一种节菱孢菌株及其用途转让专利
申请号 : CN200810061331.0
文献号 : CN101294137B
文献日 : 2010-06-09
发明人 : 章初龙 , 陈绍瑗 , 林福呈
申请人 : 浙江大学
摘要 :
本发明公开了一种节菱孢菌株，该节菱孢(Arthrinium sp.)菌株保藏名称为：节菱孢菌株Ph1012，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2007年6月8日，保藏号：CGMCC 2082。上述节菱孢菌株能用于制备2，3β-二羟基卷线孢菌素，该2，3β-二羟基卷线孢菌素是一种具有抗细菌活性的无毒的红色色素。
权利要求 :
1.一种节菱孢菌株，其特征是：该节菱孢(Arthrinium sp.)菌株保藏名称为：节菱孢菌株Phl012，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2007年6月8日，保藏号：CGMCC 2082。
2.如权利要求1所述的节菱孢菌株的用途，其特征是：用于制备2，3β-二羟基卷线孢菌素，所述2，3β-二羟基卷线孢菌素的结构式如下：
说明书 :
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体地说是一种内生真菌节菱孢菌株及其在制备2，3β-二羟基卷线孢菌素中的用途。
背景技术
从天然产物中发现新型先导化合物，是新药创制的重要途径。微生物是自然界中天然产物的主要来源，植物内生真菌作为其中的一个重要类群，是相对较新的研究领域。内生真菌产生的丰富多样的具多种生物活性的次生代谢产物在现代医药和农药工业中具有重要的应用潜力，它们在抗菌、抗病毒、杀虫、抗肿瘤、抗心血管疾病以及抗衰老等领域具有广阔的应用前景。典型例子是产生紫杉醇的内生真菌的发现(Stierle et al.，1993)。另一方面依靠植物内生真菌也发现了许多新生物活性物质，如从传统药用植物雷公藤分离到的内生真菌Rhinocladiella sp.可产生3种新松胞菌素(cytochalasin)，对多种人肿瘤细胞有很强的抑制作用(Wagenaar et al，2000)；从青蒿茎干中分离的内生真菌Colletotrichum sp.能产生多种对病原真菌和植物病原细菌有良好抑制作用的化合物，其MIC值一般在25～50μg/L(Lu et al.，2000)。
卷线孢菌素是一类四羟基蒽醌类化合物，1968年首先分离得到，但由于分子结构的信息不够完全，该分子的确切分子构型没有得到确定。从暗孢节菱孢(Arthriniumphaeospermum)和链格孢(Alternaria eichhorniae)发酵得到的卷线孢菌素(如式I和式II所示)分子结构中2个羰基在B环(Bostrycin，a tetrahydroanthraquinone pigment and someother metabolites from the fungus Arthrinium phaeospermum.Cellular and Molecular LifeSciences 1975，31(7)：783-784；Bostrycin and 4-deoxybostrycin：two nonspecific phytotoxinsproduced by Alternaria eichhorniae.Appl Environ Microbiol.1982，43(4)：846-849.)。1985年T.Ross Kelly(Bostrycin：Structure Correction and Synthesis.The Journal Of Organic Chemistry1985，50(20)：3679-3685)报道通过化学合成得到的产物，通过衍生物的X-单晶衍射数据修订了卷线孢菌素的化学结构为2，3α-二羟基卷线孢菌素(如式III所示)。
式I 式II
式III
卷线孢菌素是一类四羟基蒽醌类化合物，1968年首先分离得到，但由于分子结构的信息不够完全，该分子的确切分子构型没有得到确定。从暗孢节菱孢(Arthriniumphaeospermum)和链格孢(Alternaria eichhorniae)发酵得到的卷线孢菌素(如式I和式II所示)分子结构中2个羰基在B环(Bostrycin，a tetrahydroanthraquinone pigment and someother metabolites from the fungus Arthrinium phaeospermum.Cellular and Molecular LifeSciences 1975，31(7)：783-784；Bostrycin and 4-deoxybostrycin：two nonspecific phytotoxinsproduced by Alternaria eichhorniae.Appl Environ Microbiol.1982，43(4)：846-849.)。1985年T.Ross Kelly(Bostrycin：Structure Correction and Synthesis.The Journal Of Organic Chemistry1985，50(20)：3679-3685)报道通过化学合成得到的产物，通过衍生物的X-单晶衍射数据修订了卷线孢菌素的化学结构为2，3α-二羟基卷线孢菌素(如式III所示)。
式I 式II
式III
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种新型的节菱孢菌株及其用途，能用于制备具有抗细菌活性的无毒的红色色素。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种节菱孢菌株，该节菱孢(Arthrinium sp.)菌株保藏名称为：节菱孢菌株Phl012，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2007年6月8日，保藏号：CGMCC 2082，保藏地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。
作为本发明的节菱孢菌株的改进：节菱孢菌株Phl012的菌种在PDA培养基上的适宜生长温度为15～30℃；气生菌丝发达，棉絮状，初白色，培养5天后开始产生红色色素，菌丝和菌落渐变红色，后期菌丝变暗红色至黑色，菌丝纠结；分生孢子单胞，红褐色，透镜形，分生孢子有1条发芽缝，大小4.5～7.0μm×3.0～4.0μm。
作为本发明的节菱孢菌株的进一步改进：节菱孢菌株Phl012的菌种在PDA培养基上的适宜生长温度为26℃，培养5天后菌落直径89mm。
作为本发明的节菱孢菌株的进一步改进：该菌株具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
本发明还同时提供了上述节菱孢菌株的用途：用于制备2，3β-二羟基卷线孢菌素，该2，3β-二羟基卷线孢菌素的结构式如下：
作为本发明的节菱孢菌株的用途的改进：2，3β-二羟基卷线孢菌素为具有抗细菌活性的无毒的红色色素。
本发明的菌株是从水蓼分离得到的，它属于真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，粪壳菌纲(Sordariomycetes)，粪壳菌亚纲(Sordariomycetidae)，梨孢假壳科(Apiosporaceae)，节菱孢属(Arthrinium)。
本发明以人工发酵生产的节菱孢菌株Phl012发酵液为原料，浓缩发酵液用乙酸乙酯萃取，减压回收乙酸乙酯，乙醇重结晶得到红色棱形单晶体，通过色谱学和X-单晶衍射的结构分析，确定为2，3β-二羟基卷线孢菌素。
利用本发明的节菱孢菌株Phl012所得的化合物——2，3β-二羟基卷线孢菌素，是一种具有抗细菌活性的无毒的红色色素，为进一步开发成一种天然可食用色素提供了研究基础。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种节菱孢菌株，该节菱孢(Arthrinium sp.)菌株保藏名称为：节菱孢菌株Phl012，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2007年6月8日，保藏号：CGMCC 2082，保藏地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。
作为本发明的节菱孢菌株的改进：节菱孢菌株Phl012的菌种在PDA培养基上的适宜生长温度为15～30℃；气生菌丝发达，棉絮状，初白色，培养5天后开始产生红色色素，菌丝和菌落渐变红色，后期菌丝变暗红色至黑色，菌丝纠结；分生孢子单胞，红褐色，透镜形，分生孢子有1条发芽缝，大小4.5～7.0μm×3.0～4.0μm。
作为本发明的节菱孢菌株的进一步改进：节菱孢菌株Phl012的菌种在PDA培养基上的适宜生长温度为26℃，培养5天后菌落直径89mm。
作为本发明的节菱孢菌株的进一步改进：该菌株具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
本发明还同时提供了上述节菱孢菌株的用途：用于制备2，3β-二羟基卷线孢菌素，该2，3β-二羟基卷线孢菌素的结构式如下：
作为本发明的节菱孢菌株的用途的改进：2，3β-二羟基卷线孢菌素为具有抗细菌活性的无毒的红色色素。
本发明的菌株是从水蓼分离得到的，它属于真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，粪壳菌纲(Sordariomycetes)，粪壳菌亚纲(Sordariomycetidae)，梨孢假壳科(Apiosporaceae)，节菱孢属(Arthrinium)。
本发明以人工发酵生产的节菱孢菌株Phl012发酵液为原料，浓缩发酵液用乙酸乙酯萃取，减压回收乙酸乙酯，乙醇重结晶得到红色棱形单晶体，通过色谱学和X-单晶衍射的结构分析，确定为2，3β-二羟基卷线孢菌素。
利用本发明的节菱孢菌株Phl012所得的化合物——2，3β-二羟基卷线孢菌素，是一种具有抗细菌活性的无毒的红色色素，为进一步开发成一种天然可食用色素提供了研究基础。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为本发明的节菱孢菌株的分子孢子梗及产生的分生孢子图；
图2为本发明的节菱孢菌株的分生孢子图；
图3为本发明的2，3β-二羟基卷线孢菌素的抗细菌活性图。
图1为本发明的节菱孢菌株的分子孢子梗及产生的分生孢子图；
图2为本发明的节菱孢菌株的分生孢子图；
图3为本发明的2，3β-二羟基卷线孢菌素的抗细菌活性图。
具体实施方式
实施例1、节菱孢(Arthrinium sp.)菌株的分离培养：
在实验室中按下列条件和步骤分离培养，即可获得本发明所述的节菱孢菌株：
1)、从我国浙江天目山自然保护区采集水蓼，将采集的水蓼用浓度0.5％(w/v)的次氯酸钠进行表面消毒10min，然后无菌水漂洗后置于无菌滤纸上吸干水；
2)、接着用无菌刀片去除水蓼的外皮层，并将其切成1cm左右大小的组织片，将组织片移接在各含100μg·ml-1氨苄青霉素和链霉素的2％(w/v)水琼脂平板上，24℃培养；
3)、待菌丝长出后，将菌丝顶端移接到PDA固体培养基上培养，24℃培养。连续纯化3次，获得纯培养。纯培养的节菱孢菌株的形态特征见图1和图2。
实施例2、2，3β-二羟基卷线孢菌素的分离提取和结构鉴定：
1)、节菱孢菌株Phl012发酵培养，依次进行以下步骤：
将节菱孢菌株Phl012在PDA培养基上26℃活化培养7天，用直径5mm的打孔器切取菌落边缘菌饼，将其接种到内装PDB培养液的500mL三角瓶中，每瓶接种3个菌饼，26℃、120r/min振荡培养15天，抽滤除去菌丝体后的滤液即为发酵液。
2)、提取、重结晶和结构鉴定：
将上述步骤1)所得的发酵液用乙酸乙酯萃取，再减压回收乙酸乙酯，得萃取液；将上述萃取液用乙醇重结晶得到红色棱形单晶体，即为2，3β-二羟基卷线孢菌素。
经核磁共振(表1)和晶体x射线衍射测定(表2和表3)，其结构式为：
晶体x射线衍射测定以单色化的Mo K日辐射为光源，在Rigaku AFC一7S型x射线衍射仪上收集晶体衍射数据。晶体结构用直接法(SHELXS 93)解出，全部非氢原子坐标和各向异性温度因子经全矩阵最小二乘法修正，氢原子位置按理论模型计算。最终一致性因子R＝0.043。晶体属单斜晶系，空间群为P21，晶胞参数a＝8.280(2)A，＝90deg.，b＝6.644(2)A，＝102.12(2)deg.，c＝13.1535(12)A，＝90deg..晶体体积：0.36×0.30×0.22mm；F(000)＝352。
表1、2，3β-二羟基卷线孢菌素的核磁共振图谱数据
No. 1H-NMR 13C-NMR 备注 1 2.65-2.68，dd，1H 35.43 2 - 68.54 3 - 76.63 4 2.51，s，1H 57.21 5 - 137.35 6 - 110.10 7 - 137.35 8 - 178.06 9 6.44，s，1H 139.98 10 - 110.10 11 - 184.87 12 - 137.35 13 - 108.03 14 - 137.35 CH3 1.23，s，3H 25.92 OCH3 3.90，s，3H 160.74 OH 12.62，13.39，4.5，5.0 重水交换
表2、2，3β-二羟基卷线孢菌素的晶体原子坐标(×104)和等效各向同性位移参数(×103nm2)
表3、2，3β-二羟基卷线孢菌素的晶体键长[A]和键角[deg]
实施例3、2，3β-二羟基卷线孢菌素的毒性测定：
以对卤虫(Artemia salina)的毒性试验测定2，3β-二羟基卷线孢菌素的毒性。卤虫卵在pH 8.5的人工海水中28℃培养孵化24hr。将人工海水以1∶1的比例与系列浓度的卷线孢菌素溶液混合加入到试管中，每处理3个重复，同时以蒸馏水、鬼臼毒素分别作为空白对照和阳性对照。在每个试管中加入30只正常的卤虫，培养24hr后观察及记录各处理的卤虫死亡数，计算校正死亡率，采用剂量对数-死亡率机率值法计算求得半抑制浓度(LC50)。
具体如表4所示。
表4
根据上述表4的内容可知：细胞毒试验测定表明，2，3β-二羟基卷线孢菌素对卤虫的LC50大于200μg/mL，表明该可作为色素的2，3β-二羟基卷线孢菌素无毒。
实施例4、2，3β-二羟基卷线孢菌素的抗细菌活性测定：
营养琼脂培养基(Nutrient agar，NA)：蛋白胨5g，牛肉浸粉3g，琼脂15g，水1000ml，pH 6.6-7.0。
以芽胞杆菌(Bacillus sp.)为指示菌株，采用琼脂稀释法测定2，3β-二羟基卷线孢菌素对指示菌的抑制作用(图3)。将预先培养的指示菌按一定量加入到预先溶化的NA培养基中，混匀成含1×105CFU指示菌的带菌培养基。再将不同浓度的2，3β-二羟基卷线孢菌素按一定量加入到上述带菌培养基中，混匀后倒入直径9mm的培养皿中，制成分别含200、50、25、12.5、6.25μg/ml 2，3β-二羟基卷线孢菌素的琼脂培养基平板，同时用不含2，3β-二羟基卷线孢菌素的带菌培养基作对照，各种浓度和对照重复3次，测定对细菌抑制的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)，如图3所示。
根据图3可知：琼脂稀释法测定表明，2，3β-二羟基卷线孢菌素对芽胞杆菌的MIC为50μg/ml。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
SEQ ID NO：1
cttattgata tgcttaagtt cagcgggtat tcctacctga tccgaggtca accactaaaa 60
aattgggggt tttatggcga gaagatagag ccttacagaa gcgagaaata aatttactac 120
gctcagagga caactatcgc tccgccactg tctttaagga actacaatac agtagattcc 180
caacactaag ctaggcttaa gggttgaaat gacgctcgaa caggcatgcc caccagaata 240
ctgatgggcg caatgtgcgt tcaaagattc gatgattcac tgaattctgc aattcacatt 300
acttatcgca tttcgctgcg ttcttcatcg atgccagaac caagagatcc gttgttgaaa 360
gttttaatta ttaaaataat acgctcagaa tataaaataa aacaagagtt tagtgtacca 420
ccggcgggcc gcagcaggag tgatgcaggg tagcgctaca gggtaagcta cagggtagct 480
accgggtaac accactctgc ctccttactg agcttacgcc gaggcataac tgagtaaagt 540
ttacaaatgg tatgggagtt gtataactct gtaatgatcc ctccgc 586
在实验室中按下列条件和步骤分离培养，即可获得本发明所述的节菱孢菌株：
1)、从我国浙江天目山自然保护区采集水蓼，将采集的水蓼用浓度0.5％(w/v)的次氯酸钠进行表面消毒10min，然后无菌水漂洗后置于无菌滤纸上吸干水；
2)、接着用无菌刀片去除水蓼的外皮层，并将其切成1cm左右大小的组织片，将组织片移接在各含100μg·ml-1氨苄青霉素和链霉素的2％(w/v)水琼脂平板上，24℃培养；
3)、待菌丝长出后，将菌丝顶端移接到PDA固体培养基上培养，24℃培养。连续纯化3次，获得纯培养。纯培养的节菱孢菌株的形态特征见图1和图2。
实施例2、2，3β-二羟基卷线孢菌素的分离提取和结构鉴定：
1)、节菱孢菌株Phl012发酵培养，依次进行以下步骤：
将节菱孢菌株Phl012在PDA培养基上26℃活化培养7天，用直径5mm的打孔器切取菌落边缘菌饼，将其接种到内装PDB培养液的500mL三角瓶中，每瓶接种3个菌饼，26℃、120r/min振荡培养15天，抽滤除去菌丝体后的滤液即为发酵液。
2)、提取、重结晶和结构鉴定：
将上述步骤1)所得的发酵液用乙酸乙酯萃取，再减压回收乙酸乙酯，得萃取液；将上述萃取液用乙醇重结晶得到红色棱形单晶体，即为2，3β-二羟基卷线孢菌素。
经核磁共振(表1)和晶体x射线衍射测定(表2和表3)，其结构式为：
晶体x射线衍射测定以单色化的Mo K日辐射为光源，在Rigaku AFC一7S型x射线衍射仪上收集晶体衍射数据。晶体结构用直接法(SHELXS 93)解出，全部非氢原子坐标和各向异性温度因子经全矩阵最小二乘法修正，氢原子位置按理论模型计算。最终一致性因子R＝0.043。晶体属单斜晶系，空间群为P21，晶胞参数a＝8.280(2)A，＝90deg.，b＝6.644(2)A，＝102.12(2)deg.，c＝13.1535(12)A，＝90deg..晶体体积：0.36×0.30×0.22mm；F(000)＝352。
表1、2，3β-二羟基卷线孢菌素的核磁共振图谱数据
No. 1H-NMR 13C-NMR 备注 1 2.65-2.68，dd，1H 35.43 2 - 68.54 3 - 76.63 4 2.51，s，1H 57.21 5 - 137.35 6 - 110.10 7 - 137.35 8 - 178.06 9 6.44，s，1H 139.98 10 - 110.10 11 - 184.87 12 - 137.35 13 - 108.03 14 - 137.35 CH3 1.23，s，3H 25.92 OCH3 3.90，s，3H 160.74 OH 12.62，13.39，4.5，5.0 重水交换
表2、2，3β-二羟基卷线孢菌素的晶体原子坐标(×104)和等效各向同性位移参数(×103nm2)
表3、2，3β-二羟基卷线孢菌素的晶体键长[A]和键角[deg]
实施例3、2，3β-二羟基卷线孢菌素的毒性测定：
以对卤虫(Artemia salina)的毒性试验测定2，3β-二羟基卷线孢菌素的毒性。卤虫卵在pH 8.5的人工海水中28℃培养孵化24hr。将人工海水以1∶1的比例与系列浓度的卷线孢菌素溶液混合加入到试管中，每处理3个重复，同时以蒸馏水、鬼臼毒素分别作为空白对照和阳性对照。在每个试管中加入30只正常的卤虫，培养24hr后观察及记录各处理的卤虫死亡数，计算校正死亡率，采用剂量对数-死亡率机率值法计算求得半抑制浓度(LC50)。
具体如表4所示。
表4
根据上述表4的内容可知：细胞毒试验测定表明，2，3β-二羟基卷线孢菌素对卤虫的LC50大于200μg/mL，表明该可作为色素的2，3β-二羟基卷线孢菌素无毒。
实施例4、2，3β-二羟基卷线孢菌素的抗细菌活性测定：
营养琼脂培养基(Nutrient agar，NA)：蛋白胨5g，牛肉浸粉3g，琼脂15g，水1000ml，pH 6.6-7.0。
以芽胞杆菌(Bacillus sp.)为指示菌株，采用琼脂稀释法测定2，3β-二羟基卷线孢菌素对指示菌的抑制作用(图3)。将预先培养的指示菌按一定量加入到预先溶化的NA培养基中，混匀成含1×105CFU指示菌的带菌培养基。再将不同浓度的2，3β-二羟基卷线孢菌素按一定量加入到上述带菌培养基中，混匀后倒入直径9mm的培养皿中，制成分别含200、50、25、12.5、6.25μg/ml 2，3β-二羟基卷线孢菌素的琼脂培养基平板，同时用不含2，3β-二羟基卷线孢菌素的带菌培养基作对照，各种浓度和对照重复3次，测定对细菌抑制的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)，如图3所示。
根据图3可知：琼脂稀释法测定表明，2，3β-二羟基卷线孢菌素对芽胞杆菌的MIC为50μg/ml。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
SEQ ID NO：1
cttattgata tgcttaagtt cagcgggtat tcctacctga tccgaggtca accactaaaa 60
aattgggggt tttatggcga gaagatagag ccttacagaa gcgagaaata aatttactac 120
gctcagagga caactatcgc tccgccactg tctttaagga actacaatac agtagattcc 180
caacactaag ctaggcttaa gggttgaaat gacgctcgaa caggcatgcc caccagaata 240
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ttacaaatgg tatgggagtt gtataactct gtaatgatcc ctccgc 586