一种乳及乳制品中四环素类抗生素残留量的检测方法

摘要

本发明涉及一种乳及乳制品中四环素类抗生素残留量的检测方法。本发明利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪测定四环素类抗生素残留量。试样经Na2EDTA-McIlvaine缓冲液(pH4.0)提取，三氯乙酸除蛋白，经HLB固相提取小柱净化和富集，采用色谱柱分离，柱温30℃，以含有0.1％甲酸的水溶液(v/v)和乙腈为流动相进行梯度洗脱，采用多反应监测方式进行定量。仪器检出限为1.0～2.0μg/kg，在1～100μg/kg的线性范围内，相关系数r达0.999以上，回收率为81.7％～100.7％(添加水平为10，50，100μg/kg)。此法具有快速、准确、灵敏度高、适用范围广的优点。

权利要求

1.一种四环素类抗生素残留量的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)使用甲醇作为溶剂，制备多个不同浓度的土霉素、四环素及金霉素的标准溶液，并对其分别检测，根据所测得的数据，绘制土霉素、四环素及金霉素的含量与检测结果之间的标准曲线图；

所述检测使用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪；

所述质谱仪的色谱分离方法如下：

色谱柱：沃特斯公司的ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，规格是2.1mm×50mm、I.D、

1.7μm，柱温30℃，流速0.3mL/min；进样体积5μL；流动相梯度如下： 时间 乙腈 含0.1％甲酸水溶液 梯度变化曲线 0.00min 10％ 90％

2.50min 30％ 70％ 线性变化 3.50min 50％ 50％ 线性变化 4.50min 10％ 90％ 线性变化 5.00min 10％ 90％ 即时变化所述质谱仪的质谱条件如下：

电离方式ES，电离电压3.50KV，源温度120℃，去溶剂气温度350℃，去溶剂气流量

500L/hr，多反应监测质谱条件如下：

其中，*表示为定量离子；

2)对样品用用步骤1)同样的方法进行检测，得到检测结果；

3)将步骤2)中的检测结果与所述的标准曲线图比对，得到样品中四环素类抗生素含量。

2.如权利要求1所述的检测方法，其中所述的步骤2)中所述样品的处理方法如下：a)样品与pH4.0的Na2EDTA-McIlvaine缓冲溶液按照质量与体积比1∶4～1∶10的比例加入，在室温条件下充分振摇1～5min，静置10～20min，充分提取，加入1～5mL的50％的三氯乙酸混匀后，除蛋白，在转速为6000rpm/min，温度为4℃的条件下离心5～

15min，过滤后得滤液；

b)用5.0mL甲醇以1.0～2.0mL/min的流速通过固相提取小柱，再用10.0mL超纯水以1.0～2.0mL/min的流速过柱，将上述所得滤液在流速为1.0～2.0mL/min的条件下经固相提取小柱净化和富集，然后用3.0mL的5％的甲醇水溶液以1.0～2.0mL/min的流速过此柱，用真空泵将固相提取小柱抽干；

c)向富集目标物质的固相提取小柱中加入6.0mL甲醇洗脱，洗脱流速1.0～2.0mL/min，收集洗脱液，用氮气在40℃水浴下吹干，用1.0mL的50％甲醇溶解，涡旋，经0.22μm微孔滤膜过滤。

3.如权利要求2所述的检测方法，其中所述固相提取小柱优选为亲水亲油平衡固相提取小柱。

说明书

一种乳及乳制品中四环素类抗生素残留量的检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种检测乳及乳制品中抗生素含量的方法，特别涉及一种乳及乳制品中四环素类抗生素残留量的检测方法，属于分析技术领域。

背景技术

[0002] 四环素类抗生素对大多数革兰氏阳性菌和阴性菌都很敏感，主要用于布鲁氏菌病、炭疽、大肠杆菌、急性呼吸道感染、乳房炎等的防治，因其具有广谱的抗菌效果和便宜的价格，成了近年来常用兽用抗生素的主要品种。但是该药物会在畜禽体内残留，牛乳中残留的四环素类对人的肺、胃肠、肾脏、皮肤和骨骼，尤其是对儿童的牙齿损害最大，可影响胎儿骨骼、牙齿生长，引起牙质发育不全、骨质生长缓慢等病症。为保护人类健康，控制四环素类抗生素(包括四环素、金霉素、土霉素等)的残留，美国FDA规定四环素、土霉素在牛奶中的残留量分别小于80μg/L和30μg/L，我国规定的四环素、土霉素在牛奶中的残留量应小于100μg/L。因此，需要寻求简便、快速、准确检测乳及乳制品中四环素类抗生素残留量的检测方法，才能满足日趋严格的残留限量要求，从而保证人们饮用牛奶的卫生和安全。

[0003] 检测四环素的方法有很多，例如微生物法、高效液相色谱法，此外还有薄层色谱法(TLC法)、紫外分光光度法，荧光光度法、气相色谱法、高效毛细管区带电泳法等。目前，乳及乳制品中四环素类抗生素常用的检测方法主要是高效液相色谱法，利用高效液相色谱仪(紫外检测器)测定四环素类抗生素的残留量，但采用此法，检测时间较长，一般一个样品检测完毕需要30min左右，而且高效液相色谱法检测四环素类抗生素的检出限较高(一般高于10μg/kg)。

[0004] 超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪在定量分析中可以根据特征离子和由此特征离子断裂产生的特征碎片作为某一目标化合物的指纹，将它从复杂基质的混合物样品中选择出来进行定量，因此灵敏度高和选择性强，是目标化合物定量分析的金标准。它是食品安全，药代动力学等各种国际法规所规定的标准仪器。超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪能够针对目标化合物电离产生的母离子和子离子进行定量，与传统的高效液相色谱法相比，大大提高了对目标化合物的选择性和灵敏度，且极大的缩短了分析时间，检测一个样品仅需4min左右。超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪的应用前景非常广泛。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种乳及乳制品中四环素类抗生素残留量的检测方法。

[0006] 本发明的四环素类抗生素残留量的检测方法，包括如下步骤：

[0007] 1)制备多个不同浓度的四环素类抗生素溶液，并对其分别检测，根据所测得的数据，绘制四环素类抗生素的含量与检测结果之间的标准曲线图；

[0008] 2)对样品用与步骤1)同样的方法进行检测，得到检测结果；

[0009] 3)将步骤2)中的检测结果与所述的标准曲线图比对，得到样品中四环素类抗生素含量；

[0010] 4)检测设备为超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪。

[0011] 上述的四环素类抗生素为：土霉素、四环素及金霉素。

[0012] 上述制备步骤1)中溶液的溶剂优选为：甲醇。

[0013] 上述多个不同浓度的四环素类抗生素溶液含量优选为：100ng/mL，50ng/mL，20ng/mL，1ng/mL，0.1ng/mL，0ng/mL的标准溶液。

[0014] 优选的，上述所述的步骤2)中所述样品的处理方法如下：

[0015] a)样品与pH4.0的Na2EDTA-McIlvaine缓冲溶液按照质量与体积比1∶4-10的比例加入，在室温条件下充分振摇1-5min，静置10-20min，充分提取，加入1-5mL50％的三氯乙酸混匀后，除蛋白，在转速为6000rpm/min，温度为4℃的条件下离心5-15min，过滤后得滤液；

[0016] b)用5.0mL甲醇以1.0～2.0mL/min的流速通过固相提取小柱，再用10.0mL超纯水以1.0～2.0mL/min的流速过柱，将上述所得滤液在流速为1.0～2.0mL/min的条件下经固相提取小柱净化和富集，然后用3.0mL的5％的甲醇水溶液以1.0～2.0mL/min的流速过此柱，用真空泵将固相提取小柱抽干；

[0017] c)向富集目标物质的固相提取小柱中加入6.0mL甲醇洗脱，洗脱流速1.0～2.0mL/min，收集洗脱液，用氮气在40℃水浴下吹干，用1.0mL的50％甲醇溶解，涡旋，经
0.22μm微孔滤膜过滤。

[0018] 所述固相分离小柱优选为HLB(亲水亲油平衡)固相提取小柱。

[0019] 优选的，上述超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪的色谱分离方法如下：

[0020] 色谱柱：沃特斯(Waters)公司的ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1mm×50mm，I.D.，1.7μm)柱，柱温：30℃，流速：0.3mL/min；进样体积：5μL；流动相梯度如下：

[0021] 时间(min) A(％)乙腈 B(％)含0.1％甲酸水溶液 梯度变化曲线[0022] 0.00 10 90

[0023] 2.50 30 70 6[0024] 3.50 50 50 6[0025] 4.50 10 90 6[0026] 5.00 10 90 1[0027] 其中，1为即时变化，6为线性变化。

[0028] 优选的，上述超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪的质谱条件如下：

[0029] 电离方式：ES(+)，电离电压：3.50KV，锥孔电压：22V，源温度：120℃，去溶剂气温度：350℃，去溶剂气流量：500L/hr，采集方式：多反应监测(MRM)：

[0030] 化合物名称 准分子离子 特征碎片离子 锥孔电压 碰撞能量 停留时间[0031] [M+H]+ (V) (eV) (S)[0032] 土霉素 461.4 426.2* 24 20 0.05[0033] 443.2 12 0.05[0034] 西环素 445.3 410.1* 25 20 0.05427.2 13 0.05[0035] 金霉素 461.4 444.0* 30 22 0.05 [0036] 462.0 15 0.05[0037] 其中，*表示为为定量离子。

[0038] 本发明的四环素类抗生素检测方法具有如下优点：

[0039] 1)检测时间短。一个样品仅需4min左右。

[0040] 2)灵敏度高。检出限仅为1.0～2.0μg/kg，能够满足国际及国内对四环素类抗生素含量特别是痕量四环素类抗生素的检测要求。

[0041] 3)对目标化合物的选择性强，精确定量。超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪根据目标化合物的母离子及经碰撞产生的特征子离子进行定量分析，只有同时满足这两个特征质量选择的目标化合物才能被检测，而且选定的特征裂片离子一定是从选定的母离子产生的，从而排除了样品中可能存在的其它分子的干扰现象。本发明的方法采用三重四极杆的ESI+离子源，确定了土霉素、四环素及金霉素的母离子和两个子离子，大大降低了利用高效液相色谱法测定四环素类抗生素可能会出现假阳(阴)性检测结果的几率，从而达对目标化合物精确定量的目的。

[0042] 4)在本发明所色谱及质谱条件下进行测定，在实验浓度范围内，相关系数r能够达到0.999以上，回收率在81.7～100.7％之间，日内和日间精密度实验的相对标准偏差(RSD)分别为2.48％和3.96％。此法能够排除干扰组分而从复杂基质中提取出目标物质，无论对于具有简单基质还是复杂基质的样品都同样适用，具有适用范围广的优点。

附图说明

[0043] 图1是本发明的一个实施例的土霉素、四环素及金霉素的总离子流谱图，其横坐标表示时间(min)，纵坐标表示离子流响应信号强度的大小，表示土霉素、四环素、金霉素三种不同目标化合物的离子流强度占总离子流的百分比。

[0044] 图2是本发明的一个实施例的土霉素母离子461.4与定量子离子426.2的色谱图。其横坐标表示时间(min)，纵坐标表示离子流响应信号强度的大小，表示土霉素的离子流强度占总离子流的百分比。

[0045] 图3是本发明的一个实施例的四环霉素母离子445.3与定量子离子410.1的色谱图。其横坐标表示时间(min)，纵坐标表示离子流响应信号强度的大小，表示四环素的离子流强度占总离子流的百分比。

[0046] 图4是本发明的一个实施例的金霉素母离子479.4与定量子离子444.1的色谱图。其横坐标表示时间(min)，纵坐标表示离子流响应信号强度的大小，表示金霉素的离子流强度占总离子流的百分比。

[0047] 图5是本发明的一个实施例的土霉素标准曲线图。其中，横坐标表示土霉素的浓度(ng/mL)，纵坐标表示离子响应信号强度(mv)。

[0048] 图6是本发明的一个实施例的四环素标准曲线图。其中，横坐标表示四环素的浓度(ng/mL)，纵坐标表示离子响应信号强度(mv)。

[0049] 图7是本发明的一个实施例的金霉素标准曲线图。其中，横坐标表示金霉素的浓度(ng/mL)，纵坐标表示离子响应信号强度(mv)。

具体实施方式

[0050] 实施例1利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪测定牛乳中土霉素、四环素及金霉素的含量。

[0051] 1)标准溶液的配制：

[0052] 精密称取土霉素、四环素及金霉素标准品各10mg，用甲醇定容于10mL棕色容量瓶中，混匀，得到土霉素、四环素及金霉素浓度均为1.00mg/mL的标准储备溶液，放置于-18℃冷柜避光保存，至少可以保存4个星期。使用时，稀释成100ng/mL，50ng/mL，20ng/mL，1ng/mL，0.1ng/mL的标准溶液。

[0053] 2)试剂的配制：

[0054] (a)提取液的配制：

[0055] 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液：准确称取28.41g磷酸氢二钠，用水溶解，定容至1000mL。

[0056] 0.1mol/L柠檬酸溶液：准确称取21.01g柠檬酸，用水溶解，定容至1000mL。

[0057] McIlvaine缓冲溶液：将1000mL0.1mol/L柠檬酸溶液与0.2mol/L磷酸氢二钠溶液625mL混合，用NaOH调节pH＝4.0。

[0058] 0.1mol/LNa2EDTA-McIlvaine缓冲溶液：称取60.5g乙二胺四乙酸二钠放入1625mLMcIlvaine缓冲液中，使其溶解，摇匀。

[0059] (b)流动相的配制：

[0060] 流动相A：乙腈

[0061] 流动相B：0.1％甲酸水溶液

[0062] 3)样品的制备：

[0063] 称取5.00g牛奶样品，置于50mL聚丙烯离心管中，加入25mLNa2EDTA-McIlvaine缓冲溶液提取，在室温条件下充分振摇2min，静置15min，充分提取，再加入2mL50％三氯乙酸混匀后除去蛋白，均质，6000rpmin温度为4℃的条件下离心10min，用定量滤纸过滤，再用20mLNa2EDTA-McIlvaine缓冲溶液提取一次，过滤合并上清液。

[0064] 用5.0mL甲醇以1.0～2.0mL/min的流速通过沃特斯(Waters)公司OasisHLB(亲水亲油平衡)固相提取小柱(填料质量：60mg；柱管体积：3ml)，再用10.0mL超纯水以1.0～2.0mL/min的流速过柱，目的是活化固相提取小柱。将上述所得滤液在流速为1.0～2.0mL/min的条件下经固相提取小柱净化和富集，等快干时用用3.0mL的5％的甲醇水溶液以1.0～2.0mL/min的流速过此柱除杂。用真空泵将固相提取小柱抽干。加入6mL甲醇洗脱，然后用氮气40℃吹干，用1mL的50％甲醇溶解，涡旋，经0.22μm微孔滤膜过滤后用于超高效液相色谱(沃特斯公司ACQUITYTM UPLC)-电喷雾串联三重四极杆质谱仪(美国沃特斯公司Quattro Premier XE MicroMass)分析。

[0065] 4)检测仪器：超高效液相色谱(沃特斯公司ACQUITYTM UPLC)-电喷雾串联三重四极杆质谱仪(美国沃特斯公司Quattro Premier XE MicroMass)》。

[0066] 5)色谱条件：

[0067] 色谱柱：沃特斯(Waters)公司的ACQUITY UPLC BEH C18柱(50mm×2.1mm I.D.，1.7μm)；柱温：30℃，流速：0.3mL/min；进样体积：5μL；流动相梯度见表1。

[0068] 表1色谱分离梯度

[0069]

[0070] 注：1为即时变化，6为线性变化。

[0071] 6)质谱条件：

[0072] 电离方式：ES(+)，电离电压：3.50KV，源温度：120℃，去溶剂气温度：350℃，去溶剂气流量：500L/hr，采集方式：多反应监测(MRM)，具体见表2：

[0073] 表2四环素类的质谱条件

[0074]

[0075] 注：*表示为为定量离子。

[0076] 7)检测步骤：

[0077] a)标准曲线的绘制：利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪测定不同浓度的土霉素、四环素及金霉素标准溶液。提取总离子流如图1所示。由图1可以看出土霉素的保留时间为1.55min，四环素的保留时间为1.76min，金霉素的保留时间为2.49min。

[0078] 从图1的总离子流图中分别提取土霉素、四环素及金霉素的母离子与各自定量子离子的离子对色谱图，结果见图2～图4。其中，图2s是土霉素母离子461.4与定量子离子426.2的色谱图，图3是四环霉素母离子445.3与定量子离子410.1的色谱图，图4金霉素母离子479.4与定量子离子444.1的色谱图。

[0079] 利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪测定不同浓度的土霉素、四环素及金霉素标准溶液(100ng/mL，50ng/mL，20ng/mL，1ng/mL，0.1ng/mL)进行检测，根据所得数据，绘制标准曲线图，结果见图5～图7。其中，图5为土霉素标准曲线图，图6为四环素标准曲线图，图7为金霉素标准曲线图。

[0080] 根据土霉素、四环素及金霉素的标准曲线图，确定线性方程及线性相关系数，以信噪比等于3时对应的浓度为检出限，具体结果见表3。

[0081] 表3土霉素、四环素及金霉素的线性方程及检出限

[0082]

[0083] 采用多反应监测(MRM)采集方式，在实验浓度范围内，相关系数r＝0.9999，回收率在81.7～100.7％之间，日内和日间精密度实验的相对标准偏差(RSD)分别为2.48％和3.96％。

[0084] b)样品测定：

[0085] 利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱检测制备好的待测样品，得到土霉素、四环素及金霉素的图谱，分别将土霉素、四环素及金霉素的相应信号值的结果套入标准曲线方程，即可分别得到样品中土霉素、四环素及金霉素的浓度(ng/mL)。测定样品后，得到样品中土霉素的响应值Y为983，代入土霉素的标准曲线方程：Y＝
44.0573x-86.1172，则此样品中土霉素的浓度为24.3纳克/毫升(ng/mL)；测得四环素的响应值Y为1021，代入四环素的标准曲线方程：Y＝54.685x-33.7211，则此样品中四环素的浓度为19.3纳克/毫升(ng/mL)；测得金霉素的响应值Y为784，代入金霉素的标准曲线方程：Y＝25.9306x-37.6191，则此样品中金霉素的浓度为31.7纳克/毫升(ng/mL)，则此样品中三种抗生素的总浓度为为75.3纳克/毫升(ng/mL)。

[0086] 实施例2利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪测定酸奶中土霉素、四环素及金霉素的含量。

[0087] 1)标准溶液的配制：

[0088] 精密称取土霉素、四环素及金霉素标准品各10mg，用甲醇定容于10mL棕色容量瓶中，混匀，得到土霉素、四环素及金霉素浓度均为1.00mg/mL的标准储备溶液，放置于-18℃冷柜避光保存，至少可以保存4个星期。使用时，稀释成50ng/mL，20ng/mL，10ng/mL，1ng/mL，0.1ng/mL的标准溶液。

[0089] 2)试剂的配制：

[0090] (a)提取液的配制：

[0091] 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液：准确称取28.41g磷酸氢二钠，用水溶解，定容至1000mL。

[0092] 0.1mol/L柠檬酸溶液：准确称取21.01g柠檬酸，用水溶解，定容至1000mL。

[0093] McIlvaine缓冲溶液：将1000mL0.1mol/L柠檬酸溶液与0.2mol/L磷酸氢二钠溶液625mL混合，用NaOH调节pH＝4.0。

[0094] 0.1mol/LNa2EDTA-McIlvaine缓冲溶液：称取60.5g乙二胺四乙酸二钠放入1625mLMcIlvaine缓冲液中，使其溶解，摇匀。

[0095] (b)流动相的配制：

[0096] 流动相A：乙腈

[0097] 流动相B：0.1％甲酸水溶液

[0098] 3)样品的制备：

[0099] 称取3.00g酸奶样品，置于50mL聚丙烯离心管中，加入25mLNa2EDTA-McIlvaine缓冲溶液提取，在室温条件下充分振摇4min，静置20min，充分提取，再加入4mL50％三氯乙酸混匀后除去蛋白，均质，6000rpmin温度为4℃的条件下离心15min，用定量滤纸过滤，再用20mLNa2EDTA-McIlvaine缓冲溶液提取一次，过滤合并上清液。

[0100] 用5.0mL甲醇以1.0～2.0mL/min的流速通过固相提取小柱(美国的BONDELUT PLEXA固相萃取小柱，填料质量：60mg；柱管体积：3ml)，再用10.0mL超纯水以1.0～2.0mL/min的流速过柱，目的是活化固体小柱。将上述所得滤液在流速为1.0～2.0mL/min的条件下经固相提取小柱净化和富集，等快干时用用3.0mL的5％的甲醇水溶液以1.0～2.0mL/min的流速过此柱除杂。用真空泵将固相提取小柱抽干。加入6mL甲醇洗脱，然后用氮气40℃吹干，用1mL的50％甲醇溶解，涡旋，经0.22μm微孔滤膜过滤后用于超高效液相色谱(沃特斯公司ACQUITYTM UPLC)-电喷雾串联三重四极杆质谱仪(美国沃特斯公司Quattro Premier XE MicroMass)分析。

[0101] 4)检测仪器：超高效液相色谱(沃特斯公司ACQUITYTM UPLC)-电喷雾串联三重四极杆质谱仪(美国沃特斯公司Quattro Premier XE MicroMass)。

[0102] 5)色谱条件：

[0103] 色谱柱：沃特斯(Waters)公司的ACQUITY UPLC BEH C18柱(50mm×2.1mm I.D.，1.7μm)；柱温：30℃，流速：0.3mL/min；进样体积：5μL；流动相梯度见表4。

[0104] 表4色谱分离梯度

[0105]

[0106] 注：1为即时变化，6为线性变化。

[0107] 6)质谱条件：

[0108] 电离方式：ES(+)，电离电压：3.50KV，源温度：120℃，去溶剂气温度：350℃，去溶剂气流量：500L/hr，采集方式：多反应监测(MRM)，具体见表5：

[0109] 表5四环素类的质谱条件

[0110]

[0111] 注：*表示为为定量离子。

[0112] 7)检测步骤：

[0113] a)标准曲线的绘制：利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪测定不同浓度的土霉素、四环素及金霉素标准溶液。提取总离子流图。

[0114] 从总离子流图中分别提取土霉素、四环素及金霉素的母离子与各自定量子离子的离子对色谱图。

[0115] 利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪测定不同浓度的土霉素、四环素及金霉素标准溶液(50ng/mL，20ng/mL，1ng/mL，0.1ng/mL)进行检测，根据所得数据，绘制标准曲线图。

[0116] 根据土霉素、四环素及金霉素的标准曲线图，确定线性方程及线性相关系数，以信噪比等于3时对应的浓度为检出限，具体结果见表6。

[0117] 表6土霉素、四环素及金霉素的线性方程及检出限

[0118]

[0119] 采用多反应监测(MRM)采集方式，在实验浓度范围内，相关系数r达到0.999，回收率为81.7％～100.7％之间，日内和日间精密度实验的相对标准偏差(RSD)分别为3.45％和5.98％。

[0120] b)样品测定：利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱检测制备好的待测样品，得到土霉素、四环素及金霉素的图谱，分别将土霉素、四环素及金霉素的相应信号值的结果套入标准曲线方程，即可分别得到样品中土霉素、四环素及金霉素的浓度(ng/mL)。测定样品后，得到样品中土霉素的响应值Y为537，代入土霉素的标准曲线方程：Y＝44.1625x-88.1150，则此样品中土霉素的浓度为14.1ng/mL；测得四环素的响应值Y为1363，代入四环素的标准曲线方程：Y＝54.586x-34.1128，则此样品中四环素的浓度为25.6ng/mL；测得金霉素的响应值Y为985，代入金霉素的标准曲线方程：Y＝26.0506x-38.7823，则此样品中金霉素的浓度为39.3ng/mL，则此样品中三种抗生素的总浓度为为79.0ng/mL。