重组人血管内皮抑制素长效制剂及其制备方法和用途

摘要

本发明涉及医药技术领域，是重组人血管内皮抑制素的乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)的长效制剂以及其作为制备肿瘤治疗药物的用途。本发明采用在体植入泵、在体植入微球、W/O/W溶剂挥发法和W/O/O溶剂挥发法四种方法制备长效制剂。所制备的长效制剂缓释时间根据需求分别为7～28天。

权利要求

1.一种长效制剂，由重组人血管内皮抑制素和聚乳酸-羟基乙酸共聚物组成，其特征在于所述长效制剂的制备方法包括以下步骤：(a) 聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于比例为3：

7~7：3的乙腈和二氯甲烷混合溶剂中，(b)与重组人血管内皮抑制素水溶液混合，(c)混合物在含有司盘80的液体石蜡、菜籽油或者硅油中挥发溶剂，形成微球；所述重组人血管内皮抑制素与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的重量比为10：100～40：100，所述的重组人血管内皮抑制素为Endostar。

2.根据权利要求1所述的长效制剂，其特征在于重组人血管内皮抑制素与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的重量比为10：100～20：100。

3.根据权利要求1所述的长效制剂，其特征在于所述的聚乳酸-羟基乙酸共聚物为聚乳酸：羟基乙酸=50：50~85：15，分子量为2000~150000。

4.权利要求1所述重组人血管内皮抑制素长效制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

说明书

重组人血管内皮抑制素长效制剂及其制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明涉及医药技术领域，是重组人血管内皮抑制素(rhEndostatin)的缓释长效制剂及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 血管生成在实体瘤生长和转移过程中起着重要的作用。为了刺激血管的生成，肿瘤细胞会上调一系列血管生成因子，如：aFGF，bFGF和VEGF等。同时也会产生一些血管生成抑制因子。组织中血管生成表型的开放与关闭将取决于组织局部区域血管生成刺激因子和抑制因子之间的动态平衡(Folkman，J.Nat.MED.1:27-31，1995；Hanahan，D.，et al.Cell.86:353-364，1996)。研究发现内源性的血管生成抑制因子，如：血管紧张素(Angiostatin)，血管内皮抑制素(Endostatin)等，均能够抑制小鼠体内肿瘤的生长(O’Relly，M.S.，et al.Cell.79:315-328，1994；O’Relly，M.S.，et al.Cell.88:277-285，1997)。由此说明肿瘤的生长是血管生成依赖性的。

[0003] 血管内皮抑制素(Endostatin)是O’Reilly于1997年从小鼠内皮细胞系EOMAD的培养液中分离得到的一种具有抑制血管内皮细胞作用的物质(O’Relly，M.S.，et al.Cell.88:277-285，1997)。氨基酸序列分析该物质为胶原蛋白XVIII的羧基末端的降解片段，分子量为20kD左右。血管内皮抑制素能够显著地抑制小鼠多种原发性肿瘤的生长。重复使用可使小鼠肿瘤处于持久的休眠状态，并且不会产生耐药性(Boehm，T.et al.Nature.390:404-407，1997)。

[0004] 重组人血管内皮抑制素(rhEndostatin)与重组鼠血管内皮抑制素在氨基酸序列上有85％的同源性。1996年美国Entremed公司采用酵母作为表达体系生产了重组人血管内皮抑制素。Folkman报道采用连续皮下给药方式能够使rhEndostatin对小鼠Lewis肺癌的抑制率达到99％。Entremed公司于1998年10月进行了I期临床试验，研究表明，即使2
剂量高达600mg/m 也未发现剂量限制毒性。

[0005] 利用传统的大肠杆菌表达方法得到的重组人血管内皮抑制素难以复性并且易于形成沉淀，而用巴斯德毕赤酵母表达系统所耗费的生产成本巨大，两种方法均未能解决将重组人血管内皮抑制素进行工业生产的问题。为此罗永章等人通过修饰人血管内皮抑制素的核苷酸编码序列，生产出N末端带有附加氨基酸序列的重组人血管内皮抑制素(rhEndostatin，取名为：Endostar，中文名：恩度)，大大简化了纯化步骤，提高了产物的纯度(ZL 00107569.1)。所生产的重组人血管内皮抑制素由192个氨基酸构成，其氨基酸序列为：

[0006] MGGSHHHHHHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGLAGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSEGPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESYCETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLCIENSFMTASK

[0007] 其生物活性与按传统方法制备的重组人血管内皮抑制素完全相同，并且没有因为附加N端序列而导致体内免疫原性。目前已经获得国家药品食品监督管理局的批准，进行市场销售。

[0008] 市场上销售的恩度注射液规格为15mg/3ml/支，14天一个疗程，患者需每天注射一次，连续14天，休息一周后，再继续下一疗程。如此频繁的注射给药，一方面在生理上给患者带来了巨大的痛苦，另一方面也在心理上给患者带来了巨大的经济压力。

发明内容

[0009] 本发明目的是提供一种重组人血管内皮抑制素的长效制剂，一次注射以后可连续释放药物7～28天，从而大大降低患者生理上的痛苦，减轻经济负担。

[0010] 近年来，聚乳酸—羟基乙酸共聚物[poly(lactide-co-glycolide)，PLGA]已经被广泛用于蛋白多肽类药物长效制剂的制备，并且已经有多个产品上市，获得了很大的成功，如：Lupron Depot，Neutropin Depot等。本发明就是利用PLGA作为基质，制备重组人血管内皮抑制素长效制剂。

[0011] 本发明的重组人血管内皮抑制素与聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)的重量比为5：100～40：100，优选10：100～20：100。

[0012] 本发明所涉及到的基质材料PLGA，分子量为2000～150000，聚乳酸：羟基乙酸为50：50～85：15。

[0013] 本发明所涉及到的药物为重组人血管内皮抑制素，优选N末端带有附加氨基酸序列的重组人血管内皮抑制素Endostar。

[0014] 本发明制备长效制剂的方法有四种：

[0015] 1、在体植入泵，包含以下步骤：

[0016] (1)PLGA溶于1-甲基-2-吡咯烷酮中；

[0017] (2)与重组人血管内皮抑制素水溶液混合；

[0018] (3)混合物经皮下注射至体内，溶剂分散至组织中，PLGA析出，形成长效在体植入泵。

[0019] 2、在体植入微球，包含以下步骤：

[0020] (1)PLGA溶于1-甲基-2-吡咯烷酮中；

[0021] (2)与重组人血管内皮抑制素水溶液混合；

[0022] (3)混合物在注射用油中乳化；

[0023] (4)皮下注射至体内，溶剂分散至组织中，PLGA析出，形成长效在体植入微球。

[0024] 3、W/O/O溶剂挥发法，包含以下步骤：

[0025] (1)PLGA溶于混合有机溶剂中；

[0026] (2)与重组人血管内皮抑制素水溶液混合；

[0027] (3)混合物在油相中挥发溶剂，形成微球。

[0028] 上述步骤(1)的混合有机溶剂为乙腈和二氯甲烷，比例为3：7～7：3。

[0029] 上述步骤(3)的油相为含有乳化剂的液体石蜡，菜籽油或者硅油，乳化剂优选司盘80。

[0030] 4、W/O/W溶剂挥发法，包含以下步骤：

[0031] (1)PLGA溶于有机溶剂中；

[0032] (2)与重组人血管内皮抑制素水溶液混合；

[0033] (3)混合物在含有聚乙烯醇(PVA)的水相中挥发溶剂，形成微球。

[0034] 上述步骤(1)的有机溶剂为二氯甲烷，乙睛，丙酮或者乙酸乙酯。

[0035] 本发明的重组人血管内皮抑制素长效制剂的体内外释放实验，测定方法采用Elisa试剂盒，检测范围在1.95～500ng/ml之间，追踪检测不同时间的释放量，其释放速率符合一级反应方程。

[0036] 本发明的重组人血管内皮抑制素长效制剂，可在制备抗肿瘤药物中应用。

[0037] 本发明的有益效果表现在：

[0038] 本发明通过选择不同配比的PLGA，可将重组人血管内皮抑制素长效制剂的释放时间控制在7～28天。根据不同需要可选择延长控制释放天数，极大地降低患者生理上的痛苦，同时还极大地减轻了患者经济上的负担。

[0039] 本发明的重组人血管内皮抑制素长效制剂释放曲线良好，第1天的释放比例可控制在20％以内，甚至10％以内，明显减少药物的突释现象。

[0040] 本发明通过W/O/O溶剂挥发法和W/O/W溶剂挥发法制备的重组人血管内皮抑制素长效制剂包封率高，可达90％，微球粒径<50μm。

[0041] 本发明的重组人血管内皮抑制素长效制剂的生物利用度可达70％以上，可以节约费用，降低毒副作用，提高疗效。

[0042] 本发明的重组人血管内皮抑制素长效制剂制备工艺简单，适合工业化大生产及临床应用。

具体实施方式

[0043] 下面实施例用于进一步说明本发明，但不是对本发明保护范围的限制。

[0044] 实施例1：

[0045] 将100mg PLGA(Mw＝15000，50：50)溶于1ml1-甲基-2-吡咯烷酮中(浓度为10％)，再加入0.1ml 100mg/ml Endostar水溶液(PLGA与Endostar的重量比为10：1)，震荡器混匀30min，混合溶液用注射器加至截留分子量为30000，直径为1厘米的透析袋中，两端用夹子加紧。再将透析袋置于含有10ml磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH7.0)的烧杯中，并用磁力搅拌器不断搅拌。溶剂迅速透析至烧杯中，PLGA固化，形成植入泵。每日取烧杯缓冲液1ml，同时补充同体积新鲜的磷酸缓冲液。样品中Endostar的含量用HPLC法测定。用药物的累计释放百分率与释药时间作图。第1天释放18.8％，第7天释放55.5％，第14天释放58.0％，第28天释放91.1％。

[0046] 实施例2

[0047] 将100mg PLGA(Mw＝40500，50：50)溶于1ml1-甲基-2-吡咯烷酮中(浓度为10％)中，再加入0.1ml 200mg/ml Endostar水溶液(PLGA与Endostar的重量比为10：2)，其余步骤同实施例1。用药物的累计释放百分率与释药时间作图。第1天释放18.1％，第
7天释放21.5％，第14天释放51.0％，第28天释放89.1％。

[0048] 实施例3

[0049] 将100mg PLGA(Mw＝40500，75：25)溶于1ml1-甲基-2-吡咯烷酮中(浓度为10％)中，再加入0.05ml 100mg/ml Endostar水溶液(PLGA与Endostar的重量比为20：
1)，其余步骤同实施例1。用药物的累计释放百分率与释药时间作图。第1天释放7.6％，第7天释放11.5％，第14天释放23.0％，第28天释放54.1％。

[0050] 实施例4

[0051] 将100mg PLGA(Mw＝15000，50：50)溶于1ml1-甲基-2-吡咯烷酮中(浓度为10％)，再加入0.1ml 100mg/ml Endostar水溶液(PLGA与Endostar的重量比为10：1)，震荡器混匀，混合溶液用注射器加入至含有1％司盘80的芝麻油溶液中，密封低温的条件下迅速用高速振荡器混匀，形成白色乳液。将此白色乳液用注射器加至截留分子量为30000，直径为1厘米的透析袋中。再将透析袋置于含有10ml磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH7.0)的烧杯中，并用磁力搅拌器不断搅拌。随着水溶液进入透析袋中，透析袋内有机溶剂不断的透析至烧杯中，与此同时PLGA不断析出，形成微球，药物被包裹于微球之中。每日取烧杯缓冲液
1ml，同时补充同体积新鲜的磷酸缓冲液。样品中Endostar的含量用HPLC法测定。用药物的累计释放百分率与释药时间作图。第1天释放5.7％，第7天释放14.5％，第14天释放
51.0％，第28天释放80.1％。

[0052] 实施例5

[0053] 将100mg PLGA(Mw＝40500，50：50)溶于3ml1-甲基-2-吡咯烷酮中(浓度为3.3％)中，再加入0.3ml 100mg/ml Endostar水溶液(PLGA与Endostar的重量比为10：
3)其余步骤同实施例4。用药物的累计释放百分率与释药时间作图。第1天释放37.2％，第7天释放45％，第14天释放53.0％，第28天释放81.1％。

[0054] 实施例6

[0055] 将100mg PLGA(Mw＝40500，75：25)溶于2ml1-甲基-2-吡咯烷酮中(浓度为2.5％)中，再加入0.2ml 200mg/ml Endostar水溶液(PLGA与Endostar的重量比为10：4)其余步骤同实施例4。用药物的累计释放百分率与释药时间作图。第1天释放5.1％，第7天释放13.5％，第14天释放26.0％，第28天释放50.1％。

[0056] 实施例7

[0057] 将PLGA(Mw＝15000，50：50)2g溶于20ml二氯甲烷和乙睛(1：1)的混合溶剂中，成为油相。精密称取200mg Endostar溶于2ml双蒸水中(内含5％甘露醇)，形成内水相。将上述水相加至油相中，4000rpm高速分散乳化，形成W/O初乳，然后将初乳迅速滴加至含有1％司盘80的液体石蜡中，机械搅拌挥发溶剂(750rpm)4小时，离心，并用石油醚洗涤三次，最后冷冻干燥得到微球。包封率为90％，粒径<50μm。

[0058] 称取100mg微球，置于至截留分子量为30000，直径为1厘米的透析袋中。再将透析袋置于含有10ml磷酸缓冲液(0.1mol/l，pH7.0)的烧杯中，并用磁力搅拌器不断搅拌。每日取烧杯中缓冲液1ml，同时补充同体积新鲜的磷酸缓冲液。样品中Endostar的含量用HPLC法测定。用药物的累计释放百分率与释药时间作图。第1天释放15.0％，第7天释放
54.5％，第14天释放91.0％。

[0059] 实施例8

[0060] 微球制备方法同实施例7，不同之处在于二氯甲烷和乙睛的比例。对制备的微球进行外观检查。

[0061]