Exendin-4新活性异构体及其应用

摘要

本发明涉一种Exendin-4新活性异构体及其应用，属有机化学及化学药品领域，及其在II型糖尿病治疗药物中的应用。Exendin-4序列中部分肽键由氨基酸的非α-氨基或羧基取代相应氨基酸的α-氨基或羧基与相邻氨基酸的α-羧基或氨基组成。本发明的Exendin-4活性异构体及其修饰物在血浆中37℃进行酶解，然后用HPLC分析水解产物，并与正常结构进行比较，它们比原有结构半衰期均有延长。对exendin-4活性异构体的药效学实验表明，具有显著降低实验动物血糖的作用。

权利要求

1.一种Exendin-4新活性异构体，其特征在于其氨基酸序列为：X1-His-Gly-X2-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-X3-Leu-Ser-Lys-Tyr-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-X4-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2；

其中：X1为乙酰基或氢，

X2是：Glu或γ-Glu或β-Asp；

X3是：Asp或γ-Glu或β-Asp；

X4是：Glu或γ-Glu；

其氨基酸序列中至少包括一种β或γ氨基酸，其位置是X2、X3、X4。

2.如权利要求1所述的Exendin-4新活性异构体，其特征在于其氨基酸序列为：His-Gly-βAsp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Tyr-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2。

3.如权利要求1所述的Exendin-4新活性异构体，其特征在于其氨基酸序列为：His-Gly-γGlu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Tyr-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2。

4.如权利要求1或2或3所述的Exendin-4新活性异构体在制备治疗糖尿病的药物中的应用。

说明书

Exendin-4新活性异构体及其应用

技术领域

[0001] 本发明属有机化学及化学药品领域，特别涉及exendin-4多肽的活性异构体和修饰物，及其在II型糖尿病治疗药物中的应用。

背景技术

[0002] Exendin-4是由美国西南部的希拉毒蜥唾液腺中分泌的一种多肽，含有39个氨基酸残基，与人的GLP-1有53％的同源性，与GLP-1受体有高度亲合性并具有相似的生理功能。

[0003] 胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide1，GLP-1)是一种肠促胰岛素，GLP-1能够刺激胰岛β细胞再生，促进胰岛素分泌，抑制胰高血糖素的释放，减慢胃排空速率，抑制食物摄入。其促胰岛素分泌作用是根据血糖水平进行的，故可降低低血糖的发生率，且对其他促胰岛素分泌剂不敏感的2型糖尿病病人仍有降糖作用，同时GLP-1还可以减轻2型糖尿病患者的体重，是一类全新的糖尿病治疗药物。由于GLP-1容易被二肽酶IV-Dipeptidylpeptidase-4(DPP-IV)水解，血浆半衰期为1-2分钟，使其无法作为临床药物使用。

[0004] Exendin-4具有促进胰岛素分泌的作用、抑制胰高血糖素释放、降低甘油三酯水平和延迟胃酸分泌活性等药理作用，此外Exendin-4还能促进胰岛β细胞增生、刺激β细胞新生及抑制β细胞凋亡的功能。在哺乳动物中可以抵制二肽基肽酶的水解。其血浆中的半衰期要比GLP-1更长。因此在治疗2型糖尿病方面比GLP-1具有很多潜在的优势。

[0005] 目前人工合成的Exendin-4已由Amylin公司与EliLilly公司共同研究开发为新型降血糖药物，2005年4月已由美国FDA批准上市，用于二甲双胍、磺酰脲类或二甲双胍和磺酰脲类联合应用不能充分控制血糖的2型糖尿病患者。

[0006] 由于exendin-4为多肽，做为肽类药物其具有较差的膜通透性、易被酶类水解、易清除、在某些情况下难溶解及易聚集，这些特性使得肽类作为口服治疗药物时具有较低的生物利用度。作为外部给药的多肽，在胃肠、血液及其它组织中对蛋白水解酶的敏感性使其快速清除，显著降低了在应答过程中的功效，所以提高肽类药物的稳定性是非常重要的。

发明内容

[0007] 本发明提供一种新的Exendin-4活性异构体及其应用，增强肽类激素的稳定性，延长它的半衰期以提高疗效，这是肽类激素的一个普遍需要解决的问题，所以改造肽类激素的结构、增加它们在体内的稳定性、提高生物利用度是非常重要的。

[0008] 本发明主要对exendin-4的结构进行了修饰，设计了活性肽异构体，在exendin-4原有结构的基础上，将其氨基酸序列中部分氨基酸用相应的β-、γ-氨基酸代替，并对它们的活性、体外稳定性进行了测定，对它们的药理药效进行了研究。结果表明，这些异构体在保持了原有活性的基础上体内外稳定性大大提高，这一发明为exendin-4活性机理的研究及新药开发提供了理论依据。

[0009] 本发明的活性异构体结构是exendin-4的氨基酸序列中部分氨基酸用其相应的β-氨基酸、γ-氨基酸及其它氨基酸代替的氨基酸序列。Exendin-4天然序列为：

[0010] His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2

[0011] 本发明Exendin-4活性异构体具有的氨基酸序列为：

[0012] X-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2，其中：

[0013] X为乙酰基或氢

[0014] 位置3的氨基酸可以是：Glu、γ-Glu、β-Asp、β-Ala

[0015] 位置4的氨基酸可以是：Gly、β-Ala

[0016] 位置6的氨基酸可以是：Phe、β-Phe

[0017] 位置7的氨基酸可以是：Thr、Ser

[0018] 位置9的氨基酸可以是：Glu、γ-Glu、Asp、β-Asp

[0019] 位置13的氨基酸可以是：Gln、Tyr、γ-Glu

[0020] 位置17的氨基酸可以是：Gln、Tyr、γ-Glu

[0021] 位置24的氨基酸可以是：Gln、Tyr、γ-Glu。

[0022] 本发明所述Exendin-4新活性异构体序列中，至少一个或多个肽键是由Asp的β-羧基和Leu的α-氨基，Glu的γ-羧基和Gly的α-氨基，Glu的γ-羧基和Glu的α-氨基，Ser的α-羧基和Lys的ε-氨基，Glu的γ-羧基和Ala的α-氨基，Glu的γ-羧基和Trp的α-氨基，Leu的α-羧基和Lys的ε-氨基，Glu的γ-羧基和β-Ala的α-氨基，β-Phe的羧基和Thr的α-氨基，β-Arg的羧基和Leu的α-氨基，γ-Arg的羧基和Leu的α-氨基。化合物可包含在药用载体组份中。式中英文缩写表示：His组氨酸，Ala丙氨酸，Glu谷氨酸，Gly甘氨酸，Thr苏氨酸，Phe苯丙氨酸，Ser丝氨酸，Asp天冬氨酸，Val缬氨酸，Leu亮氨酸，Lys赖氨酸，Gln谷氨酰胺，Met甲硫氨酸，Arg精氨酸，Ile异亮氨酸，Trp色氨酸，Asn天冬酰胺，Pro脯氨酸。

[0023] 本发明所述Exendin-4新活性异构体还包括将exendin-4天然氨基酸序列中的Gln替换为Tyr，其余部分氨基酸用其相应的β-氨基酸、γ-氨基酸代替的氨基酸序列。

[0024] 本发明以下列化合物为优选，但不限于所列出的化合物。(X为乙酰基或氢)[0025] 本发明化合物之一(exendin-4 β-Asp9)氨基酸序列如下：

[0026] X-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-βAsp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2

[0027] 有一个肽键分别是由Asp的β-羧基和Leu的α-氨基生成。

[0028] 本发明化合物之二(exendin-4Tyr13 β-Asp9)氨基酸序列如下：

[0029] X-Hi s-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-βAsp-Leu-Ser-Lys-Tyr-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2

[0030] 有一个肽键分别是由Asp的β-羧基和Leu的α-氨基生成，13号位的Gln换为Tyr。

[0031] 本发明化合物之三(exendin-4 γ-Glu3，17，24)氨基酸序列如下：

[0032] X-His-Gly-γGlu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-γGlu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-γGlu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2

[0033] 有三个肽键分别是由Glu的γ-羧基和Gly的α-氨基生成，Glu的γ-羧基和Ala的α-氨基，Glu的γ-羧基和Trp的α-氨基生成。

[0034] 本发明化合物之四(exendin-4 Tyr13，γ-Glu3，17，24)氨基酸序列如下：

[0035] X-His-Gly-γGlu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Tyr-Met-Glu-Glu-γGlu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-γGlu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2

[0036] 有三个肽键分别是由Glu的γ-羧基和Gly的α-氨基生成，Glu的γ-羧基和Ala的α-氨基，Glu的γ-羧基和Trp的α-氨基生成，13号位的Gln换为Tyr。

[0037] 本发明化合物之五(exendin-4γ-Glu3，17)氨基酸序列如下：

[0038] X-His-Gly-γGlu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-γGlu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2

[0039] 有二个肽键分别是由Glu的γ-羧基和Gly的α-氨基生成，Glu的γ-羧基和Ala的α-氨基生成。

[0040] 本发明化合物之六(exendin-4 Tyr13，γ-Glu3，17)氨基酸序列如下：

[0041] X-His-Gly-γGlu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Tyr-Met-Glu-Glu-γGlu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2

[0042] 有二个肽键分别是由Glu的γ-羧基和Gly的α-氨基生成，Glu的γ-羧基和Ala的α-氨基生成，13号位的Gln换为Tyr。

[0043] 本发明化合物之七(exendin-4 γ-Glu17，24)氨基酸序列如下：

[0044] X-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-γGlu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-γGlu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2

[0045] 有三个肽键分别是由Glu的γ-羧基和Ala的α-氨基，Glu的γ-羧基和Trp的α-氨基生成。

[0046] 本发明化合物之八(exendin-4 Tyr13，γ-Glu17，24)氨基酸序列如下：

[0047] X-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Tyr-Met-Glu-Glu-γGlu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-γGlu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2

[0048] 有三个肽键分别是由Glu的γ-羧基和Ala的α-氨基，Glu的γ-羧基和Trp的α-氨基生成，13号位的Gln换为Tyr。

[0049] 本发明化合物之九(exendin-4 γ-Glu3，24)氨基酸序列如下：

[0050] X-His-Gly-γGlu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-γGlu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2

[0051] 有三个肽键分别是由Glu的γ-羧基和Gly的α-氨基生成，Glu的γ-羧基和Trp的α-氨基生成。

[0052] 本发明化合物之十(exendin-4 Tyr13，γ-Glu3，24)氨基酸序列如下：

[0053] X-His-Gly-γGlu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Tyr-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-γGlu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2

[0054] 有三个肽键分别是由Glu的γ-羧基和Gly的α-氨基生成，Glu的γ-羧基和Trp的α-氨基生成，13号位的Gln换为Tyr。

[0055] 本发明化合物之十一(exendin-4 γ-Glu3)氨基酸序列如下：

[0056] X-His-Gly-γGlu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2

[0057] 有一个肽键是由Glu的γ-羧基和Gly的α-氨基生成。

[0058] 本发明化合物之十二(exendin-4 Tyr13，γ-Glu3)氨基酸序列如下：

[0059] X-His-Gly-γGlu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Tyr-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2

[0060] 有一个肽键是由Glu的γ-羧基和Gly的α-氨基生成。13号位的Gln换为Tyr。

[0061] 本发明化合物之十三(exendin-4 γ-Glu17)氨基酸序列如下：

[0062] X-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-γGlu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2

[0063] 有一个肽键是由Glu的γ-羧基和Ala的α-氨基生成。

[0064] 本发明化合物之十四(exendin-4 Tyr13，γ-Glu17)氨基酸序列如下：

[0065] X-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Tyr-Met-Glu-Glu-γGlu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2

[0066] 有一个肽键是由Glu的γ-羧基和Ala的α-氨基生成，13号位的Gln换为Tyr。

[0067] 本发明化合物之十五(exendin-4 γ-Glu24)氨基酸序列如下：

[0068] X-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-γGlu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2

[0069] 有一个肽键是由Glu的γ-羧基和Trp的α-氨基生成。

[0070] 本发明化合物之十六(exendin-4 Tyrl3，γ-Glu24)氨基酸序列如下：

[0071] X-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Tyr-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-γGlu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2

[0072] 有一个肽键是由Glu的γ-羧基和Trp的α-氨基生成，13号位的Gln换为Tyr。

[0073] 本发明的优选化合物还包括(X为乙酰基或氢)：

[0074] 本发明化合物之十七：

[0075] X-His-Gly-βAsp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Tyr-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2

[0076] 本发明化合物之十八：

[0077] X-His-Gly-γGlu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Asp-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2

[0078] 本发明化合物之十九：

[0079] X-His-Gly-Glu-βAla-Thr-Phe-Ser-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2

[0080] 本发明化合物之二十：

[0081] X-His-Gly-βAsp-Gly-Thr-Phe-Ser-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2

[0082] 本发明化合物之二十一：

[0083] X-His-Gly-γGlu-βAla-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2

[0084] 本发明化合物之二十二：

[0085] X-His-Gly-βAsp-Gly-Thr-βPhe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2

[0086] 本发明化合物之二十三：

[0087] X-His-Gly-Glu-Gly-Thr-βPhe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2

[0088] 本发明化合物之二十四：

[0089] X-His-Gly-Glu-Gly-Thr-βPhe-Ser-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2

[0090] 本发明化合物之二十五：

[0091] X-His-Gly-βAsp-Gly-ThrβPhe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2

[0092] 本发明化合物之二十六：

[0093] X-His-Gly-Glu-βAla-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2

[0094] 本发明中活性异构肽的制备方法以本领域技术人员所通常的Fmoc固相肽合成法合成。

[0095] 原料及试剂：接肽树脂为Rink Amide MBHA树脂。氨基酸衍生物为

[0096] Fmoc-Ser(But)-OH、Fmoc-Pro-oH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、
Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(But)-OH、
Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Asp-OtBu、Fmoc-Glu-OtBu、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-β-Phe-OH。

[0097] 偶联反应缩合剂为苯骈三唑-1-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)、1-羟基苯骈三氮唑(HOBt)、N-甲基吗啉(NMM)。脱保护剂为20％哌啶/DMF溶液。切割试剂为三氟乙酸。

[0098] 树脂用DMF溶胀30分钟，然后脱保护20分钟，用DMF洗涤，反应器中加入氨基酸衍生物及缩合剂，室温反应2小时，洗涤，再脱保护，加入氨基酸衍生物及缩合剂，重复进行至接上所有的氨基酸。反应器中再加入切割试剂，室温反应1小时，后过滤，滤液在乙醚中沉淀，得粗品。

[0099] 粗产品的纯化：采用高效液相色谱法进行纯化。洗脱液为三氟乙酸水溶液，乙腈。流速为20ml/min，监测波长为214nm。

[0100] 本发明的Exendin-4活性异构体及其修饰物在血浆中37℃进行酶解，然后用HPLC分析水解产物，并与正常结构进行比较，它们比原有结构半衰期均有延长。

[0101] 本发明还包括Exendin-4活性异构体及其修饰物在糖尿病治疗药物方面的应用。对exendin-4活性异构体的药效学实验表明，具有显著降低实验动物血糖的作用。

具体实施方式

[0102] 下面的实施例，可以更详细地说明本发明，但不以任何形式限制本发明。

[0103] 以下各实施例中，化合物十七，化合物十二，化合物十八，化合物十九，化合物二十，化合物二十四中X为氢；其余化合物为中X为乙酰基。

[0104] 实施例1化合物的固相合成

[0105] 1、偶联反应

[0106] 称取15.4g Rink Amide MBHA树脂，装入自动合成仪的反应瓶中，各氨基酸衍生物、偶联试剂、DMF分别装入各溶剂瓶中，设定反应程序，开始合成。

[0107] 反应温度为25℃，偶联反应时间为1小时，脱保护时间为30分钟，偶联及脱保护反应溶剂添充量为200ml，洗树脂次数为3min/次×5次。

[0108] 最后一个氨基酸偶联结束后，用甲醇洗树脂5次，通入氮气干燥30分钟。偶联及脱保反应的检测

[0109] 在每一次偶联及脱保护结束后暂停反应，取出几粒树脂检测反应是否完全。检测试剂分为三部分，试剂A为茚三酮的无水乙醚溶液，试剂B为苯酚的无水乙醇溶液，试剂C为氰化钾的吡啶溶液。待检测的树脂数粒放于试管中，分别加入上述试剂各二滴，120℃加热5分钟，若偶联反应完全，则树脂颗粒为亮黄色。若脱保护反应完全，则树脂颗粒变为蓝色或紫红色。

[0110] 2、脱保护并切割肽-树脂

[0111] 脱保护切割试剂为TFA/EDT/苯甲硫醚/茴香醚(92.5∶2.5∶2.5∶2.5)，脱保护切割试剂添充量为300ml，在N2保护下、25℃下反应1小时，过滤，收集滤液。树脂再切割30分钟，合并收集液。

[0112] 3、沉淀

[0113] 向反应液中加入预冷的沉淀试剂无水乙醚800ml，于-20℃中沉淀20分钟，然后以6000rpm离心8分钟，沉淀再用100ml无水乙醚洗二次，真空干燥，称重得粗品23.6g，粗肽收率为93.7％。

[0114] 4、纯化方法

[0115] Exendin-4活性异构体粗品配制成浓度为100mg/ml的水溶液，进样10ml，流动相B从28％到35％梯度洗脱70min，收集产物峰。将收集的样品溶液减压蒸馏除去乙腈，冷冻真空干燥，得三氟乙酸型Exendin-4活性异构体纯品3.05g，收率为12.1％。

[0116] 实施例2体外血浆中稳定性的测定

[0117] 为测定各化合物的体外稳定性，我们将样品在血浆中37℃进行酶解，然后用HPLC分析水解产物，并与Exendin-4进行比较。

[0118] 方法：新鲜人血浆37℃水浴活化30分钟，再加入样品，使样品的终浓度为50μg/ml，37℃水浴水解，每间隔1分钟取样品种400μl，加入醋酸400μl终止反应。样品用HPLC检测水解产物的浓度，求算出半衰期。

[0119] 测定结果：

[0120]样品 半衰期(小时)
Exendin-4 9.5
化合物一 9.8
化合物二 10.36
化合物三 19.8
化合物四 12.5
化合物五 9.4
化合物六 13.8
化合物七 11.5
化合物八 12.3
化合物九 13.5
化合物十 12.6
化合物十一 15.4
化合物十二 13.7
化合物十七 27.6
化合物十八 11.5
化合物十九 18.8
化合物二十 13.9
化合物二十四 10.9

[0121] 结论：各化合物的体外稳定性明显好于Exendin-4。

[0122] 实施例3体内半衰期的测定实验

[0123] Wistar大鼠，雌雄各半，体重230-280g，长春高新医学动物实验研究中心提供，合格证号：吉实动质字(2003)004号。

[0124] 药物：化合物十七，化合物十二，化合物十九。

[0125] 方法：

[0126] 1、称取受试肽，用生理盐水溶解。

[0127] 2、健康Wistar大鼠10只，试验期间自由进食与饮水。以受试化合物皮下给药(0.1mg/kg)，于给药0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、5、6小时后经大鼠眼球后静脉处取静脉血1ml，置于肝素化试管中，15000rpm离心10min，分离血浆，20℃保存，待测。

[0128] 3、样品用活化好的C18固相萃取柱过滤，再用水洗柱两次，除去血浆中的杂蛋白，然后用含0.01％三氟乙酸的90％乙腈溶液100μl将样品洗脱下来。样品中通入氮气进行浓缩，浓缩后的样品用HPLC-MS进行分析，测定血浆中样品含量随时间的变化。

[0129] 用内标法绘制药时曲线，应用Topfit2.2软件计算样品在大鼠体内的半衰期。

[0130] 各化合物体内半衰期

[0131]样品 半衰期(小时)
Exendin-4 1.39±0.26
化合物十七 2.95±0.23
化合物十二 2.53±0.31
化合物十九 1.98±0.19

[0132] 结论：各化合物的体内稳定性明显好于Exendin-4。

[0133] 实施例4细胞增殖实验

[0134] 1、细胞悬液的制备

[0135] 大鼠处死，打开腹腔取出胰脏，加入Hanks液，将胰脏组织剪碎加入胶原酶振荡5分钟，用Hanks清洗后加入Krebs-Ringer bicarbonate缓冲液，收集胰岛.将收集的胰岛用PBS洗1次，在用PBS盐溶液于37摄氏度保温20分钟.然后将胰岛吹打成单个细胞，将细胞放置于冰浴中，加入培养液，待细胞贴壁可用于实验。

[0136] 2、反应体系

[0137] 将β细胞接种于96孔板，每孔细胞浓度为107左右，加入最适浓度的药物培养68小时后，再加入MTT，继续培养4小时.然后取出96孔板，于2500r离心5分钟，弃上清，每孔加入100微升二甲基亚砜，于570nm波长下测定吸收值，计算增殖率。

[0138]

[0139]样品 刺激率(％)
Exendin-4 60.32
化合物一 59.87
化合物二 61.02
化合物三 74.07
化合物四 70.53
化合物五 62.13
化合物六 69.87
化合物七 65.23
化合物八 70.84
化合物九 59.96
化合物十 71.25
化合物十一 67.22
化合物十二 63.56
化合物十七 77.98
化合物十八 68.56
化合物十九 67.21
化合物二十 66.26
化合物二十四 60.88

[0140] 结论：各化合物对细胞增殖的影响与Exendin-4相当或好于Exendin-4。

[0141] 实施例5药效实验

[0142] 各化合物对链佐霉素(STZ)造成糖尿病小鼠的降血糖作用，及对小鼠胰岛β细胞数量的影响。

[0143] 1、试验材料

[0144] 本试验选用清洁级小鼠体重18～20g，雌雄各半。

[0145] 2、试验方法

[0146] 2.1试验分组及给药

[0147] 本试验分组情况为空白对照组、模型对照组、Exendin-4组、各样品组。空白对照组给予注射用水；模型组给予STZ(50mg/kg)；样品组中Exendin-4及化合物一～化合物-1二十四给予样品50mg·kg 。

[0148] 各组按上述剂量皮下注射给予注射用水或样品连续10天，模型组及样品组在开始5天腹腔加注链佐霉素。

[0149] 2.2观察指标

[0150] 分别在试验的第1～10天、12、15、18、21天上午的8时左右对小鼠尾静脉取血，进行快速血糖测定。

[0151] 试验结束后，处死小鼠取出胰腺，称重。剩余部分胰腺固定于Bouin氏液后，进行醛品红β细胞特殊染色。固定好的胰腺组织常规脱水包埋，切片脱蜡至水，用酸化高锰酸钾液氧化5分钟，2％草酸液漂白2～3分钟，流水冲5分钟，入醛品红液15～30分钟，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。β-细胞特染后胞质紫红色，记录每只小鼠所有染色切片上完整胰岛内的阳性β细胞数量，取平均值作为每只小鼠胰岛内β的细胞计数。

[0152] 3、数据处理

[0153] 数据以 表示，采用SPSS统计软件进行t检验，以P＜0.05评价显著性。

[0154] 4、试验结果

[0155] 4.1各样品对糖尿病小鼠血糖的影响

[0156] 连续注射各样品后，小鼠血糖明显较糖尿病模型组小鼠低(P＜0.05)，模型组在第3天后血糖开始明显升高(与空白组比较P＜0.05)，至试验结束。各样品组在治疗后第4天开始发挥作用，与模型组比较血糖明显下降，结果见下表。

[0157]时间(天) 1 2 3 4 5 6 7
7.05 7.69 6.99 6.56 7.39 7.12 7.96
空白对照组
±1.10 ±0.88 ±0.65 ±1.02 ±0.95 ±1.35 ±0.82
7.36 7.75 8.69 9.24 11.05 12.58 12.98
模型组
±0.82 ±1.92 ±0.46 ±1.74 ±1.31 ±1.66 ±0.83
6.36 7.91 7.58 8.01 8.55 9.82 9.66
Exendin-4
±0.58 ±0.74 ±0.62 ±1.42 ±0.50 ±1.07 ±1.0
7.09 7.62 7.36 7.91 8.31 9.49 9.47
化合物一
±0.44 ±0.79 ±1.62 ±0.42 ±0.47 ±0.98 ±1.00
7.36 7.62 7.96 8.54 8.62 9.63 9.85
化合物二
±0.23 ±0.87 ±1.62 ±1.02 ±1.50 ±1.06 ±1.0*
7.25 7.36 7.45 7.14 7.84 8.33 8.75
化合物三
±0.23 ±0.37 ±1.60 ±1.02 ±1.04 ±1.39 ±1.09
7.52 7.49 7.65 7.74 8.14 8.52 8.91
化合物四
±0.21 ±0.35 ±0.37 ±1.47 ±1.15 ±1.51 ±1.83
7.14 7.69 7.44 7.95 8.19 9.06 9.46
化合物五
±0.29 ±0.39 ±0.63 ±1.28 ±1.51 ±1.11 ±1.02
6.96 7.54 7.25 8.02 8.24 9.57 9.47
化合物六
±0.48 ±0.84 ±0.84 ±1.53 ±0.47 ±1.04 ±1.02
7.36 7.31 7.98 8.67 8.86 9.76 9.55
化合物七
±0.62 ±0.48 ±0.65 ±1.54 ±0.54 ±1.45 ±1.43
7.87 7.36 7.97 7.54 8.09 8.23 8.34
化合物八
±0.45 ±0.87 ±0.46 ±1.45 ±1.02 ±1.43 ±1.32
6.94 7.06 7.47 8.09 8.34 9.06 9.22
化合物九
±0.87 ±0.56 ±0.47 ±1.5 ±0.42 ±1.55 ±1.02
7.23 7.38 7.47 7.55 7.64 7.92 8.14
化合物十
±0.43 ±0.85 ±0.36 ±1.46 ±1.0 ±1.42 ±1.76
7.38 7.53 7.33 7.49 7.45 8.79 9.09
化合物十一
±0.68 ±0.63 ±0.25 ±1.09 ±1.09 ±1.04 ±1.66

[0158]7.24 7.52 7.47 7.85 8.77 9.20 9.22
化合物十二
±1.01 ±0.21 ±0.84 ±1.44 ±1.84 ±1.34 ±1.32
7.01 7.36 7.39 7.74 7.84 8.01 8.25
化合物十七
±0.36 ±0.41 ±0.88 ±1.47 ±1.1 ±1.22 ±1.19
7.66 7.24 7.66 8.25 8.88 9.95 9.38
化合物十八
±0.33 ±0.82 ±0.97 ±0.99 ±0.46 ±1.2 ±1.24
7.09 7.24 7.32 7.37 7.48 8.85 9.22
化合物十九
±0.68 ±0.45 ±0.58 ±1.32 ±1.54 ±1.44 ±1.74
7.03 7.32 7.57 7.28 8.25 9.0 9.35
化合物二十
±0.36 ±0.68 ±1.08 ±0.89 ±0.57 ±1.28 ±1.54
7.35 7.62 7.87 8.43 8.42 9.57 9.20
化合物二十四
±0.77 ±0.88 ±0.96 ±1.11 ±1.34 ±1.37 ±1.09

[0159]时间(天) 8 9 10 12 15 18 21
7.67± 7.58 7.35 7.79 7.25 7.63 7.96
空白对照组
0.63 ±0.54 ±1.07 ±0.24 ±1.48 ±0.28 ±0.45
13.22. 15.21. 16.07. 16.37. 17.32. 18.07 19.24.
模型组
±1.55 ±0.24 ±0.72 ±0.95 ±0.48 ±1.23 ±0.76
10.04 12.47 12.06 13.28 13.54 15.87 15.69
Exendin-4
±1.83 ±1.85 ±1.44 ±1.23 ±2.00 ±2.01 ±1.50
10.36 12.87 13.25 13.89 14.04 15.99 16.09
化合物一
±0.86 ±1.06 ±1.22 ±1.54 ±1.31 ±1.31 ±1.62
10.54 12.08 12.76 13.21 13.77 15.53 15.82
化合物二
±0.69 ±1.45 ±1.57 ±1.03 ±1.07 ±1.61 ±1.33
9.26 9.87± 10.76 12.08 12.35 13.71 14.06
化合物三
±0.80 1.43 ±1.62 ±1.49 ±1.49 ±1.01 ±1.38
9.86 10.02 11.29 13.35 13.44 14.28 14.96
化合物四
±1.42 ±1.09 ±1.84 ±1.09 ±2.01 ±1.91 ±1.65
9.99± 11.72 12.36 13.01 13.77 14.93 15.38
化合物五
0.34 ±0.45 ±1.07 ±1.42 ±1.24 ±0.69 ±1.37
10.08 10.36 11.07 12.95 13.18 13.97 14.56
化合物六
±1.23 ±1.19 ±1.48 ±1.13 ±2.31 ±1.84 ±0.76
10.29 11.35 12.07 12.93 13.23 14.62 15.08
化合物七
±1.31 ±1.45 ±1.32 ±1.71 ±1.14 ±1.39 ±1.28
8.79 9.32± 10.09 11.35 12.84 13.67 13.96
化合物八
±1.24 1.43 ±0.84 ±1.33 ±1.13 ±1.00 ±1.37
9.04± 10.97 11.86 13.02 13.48 14.78 15.21
化合物九
1.35 ±1.37 ±1.38 ±1.82 ±1.02 ±1.19 ±1.34
8.96 9.33± 10.05 11.88 12.13 13.05 13.96
化合物十
±1.80 1.29 ±1.04 ±1.54 ±1.37 ±1.41 ±1.57
9.87 10.57 11.24 12.18 13.44 14.57 14.97
化合物十一
±1.62 ±1.38 ±1.85 ±1.63 ±1.37 ±1.28 ±1.76
化合物十二 10.09 11.17 12.24 13.00 13.86 14.88 15.27

[0160]±1.34 ±1.45 ±1.71 ±1.34 ±1.54 ±1.69 ±1.19
8.96 9.07± 10.25 11.78 12.12 12.87 13.76
化合物十七
±1.81 1.35 ±1.33 ±1.37 ±1.73 ±1.08 ±1.85
10.22 10.86 11.47 12.69 13.58 14.07 14.79
化合物十八
±1.65 ±1.37 ±1.85 ±1.04 ±2.17 ±1.84 ±1.76
9.82 10.24 11.57 12.08 13.49 13.98 14.25
化合物十九
±1.04 ±1.49 ±1.21 ±1.84 ±1.96 ±1.24 ±1.68
9.75 10.28 11.56 12.11 13.85 14.47 14.55
化合物二十
±1.46 ±1.37 ±1.41 ±1.34 ±1.73 ±1.68 ±1.49
9.85± 11.98 12.78 13.64 14.28 15.31 15.67
化合物二十四
1.69 ±1.35 ±1.65 ±1.23 ±1.37 ±1.46 ±1.42

[0161] 与模型组比较P＜0.05

[0162] 4.2胰腺重量

[0163] 处死动物后，称量胰腺重量，计算胰腺重量/体重。结果显示，模型组动物胰腺重量/体重指数明显下降，样品治疗组胰腺重量/体重指数与模型组比较有所增加，结果见下表。

[0164] 样品对糖尿病小鼠胰腺重量的影响

[0165]组别 动物数(只) 胰腺重量/体重(mg/g)
空白对照组 10 2.45±0.21
模型组 10 1.26±0.52
Exendin-4组 10 2.09±0.33
化合物一 10 2.32±0.25
化合物二 10 2.19±0.38
化合物三 10 1.86±0.47
化合物四 10 1.96±0.38
化合物五 10 2.11±0.54
化合物六 10 2.19±0.43
化合物七 10 2.04±0.47
化合物八 10 1.78±0.52
化合物九 10 1.85±0.31
化合物十 10 2.14±0.25
化合物十一 10 2.00±0.18
化合物十二 10 2.24±0.33
化合物十七 10 2.06±0.41
化合物十八 10 1.82±0.39
化合物十九 10 2.02±.024
化合物二十 10 2.25±0.31
化合物二十四 10 2.03±0.25

[0166] 与模型组比较P＜0.05

[0167] 4.3胰岛β细胞计数

[0168] 计数胰岛内β细胞的结果显示，模型组胰岛内含分泌颗粒的β细胞数量较空白对照组明显下降，经Exendin-4活性异构体治疗后，含分泌颗粒的胰岛β细胞数量明显多于模型组，结果见下表。

[0169] 各样品对糖尿病小鼠胰岛β细胞数量的影响

[0170]组别 动物数(只) 胰岛β细胞计数
空白对照组 10 67.2±16.5
模型组 10 8.6±4.7
Exendin-4组 10 27.9±11.5
化合物一 10 28.3±11.2
化合物二 10 25.5±9.4
化合物三 10 26.2±12.5
化合物四 10 25.9±11.3
化合物五 10 27.4±12.9
化合物六 10 26.8±11.2
化合物七 10 27.1±15.5
化合物八 10 28.0±11.1
化合物九 10 27.4±13.6
化合物十 10 26.9±11.8
化合物十一 10 27.1±14.5
化合物十二 10 25.8±12.3
化合物十七 10 26.0±11.7
化合物十八 10 27.2±11.3
化合物十九 10 25.9±11.9
化合物二十 10 26.8±12.4
化合物二十四 10 27.2±13.6

[0171] *与模型组比较P＜0.05

[0172] 通过本试验皮下注射各样品可以有效控制链佐霉素诱导的小鼠血糖增高，给药期间样品组小鼠的血糖明显低于模型对照组，在停药后Exendin-4及其活性异构体的降糖作用仍持续较长时间。

[0173] 各样品对糖尿病小鼠血糖的降低作用与促进胰岛β细胞增生，增加胰岛β细胞数量有关。本研究中模型对照组小鼠胰腺重量/体重指数低于正常对照组，但经各样品治疗组指数明显增加。醛品红特殊染色结果显示，各样品治疗组胰岛β细胞数目明显增多。

[0174] 综合体外血浆中稳定性的测定实验，体内半衰期的测定实验，细胞增殖实验和药效实验，得出：如下氨基酸序列的化合物更具有药用价值。分别为：

[0175] 化合物十七：

[0176] His-Gly-βAsp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Tyr-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2。

[0177] 化合物十二：

[0178] His-Gly-γGlu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Tyr-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2。

[0179] 化合物十九：