克服根癌农杆菌介导小麦幼胚褐化的转化方法及其专用培养基

摘要

本发明公开了一种根癌农杆菌介导的转化小麦幼胚的方法及其专用培养基。本发明所提供的根癌农杆菌介导的转化小麦幼胚的方法，包括下述步骤：1)将小麦幼胚接种于预培养的培养基中，24-26℃的培养温度下黑暗培养4-7天；2)用目的根癌农杆菌侵染经过步骤1)培养的小麦幼胚、进行共培养，将根癌农杆菌中的目标T-DNA导入小麦幼胚。利用上述根癌农杆菌介导的转化方法将外源基因导入小麦中，经测定，用本发明的培养基及其转化方法，胚性愈伤组织的诱导率和抗性植株的获得率均得到提高。

权利要求

1.根癌农杆菌介导的转化小麦幼胚用培养基，其组成如下：MS基本培养基的大量元素、MS基本培养基的微量元素、MS基本培养基的铁盐、浓度为30g/L的蔗糖、浓度为0.5mg/L的PAA和浓度为2.0mg/L的Dicamba；所述培养基为固体培养基。

2.一种根癌农杆菌介导的转化小麦幼胚的方法，包括下述步骤：

1)将小麦幼胚接种于权利要求1所述的培养基中，24-26℃的培养温度下黑暗培养4-7天；

2)用目的根癌农杆菌侵染经过步骤1)处理的小麦幼胚、进行共培养，将目的根癌农杆菌中的目标基因导入小麦幼胚。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述小麦幼胚的培养温度为25℃。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述目的根癌农杆菌中含有目标基因。

5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中还包括将用于提供小麦幼胚的小麦植株种植在温度为15-25℃的温室中生长发育的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法中还包括将经过共培养的小麦幼胚转入如下培养基中诱导胚性愈伤组织的步骤；所述培养基是在每升权利要求1所述的培养基中补充10.0mg G418和250.0mg羧苄青霉素得到的。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法中还包括将得到的胚性愈伤组织进行分化培养的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法中还包括在所述分化培养后进行生根的步骤。

说明书

克服根癌农杆菌介导小麦幼胚褐化的转化方法及其专用培

养基

技术领域

[0001] 本发明涉及一种克服根癌农杆菌介导小麦幼胚褐化的转化方法及其专用其培养基。

背景技术

[0002] DNA双螺旋结构的发现为分子生物学研究奠定了基础，DNA重组技术的创立使分子生物学研究由理论进入实践，植物基因工程研究应运而生。在此基础上，Zambryski等利用农杆菌介导法获得了世界上第一株转基因烟草植株，Horch等建立了农杆菌介导的叶盘转化法，马铃薯、番茄、拟南芥等双子叶模式植物先后转基因获得成功。此后，植物转基因技术迅速发展，先后建立了除农杆菌介导法以外的PEG介导法、电激穿孔法、病毒介导法、基因枪法、显微注射法、花粉管通道法和超声波法等，转基因成功的物种不断扩大，涉及35个科的50多个种，共120多种植物。经过多年的实践和优胜劣汰，多数转化方法已被逐步放弃，形成了以农杆菌介导法和基因枪法占主导地位的两大植物转基因体系。迄今为止，媒介农杆菌法获得的转基因植物占转基因植物总数的85％左右。同时，将一些有利用价值的外源基因导入植物，并逐步将转基因植物应用到农业生产中。植物基因工程研究已涉及到品种改良的各个方面，包括抗虫、抗病(病毒、细菌和真菌病害)、抗除草剂、抗逆(寒冷、盐碱、重金属等)、品质改良(碳水化合物、油脂和蛋白质等)、发育调控和营养吸收等。在开展主要农作物转基因技术体系和功能基因转化研究的同时，转基因大豆、玉米、棉花、油菜等作物新品种在生产上的产业化面积逐年增加。

[0003] 在粮食作物中，小麦属于遗传转化最为困难的作物，加上转基因研究起步较晚，基因工程育种进程明显落后于其它作物。Hessd等(1990)、Mooney等(1991)先后对农杆菌介导法转化小麦的可行性进行了研究，但未能获得转基因植株。随着基因枪的问世、新的选择标记基因和高效启动子的运用，1991年以后小麦转基因研究开始增多。1992年Vasil等利用基因枪介导法将bar基因导入了小麦，获得了世界上第一例转基因小麦植株。1993年Weeks等、Perl等利用基因枪介导法将GUS基因、bar基因导入了小麦，建立了基因枪法转化小麦幼胚的技术体系。然而，农杆菌介导法一直是小麦遗传转化的一道难关。1997年Cheng等首次利用农杆菌介导法将GUS基因和npt II基因转入了小麦幼胚愈伤组织，获得了小麦转基因植株，并对转基因植株T0代-T2代进行了分子检测。夏光敏等(1999)、叶兴国等(2001)利用农杆菌介导法将npt II、bar等外源基因转入小麦，获得了转基因植株。Zhou等利用农杆菌介导法将抗除草剂的Roundup基因转入了小麦品种Bobwhite，培育了Roundup Ready转基因小麦。由于农杆菌介导法的一些独特优点，如转移片段明确、拷贝数低、容易表达、操作简单和成本低等，人们对此项研究一直坚持不懈。2003年Khanna等通过构建超级双元表达载体HK21和在培养基中加入多胺类化合物，使转化效率达到了1.2-3.9％；Hu等以来源于农杆菌的抗除草剂基因EPSPS为选择标记，以草丁膦为筛选剂，将EPSPS基因导入了小麦品种Bobwhite，转化效率达到了4.3％。Cheng等(2003)认为农杆菌感染后对外植体进行干燥处理可显著提高T-DNA转运水平和转化效率。

[0004] 小麦转基因研究大多采用授粉后13-14天的幼胚为受体材料，表达载体构建中普遍采用Ubi、E35S等启动子和bar、nptII、EPSPS、hpt等筛选标记基因，筛选剂一般使用Bialaphos、Glufosinate、G418和hygromycin等，利用的农杆菌菌系包括ABI、Agl1、C58C1、LBA4404和CP4等。尽管农杆菌介导法取得了一定的进展，但是目前利用农杆菌转化小麦仍然比较困难，尤其是农杆菌侵染小麦幼胚后愈伤组织褐化死亡的现象非常严重，不能获得足够数量的抗性愈伤组织和再生植株，是小麦转基因研究的瓶颈，限制了转基因小麦的规模化生产和小麦功能基因组研究的发展。因此，解决农杆菌转化小麦幼胚后愈伤组织褐化死亡的问题是小麦转基因研究的关键。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种根癌农杆菌介导的转化小麦幼胚用培养基。

[0006] 本发明所提供的根癌农杆菌介导的转化小麦幼胚用培养基是含有MS基本培养基的大量元素、MS基本培养基的微量元素、MS基本培养基的铁盐、蔗糖、PAA和Dicamba的固体培养基，其中PAA的浓度为0-1.0mg/L，Dicamba的浓度为2.0-3.0mg/L，蔗糖的浓度为20.0-40.0g/L。

[0007] 上述培养基中PAA的浓度优选为0.5mg/L，Dicamba的浓度优选为2mg/L，蔗糖的浓度优选为30g/L。

[0008] 本发明的另一个目的是提供一种根癌农杆菌介导的转化小麦幼胚的方法。

[0009] 本发明所提供的根癌农杆菌介导的转化小麦幼胚的方法，包括下述步骤：

[0010] 1)将小麦幼胚接种于上述培养基上，24-26℃的培养温度下黑暗培养4-7天；

[0011] 2)用目的根癌农杆菌侵染经过步骤1)培养的小麦幼胚、进行共培养，将根癌农杆菌中的目的基因导入小麦幼胚。

[0012] 上述小麦幼胚培养温度优选为25℃，上述根癌农杆菌为含有目标基因的根癌农杆菌。

[0013] 在进行根癌农杆菌转化之前，可以将用于提供小麦幼胚的小麦植株种植在温度为15-25℃的温室中生长发育。

[0014] 上述根癌农杆菌介导的转化小麦幼胚的方法中还包括将经过共培养的小麦幼胚转入在每升上述培养基中补充10.0mg G418和250.0mg羧苄青霉素得到的培养基中诱导胚性愈伤组织的步骤。

[0015] 上述方法中还包括将得到的胚性愈伤组织进行分化培养并进行生根的步骤。

[0016] 利用本发明的培养基及其转化方法，胚性愈伤组织的诱导率和抗性植株的获得率均得到提高。其中，小麦CB037的胚性愈伤组织的平均诱导率为67.1％，小麦石4185的胚性愈伤组织的平均诱导率为56.4％，小麦Bobwhite的胚性愈伤组织的平均诱导率为60.9％；小麦CB037抗性植株的平均获得率为241％，小麦石4185抗性植株的平均获得率为204％，小麦Bobwhite抗性植株的平均获得率为283％。

附图说明

[0017] 图1为按照已发文献中的常规根癌农杆菌转化法对小麦CB037的幼胚进行根癌农杆菌侵染后的培养效果

[0018] 图2为本发明培养基和转化方法对小麦CB037的幼胚进行根癌农杆菌侵染后的培养效果

[0019] 图3为本发明培养基和转化方法对小麦石4185的幼胚进行根癌农杆菌侵染后的培养效果

[0020] 图4为按照已发文献中的常规根癌农杆菌转化法转化小麦CB037后的抗性愈伤组织的分化情况

[0021] 图5为本发明培养基和转化方法转化小麦CB037后的抗性愈伤组织的分化情况[0022] 图6为本发明培养基和转化方法转化小麦石4185后的抗性愈伤组织的分化情况具体实施方式

[0023] 下述实施例中所涉及的实验方法如无特殊说明均为常规方法。

[0024] 实施例1、根癌农杆菌转化法侵染小麦幼胚

[0025] 一、培养基的配制和灭菌

[0026] MSD2P0.5培养基：10×MS大量100ml、100×MS微量10ml、200×MS铁盐5ml、蔗糖30g，定容至1000ml，然后调节pH至6.0，再加入植物凝胶(Phytagel)2.4g，以上成分采用
121℃高压湿热灭菌20分钟；待灭菌后的培养基温度降至65℃左右时，加入过滤灭菌后的苯乙酸(PAA)0.5mg和3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸(Dicamba)2mg。

[0027] 与传统的MS培养基相比，MSD2P0.5培养基的显著特点是去除了MS培养基中的全部有机成分，用Dicamba取代了2，4-D，并添加了PAA。

[0028] WCCP0.5培养基：10×MS大量10ml、100×MS微量1ml、200×MS铁盐0.5ml、麦芽糖40g、MgCl2 0.75g、乙磺酸(MES)1.95g，定容至975ml，然后调节pH至5.4，以上成分采用121℃高压湿热灭菌20分钟；均匀混合下面的几种成分：100×MS维生素10ml、谷氨酰胺0.5g、水解酪蛋白0.1g、葡萄糖10g、100mg/ml维生素C 1ml、4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸(Picloram)2.2mg、乙酰丁香酮(AS)39mg，定容至25ml，过滤灭菌后加入到上述高压灭菌后的培养基中；待灭菌后的培养基温度降至65℃左右时，再加入过滤灭菌后的PAA 0.5mg和Dicamba 2mg。

[0029] 胚性愈伤组织分化培养基：10×MS大量100ml、100×MS微量10ml、200×MS铁盐5ml、2，4-D 0.2mg、蔗糖30g、100×MS维生素10ml，定容至1000ml，然后调节pH至6.0，再加入琼脂8g，以上成分采用121℃高压湿热灭菌20分钟；待灭菌后的培养基温度降至65℃左右时，加入过滤灭菌后的羧卞青霉素250mg和G41825mg。

[0030] 二、根癌农杆菌转化法转化小麦幼胚

[0031] 1、预培养

[0032] 将小麦CB037、小麦石4185和小麦Bobwhite(中国国家种质资源库)种植在温度为15-25℃的温室中，开花授粉后13-14天的小麦CB037、小麦石4185和小麦Bobwhite的幼胚(心形期，大小为1.0-1.2mm)，接种在上述MSD2P0.5培养基上，25℃黑暗条件下培养4-7天。

[0033] 2、侵染

[0034] 将携带有nptII基因的pBI121质粒转入根癌农杆菌C58C1(北京拜尔迪生物技术有限公司)中，将得到的包含pBI121质粒的根癌农杆菌命名为C58C1-121。

[0035] 挑取根癌农杆菌C58C1-121的单菌落接种到YEP液体培养基中，28℃条件下250rpm振荡培养至OD600＝0.6-1.0。

[0036] 将上述OD600值为0.6-1.0的根癌农杆菌C58C1-121的菌液于室温条件下4500rpm离心10min收集，沉淀重悬于上述WCCP0.5液体培养基中，将上述预培养的小麦CB037、小麦石4185和小麦Bobwhite的幼胚分别放入重悬菌液中浸泡30min，期间轻轻摇动。

[0037] 3、共培养

[0038] 从根癌农杆菌C58C1-121重悬液中取出小麦CB037、小麦石4185和小麦Bobwhite的幼胚，置于无菌滤纸上，25℃黑暗条件下共培养2天。

[0039] 4、诱导愈伤组织

[0040] 分别将小麦CB037、小麦石4185和小麦Bobwhite的幼胚转移到每升培养基中补充10.0mg G418和250.0mg羧苄青霉素的MSD2P0.5培养基上，25℃黑暗条件下诱导胚性愈伤组织。小麦CB037的幼胚经根癌农杆菌C58C1-121侵染后愈伤组织诱导效果如图2所示，小麦石4185的幼胚经根癌农杆菌C58C1-121侵染后愈伤组织诱导效果如图3所示。小麦CB037的胚性愈伤组织的平均诱导率为67.1％(胚性愈伤组织的诱导率指胚性愈伤组织数占根癌农杆菌转化幼胚数的百分率)，小麦石4185的胚性愈伤组织的平均诱导率为56.4％，小麦Bobwhite的胚性愈伤组织的平均诱导率为60.9％。

[0041] 5、愈伤组织分化

[0042] 将小麦CB037、小麦石4185和小麦Bobwhite的胚性愈伤组织分别转移到胚性愈伤组织分化培养基上，15-25℃条件下，每天光照12-14小时进行分化培养。小麦CB037的幼胚经根癌农杆菌C58C1-121侵染后的抗性愈伤组织的分化情况如图5所示，小麦石4185的幼胚经根癌农杆菌C58C1-121侵染后的抗性愈伤组织的分化情况如图6所示。

[0043] 6、生根培养

[0044] 从小麦CB037、小麦石4185和小麦Bobwhite抗性愈伤组织分化出的抗性再生芽高度达2-3cm时，分别转到生根培养基上，当不定根长到3-4cm时，取出植株，彻底清除根部培养基，移入土壤中培养。小麦CB037抗性植株的平均获得率为241％，小麦石4185抗性植株的平均获得率为204％，小麦Bobwhite抗性植株的平均获得率为283％。

[0045] 对比例1

[0046] 将小麦CB037、小麦石4185和小麦Bobwhite种植在温度为15-25℃的温室中，按照已发文献中的常规根癌农杆菌转化方法(Cheng M et al.，Plant Physiol.，1997，115：971-980)对开花授粉后13-14天的小麦CB037、小麦石4185和小麦Bobwhite的幼胚(心形期，大小为1.0-1.2mm)进行转化。小麦CB037的幼胚进行常规根癌农杆菌侵染后的培养效果如图1所示，其抗性愈伤组织的分化情况如图4所示。结果表明，按照上述文献中的常规根癌农杆菌转化法侵染后，胚性愈伤组织的平均诱导率为5.6％，常规根癌农杆菌转化法侵染小麦幼胚后引起的小麦幼胚褐化死亡问题在一些文献中已有描述(David L P et al.，Physiological and Molecular Plant Pathology，2002，60：59-69；Shrawat A K et al.，Plant Biotechnology Journal，2006，4：575-603)。