氨基酸及其氨基酸补充剂的用途

摘要

本发明涉及游离L-脯氨酸在制备补充剂中的用途，涉及一种这样制备的补充剂，以及一种使用这种补充剂补充鲍鱼中的细胞游离L-脯氨酸的浓度和限制鲍鱼脱水的方法。所述补充剂进一步有效降低经历水应激和缺氧应激的鲍鱼中的自由基的水平。本发明进一步涉及一种在贮存和运输期间限制鲍鱼脱水的方法，包括给予鲍鱼有效量的游离L-脯氨酸的步骤。

权利要求

1.游离L-脯氨酸在制备用于补充鲍鱼中细胞游离L-脯氨酸的浓度和用于限制鲍鱼脱水的补充剂中的用途。

2.游离L-脯氨酸作为用于补充鲍鱼中的细胞游离L-脯氨酸的浓度和用于限制鲍鱼脱水的补充剂的非治疗目的的用途。

3.补充鲍鱼中细胞游离L-脯氨酸的浓度和用于限制鲍鱼脱水的非治疗目的的方法，它包括给予鲍鱼有效量游离L-脯氨酸的步骤。

4.限制贮存和运输期间鲍鱼脱水的非治疗目的的方法，它包括给予鲍鱼有效量游离L-脯氨酸的步骤。

5.根据权利要求4的限制贮存和运输期间鲍鱼脱水的非治疗目的的方法，其中L-脯氨酸的有效量是每2～20千克干重饲料含50～200克游离L-脯氨酸，每1～6天将10～

100克干饲料喂给2～20千克活鲍鱼。

6.根据权利要求5的限制贮存和运输期间鲍鱼脱水的非治疗目的的方法，其中L-脯氨酸的有效量是每10千克干重饲料含100克游离L-脯氨酸，每3天将50克干饲料喂给10千克活鲍鱼。

说明书

氨基酸及其氨基酸补充剂的用途

[0001] 技术领域

[0002] 本发明涉及氨基酸及其氨基酸补充剂的用途。本发明进一步涉及一种包括该氨基酸的鲍鱼饲料和抗脱水补充剂。

[0003] 背景技术

[0004] 在南非，南非鲍(Haliotis midae)在基于陆地的生长系统中已成功进行商业养殖。南非鲍鱼养殖业的投资超过R 80,000,000，受表面上不满足的国外市场和出口商享受的有利汇率所驱使。

[0005] 目前11个最大商业养殖场的产量总计为每年约780吨，原料被指定用于远东市场。每千克37美元(包括外壳)时，这相当于每年约R200,000,000外汇收入。除巨大的外汇收入外，养殖鲍鱼的另外一个优势是它减轻了被偷猎者掠夺的有限的和生长缓慢的天然群落的压力。

[0006] 然而，南非并不是唯一的养殖鲍鱼的生产者，并且在这一市场区域中增加的竞争对该产业产生压力，在降低生产成本和增加产品质量和产量方面变得更有竞争性。

[0007] 动物健康、生长阶段和生理条件对产品质量和产量的影响在传统畜牧业系统中长期以来已被认识到。鲍鱼没有不同。过去几年的经历已清楚地表明，鲍鱼的状况在活体运输和罐头制造期间都影响最终产品。活体出口过程中经历了死亡和重量过度减少的问题，罐头制造时经历了产量降低和肉质量低劣问题。这影响个体生产者，并且对南非鲍鱼整体市场是有害的。

[0008] 活体出口期间，鲍鱼被装在充气的聚苯乙烯容器中空运。在航空暴露的(至多)40小时期间，动物平均损失其体重15％的水。主要的失水途径是通过蒸发失水和粘液产生。由于养殖者根据着陆后的重量付费，所以这相当于损失外汇收入的15％，根据上述数据，总计每年损失约R30,000,000。

[0009] 水是维持生命的必要分子，并且动物应对其体内含水量变化的能力对于其生存是极为重要的。体内水分的损失是所有动物共有一种威胁。这类损失可通过蒸发、废物排泄、粘液产生或渗透发生。渗透通常发生于盐水环境中，如海水中，或者通过细胞外冰冻发生。作为运输过程期间失水和缺氧的结果，细胞内自由基水平增加，引起细胞损伤。

[0010] 根据生物对水应激的适应，将其分为两种主要种类，即随渗生物(osmoconformer)和调渗生物(osmoregulator)。随渗生物通常使用有机渗质，如氨基酸，以维持细胞的渗透压与外部流体环境相等。调渗生物利用离子运输以体内平衡地调节内部渗透压。随渗生物最常见于海洋中，并包括除大多数脊椎动物和一些节肢动物(athropod)外的大多数生命类型。鲍鱼是一种随渗生物，并且当经历水应激时，积聚了相对较高水平的渗质，如L-脯氨酸。鲍鱼仅具有有限的渗透压调节的能力，因此盐浓度波动的效应直接影响体内的离子平衡。先前已显示，饮食史可直接影响鲍鱼对低盐浓度的耐受。

[0011] 已知关于L-脯氨酸作为渗质的大多数研究与其在淡水动物中的作用有关。已显示当淡水和咸水动物暴露于高渗透压中时，L-脯氨酸的浓度增加。一些实例包括对虾、贻贝、蛤、蜉蝣和蚊幼虫。

[0012] 关于海洋动物如鲍鱼，几乎没有参考文献可用。发现仅有一篇文献与鲍鱼中L-脯氨酸的作用相关。已知L-脯氨酸从澳洲鲍(Haliotis roei)的细胞释放以在低盐浓度时维持细胞容积。鲍鱼中细胞容积调节的最重要的氨基酸似乎是牛磺酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸，重点是牛磺酸。

[0013] 以上实例证明，为什么一般而言，氨基酸(包括L-脯氨酸)被认为是动物细胞的细胞内渗质。这些化合物可蓄积或释放，以维持渗透浓度而对细胞功能没有不利影响。

[0014] 以下也是已知的：

[0015] -当与环多醇和多元醇(例如甘露醇)比较时，脯氨酸和甜菜碱在植物细胞中不是非常有效的抗氧化剂；

[0016] -L-脯氨酸在植物细胞中用于水分保持；

[0017] -L-脯氨酸在水应激的植物细胞中可帮助维持氧化还原平衡；以及[0018] -这些溶质(渗质)中的一些，尤其是牛磺酸，并且有时是肌醇和甘氨酸甜菜碱，是许多能量或运动饮料的主要成分。在这点上没有提及L-脯氨酸。

[0019] 根据上述内容，已充分研究并接受了在细胞中L-脯氨酸在维持渗透平衡中发挥重要作用这一事实。

[0020] JP01215248A2公开了在人造复合鱼饲料中使用游离L-脯氨酸用于提高养殖鱼的活力、存活率和生长。然而，没有发现游离L-脯氨酸作为饲料补充剂的用途的文献，该补充剂作为抗脱水剂和抗氧化剂是有效的。

[0021] 发明内容

[0022] 发明目的

[0023] 相应地，本发明的目的是提供一种可减轻活鲍鱼运输中经历的上述不利的鲍鱼补充剂。特别地，一个目的是提供一种抗脱水和抗氧化剂及补充剂，其用于限制活鲍鱼脱水并降低活鲍鱼中的自由基水平，尤其是经历水应激的鲍鱼。

[0024] 发明概述

[0025] 根据本发明的第一方面，提供了游离L-脯氨酸在制备用于补充鲍鱼细胞游离L-脯氨酸浓度和用于限制鲍鱼脱水的补充剂中的用途。

[0026] 根据本发明的第二方面，提供了游离L-脯氨酸作为用于补充鲍鱼细胞游离L-脯氨酸浓度和用于限制鲍鱼脱水的补充剂的用途。

[0027] 根据本发明的第三方面，提供了一种用于补充鲍鱼细胞游离L-脯氨酸浓度和用于限制鲍鱼脱水的补充剂，该补充剂包含有效量的游离L-脯氨酸。

[0028] 上述补充剂进一步有效降低经历水应激和缺氧应激的鲍鱼中的自由基水平。

[0029] 根据本发明的第四方面，提供了一种补充鲍鱼细胞游离L-脯氨酸浓度和限制鲍鱼脱水的方法，它包括给予鲍鱼有效量游离L-脯氨酸的步骤。

[0030] 根据本发明的第五方面，提供了一种贮存和运输期间限制鲍鱼脱水的方法，它包括给予鲍鱼有效量游离L-脯氨酸的步骤。

[0031] L-脯氨酸的有效量可以是每2～20千克，优选10千克干重量饲料，含50～200克，优选100克游离L-脯氨酸，用10～100克，优选50克干饲料每1～6天，优选每3天喂给2～20，优选10千克活鲍鱼。

[0032] 本发明优选实施方案的内容

[0033] 申请人已研究了用于克服运输中鲍鱼脱水的方法和补充剂。特别地，申请人研究了在干燥的活体出口过程期间游离L-脯氨酸在鲍鱼肌肉组织中沉积增加对其水分保持的效应。另外，申请人研究了包含游离L-脯氨酸的补充剂的制剂，以及该补充剂与目前选择的鲍鱼人工食物即Abfeed 混合作为鲍鱼饲料的应用。

[0034] 方法

[0035] 养殖系统

[0036] 在基于养殖的试验期间，动物在实验室或在养殖条件下在流通(flow-through)体系中于16℃时饲养。

[0037] 确定鲍鱼是否表现出游离L-脯氨酸的渗透响应的实验

[0038] 第一步是确定鲍鱼确实使用L-脯氨酸来应付渗透损伤。在此实验中，动物对照组保持在完全强度(100％)的海水中，第二组保持在稀释的海水(67％SW)中，以及第三组保持在浓缩的海水(133％)中(图1)。从皮质窦取出血液，并且化合物L-脯氨酸在所有三组中均被定量。

[0039] 确定从增强的饲料中摄取游离L-脯氨酸是否提供质量损失益处的实验[0040] 三批Abfeed 用等级量的游离L-脯氨酸生产。三种制剂和作为对照的标准Abfeed 喂给四组出口大小等级的鲍鱼(约100克动物)。80只动物被分为四个喂养组。养鱼场养殖的动物市售获得。

[0041] 十四周结束(两周适应标准Abfeed 和12周适应所述制剂)时，每组中10只分别称重的动物进行模拟出口(在12℃蒸气饱和的空气中36小时)并记录相对于初时重量的重量损失。将每组的其它10动物在液氮中快速冷冻，以定量血液和肌肉组织中的游离L-脯氨酸。

[0042] 水质

[0043] 每天监测海水的离子组成(10,000x稀释和酸化后ICP-MS)，以便调节最佳浓度。每周监测氨、硝酸盐和亚硝酸盐以检查过滤系统的机能。

[0044] 统计学分析

[0045] 重量损失的差异与喂养组和活性成分的最终组织水平相关。

[0046] 附图说明

[0047] 现在，通过实施例(仅仅是举例)，尤其是参考附图，本发明将被进一步描述，其中：

[0048] 图1是表示测试与盐浓度变化相关测定的鲍鱼渗透响应的实验设计图；

[0049] 图2是说明在基于养鱼场的喂养试验中，检测包含不同量游离L-脯氨酸的人工饲料对鲍鱼的影响的实验设计图；

[0050] 图3是说明分为四组的鲍鱼在各组被给予不同饮食三个月后的生长图；

[0051] 图4是说明活体出口期间四个不同的组中鲍鱼重量损失百分数的图；

[0052] 图5是说明相对于对照组，活体出口期间鲍鱼重量损失百分数的图；

[0053] 图6是说明鲍鱼肌肉组织中细胞游离L-脯氨酸浓度的图；

[0054] 图7是说明活体出口期间相对于减少的重量损失，鲍鱼肌肉组织中L-脯氨酸水平的图；

[0055] 图8是说明相对于水浓缩倍数，在鲍鱼的肌肉组织中L-脯氨酸浓度的图；

[0056] 图9是说明与对照组的重量损失相比，冷冻期间鲍鱼重量损失百分数的图；

[0057] 图10是说明与对照组的重量损失相比，烹饪加工之前鲍鱼罐头中的质量百分数的图；

[0058] 图11是说明与对照组的重量损失相比，罐装鲍鱼烹饪过程中质量损失百分数的图；

[0059] 图12是说明作为DNA损伤指数的鲍鱼血细胞的相对尾力距(tailmoment)的图；以及

[0060] 图13是为了监测鲍鱼随时间生长的评估，描述Abfeed 中L-脯氨酸浓度增加的图。

[0061] 具体实施方式

[0062] 实施例

[0063] 将鲍鱼分为四个不同的组，其中一组是喂给标准Abfeed 的对照组。其它三组喂给增加了不同量L-脯氨酸的Abfeed 。在基于养鱼场的喂养试验中，使用四组鲍鱼。商业鲍鱼养殖者提供了大约1000只试验用动物。由于没有先前的研究可被利用，选择了指数差异的L-脯氨酸浓度。

[0064] 图3描述了喂以不同饮食3个月后4组动物的生长。喂养试验开始之前以及试验结束时将动物称重并测量。不同组之间的生长没有明显差异，表明增加了L-脯氨酸的Abfeed 对动物的生长没有负面影响，并且增加的饲料是可口的且容易被动物接受。在第一个月开始时，每组有120只动物，并且第三个月结束时，每组有30只动物。

[0065] 3个月的喂养试验结束时，将每组的10只动物去壳，采集肌肉组织和血样品。将样品现场在液氮中快速冷冻，在液氮中运输并转移至-80℃的冷冻柜中。

[0066] 按照标准洁净方案，每组中准备20只分别称重的动物用于活体出口，包装并飞至约翰内斯堡国际机场。加封后恰好36小时将盒子打开，以模拟活体出口情节最坏的情形，并且所有动物都分别再称重，以计算活体出口期间重量损失的百分数。

[0067] 四组的重量损失的百分数显示于图4中。对照和100X之间的不配对t-检验表明，重量损失表现非常明显的改善(P＝0.0275)。这表示相对于对照动物重量损失改善20％。出口表现改善20％可能意味着该产业的收入实质上每年增加。

[0068] 2X～100X的L-脯氨酸浓度似乎提供最好的出口表现增强，1000X时饱和是明显的。

[0069] 喂养时间的影响通过在1、2和3个月后抽取喂以不同饲料的动物来研究。如图5中所示，很清楚，最大益处在每10千克干饲料增加100克L-脯氨酸的Abfeed (10克/千克，1％，0.3克L-脯氨酸/天)喂养3个月后获得。

[0070] 为了证明强化的饲料增加动物肌肉组织中的游离L-脯氨酸，在所有组和不同喂养时间分析肌肉组织的游离L-脯氨酸。以增加了L-脯氨酸的饲料喂养3个月后，动物组织中游离L-脯氨酸的浓度明显增加，如图6中所示。如图6中所述，仅高度强化L-脯氨酸的饲料使得动物肌肉组织中的游离L-脯氨酸明显。较低水平的饲料强化，游离L-脯氨酸被充分调节。

[0071] 图7显示了活体出口期间动物肌肉组织中游离L-脯氨酸和各组动物伴随的重量损失百分数之间的关系。显然，组织L-脯氨酸和降低的重量损失之间存在相关性。大相关2
系数(R ＝0.4624)表明，组织中L-脯氨酸的高水平将导致动物活体出口期间重量损失减少。

[0072] 可证明喂以不同饲料制剂的动物的含水量之间无明显差异。因此，L-脯氨酸作为一种渗质的作用不是增加动物的含水量。L-脯氨酸的功能仅在渗透应激条件下是明显的，例如动物活体出口期间。活体出口期间观察到的重量降低完全归咎于机体水的损失。这将导致离子和氨基酸浓缩约1.2倍。然而，在出口的动物中，L-脯氨酸被浓缩1.4倍或更多，如图8中所示，这表明从来源的释放而非游离L-脯氨酸，例如较大L-脯氨酸含量的蛋白质。

[0073] 从该研究中可受益的另外两种产品已被确定，即罐头制造和冷冻。罐装和冷冻鲍鱼产品在远东是非常受欢迎的。由于生产期间遭受的流体损失的量，两种加工的效率都低。估计罐装结束时每100克活鲍鱼重量仅有40克。在这些加工中，通过增加L-脯氨酸的饲料改善鲍鱼的渗透势产生改善。

[0074] 图9显示了每10千克干饲料含100克L-脯氨酸，在冷冻期间动物的重量损失。该图描述了喂以强化饲料的动物失水相对于对照组动物的重量损失来说减少了。1个月后，喂以强化饲料的动物中性能表现增强明显。

[0075] 图10显示了与对照组的重量损失比较，烹饪过程之前鲍鱼罐头中的重量百分数。使用每10千克干饲料含100克L-脯氨酸的饮食的动物出现动物肉重量增加(27％～30％)。

[0076] 图11显示了与对照组的重量损失比较，罐头鲍鱼的烹饪过程期间的重量损失百分数，是目前的产业标准。至少三个月后，产量提高是明显的。

[0077] 图12描述了用L-脯氨酸强化的饲料喂养的动物的另一个优点，是抗氧化保护作用。测定了L-脯氨酸保护动物细胞不受自由基损伤的能力。预期自由基损伤在活体出口过程的氧化应激期间发生。出口后，动物的血细胞进行COMET分析，并测定相对尾力距。在喂以增加了L-脯氨酸的饮食的动物中，DNA损伤(如通过相对尾力距所测定的)明显较小。因此，预见包含L-脯氨酸增加的饲料的饮食可在缺氧、氧过多和频繁装卸期间在鲍鱼中导致有限的氧化损伤。

[0078] 目前有效浓度范围已确定为L-脯氨酸摄取2～100X增加。

[0079] 生产四种饲料制剂，用标准Abfeed 制剂作为对照，并且三种标准Abfeed 制剂每10千克Abfeed 批次增加2、100和1000克L-脯氨酸。根据标准养殖放养密度，使用四篮子鲍鱼(平均80克，或者出口大小起2个月)，并且根据标准养殖方案维持。

[0080] 将各篮子中的30只动物做好标记并称重，用于受控的生长评估：试验开始时、1个月后和2个月后再次。为了监测鲍鱼随时间的生长，图13中显示了Abfeed 中的L-脯氨酸浓度增加。

[0081] T1和T2时，每组取样10只动物以测定L-脯氨酸含量。

[0082] T1和T2时，按照标准养殖方案，将每组分别称重的20只动物出口至西北大学，36小时后再称重以测定每组遭受失水的程度。

[0083] 这些试验表明，Abfeed 中L-脯氨酸的最佳浓度总计为每10千克干重鲍鱼饲料含100克L-脯氨酸，每3天将50克干重鲍鱼饲料给予10千克鲍鱼。

[0084] 申请人令人意外地发现，用游离L-脯氨酸增加Abfeed 导致活体出口期间重量损失的降低。重量损失最有效的降低发生在3个月后。而且，已显示每10千克干饲料增加100克L-脯氨酸的Abfeed 喂给鲍鱼，历经3个月的时间，容易被动物接受，并且不负面影响动物的生长。

[0085] 游离L-脯氨酸作为水合剂是有效的，这一发现需要直觉跳跃，根据渗透应激下细胞蓄积L-脯氨酸以维持细胞容积，通过沿着渗透梯度将水吸回细胞内。就确定来说，L-脯氨酸仍未被暗示为可预防或限制水从经历水应激如当被运输时的鲍鱼中损失的外部补充剂。

[0086] 应当理解，本发明的细节变化是可能的，而没有偏离所附权利要求的范围。