胸腺肽β4在制备防治支气管哮喘药物中的应用

摘要

本发明提供了胸腺肽β4在制备防治支气管哮喘药物中的应用。经试验证明，胸腺肽β4可以提高小鼠的潮气量，降低呼吸频率，改善小鼠的肺通气功能；胸腺肽β4可以抑制Th2细胞亚群的亢进，减少IL-5的产生，阻止嗜酸性粒细胞的聚集及黏附，从而减轻气道和肺组织的炎症；胸腺肽β4从上述途径干预哮喘的发生，减轻哮喘的症状，延缓气道阻塞的不可逆性，恢复哮喘的肺功能水平。本发明为新药筛选提供了基础。

权利要求

1.天然胸腺肽β4作为唯一活性成分在制备防治支气管哮喘药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于胸腺肽β4在制备改善肺通气功能的药物中的应用。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于胸腺肽β4在制备减轻气道和肺组织炎症的药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于胸腺肽β4在制备减少血液中IL-5产生的药物中的应用。

说明书

胸腺肽β4在制备防治支气管哮喘药物中的应用

(一)技术领域

[0001] 本发明涉及胸腺肽β4在制备防治支气管哮喘药物中的应用。(二)背景技术

[0002] 支气管哮喘(bronchial asthma，简称哮喘)是一种世界常见和多发的呼吸道顽固性疾病。全球约有1.6亿左右哮喘患者(马艳良，何权瀛.从哮喘的流行病学调查看我国哮喘诊断不足问题，中国呼吸与危重监护杂志，Jan，2004，Vol.3，No.1)，并且全球范围的哮喘发病率和病死率均呈上升趋势。哮喘不仅直接影响患者的健康，而且成为严重的社会问题，对社会增加严重的经济负担，故哮喘的防治有着极高的社会意义和经济效益。但哮喘是一种复杂的气道疾病，其发病机制比较复杂，目前为止尚没有满意的诠释。2006版GINA的出台为哮喘的诊断和治疗提出了指导性的意见，使其有了可遵循的依据。GINA对哮喘的定义为：哮喘是气道的一种慢性炎症性疾病，许多细胞和细胞因子参与此过程的发生。这种慢性炎症引起气道高反应性，导致喘鸣、呼吸困难、咳嗽的反复发作，常在夜间和清晨发生，与广泛多变的气流受限有关，常可自行缓解或经治疗后缓解。GINA还强调了肺功能检查在哮喘的诊断及分级方面的重要性，认为通过肺功能检查可以很大程度上提高对哮喘诊断的准确性，减少漏诊和误诊。通过肺功能的检查，在治疗哮喘的过程中，可以随时监测肺的通气功能及了解气道阻塞情况，指导临床用药。

[0003] 现代医学治疗哮喘以糖皮质激素为最有效的平喘抗炎治疗药物，因哮喘是一种慢性持续性炎症，需要长期用药，使患者出现了一系列的不良反应，主要表现为：口咽部真菌感染、声嘶，长期大剂量还可引起高血压、糖尿病、胃十二指肠溃疡出血、骨质疏松和股骨头坏死等，使患者对激素治疗产生恐惧。临床上还选用色甘酸钠、抗白三烯药物等抗炎、支气管舒张药、免疫方法治疗哮喘，但效果不是很好。迫切需要研究开发针对性强、副作用小、疗效高的平喘抗炎治疗药物。

[0004] 有关胸腺肤的研究开始于20世纪60年代，当时研究者正在寻找调节胸腺生理功能的胸腺因子。继而，在为恢复丧失胸腺调节功能的动物以及患有先天性免疫缺陷和免疫力低下患者的胸腺调节功能的摸索过程中，胸腺5(thymosin fraction5，TFS)被发现了：它是小牛胸腺的提取物，是一类具有改善免疫调节功能的小分子多肽混合物。根据等电点的不同，胸腺肽可以分为三大类：pH低于5.0的α-胸腺肽，pH在5.0和7.0之间的β-胸腺肽，以及pH高于7.0的γ-胸腺肽。最先从胸腺素5中分离出的两个多肽是α1和β1。
近年来，随着分离纯化技术的不断改善和提高，从TF5中分离出了α1、α3、α7、β3、β4等多种具有活性的单肽成分。目前这些单肽成分己经被用于临床实验研究。众多研究表明，胸腺肽含有多种有效成份，对机体的免疫系统、神经系统、生殖系统发挥着重要作用，能明显改善临床症状，尤其对支气管哮喘患者的细胞免疫和体液免疫有增强和调节作用。但胸腺肽为众多小分子多肽的混合物，所包含的物质达一百多种，究竟是哪一种多肽对支气管哮喘患者的细胞免疫和体液免疫有增强和调节作用，及其作用机理如何，还有待进一步深入研究。

[0005] 胸腺肽β4是从胸腺素5和5A中分离得到的，是胸腺肽β家族中的一员。尽管胸腺肽β4是从胸腺中分离得到的，但在机体众多组织中均有它的踪迹，在参与调节细胞及生理活动等一系列过程中呈现出功能的多样性，因此自它诞生时起，就引起了生物医学工作者的广泛关注。

[0006] 胸腺肤β4是由43个氨基酸残基组成的多肽，分子量4963，等电点为5.1，在哺乳动物中高度保守。与胸腺肤α原或类胸腺肽不同，胸腺肽β4是胞浆蛋白而非核蛋白。并且它只含有较少的疏水性氨基酸，不含有Lys-Lys-Xaa-Lys区域。其氨基酸序列如下：

[0007] Ser-AsP-Lys-Pro-AsP-Met-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Phe-AsP-Lys-Ser-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-Gln-Lys-Asn-Pro-Leu-Pro-Ser-Lys-Glu-Thr-I1e-Glu-Gin-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser。

[0008] 研究表明，胸腺肽β4具有广泛的医疗应用价值。目前还未有胸腺肽β4应用于支气管哮喘的报道。(三)发明内容

[0009] 本发明目的是提供胸腺肽β4在制备防治哮喘病药物中的应用。

[0010] 本发明采用的技术方案是：

[0011] 胸腺肽β4在制备防治支气管哮喘药物中的应用。

[0012] 具体的，胸腺肽β4可用于制备改善肺通气功能的药物或减轻气道和肺组织炎症的药物。

[0013] 支气管哮喘是以气道局部炎症反应为主要特点的变态反应性疾病，其发病机制的研究已经成为国内外医学界的热点之一。研究哮喘的首要问题就是成功复制支气管哮喘动物模型，并成为研究临床哮喘的关键步骤。哮喘动物模型的制作最基础的环节是动物的选择。最初国内外首选较易致敏的豚鼠，但缺点在于豚鼠的个体反应差异大，对于致敏原或不反应或明显反应甚至死亡。

[0014] 近十几年来，用大鼠制作哮喘动物模型的技术日见成熟，国内以wistar大鼠为主，国外以Brown Norway大鼠为主。但由于大鼠价格比较贵，体积比较大，操作起来不是很方便。最近几年由于实验技术和检测手段的改进，国内外开始选择小鼠复制哮喘模型。小鼠价格低廉、品系纯、繁殖快、免疫系统认识广泛全面，是近年来采用最多的哮喘动物模型，国内外用来研究支气管哮喘常用的小鼠为BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠。小鼠哮喘模型一般分为变态反应性炎症哮喘模型、气道重塑模型和生物因素诱导的哮喘模型等。实验中一般用的哮喘模型为变态反应性炎症哮喘模型，抗原一般选择鸡卵清白蛋白(OVA)，因OVA免疫原性强、价格低廉、来源方便，比较常用，还可以与免疫佐剂(主要为氢氧化铝)联合使用。

[0015] Temelkovski等首先应用OVA在小鼠腹腔注射致敏，并在三周后以2.5％的OVA雾化激发，每天雾化30min，每周3次，持续8周，成功建立小鼠的哮喘模型。许多研究结果认为采用卵蛋白腹腔注射之后再吸入卵蛋白方法诱发哮喘造模方法简便、成功率高，也比较经济。Kumay用BALB/C小鼠亦成功复制支气管哮喘模型。

[0016] 浙江大学医学院附属二院呼吸科、浙江大学呼吸疾病研究所沈华浩教授经过大量的研究发现对于小鼠哮喘模型而言，BALB/c和C57BL/6均是合适的品系，其在进行哮喘试验中，选取C57BL/6健康小鼠，并于实验的第0天及第14天两次OVA致敏，试验第24天开始以1％的OVA雾化吸入，每日一次，共三天以激发哮喘，经小鼠肺组织病理切片检测证实成功复制哮喘。本发明按照上述方法复制小鼠哮喘模型，并通过肺组织病理切片显示哮喘模型复制成功。

[0017] 经试验证明，胸腺肽β4可以提高小鼠的潮气量，降低呼吸频率，改善小鼠的肺通气功能；胸腺肽β4可以抑制Th2细胞亚群的亢进，减少血清中IL-5的产生，阻止嗜酸性粒细胞的聚集及黏附，从而减轻气道和肺组织的炎症；胸腺肽β4从上述途径干预哮喘的发生，减轻哮喘的症状，延缓气道阻塞的不可逆性，恢复哮喘的肺功能水平。

[0018] 本发明有益效果主要体现在：提供了胸腺肽β4在制备防治支气管哮喘药物中的应用，为新药筛选提供了基础。(四)附图说明

[0019] 图1为各组小鼠潮气量比较：1为胸腺肽β4高剂量组；2为胸腺肽β4中剂量组；3为胸腺肽β4低剂量组；4地塞米松组；5为正常对照组；6为模型对照组；

[0020] 图2为各组小鼠呼吸频率比较注：1为胸腺肽β4高剂量组；2为胸腺肽β4中剂量组；3为胸腺肽β4低剂量组；4地塞米松组；5为正常对照组；6为模型对照组；

[0021] 图3为各组鼠的肺每分钟通气量比较：1为胸腺肽β4高剂量组；2为胸腺肽β4中剂量组；3为胸腺肽β4低剂量组；4地塞米松组；5为正常对照组；6为模型对照组；

[0022] 图4为各组小鼠肺泡灌洗液中欧EOS白细胞总数的比值比较：注：1为胸腺肽β4高剂量组；2为胸腺肽β4中剂量组；3为胸腺肽β4低剂量组；4地塞米松组；5为正常对照组；6为模型对照组；

[0023] 图5为小鼠哮喘模型抗原致敏、激发及药物干预程序；S1为第一次致敏，S2为第二次致敏，C1为第一次激发，C2为第二次激发，C3为第三次激发， 开始药物干预。(五)具体实施方式

[0024] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

[0025] 实施例1：

[0026] 一、实验材料与方法

[0027] 1.实验动物

[0028] 健康C57BL/6小鼠，60只，体重20±2g，雄性，浙江省中医药研究院实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK(浙)2004-0034。

[0029] 2.实验药品

[0030] 卵白蛋白(OVA)：批号052K1275，Sigma公司；

[0031] 氯化钠注射液：批号070206，浙江天瑞药业有限公司；

[0032] 戊巴比妥钠：产品批号F20030816，中国医药(集团)上海化学试剂公司；

[0033] 小鼠IL-5试剂盒：批号EK0408，武汉博士德生物工程有限公司；

[0034] 胸腺肽β4：浙江省中医药研究院提供；

[0035] 地塞米松：批号061007，浙江仙琚药股份有限公司。

[0036] 3.实验器材

[0037] Medlab-U/4C501H型生物信号采集系统，南京美易科技有限公司；

[0038] HX200型呼吸流量换能器，北京新航兴业科贸有限公司；

[0039] 402型超声雾化器，上海合力医疗器械厂；

[0040] 20cm×40cm×50cm雾化箱、3cm×4cm×10cm体积描记箱，杭州工艺品联合有限公司定做；

[0041] LXJ-IIB型低速大容量多管离心机，上海安享科学仪器厂；

[0042] Wellscan MK2型酶标仪，芬兰产；

[0043] PK-8A型电热恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司。

[0044] 4.实验方法

[0045] 4.1动物选择与分组

[0046] 取健康C57BL/6小鼠60只，雄性，称重后按照随机数字表进行分组、编号，正常对照组10只、哮喘模型组10只、地塞米松组(阳性对照组)10只、胸腺肽β4治疗组(高、中、低三个剂量组，每组10只)。

[0047] 4.2实验步骤

[0048] 4.2.1致敏液及药物配制

[0049] 4.2.1.1致敏液配制：称取20mg卵蛋白(OVA)加入1mL生理盐水中，充分溶解后，取出0.6mL加入14.4mL生理盐水中，混匀，4℃放置30分钟后使用。

[0050] 4.2.1.2药物配置：

[0051] 胸腺肽β4注射液的配制：取固体胸腺肽β42mg溶于16ml生理盐水中，胸腺肽β4高剂量组按照0.8ml/鼠腹腔注射，中剂量组按0.4ml/鼠腹腔注射，低剂量组则将上述溶液1∶1稀释后，以0.4ml/鼠腹腔注射。地塞米松组：取5mg/ml地塞米松1ml加19ml生理盐水，按照0.2ml/鼠腹腔注射。

[0052] 4.2.2小鼠哮喘模型的建立：按照经典的卵蛋白致敏法(Jeffrey R.Crosby，HH.Shen，MT.Borchers，et al.Ectopic expression of IL-5 identifies an additional CD4+Tcell mechanism of airway eosinophil recruitment.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2002；282(1)：L99-108。)建立小鼠哮喘模型。哮喘模型组、地塞米松组、胸腺肽高、中、低剂量组于实验第0天及第14天，常规消毒皮肤后，腹腔注射上述致敏液OVA，按0.2mL/鼠分别致敏；正常对照组腹腔注射0.2ml/鼠的生理盐水。

[0053] 4.2.3药物干预：于实验第21天开始，正常对照组及哮喘模型组用生理盐水按0.6ml/鼠腹腔注射生理盐水，胸腺肽β4治疗组及地塞米松组分别以上述剂量腹腔注射药物，每天一次，疗程七天。

[0054] 4.2.4哮喘激发：于实验第24天开始，激发哮喘：将正常对照组小鼠置于一密闭的自制容器(20×40×50cm)中，以生理盐水代替OVA超声雾化吸入，30分钟/次，每日1次，雾化流量为3mL/分，连续3天；其余各组小鼠分别置于相同密闭容器中，以1％OVA溶液超声雾化吸入，激发哮喘：30分钟/次，雾化流量为3mL/分，每日1次，连续3天。

[0055] 4.2.5动物处理：末次激发哮喘后48小时处理动物：称体重、测定小鼠肺功能(包括潮气量、呼吸频率，计算肺每分通气量)、摘眼球取血、取肺泡灌洗液、取肺组织等。

[0056] 具体程序见图5：

[0057] 4.2.6指标测定：

[0058] 4.2.6.1测定小鼠肺功能：将小鼠置于体积描记箱中，体积描记箱一端的三通管接雾化器，另一端接呼吸传感器，呼吸传感器再与电脑相连接。正常对照组小鼠暴露于生理盐水雾化液中，1min后测定潮气量、呼吸频率，并计算每分通气量；其余各组小鼠分别暴露于1％OVA雾化液中1分钟左右，测定潮气量、呼吸频率，计算每分通气量，并保存数据；

[0059] 4.2.6.2摘眼球取血：测定小鼠肺功能后取血，4℃离心，分离血清，保存于-20℃冰箱待测白细胞介素-5(IL-5)。

[0060] 4.2.6.3酶联免疫吸附方法(ELISA)测定IL-5：采用酶联免疫吸附方法测定血液上清液中IL-5含量.严格按照试剂盒说明书进行操作：

[0061] 具体步骤如下：

[0062] 1.取出酶标板，除去包装膜，选定拟使用孔，增加1孔作为TMB空白显色孔。

[0063] 2.按1∶2稀释样品：取50ul待测血清样品加50ul样品稀释液。

[0064] 3.取50pg/ml、25pg/ml、12.5pg/ml、6.25pg/ml、3.13pg/ml、1.56pg/ml标准品各100ul依次加入一排6孔中，另选1孔只加样品稀释液作为零孔，其他孔中依次加入稀释好的样品100ul。

[0065] 4.酶标板加盖，37℃反应60min。

[0066] 5.甩去酶标板内各孔液体，再对着吸水纸拍几下，不洗。

[0067] 6.各孔依次加入0.1ml生物素-抗小鼠IL-5抗体工作液(TMB空白显色孔除外)，37℃反应60min。

[0068] 7.以0.01M PBS洗涤3次，每次浸泡1分钟左右。

[0069] 8.各孔依次加入100ul亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)工作液(TMB空白显色孔除外)，37℃反应30min。

[0070] 9.各孔依次加入90ul TMB显色液，37℃避光反应10-15min；各孔依次滴加100ul TMB终止液，终止反应，此时蓝色立转黄色。

[0071] 10.于30分钟内用酶标仪以450nm波长测定吸光度值。

[0072] 4.2.6.4采集肺泡灌洗液：颈椎脱臼处死小鼠，结扎一侧肺进行肺泡灌洗。取1ml生理盐水缓慢注入气管，进行回抽，反复抽洗三次，共得灌洗液0.8ml以上，进行涂片、染色，于显微镜下进行细胞计数及分类，计算嗜酸性粒细胞/白细胞总数的比值。

[0073] 4.2.6.5病理组织切片：取未进行肺泡灌洗的一侧肺组织，以10％甲醛固定，石蜡包埋，进行病理切片。肺组织固定过夜后以0.1mol/LPBS液冲洗5min×3次，常规取材后进梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋、切片(厚3mm)2份，将切好的肺组织置于载玻片上，37℃烤片机上烤1小时后常温保存，2份各做HE染色。

[0074] HE染色：脱蜡(二甲苯I、II中各5分钟)→水化(100％、95％、90％、85％的酒精中各1分钟)→自来水充分冲洗1分钟→苏木素染色10分钟→酒精+盐酸分化5分钟→氨水泛蓝30秒→自来水充分冲洗1分钟→伊红染色1分钟→脱水(85％、90％、95％的酒精各1分钟)→二甲苯II、I各1分钟→树胶封片。

[0075] 光镜下观察肺组织病理形态变化并分级，采用S.Underwood制定的标准，详见表1：

[0076] 表1：哮喘小鼠肺切片的病理评分标准

[0077]血管、支气管周围
病理分级 水肿 气道上皮损伤
嗜酸性粒细胞浸润
0分 正常 正常 正常
轻度细胞浸润
1分 轻度弥漫性水肿 轻度细胞缺失
无组织病理改变
轻至中度细胞浸润
2分 中度肺泡、支气管水肿 轻度细胞缺失
轻度组织损伤
中度细胞浸润
3分 区域或局灶性水肿 中度细胞缺失
轻度组织损伤
中至高度细胞浸润
4分 明显水肿 中度细胞缺失
明显组织损伤
高度细胞浸润 上皮细胞化生
5分 类肺炎样水肿
显著组织损伤 粘液细胞增生

[0078] 注：A、轻、中、重度细胞浸润指每高倍镜下5-19个、20-39个、40个以上EOS；

[0079] B、轻度水肿指细胞肿胀、细胞间隙略增宽，偶见少量渗出液；中度指伴细胞间隙增宽达0.5个细胞平均直径以上且有较多渗出液；

[0080] C、轻度细胞缺失指高倍镜下上皮偶有中断，且少于5个细胞平均直径；中度指上皮中段距离长，多于5个细胞平均直径。

[0081] 统计方法：全部实验数据用均数±标准差(x±s)表示。多组间比较及两两之间比较采用完全随机设计的单因素方差分析(One-way ANOVA)及LSD-t检验。以P＜0.05或P＜0.01表示有显著性差异。

[0082] 二、实验结果

[0083] 1.胸腺肽β4对小鼠肺功能的影响

[0084] 胸腺肽β4高剂量、中剂量组、地塞米松组及正常对照组小鼠的潮气量和肺每分通气量明显高于哮喘模型组(P＜0.05或P＜0.01)；胸腺肽β4低剂量组小鼠的潮气量与正常对照组的小鼠比较，差异明显(P＜0.01)；胸腺肽β4高、中剂量组及地塞米松组小鼠的肺每分通气量与正常对照组比较(P＜0.01)，胸腺肽β4各剂量组与地塞米松组小鼠肺每分通气量的比较差异显著，(P＜0.01)，余项比较均无显著性差异；胸腺肽β4高、中、低及地塞米松组小鼠的呼吸频率明显低于哮喘模型组(P＜0.05)，哮喘模型组小鼠的呼吸频率明显高于正常对照组(P＜0.01)，余项比较均无显著性差异。结果分别见表2及图1、图2、图3。

[0085] 表2：各组小鼠的肺通气功能

[0086]

[0087] 注：数据表示均数±标准差

[0088] *表示与正常对照组比较，P＜0.05；△表示与哮喘模型组比较，P＜0.05；

[0089] △△表示与哮喘模型组比较，P＜0.01；☆表示与地塞米松组比较，P＜0.05；

[0090] ☆☆表示与地塞米松组比较，P＜0.01。

[0091] 2.胸腺肽β4对BALF中白细胞及嗜酸性粒细胞的影响

[0092] 胸腺肽β4高、中、低剂量组、地塞米松组及正常对照组小鼠BALF中嗜酸性粒细胞占白细胞总数的百分比明显低于哮喘模型组(P＜0.01)，胸腺肽β4各剂量组及地塞米松组与正常对照组比较，有显著差异(P＜0.01)，胸腺肽β4各剂量组与地塞米松组比较差异显著(P＜0.01)。见表3及图4。

[0093] 表3：各组小鼠BALF中白细胞及Eos数及Eos所占百分比

[0094]组别 EOS总数 白细胞总数 EOS所占百分比
(×107) (×107) (％)
胸腺肽β4高剂量组 1.581±0.51 44.92±3.98 3.55±1.19*″#
胸腺肽β4中剂量组 11.83±1.60 95.80±3.76 12.39±1.98*″#
胸腺肽β4低剂量组 18.18±2.37 97.48±3.0 18.63±2.22*″#
地塞米松组 0.92±0.18 41.58±5.91 2.22±0.37*″
正常对照组 0.11±0.03 25.91±2.73 0.44±0.14
哮喘模型组 35.52±3.09 100.27±10.42 35.85±5.35*

[0095] 注：数据表示均数±标准差，*表示与正常对照组比较，P＜0.01；″表示与哮喘模型组比较，P＜0.01；#表示与阳性对照组比较，P＜0.05。

[0096] 3.胸腺肽β4对小鼠血清中IL-5的影响

[0097] 表4：各组小鼠血清中IL-5的浓度

[0098]组别 小鼠数量(n) IL-5的浓度
胸腺肽β4高剂量组 10 16.62±1.51″
胸腺肽β4中剂量组 10 18.80±3.84*#
胸腺肽β4低剂量组 10 20.42±4.84*#
地塞米松组 10 16.60±2.74″
正常对照组 10 16.71±1.27
哮喘模型组 10 20.32±3.38*#

[0099] 注：数据表示均数±标准差，*表示与正常对照组比较，P＜0.05；″表示与哮喘模型组比较，P＜0.05；#表示与阳性对照组比较，P＜0.05。

[0100] 4.胸腺肽β4对小鼠哮喘模型肺组织形态病理学的影响

[0101] 4.1HE切片光镜下观察各组小鼠肺组织形态病理学，主要观察指标为肺支气管粘膜的炎症细胞浸润情况，特别是嗜酸性粒细胞浸润；气道上皮细胞损伤程度；粘膜以及周围组织水肿情况；细支气管与小血管管壁增厚情况等，同时进行肺组织炎症病理学分级评分分析。

[0102] 正常组小鼠肺组织切片偶见极轻度的病理损伤；周围血管和支气管偶见极少量的炎性细胞，但未见嗜酸性粒细胞；肺泡结构完整；周围组织无水肿；气道上皮细胞无损伤。

[0103] 模型组小鼠肺组织切片可见支气管和血管周围及其管腔内大量炎性细胞浸润，大量嗜酸性粒细胞及淋巴细胞渗出，并可见浆细胞浸润；气道壁有纤维化改变有结构破坏；支气管粘膜上皮水肿、变性和脱落；毛细血管扩张，充血，细小的支气管内可见粘液栓，细小支气管和小血管的管壁轻度增厚；肺泡腔融合扩大；周围组织明显水肿。

[0104] 地塞米松组小鼠的肺病理切片可见轻度的病理损伤；周围血管和支气管内少量炎性细胞浸润，主要是嗜酸性粒细胞渗出；周围组织轻度水肿，气道上皮细胞偶见损伤；支气管粘膜上皮轻度水肿，未见变性和脱落；毛细血管未见扩张、充血，细小的支气管内少量粘液栓，未见管壁增厚。

[0105] 胸腺肽β4高剂量组病理切片与地塞米松组相差不大，肺组织可见少量嗜酸性粒细胞浸润，周围组织见轻度水肿，细小支气管内少见粘液栓等。中剂量组及低剂量组病理切片嗜酸性粒细胞浸润较地塞米松组明显，周围组织中度水肿，毛细血管轻度扩张，充血。

[0106] 4.2按照上述肺组织病理评分标准进行评分

[0107] 从表5中可见，除正常对照组外，胸腺肽β4高、中、低剂量组，地塞米松组及哮喘模型组小鼠的肺组织均有不同程度的损伤及炎性细胞的浸润，与正常对照组比较有显著性差异(P＜0.01)；胸腺肽β4高、中剂量组积分明显低于哮喘模型组，差异有统计学意义(P＜0.01)，高于地塞米松组，P＜0.01；胸腺肽β4低剂量组积分与哮喘模型组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。表明胸腺肽β4高、中剂量可以减轻肺组织炎性细胞的浸润，减轻肺组织的损伤，而低剂量效果不显著。

[0108] 表5：各组小鼠肺组织病理评分的比较

[0109]

[0110] 注：数据表示均数±标准差

[0111] **表示与正常对照组比较，P＜0.01；△△表示与哮喘模型组比较，P＜0.01；

[0112] ☆☆表示与地塞米松组比较，P＜0.01

[0113] 三、结论

[0114] 实验研究结果显示胸腺肽β4可以减轻气道炎症，减少气道及肺组织内炎性物质渗出，减轻气道阻塞，改善小鼠的肺通气功能，对哮喘起到治疗作用。具体如下：

[0115] 哮喘模型组小鼠血清中IL-5及肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞水平比正常对照组比较明显增高(P＜0.5)，提示用卵蛋白致敏小鼠气道出现炎症反应，致敏后血清中IL-5、肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞明显升高。

[0116] 用地塞米松及胸腺肽高、中、低三个剂量对致敏小鼠腹腔注射治疗一周后，发现与哮喘模型组比较，地塞米松及胸腺肽β4可以明显减少血液中IL-5的水平及肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞的含量(P＜0.05)，推论胸腺肽β4可以抑制Th2细胞的亢进，抑制Th2细胞分泌产生IL-5，从而减少IL-5对EOS的促进繁殖及分化作用，减少EOS的趋化和黏附，从而减轻气道炎症，达到治疗哮喘的目的。

[0117] 实验中选择潮气量、呼吸频率和每分通气量作为评价肺通气功能的指标。实验结果显示，哮喘模型组小鼠的肺通气功能与正常组比较明显降低(潮气量下降、呼吸频率提高，每分通气量降低，P＜0.01)；经过地塞米松及胸腺肽β4治疗后小鼠的肺功能得到明显改善，与正常组比较，无统计学意义(P＞0.05)；地塞米松组与胸腺肽β4三个剂量组比较差异不明显(P＞0.05)。提示胸腺肽β4可以改善哮喘小鼠的肺通气功能，改善小鼠的气道阻塞，从而减轻哮喘症状。

[0118] 实验结果显示胸腺肽β4可以调整机体的免疫功能，通过增强Th1类细胞因子的合成与释放，抑制Th2细胞亚群的亢进，纠正Th1/Th2比例失衡，减少血清中IL-5等细胞因子的产生，抑制EOS繁殖、分化、趋化和黏附作用，减轻气道炎症，达到治疗哮喘的目的；胸腺肽β4通过降低小鼠的呼吸频率，提高潮气量，达到改善小鼠的肺通气功能。

[0119] 本发明为胸腺肽β4应用于临床哮喘病的治疗提供了一条新途径。