大豆疫霉菌接种大豆的一种方法

摘要

本发明公开了一种大豆疫霉菌接种大豆的方法。本发明所提供的大豆疫霉菌接种大豆苗的方法是用大豆疫霉菌的孢子悬浮液接种胚根露出种皮的大豆苗。本发明的游动孢子根部接种法可以严格定量接种，避免了接种量过大而导致原本抗病的品种表现为感病性状，使其在抗源筛选的应用中更有效准确；同时本发明方法在实际操作中，具有占用空间小、所需的劳动量小、实验周期短、后期实验材料处理简单的优点。因此，本发明方法适合推广应用。

权利要求

1.一种大豆疫霉菌接种大豆的方法，是将胚根露出种皮的大豆苗浸入大豆疫霉菌的孢子悬浮液中，进行共培养；

所述大豆苗的胚根长至少为2cm；

所述方法中是将所述大豆苗的胚根浸入所述孢子悬浮液至少1cm；

所述孢子悬浮液的用量大于等于250个孢子/1个大豆苗；

所述共培养的时间为5-7天；

所述共培养的温度为22-24℃；

-2 -1

所述共培养的光强为250-290μmol·m ·s 。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述共培养的温度为22℃。

-2 -1

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述共培养的光强为270μmol·m ·s 。

4.权利要求1-3中任一所述方法在抗源筛选或病原菌毒力测定中的应用。

说明书

大豆疫霉菌接种大豆的一种方法

技术领域

[0001] 本发明涉及大豆疫霉菌接种大豆的一种方法，特别涉及一种游动孢子根部接种法。

背景技术

[0002] 大豆疫霉根腐病(Phytophthora root rot)是由大豆疫霉菌(Phytophthorasojae Kaufmann & Gerdemann)侵染引起的，是危害极其严重的、最具毁灭性的大豆病害之一，在环境条件有利于病害发生的情况下可导致大豆绝产。大豆抗病育种是防治大豆疫霉根腐病的最直接、最有效的途径。自20世纪90年代中期以来，中国开展了大规模的抗大豆疫霉根腐病种质资源筛选。抗源筛选的基本方法是采用Kaufmann和Gerdemann提出的下胚轴伤口接种方法。下胚轴伤口接种法作为一种国际通用的接种方法虽然比较成熟，但也有其不足：该方法对菌块大小、菌量多少及菌龄均很难控制，比实际田间发病的接菌量一般要大很多，这样的接种量压力过大，一般中抗或低抗品种可能会被鉴定为感病；另外，该方法所鉴定的抗病性主要是抗扩展，对于抗侵入的品种鉴定不准确，因而会减少筛选到的抗源数量，尤其对水平抗病品种的筛选是非常不利的，而且该方法在操作过程中容易因切口过大而导致植株死亡，会导致误筛；由于是苗期接种，每个处理至少需要10株，3次重复即30株，需要盆栽条件，占用空间较大，所需时间长，工作量较大；大豆疫霉根腐病是检疫性病害，实验材料量大，处理起来费工费时，风险性大。

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供一种大豆疫霉菌接种大豆的方法。

[0004] 本发明所提供的一种大豆疫霉菌接种大豆的方法，是用大豆疫霉菌的游动孢子悬浮液接种胚根露出种皮的大豆苗。

[0005] 所述方法具体可为将所述大豆苗浸入所述孢子悬浮液中，然后再进行共培养。

[0006] 其中，为保证接种效率，所述大豆苗的胚根长应至少为2cm。

[0007] 所述大豆苗的胚根浸入所述孢子悬浮液至少1cm。

[0008] 所述孢子悬浮液的用量可以大于等于250个孢子/1个大豆苗。

[0009] 所述共培养的时间可为5-7天。

[0010] 所述共培养的温度可为22℃-24℃，优选为22℃。

[0011] 所述共培养的光强可为250-290μmol·m-2·s-1，优选为270μmol·m-2·s-1。

[0012] 上述任一方法在抗源筛选或病原菌毒力测定中的应用。

[0013] 本发明模拟田间自然发病的状态(自然条件下大豆疫霉菌游动孢子侵染大豆根部)提供了一种游动孢子根部接种方法，该方法能使大豆的下胚轴及根部都会接触到游动孢子，游动孢子既可从根部侵入也可从下胚轴侵入，这正与田问的侵入方式比较接近；与下胚轴伤口接种法相比，游动孢子根部接种法可以严格定量接种，避免了接种量过大而导致原本抗病的品种表现为感病性状，使其在抗源筛选的应用中更有效准确；同时本发明方法在实际操作中，具有占用空间小、所需的劳动量小、实验周期短、后期实验材料处理简单的优点。本发明的方法简便易行，可以短时间在实验室中进行大批量抗性资源的鉴定。

具体实施方式

[0014] 实施例1、游动孢子根部接种法的实验步骤及接种量的确定

[0015] 本实施例用大豆疫霉菌1号生理小种(许修宏，吕慧颖，曲娟娟，杨庆凯.大豆疫霉根腐病菌生理小种鉴定及毒性分析，植物保护学报，2003，30(2)：125-128)为实验菌株，用绥农10(抗病品种)和sloan(感病品种)作为实验大豆品种。

[0016] 具体操作如下：

[0017] (1)大豆苗的准备

[0018] 将sloan大豆种子保湿催芽2-3天至其胚根长2cm左右时，选择胚根长一致的幼苗，将其分装到含有等量灭菌自来水的安瓿瓶(容积10ml)中，将下胚轴1cm及根全部浸在无菌水中，子叶留在瓶外，4株/瓶，以保证生长中有足够的空间，将其置于光照培养箱内，-2 -1在22℃、270μmol·m ·s 光强的条件下培养备用。

[0019] 绥农10的大豆种子也按照上述方法进行培养，得到绥农10的大豆苗。

[0020] (2)游动孢子的制备及计数

[0021] 将大豆疫霉菌1号生理小种接种于胡萝卜琼脂平板上，活化培养3-5天；将数块大豆疫霉菌菌碟放入无菌的空灭菌培养皿中，倒入灭菌自来水直至刚刚没过菌碟表面，每隔6小时换1次灭菌自来水，培养24-48小时，至产生大量孢子囊并释放出游动孢子；用双层纱布将大豆疫霉菌蝶过滤掉，保留滤液，即得到大豆疫霉菌1号生理小种的游动孢子悬浮液。

[0022] 用微量加样器吸取上述获得的游动孢子悬浮液5μl在干净载玻片上拖成一条细长的带，在10×10倍显微镜视野下计算游动孢子的总数，重复取样5次，检测后并稀释悬浮液中游动孢子的浓度，使大豆疫霉菌1号生理小种的游动孢子悬浮液的浓度为1000个孢子/ml悬浮液。

[0023] (3)游动孢子灌根接种

[0024] 用移液器吸取步骤(2)得到的游动孢子悬浮液，分别接种到步骤(1)中装有胚根露出种皮的大豆苗的10ml安瓿瓶中，每个瓶中4株大豆苗，每个大豆品种分别按10个游动孢子/瓶(即接种浓度为2.5个孢子/1株大豆苗)、100个游动孢子/瓶(即接种浓度为25个孢子/1株大豆苗)、1000个游动孢子/瓶(即接种浓度为250个孢子/1株大豆苗)、
3000个游动孢子/瓶(即接种浓度为750个孢子/1株大豆苗)、10000个游动孢子/瓶(即接种浓度为2500个孢子/1株大豆苗)的接种浓度进行接种。接种完毕后，将安瓿瓶放至-2 -1
光照培养箱内，在22℃、270μmol·m ·s 光强的条件下培养5-7天。

[0025] 以未接种任何菌的绥农10和sloan大豆种子在相同条件下培养相同时间作为对照。

[0026] (4)鉴定是否接种上大豆疫霉菌

[0027] 通过抗性鉴定的方法来鉴定是否接种上大豆疫霉菌。接种后7天观察实验结果，与空白对照相比植株根系无变化的为没接上菌的即抗病的，植株同时出现植株根尖变褐、须根缩短和须根数量减少的均为已经被接上菌的即感病的。

[0028] 实验设3次重复，结果如表1所示。

[0029] 表1、疫霉菌游动孢子不同浓度接种大豆的抗性表现

[0030]游动孢子数量(个/
瓶) 10 100 1000 3000 10000
大豆品种
绥农10(抗病品种) - - - - -
Sloan(感病品种) - + ++ ++ ++

[0031] -无症状；+根尖轻微变褐，须根不变短、数量不减少；++根尖变褐严重，须根变短、数量减少严重

[0032] 实验结果表明，对于感病品种，用100个游动孢子/瓶的接种浓度接种即可以表现感病症状，当接种浓度为1000个孢子/瓶(即为250个孢子/1株大豆苗)时接种症状最为明显；对于抗病品种，用10000个游动孢子/瓶的接种浓度接种也未表现症状。所以实际应用中，可以按250个孢子/1株大豆苗的浓度作为标准。采用该接种方法接种，可以使瓶内所有植株症状表现一致，避免了用下胚轴伤口接种法接种时经常出现的中间型问题(即有些植株发病，而另一些植株不发病，很难判定菌株的毒性和寄主的抗病性)，更有利于接种后的调查。

[0033] 实施例2、游动孢子根部接种法在抗源筛选中的应用

[0034] 本实施例所用的菌株如表2所示(李莹，杨明秀，文景芝，大豆疫霉菌子1代单游动孢株群体毒力变异，中国油料作物学报，2007(4)：460-465)。本实施例所用的大豆品种为9个国际通用的大豆疫霉菌鉴别寄主和11个生产上常用品种，品种目录见表3。

[0035] 表2、大豆疫霉菌生理小种及其对应的毒性公式(李莹，2007)

[0036]序号 毒性公式 生理小种 序号 毒性公式 生理小种
1 1a，7 3 5 3a，7 15
2 1a 6 7 1
3 3a，1b，7 7 1b，7 2
4 1a，1c，7 4

[0037] 实验方法如下：

[0038] 一、游动孢子根部接种法

[0039] 用表2中除1号生理小种外其余各生理小种分别感染表3中所示的20个品种的大豆苗，其中，每个菌株感染每个品种的大豆苗的实验方法，除了接种浓度均为250个孢子/1个大豆苗外，其余方法均与实施例1中所述一致。

[0040] 分别以未接种任何菌的同一品种的大豆苗在相同条件下培养相同时间作为对照。

[0041] 用游动孢子根部接种法，进行6个生理小种对20个品种的实验过程中，一共至少占用1m2的空间。准备大豆苗3-4天，制备游动孢子悬浮液(包括菌培养)4-7天，进行孢子接种时，准备时间约4小时，接种20个大豆品种对6个生理小种的操作可在3小时内完成。大豆疫霉根腐病是检疫性病害，试验后的材料均需要灭菌处理，1680株大豆苗用1个18L的灭菌锅1次灭菌，18个培养皿和420个安瓿瓶用200L干热灭菌器1次灭菌。

[0042] 二、下胚轴伤口接种法

[0043] 同样，用表2中除1号生理小种外其余各生理小种分别感染表3中所示的20个品种的大豆苗，下面以2号生理小种接种sloan大豆苗为例，详细叙述下胚轴伤口接种法的实验方法，其余各菌株分别接种各品种大豆苗的方法都与此相同。

[0044] (1)将大豆品种sloan的种子置于培养钵栽培到土壤或蛭石中，约10-12天后大豆植株对生真叶展开。

[0045] (2)将菌株2号生理小种接种于胡萝卜琼脂平板上，活化培养4-7天；

[0046] (3)当大豆植株对生真叶展开后，用消毒后的刀片在大豆子叶节下约1cm处划一伤口，伤口深度不超过大豆茎粗的三分之一，取扩繁后的带有培养基的病原菌菌丝体(边长3mm的方块)嵌入伤口中；接种后，在大豆苗的上部罩上塑料薄膜，向膜内浇水，保持膜内-2 -1相对湿度在90％以上，在22℃、270μmol·m ·s 光强的条件下培养。

[0047] 以未接种任何菌的sloan大豆种子在相同条件下培养相同时间作为对照。

[0048] (4)鉴定是否接种上大豆疫霉菌

[0049] 接种后，感病植株很快发生萎蔫，植株从接种部位折断，全株死亡，抗病植株仅在下胚轴伤口处发生局部变褐，植株继续生长。死苗率≥70％记为感病(S)，死苗率≤30％记为抗病(R)，死苗率介于30％-70％之间记为中间类型(I)。

[0050] 用下胚轴伤口接种法，进行6个菌种对20个品种的实验过程中，一共至少占用2
10m 的空间。准备植株10-12天，培养菌需4-7天，进行菌种小块分割时，准备时间约0.5小时，接种20个大豆品种对6个生理小种的操作可在20小时内完成。大豆疫霉根腐病是检疫性病害，试验后的材料均需要灭菌处理，将本实验的18个培养皿、140个培养钵、1680株大豆苗、土壤或蛭石等至少分15次放入18L的灭菌锅可以处理完毕。

[0051] 表3、20个大豆品种(系)资源对疫霉根腐病抗性鉴定结果

[0052]

[0053]

[0054] 注：1为下胚轴伤口接种法；2为游动孢子根部接种法；S为感病；R为抗病；I为中间型

[0055] 实验设三次重复，结果如表3所示。结果表明，两种接种方法在绝大多数品种资源上抗/感表现一致，少数抗/感鉴定结果相反，在鉴定结果相反的情况下，都是下胚轴伤口接种法鉴定为感病而游动孢子根部接种法为抗病，与下胚轴伤口接种方法相比，本发明的游动孢子根部接种法鉴定出的抗源的数量多了近20％，是下胚轴伤口接种时人为制造的伤口使得原本具有抗侵入能力的品种被淘汰了，导致其在实际应用中效率明显降低。

[0056] 以上结果进一步表明，在用游动孢子根部接种法进行20个大豆品种对6个生理小2
种的抗源筛选时，1m 的空间就可以；在安瓿瓶中加入约9ml灭菌的自来水，然后选择生长一致的幼苗，4株/瓶，摆好不同处理的安瓿瓶，这些准备操作可以在4h内完成，将培养好的游动孢子，用纱布过滤，后在显微镜下确定孢子悬浮液的浓度和接种量，接种操作可在3h内完成，从准备种子到完成鉴定一般15d就可以完成，比下胚轴伤口接种法节省1周的时间，如多批接种会更节省时间；材料灭菌处理时，大豆植株用1个18L的灭菌锅1次就可以处理完，培养皿、接种的安瓿瓶用200L干热灭菌器1次就可以处理完，下次可直接使用；在
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用下胚轴接种法进行20个大豆品种对6个生理小种的抗源筛选时，至少要用10m ；需要将生长不一致的幼苗剔除，做好处理标记，然后用手术刀进行下胚轴切伤，将菌块接种于伤口处，用脱脂棉蘸灭菌的无菌水夹在伤口处保湿，最后将每个处理的植株用塑料布保湿48h，这些操作完成最少也要20h左右，从准备种子到完成鉴定一般22d就可以完成；材料灭菌处理时，试验用到的土壤或蛭石、苗和培养钵等最少也要处理十几锅。

[0057] 实施例3、用游动孢子根部接种方法筛选抗源

[0058] 本实施例用的32个大豆品种为生产上常用品种，用表2中除1号生理小种外其余各生理小种分别进行试验。

[0059] 用表2中除1号生理小种外其余各生理小种分别感染表4中所示的32个品种的大豆苗，其中，每个菌株感染每个品种的大豆苗的实验方法，除了接种浓度均为250个孢子/1个大豆苗外，其余方法均与实施例1中所述一致。

[0060] 实验设3次重复，结果如表4所示。

[0061] 表4、32份大豆品种资源抗疫霉根腐病鉴定结果

[0062]

[0063]

[0064] 注：S为感病；R为抗病

[0065] 实验结果表明，大豆品种中抗疫霉根腐病资源十分丰富，对不同生理小种均能找到相应的抗源。同时也表明，疫霉菌的不同菌株毒性差异较大，如供试的32个大豆品种中，对所有6种供试毒性型均具有抗性的品种有5个，占15.6％，均感病的有2个，占6.3％。在所有192个互作中，亲和性互作为98个，占51％，非亲和性互作有94个，占49％，说明大豆