粘菌素原料粉末的制造方法

摘要

本发明提供一种粘菌素原料粉末的制造方法，其能够解决脱色步骤造成的制造时间增加、粘菌素主成分的收率下降而导致成本上升、以及碳废弃物的产生造成的环境负荷等现有制造法的问题，且不进行脱色步骤。本发明提供能够生产白色度高的粘菌素原料粉末的多粘芽孢杆菌变种粘菌素、白色度高的粘菌素原料粉末、以及制造白色度高的粘菌素原料粉末的方法。

权利要求

1.一种多粘芽孢杆菌变种粘菌素M50株，其在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心以登记号FERM ABP-10656保藏。

2.一种制造在400nm处5％浓度(W/V)水溶液的吸光度为0.15以下的粘菌素原料粉末的方法，其中，培养权利要求1所述的多粘芽孢杆菌变种粘菌素，使培养物吸附到离子交换树脂上并洗脱后，进行浓缩和干燥。

3.通过权利要求2所述的制造方法得到的在400nm处5％浓度(W/V)水溶液的吸光度为0.15以下的粘菌素原料粉末。

说明书

粘菌素原料粉末的制造方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种不进行脱色步骤而得到白色度高的粘菌素原料粉末(原末)的制造方法，其特征在于，可以得到与现有的粘菌素发酵生产中使用的生产菌株相比培养液的着色大幅减少的新型菌株，并且将该新型菌株作为生产菌株使用。

背景技术

[0002] 粘菌素是对革兰阴性菌具有广谱杀菌作用的肽类抗生物质。其作用机理是通过活化细菌的细胞质膜的磷脂酶而引起磷脂的分解，从而溶菌。粘菌素的选择毒性低，不从肠道吸收，因此作为饲料用添加物广泛使用。

[0003] 作为通过微生物的发酵生产制造粘菌素的方法，已知以含有大量可以廉价得到的淀粉物质等的天然原料作为主原料的、通过杆菌(Bacillus)属细菌、特别是多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)进行发酵生产的方法(参照专利文献1、2)。

[0004] 以便宜的天然原料作为主原料，通过杆菌属细菌特别是多粘芽孢杆菌进行粘菌素的发酵制造时，随着发酵的进行培养液的着色变深，一直到目标物粘菌素的生产量达到最高值的发酵结束时着色增加。因此，为了从含有粘菌素的培养液中除去培养基营养源成分或发酵生成的粘菌素以外的代谢物等，提高粘菌素的纯度，而实施纯化步骤。但是，对于发酵步骤中增加的培养液的着色物质而言，不能通过上述纯化步骤完全除去，而残留在制品的粘菌素原料粉末中，结果得到着色深的粘菌素原料粉末。特别是欧洲医药品(包括动物用医药品)中使用的质量标准《欧洲药典第5版》(2004年6月15日发行，2005年1月1日实施)中，规定了粘菌素原料粉末的颜色标准是“白色或者大致白色”。为了制造符合该标准的粘菌素原料粉末，在现有的粘菌素原料粉末的制造方法中，在纯化步骤中需要使用碳等的脱色步骤。通过碳进行脱色步骤的现有粘菌素原料粉末制造方法中，存在制造所需的时间增加、且目标物质粘菌素原料粉末的回收率下降等问题。

[0005] 专利文献1：日本特开昭58-47493号公报

[0006] 专利文献2：日本特开昭58-129993号公报

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供不进行现有粘菌素原料粉末的制造方法中所必需的脱色步骤、而制造白色度高的粘菌素原料粉末的方法。

[0008] 为了解决上述问题，本发明人进行了广泛深入的研究，结果发现通过对现有的生产菌株进行变异处理，可以得到着色度减少的菌株，并且通过使用该菌株，不进行脱色步骤可以得到白色度高的粘菌素原料粉末，从而完成了本发明。

[0009] 即，本发明如下所述。

[0010] (1)一种多粘芽孢杆菌变种粘菌素(バチルス·ポリミキサ·バ一·コリスチニゥス，bacillus polymyxa var.colistinus)，其能够生产在400nm处5％浓度(W/V)水溶液的吸光度为0.15以下的粘菌素原料粉末。

[0011] (2)一种多粘芽孢杆菌变种粘菌素M50株，其在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心以登记号FERM ABP-10656保藏。

[0012] (3)一种制造在400nm处5％浓度(W/V)水溶液的吸光度为0.15以下的粘菌素原料粉末的方法，其中，培养上述(1)或(2)所述的多粘芽孢杆菌变种粘菌素，使培养物吸附到离子交换树脂上并洗脱后，进行浓缩和干燥。

[0013] (4)通过上述(3)所述的制造方法得到的在400nm处5％浓度(W/V)水溶液的吸光度为0.15以下的粘菌素原料粉末。

[0014] 发明效果

[0015] 通过本发明，可以提供对粘菌素原料粉末的制造方法有用的新型生产菌株。另外，通过使用本发明的菌株作为生产菌株，不进行现有粘菌素原料粉末制造方法中必须的脱色步骤就可以提供白色度高的粘菌素原料粉末。

附图说明

[0016] 图1表示来自实施例1得到的202-71株的培养滤液及来自M50株的培养滤液在300～600nm处的吸光度。

[0017] 图2表示来自实施例3得到的M50株的粘菌素原料粉末溶于去离子水中得到的液体的液相色谱(HPLC)分析图。

具体实施方式

[0018] 微生物的保藏

[0019] 多粘芽孢杆菌变种粘菌素(bacillus polymyxa var.colistinus)M50株在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心( 305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)以登记号：FERMABP-10656进行了国际保藏(平成18年8月11日自原保藏：FERMP-20553、原保藏日：平成17年5月31日基于布达佩斯条约移交国际保藏)。

[0020] 以下详细说明本发明。

[0021] 本发明中，对现有粘菌素发酵生产中使用的生产菌株进行人工突变处理，得到目标生产菌株。

[0022] 作为人工突变处理方法，如果是人工变异处理则没有特别限制，可以使用例如：使用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、甲磺酸乙酯等变异剂的化学方法；紫外线照射、X射线照射等物理方法；利用基因重组、转座子等的生物学方法等变异处理方法。

[0023] 进行突变处理得到的菌群，使用烧瓶进行液体培养，以培养液的着色度及粘菌素的生产能力为指标进行筛选。在此，着色度以培养液的滤纸过滤液在400nm处的吸光度测定值为指标。另外，粘菌素生产能力以培养液的滤纸过滤液的HPLC分析值为指标。

[0024] 这样，得到一种该着色度与现有的生产菌株相比大幅下降、且粘菌素生产能力为同等或者更好的生产菌株多粘芽孢杆菌变种粘菌素(bacillus polymyxa var.colistinus)。

[0025] 本发明中，可以使用多粘芽孢杆菌变种粘菌素的粘菌素生产中得到的粘菌素原料粉末的白色度明显高的菌株。具体而言，如果是可以得到在400nm处5％浓度(W/V)水溶液的吸光度为0.15以下、优选0.087以下、更优选0.070以上0.087以下的粘菌素原料粉末的多粘芽孢杆菌变种粘菌素，则可以在本发明中使用。另外，作为本发明中可以使用的生产菌株，可以列举这些菌株的传代培养株、变异株、基因重组株等。

[0026] 以本发明的生产菌株的一个例子M50株作为生产菌株从发酵生产的培养液不进行碳等的脱色步骤而制造的粘菌素原料粉末的色调，与从得自现有的生产菌株的培养液进行脱色步骤制造的粘菌素原料粉末的色调相比，白色度明显高。即，通过使用本发明得到的M50株作为生产菌株，不进行现有粘菌素原料粉末制造方法中所必须的脱色步骤，可以得到白色度高的粘菌素原料粉末。

[0027] 本发明中，通过培养多粘芽孢杆菌变种粘菌素，使培养物吸附到离子交换树脂上并洗脱，然后进行浓缩和干燥，不进行脱色步骤，可以制造在400nm处5％浓度(W/V)水溶液的吸光度为0.15以下的粘菌素原料粉末。由此，可以制造符合欧洲医药品(包括动物用医药品)中使用的粘菌素原料粉末质量标准、即欧洲药典的颜色标准“大致为白色”的粘菌素原料粉末。另外，通常需要添加活性炭等碳并搅拌过滤等的脱色步骤，但是本发明的制造方法中由于省略了脱色步骤，因此可以将粘菌素原料粉末制造所需的时间缩短约半天。另外，可以减少脱色中使用的碳等造成的粘菌素原料粉末损失，同时也可以避免现有粘菌素原料粉末制造法的脱色步骤中使用的碳等的废弃。

[0028] 另外，本发明的粘菌素原料粉末，含有作为多粘菌素类肽抗生物质普遍知道的粘菌素。粘菌素中，已知下述结构的粘菌素A、以及具有同样氨基酸结构的粘菌素B。

[0029]

[0030] MOA：6-甲基辛酸

[0031] Dia：α，γ-二氨基丁酸

[0032] 粘菌素A

[0033] 本发明的粘菌素原料粉末，是指以可以作为医药品使用的程度含有粘菌素的粗提取物，如上所述不经脱色步骤而得到。粘菌素原料粉末的使用方法没有特别限制，既可以直接使用，也可以进一步处理后作为粘菌素制剂使用。

[0034] 以下通过实施例和试验例更详细地说明本发明，但是本发明不限于这些实施例及试验例。另外，各实施例和试验例中吸光度的测定使用日本分光社制造的分光高度计V-560进行。另外，如果没有特别定义，则％表示重量对容量的百分率(W/V)。

[0035] 实施例

[0036] <实施例1>

[0037] 对现有在粘菌素原料粉末的制造中使用的多粘芽孢杆菌变种粘菌素202-71株，通过浓度10～1000μg/mg的NTG、在温度25～30℃静置或振荡1分钟～24小时，进行突变处理，在包含胰蛋白胨2％、酵母提取物0.2％和葡萄糖1％的琼脂培养板上培养菌落。将各菌落(菌株)接种到包含普通肉汤2％、酵母提取物0.2％和氯化钠0.3％的液体种子培养基上，在28℃培养约24小时后，将约0.1mL接种到加有30mL含有矢车菊4.5％、玉米粉1.5％、小麦胚芽0.2％、脱脂大豆0.2％、硫酸铵1％、磷酸二氢钾0.05％、硫酸亚铁
0.005％、碳酸钙0.05％和糖稀1.5％的液体培养基的250mL容积锥形瓶中。在28℃振荡培养约120小时后，使用滤纸过滤培养液，比较所得滤液的色调和粘菌素的生产率。从这些菌群中选择M50株作为与202-71株的粘菌素生产能力同等或更好、并且滤液的色调明显比202-71株淡的菌株。对于202-71株和M50株的培养滤液，使用分光光度计测定300～
600nm处的吸光度，结果示于图1。对于400nm的吸光度而言，与来自202-71株的培养滤液的3.61相比，来自M50株的培养滤液为1.42，发现有明显差异(表1)。

[0038] 表1

[0039]菌株 粘菌素生产能力(％) 吸光度(400nm)
M50 150 1.42
202-71 100 3.61

[0040] <实施例2>

[0041] 将实施例1得到的培养液着色浅的M50株和现有的粘菌素发酵生产中使用的培养液着色深的202-71株接种到含有普通肉汤2％、酵母提取物0.2％和氯化钠0.3％的液体种子培养基中，在28℃培养约24小时后，将各自约15mL接种到加入了4L含有矢车菊4.5％、玉米粉1.5％、小麦胚芽0.2％、脱脂大豆0.2％、硫酸铵1％、磷酸二氢钾0.05％、硫酸亚铁0.005％、碳酸钙0.05％和糖稀1.5％的液体培养基的5L容积的发酵缸中。分别在通风搅拌、且在pH5.0～7.0、30℃下培养约120～144小时。使用滤纸过滤得到的培养液，测定
400nm处的吸光度，结果与来自202-71株的培养滤液的4.50相比，来自M50株的培养滤液为1.39，与实施例1用烧瓶的试验结果同样发现了明显差异(表2)。

[0042] 表2

[0043]菌株 粘菌素生产能力(％) 吸光度(400nm)
M50 129 1.39
202-71 100 4.50

[0044] <实施例3>

[0045] 将实施例2得到的M50株和202-71株的5L容积发酵缸培养液用涂敷了助滤剂(ボディミックス)的吸滤器(Nutsche)过滤后，使其吸附到填充到柱子中的离子交换树+脂(ァンバ一ラィトIRC-50(Na 型)ロ一ムァンドハ一ス社制，300mL)上。用约0.4mol/L的硫酸从离子交换树脂上洗脱粘菌素后，用600mL去离子水洗涤，将得到的洗脱液、洗涤液的混合液浓缩至约5％浓度(W/V)，得到粘菌素高含量液。粘菌素高含量液的在400nm处吸光度，与来自202-71株的粘菌素高含量液的0.359相比，来自M50株的粘菌素高含量液为0.07，很明显来自M50株的粘菌素高含量液的着色浅(表3)。

[0046] 表3

[0047]菌株 吸光度(400nm) 固体(％) pH
M50 0.070 4.9 3.35
202-71 0.359 5.0 3.33

[0048] 另外，将各粘菌素高含量液喷雾干燥，得到目标粘菌素原料粉末。来自202-71株的粘菌素原料粉末，为带有茶色的色调。与此相对，来自M50株的粘菌素原料粉末为稍带黄色的白色，很明显来自M50株的粘菌素原料粉末的着色比来自202-71株的粘菌素原料粉末浅，为更加白色。将各粘菌素原料粉末溶解于去离子水中至5％浓度(W/V)，得到5％浓度(W/V)水溶液。测定400nm处5％浓度(W/V)水溶液的吸光度，与来自202-71株的粘菌素原料粉末的0.479相比，来自M50株的粘菌素原料粉末为0.087，发现明显差异(表4)。

[0049] 表4

[0050]菌株 吸光度(400nm)
M50 0.087
202-71 0.479

[0051] <试验例1>

[0052] 将实施例3得到的来自M50株的粘菌素原料粉末溶解于去离子水中得到的液体通过液相色谱(HPLC)进行分析，其结果示于图2中。HPLC的测定条件如下所述。

[0053] 测定条件

[0054] 检测器：吸光度检测器(测定波长：215nm)

[0055] 色谱柱：YMC-Pack ODS-AM(AM-312)(YMC社制)

[0056] 150mm×Ф4.6mm

[0057] 柱温：30℃

[0058] 流动相：4.46克无水硫酸钠溶解于900ml纯水中，加入2.5ml的磷酸，定容到100ml(pH2.3～2.5)。在该溶液78中以22的比例混合乙腈。

[0059] 流量：1.0ml/分钟

[0060] <试验例2>

[0061] 为了使实施例3得到的来自202-71株的粘菌素高含量液达到实施例3得到的来自M50株的粘菌素高含量液的色调，关于必要的脱色碳量进行试验。相对于来自202-71株的粘菌素高含量液的固体成分换算量，添加相当于2％、5％和10％(均为W/V)的碳(精製白鹭，武田药品工业公司制)并搅拌30分钟，然后用桐山漏斗过滤，将得到的滤液喷雾干燥。将各喷雾干燥粉末溶解于去离子水，得到5％浓度(W/V)水溶液。测定400nm处5％浓度(W/V)水溶液的吸光度的结果，即使是脱色碳量最多的添加10％(W/V)碳的水溶液，吸光度也为0.135，未达到实施例3得到的未进行脱色碳处理的来自M50株的粘菌素高含量液的吸光度0.087(表5)。

[0062] 表5

[0063]菌株 添加的碳量(W/V) 吸光度(400nm) 粘菌素收率损失(％)
M50 0％ 0.087 0
202-71 0％ 0.479 0
2％ 0.246 --
5％ 0.168 --
10％ 0.135 26.7

[0064] 另外，由于添加10％(W/V)碳的脱色步骤造成的粘菌素收率损失为约27％(表5)，因此包含脱色步骤的粘菌素制造法中粘菌素的收率明显下降。利用现有的生产菌株为了得到白色度高的粘菌素原料粉末，必须进行用大量的去离子水洗涤离子交换树脂、或者经过用大量碳处理离子交换树脂的洗脱液的脱色步骤，但是使用培养液的着色浅、无需碳脱色步骤的M50株的粘菌素原料粉末的制造法具有非常大的优点。

[0065] 产业实用性

[0066] 通过本发明，可以提供在粘菌素原料粉末的制造法中有用的新型生产菌株。另外，通过使用本发明的菌株，不经现有粘菌素原料粉末制造法中必须的脱色步骤，可以提供有效的粘菌素原料粉末制造法。