具有双阳离子侧臂的二(2,2’-联吡啶)合铜配合物在制备超氧离子自由基清除剂中的应用转让专利
申请号 : CN200810027707.6
文献号 : CN101284010B
文献日 : 2010-12-15
发明人 : 毛宗万 , 安燕 , 胡平 , 李佶辉 , 黄华珍
申请人 : 中山大学
摘要 :
本发明公开了一种具有双阳离子侧臂的二(2，2’-联吡啶)合铜配合物消除超氧离子自由基的应用的技术方案，所述的技术方案是通过对二(2，2’-联吡啶)合铜配合物连接带正电荷的季铵离子侧臂来模拟Cu，Zn-SOD的活性区的疏水环境和有识别功能的精氨酸残基，从而实现高效清除超氧离子自由基的目的。本发明改变了现有技术单纯模拟天然Cu，Zn-SOD活性中心结构设计SOD替代品的思路，提供了一种全新的寻找SOD模拟物的途径，而且所述的二(2，2’-联吡啶)合铜配合物SOD活性测试结果超过了现有技术中所有模型物的SOD活性，达到天然牛红细胞铜锌超氧化物歧化酶SOD活性的一半，接近天然的山葵超氧化物歧化酶SOD的活性。
权利要求 :
1.具有双阳离子侧臂的二(2，2’-联吡啶)合铜配合物在制备超氧离子自由基清除剂中的应用，其中，所述二(2，2’-联吡啶)合铜配合物的化学结构式如式(I)所示：R＝CH3CH2-、CH3CH2CH2CH2-或CH3CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的二(2，2’-联吡啶)合铜配合物结构中带正电荷的铵离子与Cu2+之间的距离为6.0～6.4
说明书 :
具有双阳离子侧臂的二(2，2’-联吡啶)合铜配合物在制
备超氧离子自由基清除剂中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及具有双阳离子侧臂的二(2，2’-联吡啶)合铜配合物在消除超氧离子自由基中的应用。
背景技术
[0002] 近年来，自由基致病和致哀学说在医学界受到普遍支持。当氧分子失去一个电子-后就形成的超氧离子自由基(O2·)是人体内氧代谢首先形成的自由基，它们在分子间和细-
胞内信号传递、细胞生长和分化以及宿主免疫防御机制等方面有重要作用。但是，O2· 非常活泼，能参与一系列的连锁反应，而且能进一步产生化学反应性极强的羟基自由基。因此它也能攻击复制中的基因，引起蛋白质变性和交联，造成基因突变，激活人体免疫系统，使体内的许多酶及激素失去生物活性，机体的免疫能力、神经反射能力、运动能力等系统活力降低，同时还能破坏核酸结构和导致整个机体代谢失常等，最终使机体发生病变。已经证实它的过量能导致衰老及许多疾病，包括癌症、糖尿病、中风、脑血栓、关节炎、肌萎缩侧索硬化症等。
胞内信号传递、细胞生长和分化以及宿主免疫防御机制等方面有重要作用。但是，O2· 非常活泼，能参与一系列的连锁反应，而且能进一步产生化学反应性极强的羟基自由基。因此它也能攻击复制中的基因，引起蛋白质变性和交联，造成基因突变，激活人体免疫系统，使体内的许多酶及激素失去生物活性，机体的免疫能力、神经反射能力、运动能力等系统活力降低，同时还能破坏核酸结构和导致整个机体代谢失常等，最终使机体发生病变。已经证实它的过量能导致衰老及许多疾病，包括癌症、糖尿病、中风、脑血栓、关节炎、肌萎缩侧索硬化症等。
[0003] 通常，细胞通过超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)催化体内-O2·的歧化反应，能够压制它们中的大部分，把它们的数量控制在一定范围内。而SOD是体-
内清除O2· 的专一性酶，它在生物界的分布极广，几乎从人到动物、植物，都有它的存在。 [0004] SOD被医学界称之为“人体清道夫”，在医学临床上可以治疗多种疾病，在防辐射，抗肿瘤等方面也有积极的作用，而且广泛用于化妆品保护皮肤。但是天然SOD具有提取困难、价格高、稳定性差、难于透过细胞膜以及异体抗原性等缺点，在临床治疗应用上受到了限制。因此，近年来许多小分子模拟物引起了人们的重视并取得了重要进展。因此，模拟生-
命体系的SOD，进一步发展限制氧化应激和清除O2·的SOD替代品，将是预防和治疗SOD失活导致的疾病的一种有效途径。
内清除O2· 的专一性酶，它在生物界的分布极广，几乎从人到动物、植物，都有它的存在。 [0004] SOD被医学界称之为“人体清道夫”，在医学临床上可以治疗多种疾病，在防辐射，抗肿瘤等方面也有积极的作用，而且广泛用于化妆品保护皮肤。但是天然SOD具有提取困难、价格高、稳定性差、难于透过细胞膜以及异体抗原性等缺点，在临床治疗应用上受到了限制。因此，近年来许多小分子模拟物引起了人们的重视并取得了重要进展。因此，模拟生-
命体系的SOD，进一步发展限制氧化应激和清除O2·的SOD替代品，将是预防和治疗SOD失活导致的疾病的一种有效途径。
[0005] 蛋白质结构研究显示动物红细胞的SOD的活性中心含有一个独特的咪唑桥联的2+ 2+
Cu -Zn 异双核结构，因此，通常用Cu，Zn-SOD表示。在该活性中心，属于五配位畸变四方
2+
锥构型的Cu ，处于一个约 宽的圆锥形溶剂通道的底部。人们做了大量的努力试图通过模拟Cu，Zn-SOD的结构特征来获得具有医学应用价值的超氧离子自由基清除剂。但是，迄今为止，所报道的模拟物的SOD活性都比较低，最高的活性也只能达到天然Cu，Zn-SOD活性的20％。
Cu -Zn 异双核结构，因此，通常用Cu，Zn-SOD表示。在该活性中心，属于五配位畸变四方
2+
锥构型的Cu ，处于一个约 宽的圆锥形溶剂通道的底部。人们做了大量的努力试图通过模拟Cu，Zn-SOD的结构特征来获得具有医学应用价值的超氧离子自由基清除剂。但是，迄今为止，所报道的模拟物的SOD活性都比较低，最高的活性也只能达到天然Cu，Zn-SOD活性的20％。
[0006] 最新研究显示Cu，Zn-SOD的活性受到活性中心周围氨基酸残基的影响。在其活性腔口靠近配位水分子处有一带正电荷的精氨酸Arg141(在植物或人Cu，Zn-SOD中为2+ - -
Arg143)，它与活性中心Cu 之间的距离为 有吸引O2 入腔的作用，诱导O2 靠近活性中心，如果这个Arg141被电中性或负电性的氨基酸残基取代，会使酶的活性降低一到两个数量级，这说明正电荷的氨基酸残基在SOD的催化过程中起着关键作用。还有研究表明，在Cu，Zn-SOD活性中心附近有几个 疏水性氨基酸侧链，如缬氨酸Val116和丙氨酸
2+
Ala138，它们与活性中心Cu 之间的距离为 它们的突变也可以改变SOD的生物活性。另外，苏氨酸Thr135因含有羟基，从而对腔的亲水性起重要作用，近年来，利用电化学和Fourier变换红外光谱技术对SOD的研究揭示，氨基酸主链提供的电荷补偿作用以及溶剂通道储存电子的性质，是Cu，Zn-SOD具有高催化活性的两个关键因素。 发明内容
Arg143)，它与活性中心Cu 之间的距离为 有吸引O2 入腔的作用，诱导O2 靠近活性中心，如果这个Arg141被电中性或负电性的氨基酸残基取代，会使酶的活性降低一到两个数量级，这说明正电荷的氨基酸残基在SOD的催化过程中起着关键作用。还有研究表明，在Cu，Zn-SOD活性中心附近有几个 疏水性氨基酸侧链，如缬氨酸Val116和丙氨酸
2+
Ala138，它们与活性中心Cu 之间的距离为 它们的突变也可以改变SOD的生物活性。另外，苏氨酸Thr135因含有羟基，从而对腔的亲水性起重要作用，近年来，利用电化学和Fourier变换红外光谱技术对SOD的研究揭示，氨基酸主链提供的电荷补偿作用以及溶剂通道储存电子的性质，是Cu，Zn-SOD具有高催化活性的两个关键因素。 发明内容
[0007] 本发明的目的在于克服现有技术中存在的困难，改变技术偏见，提供一种具有双阳离子侧臂的二(2，2’-联吡啶)合铜配合物的应用于模拟SOD消除超氧离子自由基的技术方案，本技术方案是通过对二(2，2’-联吡啶)合铜配合物连接带正电荷的季铵离子侧臂来模拟Cu，Zn-SOD的活性区的疏水环境和有识别功能的精氨酸残基，从而实现高效清除超氧离子自由基的目的。
[0008] 本发明所述的具有季铵离子侧臂的2，2′-联吡啶合铜配合物结构如下： [0009]
[0010] 上述结构式可以用化学式[Cu(L)2Br](ClO4)5来表示，L是金属离子与阴离子以外的有机基团，其中N上连有三个相同的烷基R，R是乙基、正丁基或正辛基，对应的配合物为L1＝5，5′-二(三乙铵基甲基)-2，2′-联吡啶、L2＝5，5′-二(三正丁铵基甲基)-2，2′-联吡啶或L3＝5，5′-二(三正辛铵基甲基)-2，2′-联吡啶，平衡的阴离子是高氯酸根。
[0011] 上述配合物带有正电性和疏水性的季铵离子侧臂，晶体结构分析的结果显示，2+
侧臂上正电荷的氮原子与Cu 之间的距离约为 这与Cu，Zn-SOD中正电荷
2+ 2+
Arg141与Cu 之间的距离比较相近；另外配合物侧链上的疏水性烷基链环绕在Cu 周围，其位置也与Cu，Zn-SOD中的疏水性氨基酸侧链非常相似，而且直接在配体的合成中引入的正电荷和疏水性取代基团比包合物中结合得更加牢固。
侧臂上正电荷的氮原子与Cu 之间的距离约为 这与Cu，Zn-SOD中正电荷
2+ 2+
Arg141与Cu 之间的距离比较相近；另外配合物侧链上的疏水性烷基链环绕在Cu 周围，其位置也与Cu，Zn-SOD中的疏水性氨基酸侧链非常相似，而且直接在配体的合成中引入的正电荷和疏水性取代基团比包合物中结合得更加牢固。
[0012] 与现有技术相比，本发明克服了现有技术的不足，所述的技术方案具有如下有益效果：本发明改变了现有技术单纯模拟天然Cu，Zn-SOD活性中心结构设计SOD替代品的思路，提供了一种全新的寻找SOD模拟物的途径；本发明所述的配合物经试验，结果显示，配合物的SOD活性明显提高，甚至能够达到牛红细胞SOD活性的一半，接近山葵SOD的活性，并且超过了以往文献报道的所有模型物的SOD活性，是目前最活性最高的消除超氧离子自由基的配合物。
附图说明
[0013] 图1是实施例2中所测得的天然酶和三种不同铜配合物催化O2- 歧化的抑制率曲线，图中1是5，5′-二(三乙铵基甲基)-2，2′-联吡啶合铜配合物，2是5，5′-二(三正丁铵基甲基)-2，2′-联吡啶合铜配合物， 3是5，5′-二(三正辛铵基甲基)-2，2′-联吡啶乙基合铜配合物。
[0014] 图2是实施例3中pH值变化对5，5′-二(三正丁铵基甲基)-2，2′-联吡啶合铜配合物的SOD活性影响。
[0015] 图3是5，5′-二(三正丁铵基甲基)-2，2′-联吡啶合铜配合物的循环伏安滴定图，铜离子与5，5′-二(三正丁铵基甲基)-2，2′-联吡啶的摩尔比分别是0.0∶2.0(a)，0.5∶2.0(b)，1.0∶2.0(c)，1.5∶2.0(d)，2.0∶2.0(e)和2.5∶2.0mM(f)，条件为
1∶1DMF-H2O作为溶剂，0.1M TBAP作为支持电解质，铂丝电极作为辅助电极，玻碳电极作-1
为工作电极，SCE电极作为参比电极，扫描速度为100mV s ，氮气保护。 具体实施方式：
1∶1DMF-H2O作为溶剂，0.1M TBAP作为支持电解质，铂丝电极作为辅助电极，玻碳电极作-1
为工作电极，SCE电极作为参比电极，扫描速度为100mV s ，氮气保护。 具体实施方式：
[0016] 实施例1配合物的活性测定方法(X-XO-NBT法)
[0017] X-XO-NBT法是指黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶-氯化硝基四氮唑法。用超纯水配制pH-3值为7.8，浓度为50mM的磷酸盐缓冲溶液，并以缓冲液为溶剂配制浓度分别为1.50×10 M-3
和1.50×10 M的黄嘌呤和NBT溶液，再用该缓冲液配制1U/mL的黄嘌呤氧化酶溶液，避光冷藏保存，配合物的溶液用含5％DMSO的磷酸缓冲液配制。做SOD活性测定时，首先测量不-
加SOD或配合物时O2 产生的吸光度变化，依次加入黄嘌呤溶液1.0mL，NBT溶液1.0mL，磷酸盐缓冲液0.070-0.100mL，搅拌并在25±0.1℃的水浴中恒温10min，搅拌下再加入黄嘌呤氧化酶溶液0.100-0.130mL，并同时开始计时，1.5min后用Cary300紫外-可见分光光度计在5min内测定560nm吸光度的 变化，求出吸光度变化A0，要求将吸光度的变化(ΔA560/Δtmin)控制在0.025±0.002范围内，取3min内所测定的数据进行分析。然后用同样的方法测定加入SOD或其配合物时的吸光度变化As，最后由公式I(％)＝(A0-As)×100/A0求-
出各浓度下配合物对O2 的抑制率I(％)。
和1.50×10 M的黄嘌呤和NBT溶液，再用该缓冲液配制1U/mL的黄嘌呤氧化酶溶液，避光冷藏保存，配合物的溶液用含5％DMSO的磷酸缓冲液配制。做SOD活性测定时，首先测量不-
加SOD或配合物时O2 产生的吸光度变化，依次加入黄嘌呤溶液1.0mL，NBT溶液1.0mL，磷酸盐缓冲液0.070-0.100mL，搅拌并在25±0.1℃的水浴中恒温10min，搅拌下再加入黄嘌呤氧化酶溶液0.100-0.130mL，并同时开始计时，1.5min后用Cary300紫外-可见分光光度计在5min内测定560nm吸光度的 变化，求出吸光度变化A0，要求将吸光度的变化(ΔA560/Δtmin)控制在0.025±0.002范围内，取3min内所测定的数据进行分析。然后用同样的方法测定加入SOD或其配合物时的吸光度变化As，最后由公式I(％)＝(A0-As)×100/A0求-
出各浓度下配合物对O2 的抑制率I(％)。
[0018] 最后以配合物浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，求出抑制率为50％时配合物的浓度，即为衡量其SOD活性的参数IC50。
[0019] 实施例2天然酶和配合物的SOD活性测定结果
[0020] 配合物以及天然牛红细胞超氧化物歧化酶(BeSOD)催化O2-歧化的活性使用X-XO-NBT法进行了测定。
[0021] 在不加天然酶或配合物和加入不同浓度天然酶或配合物时，测得样品的吸光度数据随时间的变化，对每个样品吸光度随时间变化的数据进行线性回归拟合得一条直线，直线的斜率即为单位时间内吸光度的变化值(ΔA/Δt)。不加天然酶或配合物时，样品的吸光度变化用A0表示，加入天然酶或配合物时样品的吸光度变化用As表示，用公式I(％)＝(A0-As)×100/A0求出每个天然酶或配合物在各种浓度下对超氧离子的抑制率I。 [0022] 然后以天然酶或配合物的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，得到清除剂催化-O2 歧化的抑制率曲线，如图1所示。
[0023] 从图1中求出抑制率为50％时配合物的浓度，即为天然酶或配合物的IC50值，IC50-值是衡量配合物SOD活性的参数，通过比较IC50 值可以判断SOD配合物催化O2 歧化的活性大小，IC50值越小则表示配合物的SOD活性越高。配合物1-3的IC50值分别为0.18±0.01、
0.089±0.01和0.33±0.01μM。配合物的SOD活性顺序为：5，5′-二(三正辛铵基甲基)-2，2′-联吡啶合铜配合物＜5，5′-二(三乙铵基甲基)-2，2′-联吡啶合铜配合物＜5，5′-二(三正丁铵基甲基)-2，2′-联吡啶合铜配合物。与以往报道的SOD替代品相比，5，5′-二(三正丁铵基甲基)-2，2′-联吡啶合铜配合物的SOD活性是目前最高的。
0.089±0.01和0.33±0.01μM。配合物的SOD活性顺序为：5，5′-二(三正辛铵基甲基)-2，2′-联吡啶合铜配合物＜5，5′-二(三乙铵基甲基)-2，2′-联吡啶合铜配合物＜5，5′-二(三正丁铵基甲基)-2，2′-联吡啶合铜配合物。与以往报道的SOD替代品相比，5，5′-二(三正丁铵基甲基)-2，2′-联吡啶合铜配合物的SOD活性是目前最高的。
[0024] 实施例3pH值变化对5，5′-二(三正丁铵基甲基)-2，2′-联吡啶合铜配合物的SOD活性影响
[0025] 5，5′-二(三正丁铵基甲基)-2，2′-联吡啶合铜配合物的IC50值在pH 6～8.5的范围内几乎没有变化，这与天然酶的特征一致。在pH为7.2时，5，5′-二(三正丁铵基甲基)-2，2′-联吡啶合铜配合物的SOD活性最高(IC50＝0.072±0.01μM)。结果显示5，5′-二(三正丁铵基甲基)-2，2′-联吡啶合铜配合物在人生理pH值时表现出最高的SOD活性，超过天然牛红细胞超氧化物歧化酶(BeSOD)活性(IC50＝0.04μM)的一半，并且与报道的来自一种天然植物(山葵，Hoseradish)的SOD的活性(IC50＝0.07μM)相当。
测试结果见图2。
测试结果见图2。
[0026] 实施例4配合物的电化学性质测试
[0027] 配合物的氧化还原电势利用循环伏安法在Zahner Elektrik IM6E型电化学工作站上进行测定，使用三电极系统，铂丝电极作为辅助电 极，玻碳电极作为工作电极，饱和甘汞(saturated calomel electrode，SCE)电极作为参比电极。用体积比为1∶1的DMF和水作溶剂，浓度为0.1M的四丁基高氯酸铵(tetra-butylammonium perchlorate，TBAP)溶-1液作为支持电解质，所有测试均在氮气保护下于室温进行，扫描速度为100mV s 。 [0028] 配合物的电化学滴定实验是在以上条件的基础上，通过固定配体的浓度，向配体中滴加金属离子溶液，改变配体与金属离子的物质的量比值，观察其电化学活性的变化。具体实验如下：
[0029] (1)以含有0.1M的四丁基高氯酸铵、体积比为1∶1的DMF和水作溶剂，配制2mM的替代物2的配体溶液，再用该溶液配制96mM的高氯酸铜溶液。
[0030] (2)取5ml上述配体的溶液，通氮气10min，然后在电化学工作站上用最低电位-600mV，最高电位600mV进行测试。
[0031] (3)向上述溶液中分次连续滴加上述高氯酸铜溶液，搅拌10min，通氮气10min然后在电化学工作站上用最低电位-600mV，最高电位600mV进行测试。该步骤共重复5次，每次操作滴加氯酸铜溶液的体积分别为26.2μL，26.4μL，26.7μL，27.0μL，27.3μL。 [0032] 实施例5配合物的电化学特性
[0033] 对5，5′-二(三正丁铵基甲基)-2，2′-联吡啶合铜配合物的电化学性质检测结果如表1所示：
[0034] (1)对应的1∶1和1∶2的铜配合物具有相同的SOD酶活性，但它们 的铜离子氧化还原电位值却不同，二者在溶液中平衡共存，当催化过程中的氧化还原态改变时，铜离子与配体的摩尔比发生转变，导致模拟体系的电位变化，即体系具有“电位转换”功能，如图3所示，而获取额外的反应自由能(ΔE)；(2)具有双季铵阳离子侧臂的配合物具有更高SOD酶活性，证明季铵阳离子不仅能够模拟SOD酶的Arg-143的生物功能，而且其诱导能力强，使得Cu原子周围的配位N原子带上较多的正电荷，以铜离子为中心形成了一个很大的正电荷区域，从而更容易吸附并清除有害超氧离子自由基；(3)由于三个铜配合物的电化学性质相似，但SOD活性不同，说明5，5′-二(三正丁铵基甲基)-2，2′-联吡啶合铜配合物双季铵阳离子侧臂上的疏水链具有适宜的长度，有利于配合物的催化超氧离子歧化。 [0035] 表1 5，5′-二(三正丁铵基甲基)-2，2′-联吡啶合铜配合物的电化学性质检测结果
[0036]
[0037] 注：L＝5，5′-二(三正丁铵基甲基)-2，2′-联吡啶，e为一个电子，L2表示两个L基团。