一种用于检测胃组织的低表达piRNA探针及其检测方法

摘要

本发明公开了一种用于胃组织的低表达piRNA探针，探针的序列由化学修饰过的寡聚核苷酸编码片段和延伸臂片段组成，寡聚核苷酸编码片段为下述piRNA序列：hsa_piR_000370；探针能对胃组织的piRNA进行杂交检测，能检测出胃组织中异常低表达的piRNA，作为胃组织发生癌变的一种诊断标志，这些piRNA进一步可作为设计定向胃癌药物的靶点，因此本发明为胃癌的诊断和定向治疗提供了有利的依据。

权利要求

1.一种用于胃组织的低表达piRNA探针，探针的序列由化学修饰过的寡聚核苷酸编码片段和延伸臂片段组成，其特征在于所述的寡聚核苷酸编码片段为下述piRNA序列：hsa_piR_000370。

说明书

一种用于检测胃组织的低表达piRNA探针及其检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及piRNA，具体涉及一种用于检测胃组织的低表达piRNA探针及其检测方法。

背景技术

[0002] 真核基因组中除了有编码蛋白质的基因外，还有一大部分DNA被转录成非编码RNA(noncoding RNAs，ncRNAs)。近年来的研究发现，许多ncRNA可在多个层次上调节着基因的表达，特别是小RNA在基因表达调控中的作用及其与疾病发生、发展的关系越来越引起了人们的重视。前期研究已经发现了2类对基因表达有重要调控作用的小RNA——短干扰RNA(short interfering RNA，siRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)。 [0003] 2006年俄罗斯、日本和美国的四家实验室几乎同时报道，在生物体内存在除siRNA和miRNA以外的另一类小RNA。这些小RNA与前2类小RNA的主要区别在于其长度更长(约为30个核苷酸)和采用不同的机制实现对基因表达的调控。因此，这类RNA被称为第三类小RNA。目前已从多种生物中发现了第三类小RNA。研究发现，它们可与小鼠和大鼠的阿格蛋白亚家族Piwi相互作用，因此根据其功能将其命名为Piwi相互作用RNA(Piwi-interacting RNA，piRNA)。

[0004] 阿格蛋白(argonaute protein)的主要功能与小分子RNA相关的基因沉默作用有密切关系。RNA沉默作用通过降解mRNA、抑制翻译和重建染色体等方式调节基因的表达。RNA沉默主要通过RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)和转录的基因沉默RNA诱导起始复合物(RNA-induced initiation of transcriptional genesilencing，RITS)来发挥作用。这些复合物的主要成分包括小分子RNA和阿格蛋白。阿格蛋白家族是在所有RISC和RITS复合物中均存在的唯一共同成分。这说明阿格蛋白在小分子RNA相关的RNA沉默机制中具有独特的功能。也说明piRNA在基因表达调控中起着重要作用。

[0005] 我国是胃癌高发区，现有的技术中均没有涉及到胃组织的癌变与哪些低表达的piRNA有关。

发明内容

[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测胃组织的piRNA异常表达的探针，还提供了利用该探针检测胃癌组织的piRNA低表达的方法。

[0007] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于胃组织的低表达piRNA探针，探针的序列由化学修饰过的寡聚核苷酸编码片段和延伸臂片段组成，所述的寡聚核苷酸编码片段为至少一种下述piRNA序列：hsa_piR_000370，hsa_piR_009567，hsa_piR_000216，hsa_piR_000728，hsa_piR_010229，hsa_piR_000990，hsa_piR_000460，hsa_piR_006105，hsa_piR_005837，hsa_piR_007743，hsa_piR_009884，hsa_piR_000001和hsa_piR_004611。

[0008] 所述的寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_000370序列。

[0009] 所述的寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_000370序列和hsa_piR_009567序列组成。

[0010] 所述的寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_000370序列、hsa_piR_009567序列和hsa_piR_000460序列组成。

[0011] 所述的寡聚核苷酸编码片段还包括至少一种下述piRNA序列：hsa_piR_000397，hsa_piR_000781，hsa_piR_010053，hsa_piR_000459，hsa_piR_009981，hsa_piR_001440，hsa_piR_008983，hsa_piR_005378，hsa_piR_001445，hsa_piR_014109，hsa_piR_001207，hsa_piR_000160和hsa_piR_007871。

[0012] 所述的寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_000370序列、hsa_piR_009567序列、hsa_piR_000460序列和hsa_piR_000397序列组成。

[0013] 所述的寡聚核苷酸编码片段还包括至少一种下述piRNA序列：hsa_piR_005687，hsa_piR_000805，hsa_piR_007819，hsa_piR_000114，hsa_piR_001101，hsa_piR_002490，hsa_piR_000045，hsa_piR_001170，hsa_piR_000172，hsa_piR_003548，hsa_piR_006465和hsa_piR_001312。

[0014] 所述的寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_000370序列、hsa_piR_009567序列、hsa_piR_000460序列、hsa_piR_000397序列和hsa_piR_005687序列组成。

[0015] 寡聚核苷酸编码片段还可以为hsa_piR_000370序列、hsa_piR_009567序列、hsa_piR_000460序列和hsa_piR_001312序列组成等，在此不一一列举。

[0016] 一种用上述低表达piRNA探针检测胃组织的piRNA的方法，依次包括胃组织样品的总RNA提取、总RNA质量分析、微离心过滤得到小RNA样品、添加Poly(A)聚合酶和用Cy3和Cy5特异性荧光标记小RNA样品步骤，用所述的低表达piRNA探针对荧光标记的小RNA样品杂交检测。

[0017] 化学修饰过的寡聚核苷酸编码片段能与靶piRNA互补杂交；延伸臂片段能使与它连接的编码片段离片基有一定的距离，减少杂交空间阻碍；探针杂交的Tm值是通过化学修饰来平衡的。

[0018] 探针是由光敏试剂原位合成为微流体芯片；piR＝piRNA。

[0019] 上述piRNA在RNA基因数据库中都能找到，延伸臂片段可以用分子生物学上能减 少杂交空间阻碍的任何延伸臂片段。

[0020] 与现有技术相比，本发明的优点在于用于胃组织的低表达piRNA探针，探针的序列由化学修饰过的寡聚核苷酸编码片段和延伸臂片段组成，寡聚核苷酸编码片段为至少一种下述piRNA序列：hsa_piR_000370，hsa_piR_009567，hsa_piR_000216，hsa_piR_000728，hsa_piR_010229，hsa_piR_000990，hsa_piR_000460，hsa_piR_006105，hsa_piR_005837，hsa_piR_007743，hsa_piR_009884，hsa_piR_000001和hsa_piR_004611，探针能对胃组织的piRNA进行杂交检测，能检测出胃组织中异常低表达的piRNA，在癌变的胃组织中探针组成的每种piRNA的量就比正常的胃组织的每种piRNA的量低出许多，piRNA探针从而就检测出胃组织中piRNA异常变异，作为胃组织发生癌变的一种诊断标志，piRNA进一步可作为设计定向胃癌药物的靶点，因此本发明为胃癌的诊断和定向治疗提供了有利的依据。hsa_piR_000397，hsa_piR_000781，hsa_piR_010053，hsa_piR_000459，hsa_piR_009981，hsa_piR_001440，hsa_piR_008983，hsa_piR_005378，hsa_piR_001445，hsa_piR_014109，hsa_piR_001207，hsa_piR_000160 和 hsa_piR_007871 和 hsa_piR_005687，hsa_piR_000805，hsa_piR_007819，hsa_piR_000114，hsa_piR_001101，hsa_piR_002490，hsa_piR_000045，hsa_piR_001170，hsa_piR_000172，hsa_piR_003548，hsa_piR_006465和hsa_piR_001312也是组成上述piRNA探针的寡聚核苷酸编码片段的成份，也能检测出胃组织中异常低表达的piRNA。

附图说明

[0021] 图1为胃癌旁组织piRNA探针检测照片；

[0022] 图2为胃癌组织piRNA探针检测照片；

[0023] 图3为胃癌组织与胃癌旁组织piRNA探针检测差异比较照片。

具体实施方式

[0024] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

[0025] 实施例1

[0026] 一种用于胃组织的低表达piRNA探针，为光敏试剂原位合成的微流体芯片，探针的序列由化学修饰过的寡聚核苷酸编码片段和延伸臂片段组成，其中寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_000370序列。

[0027] 实施例2

[0028] 一种用于胃组织的低表达piRNA探针，与实施例1基本相同，所不同的只是寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_009567序列。

[0029] 实施例3

[0030] 一种用于胃组织的低表达piRNA探针，与实施例1基本相同，所不同的只是寡聚 核苷酸编码片段为hsa_piR_000370序列和hsa_piR_009567序列组成。

[0031] 实施例4

[0032] 一种用于胃组织的低表达piRNA探针，与实施例1基本相同，所不同的只是寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_000370序列、hsa_piR_009567序列和hsa piR_000460序列组成。

[0033] 实施例5

[0034] 一种用于胃组织的低表达piRNA探针，与实施例1基本相同，所不同的只是寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_000370序列、hsa_piR_009567序列、hsa_piR_000460序列和hsa_piR_000397序列组成。

[0035] 实施例6

[0036] 一种用于胃组织的低表达piRNA探针，与实施例1基本相同，所不同的只是寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_0003700序列和hsa_piR_000397序列组成。

[0037] 实施例7

[0038] 一种用于胃组织的低表达piRNA探针，与实施例1基本相同，所不同的只是寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_000370序列、hsa_piR_000397序列和hsa_piR_005687序列组成。

[0039] 实施例8

[0040] 一种用于胃组织的低表达piRNA探针，与实施例1基本相同，所不同的只是寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_000370序列、hsa_piR_009567序列和hsa_piR_005687序列组成。

[0041] 实施例9

[0042] 一种用于胃组织的低表达piRNA探针，与实施例1基本相同，所不同的只是寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_000370、hsa_piR_009567、hsa_piR_000216、hsa_piR_000728、hsa_piR_010229、hsa_piR_000990、hsa_piR_000460、hsa_piR_006105、hsa_piR_005837、hsa_piR_007743、hsa_piR_009884、hsa_piR_000001、hsa_piR_004611、hsa_piR_000397、hsa_piR_000781、hsa_piR_010053、hsa_piR_000459、hsa_piR_009981、hsa_piR_001440、hsa_piR_008983、hsa_piR_005378、hsa_piR_001445、hsa_piR_014109、hsa_piR_001207、hsa_piR_000160、hsa_piR_007871、hsa_piR_005687、hsa_piR_000805、hsa_piR 007819、hsa_piR_000114、hsa_piR_001101、hsa_piR_002490、hsa_piR_000045、hsa_piR_001170、hsa_piR_000172、hsa_piR_003548、hsa_piR_006465和hsa_piR_001312序列组成。 [0043] 寡聚核苷酸编码片段能与胃组织的靶piRNA互补，延伸臂片段能使与它连接的编码片段离片基有一定的距离，减少杂交空间阻碍，探针杂交的Tm值是通过化学修饰来平衡的。

[0044] 实施例10

[0045] 一种用piRNA探针检测胃组织的低表达piRNA的方法，依次包括(1)总RNA提取：分别各自称取100mg胃癌组织和胃癌旁组织，分别加入到液氮中研磨至干粉状→加1ml Trizol→继续研磨至匀浆→转入1.5ml离心管中→12000×g离心10min→收集上清至新离心管中→室温放置5min→加入0.2ml氯仿→涡旋15-30s→室温放置3min→12000×g离心15min→收集上清→加两倍上清体积的异丙醇→-20℃沉淀过夜→12000×g离心15min，去上清→加1ml含有DEPC水75％乙醇(预冷)→7500×g离心5min→倒尽液体，轻微离心，除去管底残液→自然干燥3min→沉淀重溶于50μl DEPC·H2O，得到各自的总RNA；(2)总RNA质量分析：通过A230、A260、A280检测，以及对各自的总RNA采用琼脂糖凝胶电泳，根据18S rRNA和28S rRNA的比值分析总RNA质量；(3)微离心过滤得到小RNA样品：对各自的总RNA用微离心过滤柱过滤，分别得到片段小于300nt的胃癌组织小RNA样品和胃癌旁组织小RNA样品；(4)在胃癌组织小RNA样品和胃癌旁组织小RNA样品中分别添加Poly(A)聚合酶：使小RNA 3′端加上poly(A)尾巴；用Cy3和Cy5特异性荧光标记分别标记胃癌组织小RNA样品和胃癌旁组织小RNA样品：先用一个寡聚核苷酸与这个poly(A)尾巴连接，然后加入Cy3和Cy5特异性荧光标记；(5)用本发明的探针(如上述实施例和未在实施例列出的探针)分别对荧光标记的胃癌组织小RNA样品和胃癌旁组织小RNA样品进行杂交检测：把各自的小RNA样品加入至含有25％的甲酰胺的100μl 6×SSPE缓冲液中(0.90M NaCl，60mM Na2HPO4，6mM EDTA，pH 6.8)，然后置于用实施例1的探针合成的微流体芯片上进行杂交检测，杂交反应仪器为微循环泵杂交仪，杂交温度为34℃，杂交时间为过一夜后采集杂交图像；杂交图象用激光扫描仪(GenePix 4000B，Molecular Device)采集，分别得到如附图1和附图2的照片，对两种样品杂交图象组合差异比较得到如附图
3的照片，杂交图像数据处理和分析用Array-Pro(Media Cybemetics)软件，数据处理和分析首先是扣除背景，计算重复点平均值和标准偏差，然后通过LOWESS(Locally-WeightedRegression)过滤进行标准化，数据处理结果采用Hierarchical clustering、K-means/mediansclustering或者ANOVA(analysis of variance)等方法，得到如表1的结果；从附图1、附图2和附图3的比较可以看出胃癌组织的有些piRNA的量比胃癌旁组织的piRNA的量要低，从表1数据处理结果进一步说明了胃癌组织的piRNA的量比胃癌旁组织的piRNA的量要低许多，因此从胃组织的piRNA的量的异常提高就可以得出胃组织发生癌变的结果，本发明就为胃癌的诊断提供了依据，进一步可以选用这些piRNA作为对胃癌进行定向靶点治疗。

[0046] 表1：胃癌组织和胃癌旁组织的piRNA表达强度及其相互比较对数值 [0047]