假单胞菌M18的RNA快速提取方法

摘要

本发明涉及的是一种生物工程技术领域的假单胞菌M18的RNA快速提取方法。包括如下步骤：收集106～107个细胞假单胞菌M18，加入变性液和氯仿，混匀，离心，菌液在管中分为三层；吸取500μl上层液体转移至硅膜柱中，并加入异丙醇，离心；加入乙醇至硅膜柱中，离心；重复上一步；再离心，保证硅膜柱内无液体；加入双蒸水、洗脱液至硅膜柱内；离心，用一干净离心管收集洗脱液。本发明提取时间大大缩短，从提取RNA的方法中可以看出：提取的时间在6min之内；没有DNA污染；提取过程易于自动化。对过柱条件优化后，提取出的RNA纯度很高；通过分光光度计测定提取出的RNA其吸光值A260/A280＝1.93。

权利要求

1.一种假单胞菌M18的RNA快速提取优化方法，其特征在于，包括如下步骤：

6 7

①收集10 ～10 个细胞假单胞菌M18，加入变性液和氯仿，混匀，离心，菌液在管中分为三层；

②吸取500μl上层液体转移至硅膜柱中，并加入异丙醇，离心；

③加入乙醇至硅膜柱中，离心；

④重复上一步；

⑤再离心，保证硅膜柱内无液体；

⑥加入双蒸水、洗脱液至硅膜柱内；

⑦离心，用一干净离心管收集洗脱液；

所述的变性液，其制备方法为：

a)取一个80ml的瓶子，称取固体异硫氰酸胍3.56g～7.12g，将其放入瓶子中；

b)称取十二烷基肌氨酸钠0.02g～0.06g，并将其倒入瓶子中；

c)配制0.75M柠檬酸钠溶液，吸取225μl～450μl放入瓶子，配制2M醋酸钠溶液，吸取300μl～600μl加入到瓶子中；

d)配制14.3Mβ-巯基乙醇，吸取45μl～90μl加入到瓶子之中；

e)加入饱和苯酚2ml～4ml；

f)加入异戊醇100μl～200μl；

g)用双蒸水定容至10ml；

h)60℃水浴加热至完全溶解，然后用纯乙酸调节pH到3.5～4.0；

i)放置在室温下备用。

2.根据权利要求1所述的假单胞菌M18的RNA快速提取优化方法，其特征是，步骤①所述的加入变性液，为800μl～3000μl。

3.根据权利要求1所述的假单胞菌M18的RNA快速提取优化方法，其特征是，步骤①所述的加入氯仿，为200μl～500μl。

4.根据权利要求1所述的假单胞菌M18的RNA快速提取优化方法，其特征是，步骤②所述的加入异丙醇为：100～500μl。

5.根据权利要求1所述的假单胞菌M18的RNA快速提取优化方法，其特征是，步骤③所述的乙醇，是指：75％乙醇洗液500μl。

6.根据权利要求1所述的假单胞菌M18的RNA快速提取优化方法，其特征是，所述的离心，是指：转速：12,000rpm，离心时间：0.5min～1min。

7.根据权利要求1所述的假单胞菌M18的RNA快速提取优化方法，其特征是，步骤⑥洗脱液，为甲酰胺50～100μl。

8.根据权利要求2所述的假单胞菌M18的RNA快速提取优化方法，其特征是，所述的变性液，其组分和重量百分比为：35.6％～71.2％异硫氰酸胍，0.2％～1.5％柠檬酸钠，

0.5％～1.0％醋酸钠，0.2％～0.6％十二烷基肌氨酸钠，0.5％～1.0％β-巯基乙醇，

20％～40％苯酚，1％～2％异戊醇。

9.根据权利要求1所述的假单胞菌M18的RNA快速提取优化方法，其特征是，所述的硅膜柱，是指：能透过溶液的、用硅材料或者玻璃纤维制成的过滤介质。

说明书

假单胞菌M18的RNA快速提取方法

技术领域

[0001] 本发明涉及的是一种生物工程技术领域的方法，特别是一种假单胞菌M18的RNA快速提取方法。

背景技术

[0002] 目前许多微生物学研究需要快速提取假单胞菌M18的RNA。当前，检测内容主要集中在环境变量、宏观生物量和产品产率几个方面。在环境、宏观生物量参数和产品之间，还存在着菌体内产品合成和调控的生化过程，如产品合成基因和调控基因的DNA转录成为RNA，RNA翻译成为蛋白质，以及酶促生化反应至产品等中间过程环节。

[0003] 国内外已有的提取RNA的方法多种多样，例如美国科学家Chomczynski P所发明的酸酚-异硫氰酸胍-氯仿法(其文章出处为：Chomczynski P，Sacchi N，The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction[J]，Nat Protoc，2006，1(2)：581-585)。目前国内外认为酸酚-异硫氰酸胍-氯仿法是最标准的方法，其基本原理是应用异硫氰酸胍裂解细胞，异硫氰酸胍同时还有保护RNA不被降解的功能，然后用异丙醇沉淀RNA。此方法耗时三小时，操作步骤繁琐，难以自动化，而且最重要的不足之处是用此方法提取出的RNA中常有DNA污染。Trizol商业试剂盒(《总RNA抽提试剂盒(Trizol法)》，技术手册No.GRX001上海博彩生物科技有限公司版本：20060815-1)，其应用的原理也是用异硫氰酸胍裂解细胞，然后用异丙醇沉淀RNA，步骤繁琐，非常昂贵，用时大概一小时。快速提取RNA的应用越来越广泛，这些方法不能快速提取RNA，各个成分的浓度也没有达到最优化，pH值等参数的影响也被忽略。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于克服现有RNA提取技术中的DNA污染现象、缩短提取时间、实现提取过程易于自动化，提供一种假单胞菌M18的RNA快速提取优化方法。本发明系统优化了变性液配方，利用硅膜柱吸附RNA代替异丙醇沉淀RNA，把整个提取时间缩短在6min之内。本发明优化了过柱的条件，采用此法提取的RNA的纯度高，OD260/280nm达到1.93，琼脂糖电泳条带中没有DNA污染。

[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0006] 本发明包括如下步骤：

[0007] ①收集假单胞菌M18(约106～107个细胞)，加入800μl～3000μl变性液，200μl～500μl氯仿，涡旋混匀，4℃ 12,000rpm离心0.5min～1min，菌液在管中分为三层；

[0008] ②吸取500μl上层液体转移至硅膜柱中，并加入100～500μl异丙醇，12,000rpm离心0.5min～1min；

[0009] ③加入75％乙醇洗液500μl至硅膜柱中，12,000rpm离心0.5min～1min；

[0010] ④重复上一步；

[0011] ⑤再12,000rpm离心0.5min～1min，保证硅膜柱内无液体；

[0012] ⑥加入双蒸水，甲酰胺或其他洗脱液50～100μl至硅膜柱内；

[0013] ⑦12,000rpm离心1min，用一干净离心管收集洗脱液。

[0014] 所述的变性液，其组分和重量百分比为：35.6％～71.2％异硫氰酸胍；0.2％～1.5％柠檬酸钠；0.5％～1.0％醋酸钠；0.2％～0.6％十二烷基肌氨酸钠；0.5％～1.0％β-巯基乙醇；20％～40％苯酚；1％～2％异戊醇。

[0015] 所述的硅膜柱，是指：能透过溶液的、用硅材料或者玻璃纤维制成的过滤介质。

[0016] 所述的变性液，其制备方法为：

[0017] ①取一个80ml的瓶子，称取固体异硫氰酸胍(3.56～7.12)g，将其放入瓶子中；

[0018] ②称取十二烷基肌氨酸钠(0.02～0.06)g，并将其倒入瓶子中；

[0019] ③配制0.75M柠檬酸钠溶液，吸取(225～450)μl放入瓶子，配制2M醋酸钠溶液，吸取(300～600)μl加入到瓶子中；

[0020] ④配制14.3M β-巯基乙醇，吸取(45～90)μl加入到瓶子之中；

[0021] ⑤加入饱和苯酚(2～4)ml；

[0022] ⑥加入异戊醇(100～200)μl；

[0023] ⑦用双蒸水定容至10ml；

[0024] ⑧60℃水浴加热至完全溶解，然后用纯乙酸调节pH到(3.5～4.0)；

[0025] ⑨放置在室温下备用。

[0026] 本发明取六管假单胞菌M18菌体，编号A、B、C、D、E、F，A、B在提取RNA的步骤第②步中，吸取500μl上层液体转移至硅膜柱内管中，不加入250μl无水乙醇和250μl异丙醇，12,000rpm离心1min，C、D中加入250μl无水乙醇，E、F中加入250μl异丙醇，其他步骤按照以上提取RNA的步骤。对提取出的RNA测定A260/A280之值。其结果如下：

[0027]

[0028] 从以上结果可以看出，从吸光值A260/A280的比较中，可以看出，在硅膜柱上加无水乙醇后，纯度增加，在硅膜柱上加异丙醇，纯度比加无水乙醇好，一般认为纯的RNA其吸光值A260/A280的范围在1.7-2.0之间(其文章出处为：于寒松，彭帅，一种RNA提取试剂盒——TRIZOL的使用方法初探[J]，食品科学，2005，26(11)：39-42)，因此经过改进后的方法提取出的RNA纯度较高。

[0029] RNA的琼脂糖凝胶电泳：

[0030] 对于上面的提取出的六管RNA，进行琼脂糖凝胶电泳，电泳步骤为：

[0031] a)制水平胶板

[0032] 准备好制胶板及配套梳子，洗净后贴好胶条，称0.5g琼脂糖，加入1×TAE至50ml，加热溶解后，室温冷却至40℃左右，倒入胶板内，保证无气泡，冷却至凝固。

[0033] b)加入样品

[0034] 每个样加入2μl loading buffer和提取的10μl RNA样品，混匀；另一份加入5μl 1kb的DNA ladder和2μl loading buffer，依次加入胶孔中。

[0035] c)电泳

[0036] 120V水平电泳20min左右。电泳缓冲液用1×TAE。用EB染色7min左右并拍照。

[0037] 本发明加入无水乙醇或异丙醇和上清液混合后过柱，其提取的23s，16s条带的亮度比没加时的亮，而且小分子的RNA提取的量也增多了，表现为最下面的条带的亮度高于没加无水乙醇或异丙醇时的条带。一般认为23s的条带是16s条带亮度的两倍，就表明降解很少(其文章出处为：庞昕，周冬生，杨瑞馥，细菌mRNA的提取方法，生物技术通报，2003，1：30-33)，在用变性液提取的RNA中，23s的条带是16s条带亮度的两倍，因此降解比较少。
在上样孔和23S条带之间没有条带，说明提取出的RNA中没有DNA污染。

[0038] 本发明的优点和效果如下：本发明提取时间大大缩短，从提取RNA的方法中可以看出：提取的时间在6min之内；没有DNA污染；提取过程易于自动化。对过柱条件优化后，提取出的RNA纯度很高；通过分光光度计测定提取出的RNA其吸光值A260/A280＝1.93。

[0039] 本发明所用研究材料为假单胞菌M18株，所述的假单胞菌M18菌株已由中国专利公开号CN1340609，专利名称为：生物农药促生拮抗菌M18及其制备方法，专利号为：00119857.2全部公开；所用荧光假单胞菌株M18，已在中国专利局指定的保藏单位：北京，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC NO.0462，2000.6.27。

[0040] 附图说明

[0041] 图1 1％琼脂糖凝胶电泳示意图；

[0042] 其中：M为：1kb DNA标记。

[0043] 具体实施方式

[0044] 以下结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

[0045] 实施例1

[0046] 变性液配方：

[0047] 异硫氰酸胍3.56g；0.75M柠檬酸钠溶液225μl；十二烷基肌氨酸钠0.02g；2M醋酸钠溶液600μl；0.1Mβ-巯基乙醇90μl；饱和苯酚2.0ml；异戊醇200μl；用双蒸水定容至10ml。60℃水浴加热至完全溶解，然后用纯乙酸调节pH到4.0。放置在室温下备用。

[0048] 提取RNA的步骤：

[0049] ①制备好的菌体，加入1000μl变性液，240μl氯仿，涡旋混匀，4℃12,000rpm离心1min，菌液在管中分为三层；

[0050] ②吸取500μl上层液体转移至硅膜柱中，并加入250μl异丙醇，12,000rpm离心1min；

[0051] ③加入75％乙醇洗液500μl至硅膜柱中，12,000rpm离心1min；

[0052] ④重复上一步；

[0053] ⑤再12,000rpm离心1min，保证硅膜柱中无液体；

[0054] ⑥加入双蒸水50μl至硅膜柱中；

[0055] ⑦12,000rpm离心1min，用一干净离心管收集双蒸水保存的RNA。

[0056] 提取出的RNA的纯度高，分光光度计测定提取出的RNA其吸光值A260/A280＝1.90，电泳后，RNA条带亮度高，没有DNA污染。

[0057] 实施例2

[0058] 变性液配方：

[0059] 异硫氰酸胍4.75g；0.75M柠檬酸钠溶液333μl；十二烷基肌氨酸钠0.05g；2M醋酸钠溶液500μl；0.1Mβ-巯基乙醇45μl；饱和苯酚2.5ml；异戊醇100μl；用双蒸水定容至10ml。60℃水浴加热至完全溶解，然后用纯乙酸调节pH到4.0。放置在室温下备用。提取RNA的步骤：

[0060] ①制备好的菌体，加入1000μl变性液，240μl氯仿，涡旋混匀，4℃12,000rpm离心1min，菌液在管中分为三层；

[0061] ②吸取500μl上层液体转移至硅膜柱中，并加入250μl异丙醇，12,000rpm离心1min；

[0062] ③加入75％乙醇洗液500μl至硅膜柱中，12,000rpm离心1min；

[0063] ④重复上一步；

[0064] ⑤再12,000rpm离心1min，保证硅膜柱中无液体；

[0065] ⑥加入双蒸水50μl至硅膜柱中；

[0066] ⑦12,000rpm离心1min，用一干净离心管收集双蒸水保存的RNA。

[0067] 提取出的RNA的纯度高，分光光度计测定提取出的RNA其吸光值A260/A280＝1.93，电泳后，RNA条带亮度高，没有DNA污染。

[0068] 实施例3

[0069] 变性液配方：

[0070] 异硫氰酸胍7.12g；0.75M柠檬酸钠溶液450μl；十二烷基肌氨酸钠0.06g；2M醋酸钠溶液500μl；0.1Mβ-巯基乙醇70μl；饱和苯酚2.5ml；异戊醇100μl；用双蒸水定容至10ml。60℃水浴加热至完全溶解，然后用纯乙酸调节pH到4.0。放置在室温下备用。

[0071] 提取RNA的步骤：

[0072] ①制备好的菌体，加入1000μl变性液，240μl氯仿，涡旋混匀，4℃12,000rpm离心1min，菌液在管中分为三层；

[0073] ②吸取500μl上层液体转移至硅膜柱中，并加入250μl异丙醇，12,000rpm离心1min；

[0074] ③加入75％乙醇洗液500μl至硅膜柱中，12,000rpm离心1min；

[0075] ④重复上一步；

[0076] ⑤再12,000rpm离心1min，保证硅膜柱中无液体；

[0077] ⑥加入双蒸水50μl至硅膜柱中；

[0078] ⑦12,000rpm离心1min，用一干净离心管收集双蒸水保存的RNA。

[0079] 提取出的RNA的纯度高，分光光度计测定提取出的RNA其吸光值A260/A280＝1.95，电泳后，RNA条带亮度高，没有DNA污染。

[0080] 实施例4

[0081] 变性液配方：

[0082] 异硫氰酸胍4.75g；0.75M柠檬酸钠溶液450μl；十二烷基肌氨酸钠0.05g；2M醋酸钠溶液300μl；0.1Mβ-巯基乙醇70μl；饱和苯酚4.0ml；异戊醇100μl；用双蒸水定容至10ml。60℃水浴加热至完全溶解，然后用纯乙酸调节pH到3.5。放置在室温下备用。

[0083] 提取RNA的步骤：

[0084] ①制备好的菌体，加入1000μl变性液，240μl氯仿，涡旋混匀，4℃12,000rpm离心1min，菌液在管中分为三层；

[0085] ②吸取500μl上层液体转移至硅膜柱中，并加入250μl异丙醇，12,000rpm离心1min；

[0086] ③加入75％乙醇洗液500μl至硅膜柱中，12,000rpm离心1min；

[0087] ④重复上一步；

[0088] ⑤再12,000rpm离心1min，保证硅膜柱中无液体；

[0089] ⑥加入双蒸水50μl至硅膜柱中；

[0090] ⑦12,000rpm离心1min，用一干净离心管收集双蒸水保存的RNA。

[0091] 提取出的RNA的纯度高，分光光度计测定提取出的RNA其吸光值A260/A280＝1.92，电泳后，RNA条带亮度高，没有DNA污染。

[0092] 实施例5

[0093] 变性液配方：

[0094] 异硫氰酸胍4.75g；0.75M柠檬酸钠溶液225μl；十二烷基肌氨酸钠0.02g；2M醋酸钠溶液300μl；0.1Mβ-巯基乙醇45μl；饱和苯酚2.0ml；异戊醇100μl；用双蒸水定容至10ml。60℃水浴加热至完全溶解，然后用纯乙酸调节pH到3.7。放置在室温下备用。

[0095] 提取RNA的步骤：

[0096] ①制备好的菌体，加入1000μl变性液，240μl氯仿，涡旋混匀，4℃12,000rpm离心1min，菌液在管中分为三层；

[0097] ②吸取500μl上层液体转移至硅膜柱中，并加入250μl异丙醇，12,000rpm离心1min；

[0098] ③加入75％乙醇洗液500μl至硅膜柱中，12,000rpm离心1min；

[0099] ④重复上一步；

[0100] ⑤再12,000rpm离心1min，保证硅膜柱中无液体；

[0101] ⑥加入双蒸水50μl至硅膜柱中；

[0102] ⑦12,000rpm离心1min，用一干净离心管收集双蒸水保存的RNA。

[0103] 提取出的RNA的纯度高，分光光度计测定提取出的RNA其吸光值A260/A280＝1.93，电泳后，RNA条带亮度高，没有DNA污染。