规模、无血清、悬浮培养工艺流程的合适的细胞系表型。实施例6描述了如何成功地获得适于悬浮培养，并且在无血清培养基中可以表达抗体的rCHO克隆，其去免疫化抗体的产率与在含有10％胎牛血清中培养的单层细胞的产率相当。无血清悬浮培养产生的抗体对于HIV-1的中和反应的活力与在10％血清中培养的单层细胞产生的抗体中和反应活力相当。

[0137] 综上所述，这些结果有力地证明使用去免疫化抗体作为治疗性药物的功效与安全性，它可以减少HIV感染患者体内的病毒数，防止接触后的感染。

[0138] 用药方法很普通，并且已有文献出版。对于抗体的使用，包括但不局限于注射用药，或直接注射在效应处。其中注射用药也不仅局限于静脉注射、肌肉注射、腹腔注射和皮下注射。

[0139] 本发明包括以上描述的去免疫化抗体的研发过程、合适的肠胃外用药方法。用药方法包括但不局限于药用无菌等渗溶剂用药形式。这些溶剂包括用于静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射或直接注射到关节及其它部位的盐溶液和磷酸盐溶液。

[0140] 本发明提供的去免疫化抗体用于哺乳动物，特别是人的时候，抗体剂量因哺乳动物的年龄、体重、身高、性别、整体健康情况、用药史等因素的不同而有差别。

[0141] 总体上说，提供的去免疫化抗体的剂量根据哺乳动物体重，往往在1mg/kg到20mg/kg范围内，高于或低于这一范围的剂量需要根据情况而定。一般，抗体要求静脉注射(IV)或者肌肉注射(IM)。

[0142] 去免疫化抗体在用于患者时，需要有一种适合静脉注射、皮下注射或肌肉注射的用药形式。这些用药形式要包括合适的药物载体，要求无毒无治疗作用。这些药物载体包括离子交换物、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(如：人血清白蛋白)、缓冲溶液物质(如：磷酸盐)、氨基乙酸、甘露醇、山梨酸、盐酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐类或电解质类(如：硫酸精蛋白、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、氯化钠、磷酸-氢钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钠二水合物、氢氧化钠、锌盐、硅胶、三硅酸镁)、聚乙烯吡咯烷酮、以纤维素为基础的物质和聚乙二醇。去免疫化抗体在溶剂中的浓度一般在0.1mg/ml到100mg/ml。

[0143] 用药配方和药剂配制方法已有记载，见《雷明顿药物科学》[51]。

[0144] 最初使用去免疫化抗体时选择的剂量一般在1到100mg/kg，优选剂量为1到25mg/kg，进一步优选剂量为1到10mg/kg，最适剂量为2到5mg/kg；可以一次性或分开用药，也可以持续用药。对于若干天或较长时间的重复用药，依据具体情况，应该持续治疗，直到病症开始受到抑制或者患者情况开始好转。每次间断性用药往往从每周一次到六个月一次不等。最佳用药剂量、最适治疗方案以及用药频率均有详细文字记录。同样，其它去免疫化抗体的剂量均在本发明包括的范围内，不用再经过额外的实验测定了。

[0145] 在以下的实施例中，描述了本发明以及它的使用情况。这些实施例仅供说明，本发明的范围不仅仅局限于此。

[0146] 实施例1

[0147] 鼠源mAb B4抗体基因的克隆与鉴定

[0148] 1.总RNA的准备

[0149] 根据使用手册，使用Promga(MAIDSon，WT)SV40总RNA分离系统(Cat.No.Z3100)6
从5×10 个B4杂交瘤细胞中提取总RNA。

[0150] 2.编码小鼠重链可变区(VH)和轻链可变区(VK)的cDNA的扩增根据使用手册，使用GeneAmp RNA PCR Kit(Perkin Elmer，Norwalk，CT，part no.N808-0017)，合成编码VH和Vκ的单链cDNA并扩增该cDNA。

[0151] 这里对这一过程作简要描述。使用MuLV逆转录酶，以16个寡聚dT作为引物，从1μg的总RNA中合成编码小鼠重轻链的单链cDNA。反应体系在42℃放置15分钟，在99℃放置5分钟，然后在5℃放置5分钟。

[0152] 使 用 AmpliTaq DNA 聚 合 酶， 以“The mouse-specific Ig Primer Sets”(Novagen，MAIDSon，WI，cat.no.69831-1)作为扩增引物，扩增VH和Vκ的单链cDNA。反应体系首先95℃加热1分45秒，然后95℃变性15秒，60℃退火30秒，35个反应循环，最后72℃保温10分钟。扩增的cDNA经过凝胶纯化，克隆进pGm T Easy载体(Promega，cat.no.A1360)。根据插入片段的大小，通过PCR筛选出VH和Vκ克隆。

[0153] 使用双脱氧链终止法对带有预期大小的DNA插入片段的VH和Vκ克隆进行测序。。互补决定区(CDRs)的位置通过参考其它抗体序列来决定[32]。B4的VH和Vκ能够分别结合在小鼠重链V(B)亚群和小鼠kappa链III亚群[32]。图1和2分别列出VH和VκCDRs的DNA和氨基酸序列。

[0154] 实施例2

[0155] B4拼接型抗体基因的构建以及在NS0细胞中的表达

[0156] 1.拼接抗体基因的构建

[0157] B4拼接型抗体由鼠-人抗体链组成，是通过把鼠源mAb B4抗体的可变区基因与人的免疫球蛋白恒定区基因相结合，结合方式类似于Morrison等描述的方式[19]。在这种结合方式中，小鼠的全部的可变区与人的抗体的恒定区连接在一起。这种含有相同人源恒定区的拼接抗体，为检测带有去免疫化可变区的B4抗体，提供了一个有用的未去免疫化的对照。

[0158] 为了构建拼接的B4抗体，使用VH-PCR1和VK-PCR1[20]载体作为模板，在鼠源的VH和Vκ周围，引入了5’端序列、前导信号肽、前导内含子和鼠源免疫球蛋白启动子、含有剪切位点和内含子序列在内的3’端序列。#7克隆中，297位的天冬酰胺被突变为组氨酸。在#7、#16和#21克隆中，κ链98位氨基酸的密码子偶然地由GAT变为GAC。但是这两个密码子都编码天冬氨酸，所以在表达成抗体的时候没有区别。产生的鼠源HV和VJ表达结构被克隆入pUC19中，并且DNA全长序列得到了确认。

[0159] 使用HindIII和BamHI从pUC19中切下鼠源VH和VL表达结构片段，然后克隆入分别含有人的IgG1[48]和κ恒定区[49]的表达载体pSVgpt和pSVhyg[20](图3和4)中，同时载体中还含有哺乳动物细胞筛选表记。通过测序证实VH和Vκ正确插入了pSV表达载体。

[0160] 2.表达B4拼接载体的宿主细胞系

[0161] 用于抗体表达的NS0宿主细胞系是不产生免疫球蛋白的小鼠骨髓瘤细胞，它来自于欧洲动物细胞培养库(European Collection of Animal Cell Cultures，Porton UK(ECACC No.85110505))。通过电转方法将拼接的重链和轻链表达载体共转入NS0细胞。在含有10％胎牛血清、0.8μg/ml霉酚酸和250μg/ml黄嘌呤的DMEM培养基中筛选出可以表达gpt基因的克隆。

[0162] 3.通过人IgG ELISA方法检测抗体的表达

[0163] 通过ELISA方法检测人IgG的产量。方法如下：在pH 9.6的碳酸盐/碳酸氢盐包埋缓冲液(Sigma，cat.no.C3041)中，用羊抗人κ的抗体包埋ELISA微孔平板，37℃包埋1小时。然后用PBST(0.05％Tween 20溶于PBS)洗平板三次。这样就能在平板上形成可以从培养基中捕获κ链的固相免疫吸收剂。

[0164] 用转染克隆的一定条件下的细胞培养基在37℃下孵育包埋后的平板微孔1小时，吸干，用PBST洗三次。以过氧化物酶共轭的羊抗人IgGγ链特异性抗体(The Binding Site，catno.AP004)作为二抗，O型苯二胺底物(OPD)(Sigma，cat.no.P7288)作为显色物质，筛选出能够分泌人抗体的细胞系并进行了扩增。

[0165] 4.拼接抗体的生产

[0166] 能够分泌最高水平拼接抗体的转染子NS0被筛选并扩增。通过ProSep A亲和层析(Millipore Cat.No.113112722)从500ml到1000ml的静态培养基中纯化抗体。用pH 3.0的0.1M甘氨酸溶液洗脱抗体，调至中性，透析换成用PBS缓冲液。纯化的抗体粗制品进行过滤灭菌，储藏在4℃。通过IgG ELISA方法测定抗体浓度，以0.1、1、5、10ng的人IgG1作为标准参照(The Binding Site，cat.no.BP078)，。

[0167] 5.相对于鼠源抗体的拼接抗体与rsCD4的相对亲和力

[0168] 通过ELISA方法测定拼接抗体与重组可溶性CD4(rsCD4)的相对亲和力。

[0169] ELISA平板 直接用 含有0.25μg/ml 的rsCD4(American Biotechnologies，Columbia MD)的碳酸盐缓冲液(0.1M，pH 9.5)包埋，然后用PBS(含3％BSA，0.05％Tween 20)溶液封闭平板。以小鼠抗体作为阳性对照，将拼接抗体稀释成不同的浓度，以过氧化物酶共轭的山羊抗人IgG和绵羊抗鼠的抗体分别来检测拼接抗体和小鼠抗体，用OPD进行显色。

[0170] 拼接抗体和小鼠抗体在加入固相rsCD4后，在各种抗体浓度下都能检测到A492的增加。这个测试证实了经过克隆和测序的重链和轻链可变区仍然保持正确的识别位点。相对于原始小鼠抗体的A492，拼接抗体的A492显示出10倍的下降。

[0171] 实施例3

[0172] 去免疫可变区序列的设计和构建

[0173] 6.去免疫V序列的设计

[0174] 把小鼠B4VH和Vκ抗体氨基酸序列与人种系的VH[33]和Vκ[34]以及J区域序列[49]进行对比。与小鼠B4VH和Vκ序列具有最高同源性的人种系的VH、Vκ以及J区域序列被挑选出来，用来作为参照序列。

[0175] 在确定了作为参照的人的框架序列后，在B4VH和Vκ框架序列中存在的某些暴露在表面的与参照序列不同的氨基酸残基会被改造为与参照序列相一致的氨基酸[24]。对于抗体的结构与结合至关重要的残基在这一过程中保持不变。例如，N端的鼠源残基因与最终抗体上的CDR很接近而得以保留。通过一过程得到的序列非常类似于一个镶嵌型抗体，抗体的表面主要为人源残基而包裹在里面的残基通常是原始小鼠的序列残基。

[0176] 把这些序列进行in silico的多肽线化处理，通过分析它们与人的18种不同的MHC II型同种异型抗免疫球蛋白的结合情况来鉴别潜在的T细胞抗原决定簇[25]。初级去免疫化的VH和Vκ氨基酸和cDNA序列已经被定义(B4DIVHv.1，图5和7；B4DIVkv.1，图6和8)。由于产生初级去免疫化的序列需要少量氨基酸替代物，这些替代物可能会影响去免疫分子的结合作用，所以设计了其它3种不同的VHs(B4DIVHv.2，B4DIVHv3.，B4DIVHv4.，图5和图7)以及2种不同的Vκs(B4DIVkv.2，B4DIVkv.3，图6和图8)。

[0177] 7.去免疫化抗体序列的构建

[0178] 通过定点突变PCR的方法构建出与以上设计相一致的去免疫化可变区TM
(QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit，Stratagene，cat.no.200518)。

[0179] 克隆的鼠源VH和Vκ基因被用来作为模板来产生序列框架的突变进而得到去免疫化序列。合成的突变引物对包含要被突变的区域。产生的去免疫化的V区域被克隆到pUC19载体中，对于去免疫化的VH和Vκ，它们的全DNA序列被确认正确。

[0180] 去免疫化的重链和轻链的V区域基因片段利用HindIII和BamHI限制性内切酶从pUC19上切下来，然后转入表达载体psvSVgpt和pSVhyg中(图3和4)。表达载体中的去免疫化VH和Vκ的全DNA序列被确认正确。

[0181] 实施例4

[0182] NSO细胞表达的去免疫化抗体的特征

[0183] 8.去免疫化抗体的表达

[0184] 用于抗体表达的NSO宿主细胞系是不产生免疫球蛋白的小鼠骨髓瘤细胞，它来自于欧洲动物细胞培养库(European Collection of Animal Cell Cultures，Porton UK(No.85110505))。

[0185] 去免疫化的重链和轻链表达载体以多种组合(12种组合)电转化共转入NS0细胞。在含有10％胎牛血清、0.8μg/ml霉酚酸和250μg/ml黄嘌呤的DMEM培养基中筛选出可以表达gpt基因的克隆。

[0186] 由转染细胞克隆产生的人IgG可以通过ELISA来检测。分泌抗体的细胞系被筛选并扩增。

[0187] 9.B4去免疫化抗体的生产

[0188] 表达B4去免疫化抗体的NS0转染细胞得到扩增后，筛选出具有最好产率的细胞系。通过ProSepA(Millipore，cat.no.113112722)亲和层析从500ml到1000ml的静态培养基中纯化抗体。用pH 3.0的0.1M甘氨酸溶液洗脱抗体，中和后用PBS透析。纯化的抗体要求过滤灭菌并储藏在4℃。通过ELISA方法，测定抗体浓度。

[0189] 10.B4去免疫化抗体结合rsCD4的亲和力

[0190] 图9-11表示的是四个B4去免疫重链与三个去免疫轻链结合情况测定的结果。

[0191] 抗体去免疫化重链1与去免疫化轻链1、2或3组合与rsCD4的结合能力与拼接抗体相同。但重链2、3、4与轻链1或2组合后与rsCD4结合能力要比拼接抗体低3倍。重链2、3或4与轻链3组合后与rsCD4的结合能力要下降5倍。

[0192] 11.病毒中和测试

[0193] 病毒储液A亚型患者分离物UG/92/029，来自于世界卫生组织HIV分离和定性网络组织。C亚型患者分离物ZIM748是由斯坦福大学D.Katzenstein赠送的。D亚型患者分离物UG266，ESI亚型患者分离物TH32036由美国军方HIV研究项目提供(SilverSpring，MD)。E亚型患者分离物TH32036同样是由J.Bradac，NIAID(NIH，Bethesda，MD).赠送的。患者分离物在PBMC中传代。T细胞系适应的HIV-1分离物MN除了一个样品在PBMC中扩增外，其余样品在H9细胞中繁殖。

[0194] 在NSO细胞中产生的B4去免疫化IgG对于病毒中和活性的测试。一般使用MT-2微斑法[36]来检测，但是热失活血清要连续稀释在50％高葡萄糖，含15％FBS及抗生素的DMEM，以及含2％的谷氨酰胺碳酸氢盐缓冲液，50％的正常人去纤维蛋白血浆中。依靠分裂素刺激的PBMC的中和反应方法本质上还是针对HIV的[50]。

[0195] NS0细胞产生的B4IgG1去免疫化抗体的中和活力定义为与不含抗体的参照相比能够使微斑数目降低50％的抗体浓度。抗体达到50％终点浓度是由不同抗体稀释浓度之间相互补充得到的。比较四条重链类型(VHv.1-4)，全部都与去免疫化κ链1(VKv.1)结合，这表明具有重链1的抗体拥有对于所有HIV-1原代分离物较高的中和活力，并且这种活力接近鼠源mAb B4抗体对于HIV-1VL135，HIV-1UG029和HIV-1TH036病毒的中和活力(表1)。

[0196] 去免疫化的B4抗体无法抑制T细胞系适应的HIV-1MN病毒。包含κ2或3的去免疫化抗体具有相同或稍低的中和活力(表2)。12种不同类型之间的比较发现含有DIVHv.1和DIVKv.1链的抗体具有较高的抗所有HIV-1原始分离物的中和活力，活力与鼠源mAb B4抗体接近。

[0197] 实施例5

[0198] 建立稳定高表达去免疫化B4抗体的CHO克隆

[0199] B4DIVHv.1和B4DIVKv.1分别用于在CHO细胞中表达重链和轻链。

[0200] 12.细胞系

[0201] 用于生产表达抗体的宿主细胞系是二氢叶酸还原酶缺陷型(CHOdfhr-)的中国仓鼠卵巢细胞，它来自于台湾食品工艺研究与开发研究所的细胞保藏与研究中心(CCRC，60133)。

[0202] 细胞需要培养在含有10％胎牛血清(DFCS，Gibco cat no.26400-044)、次黄嘌呤和胸腺嘧啶(Gibco，cat no.11067-030)的Isocoves Modified Dulbecco’s Medium(IMDM，Sigma catno.I-3390)培养基中。DHFR标记物是用来扩增和筛选的。dhfr基因的表达能够在二氢叶酸还原酶抑制剂methorexate(MTX)作用下扩增。

[0203] 当dhfr基因扩增时，其他相邻的基因也能够同时被扩增，这样在每一轮扩增后，细胞被亚克隆，进而就能筛选出具有产率不断增长的克隆。

[0204] 13.质粒构建

[0205] 表达DHFR基因的质粒使用GeneAmp RNA PCR Kit (Perkin Elmer part no.N808-0017)从NS0细胞总RNA中合成dhfr基因的cDNA。这一基因片段被插入到哺乳动物细胞表达载体pSI(Promega，cat.no.E172A)SV40增强子和前启动子下游，SV40终止子上游的EcoR1位点，用于高水平持续性表达(图12)。

[0206] 表达B4DIVHv.1重链的质粒编码拼接B4重链的DNA片段是以pSVgpt B4拼接IgG作为模板通过PCR扩增得到的。拼接的IgG基因插入到哺乳动物表达载体pcDNA3.1Neo(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat.no.V790-20)的HindIII和EcoRI酶切位点之间。该插入位置位于CMV增强子和用于高表达早期启动子的下游，多聚腺嘌呤信号和用于增强mRNA稳定性的牛生长激素(BGH)的终止序列之前。通过HindIII和BamHI位点的拼接，它的可变区序列被B4DIVHv.1可变区序列代替，从而得到了表达B4DIVHv.1重链的质粒(pCDNA3.1(+)NeoDeIgG1-S，图13)。

[0207] 表达去糖基化的B4DIVHv.1重链的质粒通过突变方法去除IgG1Fc区域中的N-糖基化位点，可以破坏IgG1结合人FcγR1的能力，从而激活补体反应，结合Clq[43]。所以去糖基化的去免疫mAb B4抗体比起糖基化抗体，可以较少的破坏CD4+细胞，具有较小的免疫毒性。

[0208] 为了去除N糖基化位点，用于编码DIVHv.1重链的第297位天冬酰胺密码子AAC通过定点突变PCR方法(Invitrogen)突变为编码组氨酸的CAC。

[0209] 表达B4DIVkv.1轻链的质粒B4DIVK.1全部轻链是通过PCR扩增方法由DIVKv.1可变区和人κ链恒定区组装成的。以pUC19-B4DIVKv.1为模板拷贝DIVKv.1区，以来自pSVhygHuCK的B4拼接抗体κ链(Vκ)为模板拷贝人κ链恒定区。完整的B4DIVK.1轻链DNA片段插入pCDNA3.1zeo(Invitrogen，cat.no.V860-20)的HindIII和EcoR1位点。插入位点位于CMV增强子和用于高表达前启动子的下游，多聚腺嘌呤信号和来自BGH用于增加mRNA稳定性的终止序列上游(图14)。

[0210] 共表达DHFR和B4DIVkv.1轻链的质粒在κ链表达单元前插入dhfr基因表达单元构建包含DHFR和B4DIVkv.1轻链表达单元的质粒。dhfr基因表达单元是通过PCR方法以pSI-DHFR为模板得到的，然后将其克隆到pcDNA3.1zeoB4DIVkv.1质粒的BglII位点(图15)。

[0211] 14.在CHOdhfr-细胞中表达抗体B4DIVHv.1-DIVKv.1

[0212] pcDNA3.1zeoB4DIVHv.1和pcDNA3.1zeoB4DIVkv.1/DHFR通过电转化共转入-CHOdhfr 细胞中。然后在含有10％DFCS、geneticin(Gibco，cat.no.10131-027)和
0.005μMMTX(Sigma，St.Louis，MO，cat no.M8047)、不含HT添加物的的IMDM培养基中筛选克隆。可以表达DHFR和重链的细胞将会在这种选择性培养基中正常生长。通过ELISA方法测定人IgG的产量。筛选并扩增分泌抗体的细胞系。

[0213] 15.通过MTX介导的DFHR基因扩增建立高表达去免疫化B4抗体的克隆

[0214] 通过逐步提高MTX浓度[42]，不断增加去免疫化mAb B4抗体的产量，扩增DFHR和IgG。克隆细胞置于从0.005-5μM连续增加的MTX浓度下3到4周。在每次细胞扩增间隙，筛选出IgG产率增加的亚克隆。

[0215] 16.通过单细胞克隆建立稳定高表达去免疫化B4抗体的细胞系

[0216] 通过限制稀释度，建立最高效表达抗体的亚克隆系。亚克隆在0.1，0.5和0.25cells/200μl选择性培养基中重新悬浮培养，然后转入96孔板。在筛选前需要在选择型培养基中培养3到4周。然后从每个细胞的培养基中取出10μl用ELISA方法测定IgG的表达情况。高产率的细胞克隆通过筛选扩增后冻存。通过这些扩增步骤，IgG最高产率可以达到10-20ng/细胞/天。产率从最初的0.1ng/细胞/天，最后增加了100-200倍。

[0217] 17.在CHO细胞中生产N-糖基化和N-去糖基化抗体

[0218] 用野生型重链以及297位天冬酰胺突变为组氨酸的重链质粒分别转染CHO细胞，并扩增。通过ProSep A亲和层析(Millipore cat.no.113112722)方法从500ml到1000ml的培养基中纯化抗体，用0.1M pH 3.0甘氨酸溶液中洗脱，中和后透析到PBS溶液中。纯化得到的抗体经过过滤灭菌，储藏在4℃。通过ELISA方法测定抗体浓度。18.通过聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE检测N-去糖基化

[0219] 具有297位天冬酰胺的重链和第297位天冬酰胺突变为组氨酸的N-糖基化和或N去糖基化的两种纯化的抗体以10％的SDS-PAGE分析，用考马斯亮兰和糖蛋白染色剂染色(GelCode Glycoprotein Stain，cat.no.24562，Pierce，Rockford Illinois)。

[0220] 与糖基化的去免疫化抗体相比，297位天冬酰胺突变为组氨酸的糖蛋白在电泳胶上具有较快的迁移率和较弱的糖蛋白染色。用N-糖基化酶F处理蛋白后，并没有改变突变抗体的凝胶迁移率和染色程度，但增加了野生型N-糖基化抗体的凝胶迁移率，同时降低了它的染色程度。在使用N-糖基化酶F处理后，野生型和突变型抗体具有相同的凝胶迁移率(图16A)和糖原蛋白染色深浅度(图16B)，从而证明了突变抗体成功的发生了去糖基化。19.CHO细胞产生的B4去免疫化IgG抗体病毒的中和活力

[0221] 上文已经描述了所使用的MT-2微斑法。CHO细胞产生的B4IgG1去免疫化抗体的中和活力定义为与不含抗体的参照相比能够使微斑数目降低50％的抗体浓度(表3)。抗体达到50％终点浓度是由不同抗体稀释浓度之间相互补充得到的。

[0222] 实施例6

[0223] B4去免疫化抗体CHO细胞克隆对于无血清悬浮培养条件的适应

[0224] 20.悬浮培养的适应

[0225] 将用75T培养瓶培养的B4CHO细胞用胰酶消化后一起转入装有50ml含有10％胎牛血清(DFCS，Gibco cat.no.26400-044)的Isocoves Modified Dulbeccos’Medium培养基(IMDM，Sigma cat.no.I-3390)的旋转培养瓶中重新悬浮。悬浮培养的旋转培养瓶放在可以旋转培养的CO2培养箱中，温度和湿度条件与单层细胞培养相同。

[0226] 每隔2到3天，检测悬浮培养细胞的密度，用新的培养基将细胞稀释到1-3×105个细胞/ml培养基浓度。在最初的几周内，要密切注意细胞的生长速率和培养基的混浊程度。

[0227] 21.对于无血清培养基的适应

[0228] 一旦悬浮培养的生长情况稳定，就将培养基离心后把细胞重悬于无血清培养基(SFMII，Gibco BRL，Rockville，MD，cat.no.31033-020)中。每隔2到3天，检测培养细胞5
浓度，并及时用新鲜培养基将细胞稀释，浓度调整到1-3×10 个细胞/ml培养基。在最初的几周内，要密切注意细胞的生长速率和培养基的混浊程度。

[0229] 22.在无血清培养基中悬浮培养的去免疫化抗体B4的生产

[0230] 适合无血清培养基悬浮培养的去免疫化B4细胞克隆开始在含有Gibco SFMII培5
养基的100ml旋转培养瓶(Bellco)中以2×10 的细胞密度培养。培养采用逐级放大，每
5
当细胞密度达到6×10cell/ml时转移，先转移到250ml的培养瓶，再转移到500ml的培养瓶。通过ProSep A亲和层析(Millipore cat.no.113112722)方法从500ml的无血清悬浮培养基中纯化抗体，用0.1M pH 3.0甘氨酸缓冲液洗脱抗体，调至中性，透析换成PBS缓冲液。纯化得到的抗体粗制品经过过滤灭菌，储藏在4℃。通过ELISA方法测定抗体浓度。

[0231] 实施例7

[0232] rCHO克隆表达的去免疫化B4抗体补体结合作用的分析

[0233] 使用补体消耗方法来评测去免疫化抗体对于它去免疫化类似物B4的补体结合能力。这一方法使得每个B4单克隆抗体结合到新培养的人CD4+细胞表面CD4复合物的位置。然后使得抗体部分结合一定量的兔子补体。在反应中剩下的补体会对抗激活的绵羊血红细胞。

[0234] 这里使用的人CD4+细胞是从静脉抽取正常血液中经过肝素化后分离得到的。全部血液与无血清RPMI-1640(Gibco，cat no.21870-076)1∶1(v/v)稀释。然后取10ml稀释TM的血液加在含有9.0ml Ficoll Hague Plus(Amersham Biosciences，cat no.17-1440-02)的50.0ml离心管中(Nunc cat no.373660)。

[0235] 在2000rpm下室温离心30分钟，分离得到淋巴细胞。收集含有外周血液单核TM细胞(PBMC)的浅黄色分离层，它位于Ficoll Hague 和稀释血清交界处，用佛罗拿缓冲液(pH7.6)洗涤三遍；其中佛罗拿缓冲液(pH 7.6)由9.1mM巴比妥钠(Merck，cat no.1.06318.0100)、15.6mM巴比妥(Merck，cat no.1.00276.0100)、0.73M氯化钠、2.5mM氯
7
化镁、2.5mM氯化钙配成。然后PBMC以每毫升相同佛罗拿缓冲液中17.0x 10 细胞数的密度悬浮培养。

[0236] 在补体结合试验中，先在200.0μl的PBMC培养物(每个离心管中含3.6×106个细胞)中加入30.0μg单独纯化的单克隆抗体，将混合物在室温孵育2小时，使之充分结合。取预先以1∶15比例用佛罗拿(Veronal)缓冲液稀释的兔子补体(Rockland，cat no.C304-0010)90.0μl，加入反应体系中，37℃下将最终反应混合物孵育10分钟使补体结合消耗掉。立刻加入350μl激活的绵羊红血球细胞(SRBC)(将3ml来自Rockland，cat no.R406的100％SRBC用来自Rockland，cat no.113-4139的含有100.0μl抗SRBC的抗血清洗涤两次，再在37℃下处理30分钟)。

[0237] 然后立即加入最终的SRBC混悬液(最终悬浮液在10.0ml佛罗拿(Veronal)缓冲液中制得)，整个反应体系在37℃下继续孵育1小时来检测在反应体系中剩下的补体。反应结束后，在5000rpm下离心1分钟，将剩下的完整SRBC离心沉淀下来。

[0238] 取每管离心的上清液150.0μl平均加到ELISA96孔板(Bectom Dickinson，cat no353915)孔中，在分光光度计中读出540nm下的吸光度值，来检测SRBC的裂解物。结果是以和对照细胞裂解液(不含单克隆抗体)比较的百分数表示的(图17)。

[0239] 实施例8

[0240] 去免疫化抗体免疫原性分析

[0241] 使用一种体外培养体系来研究单个单克隆抗体(如mAbs B4，DIVHv 1/VK1#7，或DIVHv1/VK1#16)刺激人PBMC的能力。此研究中使用的PBMC是按照上面实施例7的方法分离得到的。

[0242] 体外PBMC的培养是将PBMC以每孔2.5×106个细胞每1.5ml完全培养基RPMI-1640的密度铺在24孔平板(Corning，cat no.3254)中，其中完全培养基RPMI-1640含有青霉素和链霉素(Gibco，cat no.10378-016)以及胎牛血清(Gibco，cat no.10099141)。单克隆抗体以10.0μg每毫升的量加入PBMC培养液中。在单个培养体系中加入2.0μg/ml的伴刀豆球蛋白(Sigma，cat no.C 5275)，或者10.0μg Pokeweed有丝分裂原(Sigma，cat.no.L-8777)作为阳性对照；不加有丝分裂原和单克隆抗体作为阴性对照。扩增培养体系，对每种刺激条件进行检测。在培养开始3、5、7、9天后收集培养物上清液，检测前在-70℃保存。

[0243] 使用来自eBioscience(USA)细胞因子试剂盒检测抗原/有丝分裂原刺激人PBMC培养物上清液中的细胞因子，从而能够检测出有无白细胞素-2(IL-2)、白细胞素4(IL-4)、白细胞素10(IL-10)、干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤致死因子α(TNF-α)的存在。
分别使用的试剂盒为：IL-2(cat no.88-7026-22)；IL-4(cat no.88-7046-22)；IL-10(cat no.88-7106-22)；IFN-γ(cat no.88-7316-22)，和TNF-α(cat no.88-7346-22)。

[0244] 根据制造商提供的说明书来进行试验，试验结果如表4所示。

[0245] 实施例9

[0246] 去免疫化抗体的临床评价

[0247] 在人体内进行单剂量用药后，开始扩大用药的临床检验，来检验去免疫化的单克隆抗体，如DH1DK1NS0#16或DH1DK1NS0#7静脉注射的安全性、免疫原性、药物动力学和效率。研究中将使用两轮HAART治疗失败的HIV感染患者分为两组，每组两个患者，没有安慰剂使用组。组一和组二分别使用抗体DH1DK1NS0#16或DH1DK1NS0#7，剂量依次为1mg/kg和5mg/kg。在第0天开始静脉注射。

[0248] 在注射前要事先采集血液血清样本，然后在注射后每隔大约10分钟，1小时和12小时进行采集。然后在24小时、48小时以及第3、7、14、21、28、35、42、49以及56天采集血液血清样本。

[0249] 用药安全性通过体检、血常规检测、整体细胞计数和记录不良反应来评定。淋巴细胞标记物通过FACs进行免疫荧光细胞计数，每隔一周来检测免疫耐受情况。

[0250] 可靠的方法是观测如下分子标记物：CD3/CD4，CD3/CD8，CD14/CD45，CD20/CD45，和抗人IgG1-FITC。每次抽血后，以rsCD4作为固相免疫吸收剂，用ELISA检测DIH1DK1NS0#7或DIH1DK1NS0#16血浆含量，从而可以测定药物动力学特性。使用抗体DIH1DK1NS0#7或DIH1DK1NS0#16作为固相免疫吸收剂通过ELISA方法检测血清中抗DIH1DK1NS0#7或DIH1DK1NS0#16表达水平，从而来确定免疫原性。

[0251] 每周通过定量RT-PCR方法检测血浆中HIV RNA水平，从而确定药物的效力。

[0252] 实施例10

[0253] 在转基因植物中生产B4去免疫化抗体

[0254] 转基因植物也是一种生产去免疫化抗体的相当经济的方式。使用含有编码去糖基化去免疫化抗体重链和轻链的7号克隆cDNAs的Agrobacterium tumefaciens载体，将其转入双子叶植物烟草(Nicotiana tabacum)中，这样就形成了有效生产B4去免疫化抗体的生物反应器植物。

[0255] 使用限制性内切酶Hind III和Eco RI从pcDNA3.1(+)Neo-DeIg1(B4DIVHv.1)-S载体(图13)上切下来编码完整去免疫化B4抗体DIH1DK1NS0#7的cDNA，其中包含去糖基化IgG1 CH，B4DIVHv.1 VH和前导序列。使用Hind III和Eco RI从pcDNA3.1(+)Zeo-HuK(B4DIVKv.1)-S载体(图14)上切下编码完整去免疫化B4抗体κ链的cDNA，其中包含人κCH、B4DIVKv.1Vκ和前导序列。编码Ig链的cDNA片段连入含有花椰菜花叶病毒35S启动子的植物表达载体pMON 530。

[0256] 将重组病毒转入E.coli DH5-α中，用来自于克隆cDNAs的放射性标记PCR产物筛选出Ig cDNA的转化菌。来自阳性克隆的质粒转入Agrobacterium tumefaciens。用重组的A.tumefaciens感染N.tabacum的叶片。从候选的转基因植物细胞产生幼苗。

[0257] 为了得到人的重链和轻链，准备叶的提取物，通过ELISA检测植物产生的重链或kappa链。由于交叉授粉，会使表达的重链和轻链相互交叉。这些过程都有描述。

[0258] 准备表达完整去免疫化抗体DIH1DK1NS0#7的杂交转基因植物的叶的提取物，通过ELISA筛选人的IgG。来自反应植物中的植物表达抗体通过它的结合功能被筛选出来，使用rsCD4ELISA和实施例4中提到的病毒中和反应方法，测定相对于7号克隆抗体活力的植物表达抗体中和活力大小。

[0259] 同时，单子叶植物玉米(Zea mays)被用来提高转基因植物产物的表达以及它的稳定性。特别值得注意的是，它的种子储存启动子可以使抗体的组织特异性表达在玉米的胚乳中。

[0260] 玉米蛋白基因的启动子特别具有这样的有用的功能。玉米蛋白是合成发生在玉米胚乳中的储存蛋白，它的启动子活性可以在玉米成熟前不断增强。因此编码去免疫化抗体DIH1DK1NS0#7重链和κ链的cDNA分别来自pcDNA3.1(+)Neo-DeIg1(B4DIVHv.1)-S(图13)和pcDNA3.1(+)Zeo-HuK(B4DIVKv.1)-S(图14)。

[0261] 这些cDNA被连入具有玉米蛋白基因启动子和筛选标记基因，如荧光素酶的表达载体中。重组载体转入E.coli中，按照以上描述的方法筛选出含有Ig cDNA的克隆。通过粒子轰击的方法将阳性E.coli转化菌转入玉米小苗种。使用PDS1000/He仪器(Bio-RadLaboratories，Hercules CA)进行DNA包裹的粒子轰击，按照上面的方法通过对提取物中蛋白的荧光测定，筛选出转化株。

[0262] 分离出的转基因玉米是从阳性胚胎长大到成熟的。然后经过交叉传粉来产生出可以生产去免疫化B4抗体的植株。上文描述了如何对抗体进行筛选和定性。

[0263] 表1

[0264] NS0产生的去免疫化B4抗体DIVHv.1-4/VKv.1的中和活性

[0265]

[0266]

[0267] 表2

[0268] NS0细胞产生的去免疫化B4抗体DIVHv.1-4/VKv.2-3的中和活性

[0269]

[0270] 表3

[0271] CHO细胞(克隆#7和#21)产生的去免疫化B4抗体DIVHv.1VKv.1的中和活性[0272]

[0273] 表4

[0274] 单克隆抗体B4及其去免疫化配对物诱导的体外细胞因子应答

[0275]

[0276] a，b&c以10.0μg/ml的浓度加入到培养基中的单克隆dBDL，低于检测水平[0277] 序列表

[0278] <110>林淑菁

[0279] 王长怡

[0280] <120>可用来抵御并治疗HIV感染的去免疫化单克隆抗体

[0281] <130>1151-4173

[0282] <140>TBA

[0283] <160>30

[0284] <170>PatentIn version 3.2

[0285] <210>1

[0286] <211>354

[0287] <212>DNA

[0288] <213>小鼠

[0289] <400>1

[0290] caggttcagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaggatg 60[0291] tcctgcaagg cttctggata cacattcact gactatgtta tacactgggt gaagcagaga 120[0292] actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatcctg gaagtggtag tgcttactcc 180[0293] aatgcgaagt tcaaggacaa ggccacactg actgcagaca aatcctccaa cacagcctac 240[0294] atgcagctca gcagtctgac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagaagaggg 300[0295] aatggtaccg ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354[0296] <210>2

[0297] <211>118

[0298] <212>PRT

[0299] <213>小鼠

[0300] <400>2

[0301] Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala[0302] 1 5 10 15

[0303] Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr[0304] 20 25 30

[0305] Val Ile His Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile[0306] 35 40 45

[0307] Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Ser Asn Ala Lys Phe[0308] 50 55 60

[0309] Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr[0310] 65 70 75 80[0311] Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala ValTyr Phe Cys[0312] 85 90 95

[0313] Ala Arg Arg Gly Asn Gly Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr[0314] 100 105 110

[0315] Leu Val Thr Val Ser Ala

[0316] 115

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[0318] <211>333

[0319] <212>DNA

[0320] <213>小鼠

[0321] <400>3

[0322] gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60[0323] atctcctgca aggccggcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtac 120[0324] caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ttgcatccaa tctagaatct 180[0325] gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240[0326] cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagt aaagttataa ggatccgctc 300[0327] acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa 333[0328] <210>4

[0329] <211>111

[0330] <212>PRT

[0331] <213>小鼠

[0332] <400>4

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[0335] Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Gly Gln Ser Val Asp Tyr Asp[0336] 20 25 30

[0337] Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro[0338] 35 40 45

[0339] Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala[0340] 50 55 60

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[0346] 100 105 110

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[0349] <212>PRT

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[0351] <400>5

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[0354] Ser ValLys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr[0355] 20 25 30

[0356] Val Ile His Trp Val Lys Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile[0357] 35 40 45

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[0367] 115

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[0370] <212>PRT

[0371] <213>小鼠

[0372] <400>6

[0373] Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala[0374] 1 5 10 15

[0375] Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr[0376] 20 25 30

[0377] Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile[0378] 35 40 45

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[0381] Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr[0382] 65 70 75 80[0383] Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys[0384] 85 90 95

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[0387] Leu Val Thr Val Ser Ser

[0388] 115

[0389] <210>7

[0390] <211>118

[0391] <212>PRT

[0392] <213>小鼠

[0393] <400>7

[0394] Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala[0395] 1 5 10 15

[0396] Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr[0397] 20 25 30

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[0406] Ala Arg Arg Gly Asn Gly Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr[0407] 100 105 110

[0408] Leu Val Thr Val Ser Ser

[0409] 115

[0410] <210>8

[0411] <211>118

[0412] <212>PRT

[0413] <213>小鼠

[0414] <400>8

[0415] Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala[0416] 1 5 10 15

[0417] Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr[0418] 20 25 30

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[0429] Leu Val Thr Val Ser Ser

[0430] 115

[0431] <210>9

[0432] <211>111

[0433] <212>PRT

[0434] <213>小鼠

[0435] <400>9

[0436] Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly[0437] 1 5 10 15

[0438] Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Ser Val Asp Tyr Asp[0439] 20 25 30

[0440] Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro[0441] 35 40 45

[0442] Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala[0443] 50 55 60

[0444] Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His[0445] 65 70 75 80[0446] Pro Val Glu Glu Asn Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr[0447] 85 90 95

[0448] Lys Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

[0449] 100 105 110

[0450] <210>10

[0451] <211>111

[0452] <212>PRT

[0453] <213>小鼠

[0454] <400>10

[0455] Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly[0456] 1 5 10 15

[0457] Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Ser Val Asp Tyr Asp[0458] 20 25 30

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[0461] Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ser[0462] 50 55 60

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[0467] Lys Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

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[0469] <210>11

[0470] <211>111

[0471] <212>PRT

[0472] <213>小鼠

[0473] <400>11

[0474] Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly[0475] 1 5 10 15

[0476] Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Ser Val Asp Tyr Asp[0477] 20 25 30

[0478] Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro[0479] 35 40 45

[0480] Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ser[0481] 50 55 60

[0482] Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn[0483] 65 70 75 80[0484] Pro Val Glu Glu Asn Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr[0485] 85 90 95

[0486] Lys Asp Pro Leu Ala Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

[0487] 100 105 110

[0488] <210>12

[0489] <211>354

[0490] <212>DNA

[0491] <213>小鼠

[0492] <400>12

[0493] caggttcagc tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggggcttc agtgaaggtg 60[0494] tcctgcaagg cttctggata cacattcact gactatgtta tacactgggt gaagcaggcg 120[0495] actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatcctg gaagtggtag tgcttactcc 180[0496] aatgcgaagt tcaaggacag ggtgacaatg actgcagaca aatcctccaa cacagcctac 240[0497] atggagctca gcagtctgac atctgacgac acagcggtct atttctgtgc aagaagaggg 300[0498] aatggtaccg ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc ttct 354[0499] <210>13

[0500] <211>354

[0501] <212>DNA

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[0503] <400>13

[0504] caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcttc agtgaaggtg 60[0505] tcctgcaagg cttctggata cacattcact gactatgtta tacactgggt gaggcaggcg 120[0506] actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatcctg gaagtggtag tgcttactcc 180[0507] aatgccaagt tcaaggacag ggtgacaatt actgcagaca aatccacaaa cacagcctac 240[0508] atggagctca ggagtctgag gtctgacgac acagcggtct atttctgtgc aagaagaggg 300[0509] aatggtaccg ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc ttct 354[0510] <210>14

[0511] <211>354

[0512] <212>DNA

[0513] <213>小鼠

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[0515] caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcttc agtgaaggtg 60[0516] tcctgcaagg cttctggata cacattcact gactatgtta tacactgggt gaagcaggcg 120[0517] actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatcctg gaagtggtag tgcttactcc 180[0518] aatgcgaagt tcaaggacag ggtgacaatt actgcagaca aatccacaaa cacagcctac 240[0519] atggagctca ggagtctgag gtctgacgac acagcggtct atttctgtgc aagaagaggg 300[0520] aatggtaccg ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc ttct 354[0521] <210>15

[0522] <211>354

[0523] <212>DNA

[0524] <213>小鼠

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[0526] caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcttc agtgaaggtg 60[0527] tcctgcaagg cttctggata cacattcact gactatgtta tacactgggt gcggcaggcg 120[0528] actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatcctg gaagtggtag tgcttactcc 180[0529] aattcgaagt tcaaggacag ggtgacaatt actgcagaca aatccacaaa cacagcctac 240[0530] atggagctca ggagtctgag gtctgacgac acagcggtct atttctgtgc aagaagaggg 300[0531] aatggtaccg ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc ttct 354[0532] <210>16

[0533] <211>333

[0534] <212>DNA

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[0545] <212>DNA

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[0548] gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctccagggca gagggccacc 60[0549] atcacctgca aggccggcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtac 120[0550] caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ttgcatccaa tctagaatct 180[0551] gggatcccaa gtaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct cacaatcaac 240[0552] cctgtggagg agaacgatac cgcaacctat tactgtcagc aaagttataa ggatccgctc 300[0553] actttcggtc aggggaccaa ggtggagatc aaa 333[0554] <210>18

[0555] <211>333

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[0567] <212>DNA

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[0570] ggatacacat tcactgacta tgttatacac 30[0571] <210>20

[0572] <211>10

[0573] <212>PRT

[0574] <213>小鼠

[0575] <400>20

[0576] Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Val Ile His

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[0578] <210>21

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[0580] <212>DNA

[0581] <213>小鼠

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[0583] gagatttatc ctggaagtgg tagtgcttac tccaatgcga agttcaagga c 51[0584] <210>22

[0585] <211>17

[0586] <212>PRT

[0587] <213>小鼠

[0588] <400>22

[0589] Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Ser Asn Ala Lys Phe Lys[0590] 1 5 10 15

[0591] Asp

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[0599] <211>10

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[0601] <213>小鼠

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[0603] Arg Gly Asn Gly Thr Gly Phe Ala Tyr Trp

[0604] 1 5 10

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[0607] <212>DNA

[0608] <213>小鼠

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[0610] aaggccggcc aaagtgttga ttatgatggt gatagttata tgaac 45[0611] <210>26

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[0613] <212>PRT

[0614] <213>小鼠

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[0616] Lys Ala Gly Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn

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[0629] Val Ala Ser Asn Leu Glu Ser

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[0633] <212>DNA

[0634] <213>小鼠

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[0636] cagcaaagtt ataaggaccc gctcacg 27

[0637] <210>30

[0638] <211>9

[0639] <212>PRT

[0640] <213>小鼠

[0641] <400>30

[0642] Gln Gln Ser Tyr Lys Asp Pro Leu Thr

[0643] 1 5