苁黄补肾制剂的检测方法

摘要

本发明涉及苁黄补肾制剂的检测方法，用于苁黄补肾制剂的质量控制。其中制剂指颗粒、片和硬胶囊。本发明公开了建立苁黄补肾新剂型质量标准的检测方法时，对已有的丸剂的检测方法进行了较大改进，具体为：增加了处方中熟地黄、菟丝子、五味子(酒蒸)的薄层定性鉴别，改变了肉苁蓉鉴别供试液的制备方法，更改了高效液相色谱含量测定成分为干扰少、含量高的松果菊苷。通过利用本发明的检测方法，可提高苁黄补肾新剂型的质量可控性，有利于产品的质量稳定。

权利要求

1.苁黄补肾制剂的检测方法，其特征在于用薄层色谱对肉苁蓉、熟地黄、菟丝子、酒蒸炮制五味子进行定性鉴别和用高效液相色谱测定肉苁蓉中活性成分松果菊苷的含量；

(1)肉苁蓉取苁黄补肾颗粒、片或者是硬胶囊剂型制剂适量，研细，称取粉末0.5～

1.0g，加水20ml，超声10min使溶散，离心转5min，取上清液再真空抽滤，滤液过强酸性阳离子交换树脂柱，用20ml水洗柱，再用0.5～4mol/l氨水溶液20～60ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用乙醇2ml溶解，静置，取上清液作为供试品溶液，甜菜碱对照品加乙醇制成每1ml含

5mg的对照品溶液；吸取供试品溶液10μl，对照品溶液5μl，分别点样于同一硅胶G薄层板上，以甲醇-冰醋酸-水为展开剂，比例是10～20∶0.5～2∶2～8，展开，取出，晾干，喷以改良碘化铋钾试液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(2)熟地黄取苁黄补肾颗粒、片或者是硬胶囊剂型制剂适量，研细，称取粉末1.0～

3.0g，加水30ml，超声处理10min，离心转5min，取上清液用正丁醇、氯仿或者是乙酸乙酯提取2次，每次15ml，合并提取液，提取液浓缩至干，残渣加乙醇1ml溶解，作为供试品溶液；

5-羟甲基糠醛对照品加乙醇制成每1ml含0.5mg的对照品溶液，吸取供试品溶液10μl，对照品溶液5μl，分别点样于同一硅胶GF254薄层板上，以比例为1～8∶2～10石油醚II-乙酸乙酯上层液为展开剂，展开，取出，晾干，置于254nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的暗斑点；

(3)菟丝子取苁黄补肾颗粒、片或者是硬胶囊剂型制剂适量，研细，称取粉末1.0～

3.0g，加氯仿、无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯或者是正丁醇10ml，超声处理15min，滤过，滤液浓缩至干，加乙醇1ml溶解残渣，作为供试品溶液，山萘素对照品加乙醇制成每1ml含0.2mg的对照品溶液，吸取供试品溶液10μl，对照品溶液5μl，分别点样于同一硅胶G薄层板上，以比例为4～10∶4～8∶1～6甲苯-乙酸乙酯-甲醇为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3％三氯化铝乙醇 溶液，置于365nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

(4)酒蒸炮制五味子取苁黄补肾颗粒、片或者是硬胶囊剂型制剂适量，研细，称取粉末

8.0～15.0g，加入甲醇、无水乙醇、氯仿、乙酸乙酯或者是正丁醇20ml，超声处理或加热回流30min，滤过，滤液浓缩至约1ml，作为供试品溶液，五味子乙素对照品加乙醇制成每1ml含0.4mg的对照品溶液；吸取供试品溶液对照品溶液各10μl，分别点样于同一硅胶GF254薄层板上，以比例为8～20∶2～8∶0.5～2石油醚I-甲酸乙酯-甲酸上层液为展开剂，展开，取出，晾干，置于254nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的暗斑点，(5)肉苁蓉中活性成分松果菊苷的含量测定：

色谱条件与系统适用性试验色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为比例是15∶10∶75甲醇-乙腈-1％醋酸溶液；检测波长为334nm，理论塔板数按松果菊苷峰计算应不低于4000；

对照品溶液制备精密称取松果菊苷对照品适量，置棕色瓶中，加流动相配成每1ml含

0.16mg的对照品溶液；

供试品溶液制备取本品适量，研细，取0.5g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，精密加流动相20ml，密塞，摇匀，称定重量，浸泡0.5小时，超声处理40min，取出，放冷，再称定重量，加流动相补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液，用0.45μm的微滤膜滤过，滤液置棕色瓶中，即得；

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定松果菊苷含量。

说明书

苁黄补肾制剂的检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于中成药质量控制领域。

背景技术

[0002] 苁黄补肾处方由肉苁蓉、熟地黄、菟丝子、五味子(酒蒸)四味药材组成，具有滋补肾阴、强筋壮骨的功效。此处方可制成丸、颗粒、片、硬胶囊等剂型。目前，公开的药品标准中只收载了丸剂标准(《国家药品监督管理局国家中成药标准汇编》内科肾系分册)，苁黄补肾其他剂型标准未见报道。丸剂标准中只有显微鉴别，肉苁蓉TLC鉴别和毛蕊花糖苷HPLC含量测定。此药处方由四味药组成，显然丸剂标准并不完善，不能有效保证产品的质量。

[0003] 同时，我们在试验中还发现：涉及的颗粒、片以及硬胶囊这三种苁黄补肾新剂型在用丸剂标准中肉苁蓉鉴别项下供试液制备方法得到的供试液，其薄层色谱上的斑点与甜菜碱对照品色谱的斑点在位置上存在一定的差距。

[0004] 另外，颗粒、片以及硬胶囊这三种苁黄补肾新剂型在做毛蕊花糖苷的HPLC含量测定时，阴性供试液有较大的干扰峰存在。试验不同的色谱柱和流动相组成均不能很好的把干扰峰与毛蕊花糖苷的峰分开。

发明内容

[0005] 本发明目的是提供一种苁黄补肾制剂的检测方法，从而提高苁黄补肾新剂型质量可控性，保证产品质量的稳定。其中制剂是指颗粒、片和硬胶囊。

[0006] 本发明对丸剂标准检测方法进行了较大的改进，具体为：增加了处方中熟地黄、菟丝子、五味子(酒蒸)的薄层定性鉴别，改变了肉苁蓉鉴别供试液的制备方法，更改了高效液相色谱含量测定成分为干扰小、含量高的松果菊苷。

[0007] 之所以改为测定松果菊苷是因为用原丸剂标准中的含测方法检测苁黄补肾新剂型的毛蕊花糖苷含量时发现有比较大的干扰。试验了甲醇-乙腈-1％乙酸(13∶10∶77，11∶9∶80，15∶10∶75)、甲醇-0.1％甲酸(28∶72，35∶65)流动相，以及
kromasil-C18(250mm×4.6mm，5μm)和Ultimate-C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，结果均不能使干扰峰与毛蕊花糖苷的峰分开。而检测松果菊苷时没有发现明显干扰峰。由于中药的复杂性，以及不能得到原丸剂标准申报厂家的丸剂样品进行比对研究，所以产生这种检测毛蕊花糖苷时存在比较大干扰问题的原因现在还不能确定，可能是所用的药材产地不同或者是制造工艺中的具体操作参数不同等原因造成的。

[0008] 有文献报道，肉苁蓉中起改善性功能功效的主成分是苯乙醇苷类化合物。松果菊苷、毛蕊花糖苷都属于含量较高的苯乙醇苷类化合物。经过我们对市售5个不同产地肉苁蓉药材(其中2个为新疆产的管花肉苁蓉)的检测，发现4个产地松果菊苷的含量均大于毛蕊花糖苷含量，另一个产地的药材中两种成分的含量相当。所以改为检测干扰小、含量高的松果菊苷的含量也能较好的反映产品质量。

[0009] 本发明所涉及的苁黄补肾新剂型的制法，除辅料品种和用量、制成总量、干燥工艺、最终剂型不同外，其它均按照丸剂标准中的处方和制法制造。整个制造方法与丸剂比较并没有大的、本质的改变。所以按照药品注册管理办法的分类，本发明所涉及的苁黄补肾颗粒、片或者是硬胶囊制剂应该属于8类新药(即仿制药改剂型)。

[0010] 本发明提供了苁黄补肾制剂——颗粒、片、硬胶囊——的检测方法，包括用薄层色谱(TLC)对肉苁蓉、熟地黄、菟丝子、五味子(酒蒸)进行定性鉴别和用高效液相色谱(HPLC)测定肉苁蓉中活性成分——松果菊苷(echinacoside)的含量。

[0011] 1、肉苁蓉的薄层鉴别

[0012] 取苁黄补肾制剂(颗粒、片或者是硬胶囊)适量，研细，称取粉末0.5～1.0g，加水20ml，超声10min使溶散，离心(4500r/min)5min，取上清液再真空抽滤，滤液过强酸性阳离子交换树脂柱，用20ml水洗柱，再用0.5～4mol/l氨水溶液20～60ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用乙醇2ml溶解，静置，取上清液作为供试品溶液。另取缺肉苁蓉的阴性样品，同法制成阴性供试液。甜菜碱对照品加乙醇制成每1ml含5mg的对照品溶液。吸取供试品溶液和阴性供试液各10μl，对照品溶液5μl，分别点样于同一硅胶G薄层板上，以甲醇-冰醋酸-水(10～20；0.5～2∶2～8)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以改良碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性样品色谱无对应斑点。

[0013] 2、熟地黄的薄层鉴别

[0014] 取苁黄补肾制剂(颗粒、片或者是硬胶囊)适量，研细，称取粉末1.0～3.0g，加水30ml，超声处理10min，离心(4500r/min)5min，取上清液用正丁醇(氯仿、乙酸乙酯)提取
2次，每次15ml，合并提取液，提取液浓缩至干，残渣加乙醇1ml溶解，作为供试品溶液。另取缺熟地黄的阴性样品，同法制成阴性供试液。5-羟甲基糠醛对照品加乙醇制成每1ml含
0.5mg的对照品溶液。吸取供试品溶液和阴性供试液各10μl，对照品溶液5μl，分别点样于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚II-乙酸乙酯(1～8∶2～10)上层液为展开剂，展开，取出，晾干，置于254nm紫外灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的暗斑点。阴性样品色谱无对应暗斑点。

[0015] 3、菟丝子的薄层鉴别

[0016] 取苁黄补肾制剂(颗粒、片或者是硬胶囊)适量，研细，称取粉末1.0～3.0g，加氯仿(无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇)10ml，超声处理15min，滤过，滤液浓缩至干，加乙醇1ml溶解残渣，作为供试品溶液。另取缺菟丝子的阴性样品，同法制成阴性供试液。山萘素对照品加乙醇制成每1ml含0.2mg的对照品溶液。吸取供试品溶液和阴性供试液各10μl，对照品溶液5μl，分别点样于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇(4～10∶4～
8∶1～6)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3％三氯化铝乙醇溶液，置于365nm紫外灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性样品色谱无对应斑点。

[0017] 4、五味子(酒蒸)的薄层鉴别

[0018] 取苁黄补肾制剂(颗粒、片或者是硬胶囊)适量，研细，称取粉末8.0～15.0g，加入甲醇(无水乙醇、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇)20ml，超声处理或加热回流30min，滤过，滤液浓缩至约1ml，作为供试品溶液。另取缺五味子的阴性样品，同法制成阴性供试液。五味子乙素对照品加乙醇制成每1ml含0.4mg的对照品溶液。吸取供试品溶液、阴性供试液和对照品溶液各10μl，分别点样于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚I-甲酸乙酯-甲酸(8～20∶2～8∶0.5～2)上层液为展开剂，展开，取出，晾干，置于254nm紫外灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的暗斑点。阴性样品色谱无对应暗斑点。

[0019] 5、肉苁蓉中松果菊苷含量测定

[0020] 色谱条件与系统适用性试验色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为甲醇-乙腈-1％醋酸溶液(15∶10∶75)；检测波长为334nm。理论塔板数按松果菊苷峰计算应不低于4000。

[0021] 对照品溶液制备精密称取松果菊苷对照品适量，置棕色瓶中，加流动相配成每1ml含0.16mg的对照品溶液

[0022] 供试品溶液制备取苁黄补肾制剂(颗粒、片或者是硬胶囊)适量，研细，取0.5g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，精密加流动相20ml，密塞，摇匀，称定重量，浸泡0.5小时，超声处理40min，取出，放冷，再称定重量，加流动相补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液，用0.45μm的微滤膜滤过，滤液置棕色瓶中，即得。

[0023] 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定。

[0024] 计算按下式计算：

[0025]

[0026] 式中：

[0027] W：松果菊苷含量，％；

[0028] Cs：对照品中松果菊苷的浓度，mg/ml；

[0029] M：供试品的称样量，mg；

[0030] As：对照品中松果菊苷的色谱峰面积；

[0031] Ai：供试品中松果菊苷的色谱峰面积。

[0032] 本发明所述苁黄补肾制剂中松果菊苷的含量测定方法经过了方法学考察试验(由于本发明所涉及的片剂和硬胶囊都是从颗粒剂通过机器压制或装填而成，只是外形的变化，没有成分变化，所以以下发明内容所采用的试验对象如果未有说明均为颗粒剂。)：

[0033] (1)仪器和试药

[0034] SPD-10Avp紫外检测仪日本岛津公司；P4000四元泵美国热电公司；AT-130色谱柱恒温箱天津市恒奥科技发展有限公司；HN1006超声清洗机中国华南超声设备厂；HM202电子分析天平日本AND公司

[0035] 松果菊苷(111670-200502)中国药品生物制品检定所；苁黄补肾制剂颗粒(批号070801、070802、070803，规格为2.0g/袋)为广州美晨药业有限公司提供；乙睛为色谱纯迪马公司。其余试剂为分析纯。

[0036] (2)色谱条件采用kromasil-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，柱温30℃；流动相为甲醇-乙腈-1％醋酸溶液(15∶10∶75)；流速为1ml/min；检测波长为334nm。

[0037] (3)对照品溶液制备精密称取松果菊苷对照品适量，置棕色瓶中，加流动相配成每1ml含0.16mg的对照品溶液

[0038] (4)供试品溶液制备取本品适量，研细，取0.5g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，精密加流动相20ml，密塞，摇匀，称定重量，浸泡0.5小时，超声处理40min，取出，放冷，再称定重量，加流动相补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液，用0.45μm的微滤膜滤过，滤液置棕色瓶中，即得。取缺肉苁蓉的阴性样品0.3g，同法制成阴性供试液。

[0039] (5)线性关系考察精密吸取上述对照品溶液3μl、5μl、7μl、10μl、12μl分别注入液相色谱仪，以峰面积A为横坐标，以进样量W(mg)为纵坐标，计算得出回归方程：W-5 -10＝-3.3143×10 +7.97149×10 A，R＝0.99996。松果菊苷在0.48μg——1.92μg之间有良好的线性关系。

[0040] (6)阴性对照试验精密吸取上述对照品溶液、供试液和阴性供试液各5μl，注入液相色谱仪，结果在松果菊苷保留时间位置上阴性供试液色谱没有明显干扰。

[0041] (7)加样回收率试验精密适当称取本品9份，每3份为1组，每组均按高、中、低三个浓度分别加入上述对照品溶液3ml、2ml、1ml。按照上述供试品溶液制备方法制备并测定。结果平均回收率为99.1％，RSD％＝1.52％。

[0042] (8)精密度试验精密吸取对照液5μl注入液相色谱仪，重复6次，记录峰面积。其RSD＝1.03％，表明本方法具有良好的精密度。

[0043] (9)稳定性试验分别于0、2、4、6、8小时精密吸取供试液各5μl注入液相色谱仪，记录峰面积。其RSD＝1.41％，表明供试液在0-8小时内稳定。

[0044] (10)重复性试验对同一批样品，按照上述测定方法，重复测定6次。其RSD＝1.01％，表明本方法具有良好的重复性。

[0045] (11)样品测定按照上述方法对三批样品进行测定，结果见下表(按公式计算所得质量百分比含量乘以制剂规格即为所列单位含量)

[0046] 表1苁黄补肾颗粒中松果菊苷的含量(n＝3)

[0047]

[0048] 本发明具有以下优点：

[0049] 1、本发明对苁黄补肾制剂——颗粒、片、硬胶囊——中四味药材都分别进行薄层色谱定性鉴别，对所含的一种活性成分进行含量测定。与丸剂标准检测方法相比，本发明更完善、更科学合理。。

[0050] 2、本发明首次提出对苁黄补肾制剂中除肉苁蓉外其他三味药材的薄层鉴别方法，并对丸剂标准检测方法中不适合检测苁黄补肾新剂型(颗粒、片、硬胶囊)的部分进行了较大的修改(改变了肉苁蓉鉴别供试液的制备方法，更改了高效液相色谱含量测定成分为干扰少、含量高的松果菊苷)。从而提高了苁黄补肾新剂型的质量控制水平，保障产品质量的稳定

[0051] 3、本发明专属性强、重复性好，可用于该药品的日常质量控制。

附图说明

[0052] 下面给出附图用于进一步说明本发明，但并不对本发明构成限制。

[0053] 图1是本发明的肉苁蓉的TLC图；

[0054] 图2是本发明的熟地黄的TLC图；

[0055] 图3是本发明的菟丝子的TLC图；

[0056] 图4是本发明的五味子的TLC图；

[0057] 图5是本发明的苁黄补肾胶囊HPLC色谱图。

具体实施方式

[0058] 下面列举检测的实施例进一步详细说明本发明，但对本发明并没有限制。

[0059] 实施例一

[0060] 1.仪器

[0061] 紫外点样仪上海安亭电子仪器厂；SPD-10Avp紫外检测仪日本岛津公司；P4000四元泵美国热电公司；AT-130色谱柱恒温箱天津市恒奥科技发展有限公司；HN1006超声清洗机中国华南超声设备厂；HM202电子分析天平日本AND公司；4K15C高速冷冻离心机；德国SIGMA公司。

[0062] 2.试药

[0063] 硅胶G青岛海洋化工有限公司；甜菜碱(894-200202)、5-羟甲基糠醛(111626-200402)、五 味子 乙素 (765-200104)、山 萘素(0861-200002)、松果 菊 苷(111670-200502)中国药品生物制品检定所；苁黄补肾颗粒(批号070801，规格2.0g/袋)，苁黄补肾片(批号070811，规格0.5g/片)，苁黄补肾硬胶囊(批号070821，规格0.4g/粒)为广州美晨药业有限公司提供；乙睛为色谱纯迪马公司。其余试剂为分析纯。

[0064] 3.薄层鉴别(以颗粒剂为例，片剂和硬胶囊剂与之相同)

[0065] 3.1.肉苁蓉

[0066] 取苁黄补肾颗粒适量，研细，称取粉末0.5～1.0g，加水20ml，超声10min使溶散，离心(4500r/min)5min，取上清液再真空抽滤，滤液过强酸性阳离子交换树脂柱，用20ml水洗柱，再用0.5～4mol/l氨水溶液20～60ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用乙醇2ml溶解，静置，取上清液作为供试品溶液。甜菜碱对照品加乙醇制成每1ml含5mg的对照品溶液。吸取供试品溶液10μl，对照品溶液5μl，分别点样于同一硅胶G薄层板上，以甲醇-冰醋酸-水(10～20∶0.5～2∶2～8)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以改良碘化铋钾试液。结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

[0067] 3.2.熟地黄

[0068] 取苁黄补肾颗粒适量，研细，称取粉末1.0～3.0g，加水30ml，超声处理10min，离心(4500r/min)5min，取上清液用正丁醇(氯仿、乙酸乙酯)提取2次，每次15ml，合并提取液，提取液浓缩至干，残渣加乙醇1ml溶解，作为供试品溶液。5-羟甲基糠醛对照品加乙醇制成每1ml含0.5mg的对照品溶液。吸取供试品溶液10μl，对照品溶液5μl，分别点样于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚II-乙酸乙酯(1～8∶2～10)上层液为展开剂，展开，取出，晾干，置于254nm紫外灯下检视。结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的暗斑点。

[0069] 3.3.菟丝子

[0070] 取苁黄补肾颗粒适量，研细，称取粉末1.0～3.0g，加氯仿(无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇)10ml，超声处理15min，滤过，滤液浓缩至干，加乙醇1ml溶解残渣，作为供试品溶液。山萘素对照品加乙醇制成每1ml含0.2mg的对照品溶液。吸取供试品溶液10μl，对照品溶液5μl，分别点样于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇(4～10∶4～8∶1～6)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3％三氯化铝乙醇溶液，置于365nm紫外灯下检视。结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

[0071] 3.4.五味子(酒蒸)

[0072] 取苁黄补肾颗粒适量，研细，称取粉末8.0～15.0g，加入甲醇(无水乙醇、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇)20ml，超声处理或加热回流30min，滤过，滤液浓缩至约1ml，作为供试品溶液。五味子乙素对照品加乙醇制成每1ml含0.4mg的对照品溶液。吸取供试品溶液和对照品溶液各10μl，分别点样于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚I-甲酸乙酯-甲酸(8～20∶2～8∶0.5～2)上层液为展开剂，展开，取出，晾干，置于254nm紫外灯下检视。结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的暗斑点。

[0073] 图1中所指的“1”是供试液，“2”是对照液，“3”是阴性供试液。

[0074] 图2中所指的“1”是供试液，“2”是对照液，“3”是阴性供试液。

[0075] 图3中所指的“1”及“3”是对照品，“2”及“5”是供试液，“4”是阴性供试液。

[0076] 图4中所指的“1”及“4”是对照液，“2”及“5”是供试液，“3”是阴性供试液。

[0077] 4.含量测定(以颗粒剂为例，片剂和硬胶囊剂除结果外其他与之相同)。

[0078] 4.1.色谱条件色谱柱采用kromasil-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱温30℃；流动相为甲醇-乙腈-1％醋酸溶液(15∶10∶75)；流速为1ml/min；检测波长为334nm。

[0079] 4.2.对照品溶液制备精密称取松果菊苷对照品适量，置棕色瓶中，加流动相配成每1ml含0.16mg的对照品溶液

[0080] 4.3.供试品溶液制备取苁黄补肾颗粒适量，研细，取0.5g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，精密加流动相20ml，密塞，摇匀，称定重量，浸泡0.5小时，超声处理40min，取出，放冷，再称定重量，加流动相补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液，用0.45μm的微滤膜滤过，滤液置棕色瓶中，即得。

[0081] 4.4.测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定。(按公式计算所得质量百分比含量乘以制剂规格即为所列单位含量。)

[0082] 4.5.结果颗粒剂每袋含松果菊苷18.1mg

[0083] 片剂每片含松果菊苷4.5mg

[0084] 硬胶囊剂每粒含松果菊苷3.9mg

[0085] 图5中所指的“I”是供试液，“II”是对照液，“III”是阴性供试液，“a”是松果菊苷。

[0086] 图1、2、3、4、5所示阴性试验结果是为了验证和说明本发明。在对检测方法进行专属性考察时一定要做阴性试验。当检测方法确定后，在日常的检测中一般并不需要做阴性试验。