有不同曲面的人工软骨或骨软骨体外培养的方法及生物反应器

摘要

本发明公开了一种滚动载荷和滑动载荷作用下有不同曲面的人工软骨或骨软骨培养的方法。包括具备O2、CO2和温度调节、细胞培养的培养箱，及保持培养液新鲜的灌流等条件和培养液中加入活性因子，其特征在于将有不同曲面的培养物坯件固定于培养室底板；在培养期间，培养物同时受到滚动载荷和滑动载荷作用，培养物培养成软骨组织或骨软骨复合组织。本发明的有益效果是：滚动载荷与滑动载荷同时作用，其加载方式更接近软骨组织生长发育的力学环境，在此载荷条件可能有利于细胞、组织的生长、发育。实验表明滚动与滑动载荷同时作用下软骨细胞分泌的粘蛋白多糖高于仅滚动加载组。培养后的不同形状培养物可作为移植物，应用于不同部位软骨缺损的修复。

权利要求

1.一种有不同曲面的人工软骨或骨软骨体外培养的方法，包括具备O2、CO2和温度调节、细胞培养的培养箱，及保持培养液新鲜的灌流条件和培养液中加入活性因子，其特征在于将有不同曲面的培养物坯件固定于培养室底板；在培养期间，培养物同时受到滚动载荷和滑动载荷作用，培养物培养成人工软骨组织或骨软骨组织。

2.根据权利要求1所述的有不同曲面的人工软骨或骨软骨体外培养的方法，其特征在于所说的培养物是：有凸、凹柱状曲面人工软骨的细胞与支架复合体、骨软骨复合体或用于软骨缺损的移植组织。

3.根据权利要求2所述的有不同曲面的人工软骨或骨软骨体外培养的方法，其特征在于所说的骨软骨复合体是部分人工软骨、部分人工骨的复合体。

4.根据权利要求1或2、3所述的有不同曲面的人工软骨或骨软骨体外培养的方法，其特征在于所说的滑动载荷是培养物相对滚动加载体的运动，其滑动方向与滚动加载体的滚动方向相反或相同。

5.根据权利要求4所述的有不同曲面的人工软骨或骨软骨体外培养的方法，其特征在于所说滚动载荷与滑动载荷同时作用是滚动与滑动不同速度位相的组合；加载的时间为每

24h加载1-3次，每次10min-360min，培养1-60天。

6.根据权利要求4所述的有不同曲面的人工软骨或骨软骨体外培养的方法，其特征在于所说滚动加载速度为0.1-15cm/s，往复滚动频率为0.1-3Hz，滚动加载处培养物变形

5％-40％。

7.根据权利要求4所述的有不同曲面的人工软骨或骨软骨体外培养的方法，其特征在于所说的滑动加载速度为0.1-35cm/s。

8.一种用于权利要求1的有不同曲面的人工软骨或骨软骨体外培养方法的生物反应器，包括底板(23)，与底板连接的培养室(7)，培养室内的培养液灌注系统，及由曲柄连杆机构带动滚动加载体(15)的滚动加载机构，其特征在于所说的生物反应器还有一个使滚动加载体与培养室之间有相对滑动的机构；所说的滑动机构是将滚动加载机构中的滚动加载体(15)所处的培养室(7)通过滑动连接杆(17)连接在由凸轮(19)控制的驱动板(18)上。

9.根据权利要求8所述的生物反应器，其特征在于所说的滚动加载体的表面是旋转曲面。

10.根据权利要求8或9所述的生物反应器，其特征在于所说的滚动加载体轴(13)的两端于培养室(7)的外侧各装有一个导向轮(14)，与导向轮接触的轨道(11)通过高度调节螺杆(9)调整滚动加载体距离培养室底面的高度。

说明书

有不同曲面的人工软骨或骨软骨体外培养的方法及生物反

应器

【技术领域】

[0001] 本发明涉及组织工程领域，特别在滚动载荷和滑动载荷作用下培养不同形状人工软骨或骨软骨的方法及相关的生物反应器。【背景技术】

[0002] 组织工程是近年来正在兴起的一门新学科，是继细胞生物学和分子生物学之后，生命科学发展史上又一个新的里程碑，标志着医学将走出器官移植的范畴，步入制造组织和器官的新时代。组织工程将会成为本世纪极具潜力的高新技术产业，必将产生巨大的社会和经济效益。

[0003] 关节软骨缺损是外科常见的疾病之一，通常由外伤、手术切除、骨性关节炎等慢性疾病引起。临床表现为顽固性疼痛，关节活动障碍，严重者可完全丧失关节功能，成为肢残[1]和劳动力丧失的主要原因之一 。大量研究结果表明，由于软骨组织再生能力极为有限，软骨损伤自我修复几乎不可能。临床上自体移植或异体移植也存在较大的限制和弊端。当前为缺损修复提供移植软骨，软骨组织工程是最理想的的方法。组织工程的基本方法是将自体或异体细胞经体外培养、扩增后，接种到一种组织相容性好的生物材料上，进行体外培养，形成一定的类组织，然后植入体缺损部位，与宿主软骨融合，达到修复软骨缺损的目的。
其中软骨组织工程和骨组织工程都是分别采用不同种子细胞、支架材料和活性因子的复合体培养，软骨组织和骨组织也可能采用相同的种子细胞，如骨髓间充质干细胞。

[0004] 软骨缺损发生于关节的不同部位，修复软骨缺损需要不同、合适的软骨移植物，当前按照临床形状要求制作不同形状的人工软骨也是非常必要的，这样有利于软骨缺损部位的修复。特别是力学环境作用下培养不同形状、具有承力功能的人工软骨，可以更好地满足临床需求。另外，软骨缺损有时深入到软骨下骨，临床治疗需要部分软骨、部分骨的移植物修复缺损，这种骨软骨组织培养时同样需要获得结构与功能同时生长。

[0005] 当前，随着组织工程的发展，种子细胞、支架材料和活性因子研究的不断深入，在生物反应器内如何培养移植物受到更多的关注，其中对移植物培养条件的力学环境越来越重视。对于软骨来说，其活体力学环境非常复杂。合适力学条件是培养出结构、功能都与天然软骨相近移植物的重要因素。最近几年相关研究者对不同的力学刺激，以优化培养物的结构和功能做了大量研究。国内有研究者采用静张应力对大鼠髁突软骨细胞增殖效应进行研究，实验表明细胞增殖数量随静张应力增高而升高[华西口腔医学杂志，2003，21(1)，57-60]；也有研究空气压应力对体外培养软骨细胞分泌细胞因子的影响[解剖学报，2001，
32(4)，385-387]，离心力在体外构建组织工程软骨中的作用[中华实验外科杂志。2005，
22(3)，281-283]，周期性流体应力刺激对组织工程软骨分化影响的实验研究[骨与关节损伤杂志，2003，18(9)，620-622]。这些加载方法可以促进细胞增殖或功能发挥，但和真正软骨受载是有差别的。Mauck等[JBiomech Eng，2000；122(3)：252-260]把软骨细胞接种在琼脂糖凝胶进行动态直接施压，载荷大小是使复合体变形10％，频率为1Hz，探索功能化软骨组织工程的培养，4周后发现GAG(氨基葡聚糖)升高45％，胶原含量增加37％，明显高于未加载组。Buschmann等施加1Hz，应变3％的动态压载荷进行软骨构建，实验表明硫酸软骨素增加15％-25％，脯氨酸增加10％-25％，同时，在这种力学条件下研究不同培养时间培养物弹性模量的变化。

[0006] 当前的生物反应器对细胞培养、组织和细胞-支架培养物培养、保持，通常使用的有四种反应器：即静态、旋转培养瓶、旋转壁式生物反应器和灌流式生物反应器[Advanced Drug Delivery Reviews33(1998)15-30，Tissue Engineering.2003，9(3)，549-553，不同种子细胞、新型支架材料、生长因子等构成培养物，分别在这几种生物反应器中培养，主要是促进培养物形态、结构的生长。尽管现有技术中各种生物反应器的使用优化了培养物的生长，但培养物的生长、发育还是没达到临床要求。如生物反应器在组织工程化培养中，也包括各种力学环境的应用，人工软骨组织发育不良，力学性能差、细胞退化、死亡等问题。这些问题的解决一方面需要使用当前生物反应器更进一步的实验，以及其它相关领域的发展，如细胞生物学研究，支架材料的研制，活性因子的制造；另一方面需要生物反应器培养条件的优化。力学环境在生物反应器的研制占有重要位置，力学因素影响生物体的整体，器官、组织、细胞和分子水平等各层次的生物学过程[Guilaket al.Functional Tissue Engineering，2003，Springer]。力学条件的优化十分重要。

[0007] 滚动载荷确实是关节软骨力学环境重要组成部分[2007100573319“滚动载荷用于培养物培养的方法及生物反应器”中国专利申请]，在关节运动过程中还有滑动现象，人工软骨软骨培养的力学环境应当尽可能模拟其天然环境，因此，滚动载荷与滑动载荷耦合作用，是人工软骨培养的重要环境。

[0008] 专利WO2004/046304给出了压力和剪应力耦合作用的生物反应器；发明专利(申请号200480038317.9，公开号CN1898375A)介绍了用于对具有三维形状、活性和机械抗力的细胞移植体进行培养和刺激的方法和生物反应器。以软骨组织工程为例，Schulz和Bader，Ivan Martin总结了组织培养时的环境[TRENDS in Biotechnology Vol.22No.2，2004，pp80-86；Eur Biophys J，DOI10.1007/s00249-007-0139-1，2007]。包括(a)为电场；
(b)锥形粘度计条件，细胞在旋转锥形体下方受到剪切力作用；(c)旋转壁式生物反应器给细胞提供微重力环境，传质过程较好；(d)单项灌流系统；(e)拉伸条件；(f)水压及灌流条件；(g)直接压缩。其后介绍了各种培养条件的耦合系统；特别是各种力学条件的联合使用。但都没有涉及滚动加载与滑动载荷耦合的培养。

[0009] 生物反应器是组织工程化培养的重要因素，生物反应器的目的是为体外组织工程构建提供合适的生长条件，使工程化组织获得与活体组织有相似的结构与功能。软骨组织工程、骨组织工程是一门仿生科学，因此培养环境尽可能接近自然条件，软骨、骨是人体的承力组织，力学对软骨、骨结构、功能都有重要影响。在骨软骨培养中滚动加载与滑动载荷同时作用是合适的力学环境。【发明内容】

[0010] 本发明的目的旨在为克服现有技术的不足，而提供一种主要在滚动载荷和滑动载荷作用下有不同曲面人工软骨或骨软骨培养的方法及相关的生物反应器。在通常细胞、组织培养的条件下，施加在滚动载荷和滑动载荷形成人工软骨或骨软骨生长的力学环境，有不同曲面的培养物在这种条件下生长，可优化培养物的结构与功能。

[0011] 本发明为实现上述目的提供了一种滚动载荷和滑动载荷作用下有不同曲面人工软骨或骨软骨培养的方法。包括具备O2、CO2和温度调节、细胞培养的培养箱，及保持培养液新鲜的灌流等条件和培养液中加入活性因子，其特征在于将有不同曲面的培养物坯件固定于培养室底板；在培养期间，培养物同时受到滚动载荷和滑动载荷作用，培养物发育成软骨组织或骨软骨组织。所说的培养物是：有凸、凹柱状曲面人工软骨的细胞与支架复合体、骨软骨复合体或用于软骨缺损的移植组织。其中的骨软骨复合体是部分人工软骨、部分人工骨的复合体。

[0012] 本发明为有不同曲面的人工软骨或骨软骨体外培养的方法设计了一种生物反应器。包括底板，与底板连接的培养室，培养室内的培养液灌注系统，及由曲柄连杆机构带动滚动加载体的滚动加载机构，其特征在于所说的生物反应器还有一个使滚动加载体与培养室之间有相对滑动的机构；所说的滑动机构是将滚动加载机构中的滚动加载体所处的培养室通过滑动连接杆连接在由凸轮控制的驱动板上。凸轮旋转带动驱动板再带动培养室移动，与加载体形成相对移动。

[0013] 本发明的有益效果是：滚动载荷与滑动载荷同时作用使其加载方式更接近软骨组织生长发育的力学环境，在此载荷条件可能有利于细胞、组织的生长、发育。实验表明滚动与滑动载荷耦合作用组的软骨细胞分泌的粘蛋白多糖高于仅滚动加载组和静态培养组。培养后的有不同曲面的培养物可作为移植物，应用于不同部位软骨缺损的修复。【附图说明】

[0014] 图1为生物反应器立体示意图；

[0015] 图2为生物反应器俯视示意图；

[0016] 图3为生物反应器主视示意图；

[0017] 图4为滑动加载机构中凸轮与驱动板示意图；

[0018] 图5为鞍形滚动加载体与培养物示意图；

[0019] 图6为单侧鼓形滚动加载体与培养物示意图；

[0020] 图7为细胞外基质中GAG含量随诱导时间变化检测图。

[0021] 图中：1电机(a)；2驱动轴；3曲柄轴；4培养室上盖；5叉形连杆；6培养液出口；7培养室；8培养物；9高度调节螺杆；10支架；11轨道；12导轨轴；13加载体轴；14导向轮；15滚动加载体；16培养液进口；17滑动连接杆；18驱动板；19凸轮；20驱动轴(b)；21电机(b)；22滑动支架；23底板；24人工骨或培养物底模。

[0022] 以下结合本发明的实施例参照附图进行详细叙述。【具体实施方式】

[0023] 本发明的培养方法所说的培养物受到滚动载荷和滑动载荷同时作用，是对培养物表面施加滚动与滑动不同速度位相的耦合。所说滑动载荷是培养物相对滚动加载体的运动，其滑动方向与滚动加载体的滚动方向相反或相同。滚动加载与滑动加载的时间为每24h加载1-3次，每次10min-360min，培养1-60天，培养物形成有不同曲面的人工软骨或骨软骨，储存或用于临床。其中：滚动加载体的滚动速度为0.1-15cm/s，加载体往复滚动频率为0.1-3Hz，滚动加载处培养物变形5％-40％。滑动加载的滑动速度为0.1-35cm/s。

[0024] 实现滚动与滑动不同速度位相的耦合：滚动速度是电机(a)转过角度 的函数，表示为 其中 w1为电机(a)的角速度，θ1为初相；滑动速度是电机(b)转过角度 的函数，其中 w2为电机(b)的角速度，θ2为初相；V1和V2都有极值，通过 位相调整使V1，V2同时达到极大值；或V1极大值、V2极小值，V1、V2方向相同或相反。滚动与滑动不同速度耦合对培养物形成不同的培养环境。

[0025] 在无菌条件下把制造人工软骨的细胞与支架复合体、骨软骨或用于软骨缺损的移植组织的培养物8转移到消毒过的培养室内，按细胞、组织培养标准过程操作，其中骨软骨的培养物为部分软骨、部分骨的复合体；培养在培养箱中进行，培养箱内有O2、CO2、温度控制，由蠕动泵驱动培养液灌注，保持培养液新鲜，培养液中加入活性因子。力学环境是对培养物滚动载荷和滑动载荷同时作用是滚动与滑动不同速度位相的耦合。滚动加载体的表面可以是需要的任何旋转曲面(如图5、图6所示)，滚动载荷以使培养物变形大小为指标，确定滚动强度大小，培养物变形为5％-40％。通过高度调节螺杆旋转，改变轨道高度，也就改变导向轮的高度，同时改变加载体的水平位置，这样调整培养物到合适的变形。轨道与轮接触可能在轮上顶点或下顶点。当滚动加载体足够重，培养物变形较大，轨道与轮下顶点接触，调节轨道升高，培养物变形到合适大小；当滚动加载体不足使培养物变形达到要求，轨道与轮上顶点接触，调节轨道下降，培养物变形到合适大小。滚动和滑动机构由电动机驱动，电动机由计算机控制。最后把优化培养的培养物应用到临床或其它方面检验。

[0026] 如图1-4所示。生物反应器包括在底板23上安装的培养室7，滚动加载机构，培养液灌注系统，滑动加载机构和上盖4等。各系统由计算机控制，滚动加载体在培养箱内运行，培养室设有培养液进口16和培养液出口6。生物反应器的滚动加载机构将滚动加载体15置于培养室内，滚动加载体轴的两端通过一个叉形连杆5连接在由电机(a)1带动的曲柄轴3上。生物反应器的滑动加载机构是在培养室与底板之间设置一副滑轨与滑槽组件，与培养室连接的滑动连接杆外端固定有一个内部为滑动配合安装凸轮19的驱动板，凸轮则通过驱动轴(b)20与电机(b)21连接。

[0027] 滚动加载体通过轴部支撑结构调整滚动加载体距离培养室底面的高度。这种调整高度的机构，可以是滚动加载体轴13的两端于培养室7的外侧各装有一个导向轮14，与导向轮接触的轨道11通过高度调节螺杆9调整滚动加载体距离培养室底面的高度。即：与轨道11接触，在轨道上做纯滚动；轨道11可沿导轨轴12上下滑动，通过高度调节螺杆9调整轨道11高度，也调整导向轮14的高度，这样就调整了滚动加载体15距离培养室底面的高度。该导向轮的直径可与滚动加载体的直径相等或不等。

[0028] 本发明的加载过程：电机(a)1带动驱动轴2驱动曲柄轴3，带动叉形连杆5，通过加载体轴13拉动滚动加载体15作往复直线滚动。导向轮14沿轨道11滚动，轮与轨道11之间磨擦足够大，轮只能纯滚动。滑动加载机构中，电机(b)21带动驱动轴(b)20再带动凸轮19旋转，凸轮的旋转又带动装在滑动支架22中的滑动连接杆17按一定的速度往返移动，使得培养室携带着培养物与滚动加载体之间产生滑动。

[0029] 通过高度调节螺杆9可以调整滚动加载体的水平高度，使培养物达到合适的变形。根据实际需要，也可以在培养物的下面衬垫培养物底模24，或培养物就是骨软骨，培养形成不同形状的培养物。

[0030] 实例

[0031] 用于软骨缺损的培养方法

[0032] 从患者非负重区活检获得一块软骨，D-Hanks液充分漂洗，再初步切碎1-2mm3后移入青霉素小瓶，用胰酶、胶原酶用消化后，离心分离获得软骨细胞，移入培养瓶中加培养液培养，扩增后细胞备用。

[0033] 消化收集扩增的软骨细胞。利用纤维蛋白原溶液重悬细胞成为2×106/ml，通过Y形共推针头混合，注入模具中，37℃静置10min充分固化，形成长方形板状复合体。然后移到培养室内，固定到培养室底板，加培养液培养。

[0034] 反应器放在培养箱内，培养箱内有O2、CO2、温度自动控制，由蠕动泵驱动培养液灌注，保持培养液新鲜，灌注速度为0.01ml/min。培养液中加入标准浓度的胰岛素样生长因子(IGFs)。

[0035] 施加滚动载荷和滑动载荷，培养物变形为10％；加载体来回滚动频率0.5Hz，滑动速度4-9mm/s，24h内总共加载1h。施加滚动载荷20min，间隔1h后，再滚动加荷20min，间隔1h后再滚动加载20min。培养20天。培养物生长良好，取出培养物用于临床治疗软骨缺损。

[0036] 其中培养第3天和第6天时，对施加滚动和滑动载荷组①，滚动载荷组②，和静态培养组③样品进行细胞外基质中GAG含量随诱导时间变化检测如7图所示。

[0037] 滚动和滑动载荷组①细胞外基质中GAG含量始终最高，高于滚动载荷组②和静态培养组③，从此实验能看出滑动载荷存在的影响。滚动和滑动载荷条件更有利于细胞、组织的生长、发育。