一种用于现场检测的ELISA试剂盒

摘要

本发明公开了一种用于现场检测的ELISA试剂盒，包括盒体，在盒体内设有抗体检测板、样品稀释试剂、阳性/阴性对照、洗涤试剂、酶结合物试剂、底物试剂、终止试剂、一次性滴管和盖板膜，底物试剂由底物、底物稀释剂和指示剂II组成；底物稀释剂为浓缩液，样品稀释试剂、洗涤试剂、酶结合物试剂、终止试剂、底物和指示剂II均为固态。该ELISA试剂盒携带、使用方便，安全性好，且能满足现场检测需求。

权利要求

1.一种用于现场检测的ELISA试剂盒，包括盒体，其特征是：在盒体内设有抗体检测板、样品稀释试剂、阳性/阴性对照、洗涤试剂、酶结合物试剂、底物试剂、终止试剂、一次性滴管和盖板膜，所述底物试剂由底物、底物稀释剂和指示剂II组成；所述底物稀释剂为浓缩液，所述样品稀释试剂、洗涤试剂、酶结合物试剂、终止试剂、底物和指示剂II均为固态；

所述阳性/阴性对照为经病毒/病菌灭活的质控样，所用的灭活剂为β-丙内酯，灭活剂与试样体积比为1∶1000～1∶6000；

所述试剂盒为双抗夹心型，所述酶结合物试剂含酶标抗体和酶结合物稀释剂，在酶结合物稀释剂中添加指示剂I；

或者所述试剂盒为三抗夹心型，所述酶结合物试剂含检测抗体、酶标抗-抗体和酶结合物稀释剂，先使指示剂I与无关蛋白发生疏水结合，再将检测抗体或酶标抗-抗体与上述结合处理后的指示剂I保存在一起；所述无关蛋白为牛血清蛋白；

所述指示剂I为甲基橙、甲基红、苯酚红、溴甲酚绿、溴百里香酚兰、茶酚绿、酸性铬兰K或亚甲基兰；

所述指示剂II为孔雀石绿。

2.根据权利要求1所述的用于现场检测的ELISA试剂盒，其特征是：酶结合物稀释剂在实际使用时稀释成常规的酶结合物稀释缓冲液，所述指示剂I在酶结合物稀释缓冲液中的浓度为0.01mg/mL～0.1mg/mL。

3.根据权利要求2所述的用于现场检测的ELISA试剂盒，其特征是：底物稀释剂在实际使用时稀释成常规的底物稀释液，所述指示剂II临用前加入底物稀释液中，指示剂II在底物稀释液中浓度为0.005mg/mL～0.06mg/mL。

4.根据权利要求3所述的用于现场检测的ELISA试剂盒，其特征是：抗体用碱性磷酸酶标记；终止试剂在实际使用时稀释成终止液，所述终止液为含0.5～2.0mol/L碳酸钠和

0.1g/L～5g/L亚硫酸钠的水溶液。

5.根据权利要求4所述的用于现场检测的ELISA试剂盒，其特征是：所述盖板膜为规格是8cm×12cm的防水遮光不干胶膜。

6.根据权利要求5所述的用于现场检测的ELISA试剂盒，其特征是：所述一次性滴管包括1～3ml一次性塑料刻度滴管和0.20～0.50ml一次性塑料刻度小滴管。

说明书

一种用于现场检测的ELISA试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及一种用于现场检测的ELISA试剂盒。

背景技术

[0002] 酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是将酶的催化反应与抗原抗体的免疫学反应结合起来的一种检测技术。由于抗原、抗体反应的高度专一性，加之酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，因此能使测定方法达到很高的特异性和灵敏度。近年来，ELISA以其灵敏、准确、重复性好、无放射性污染等特点，被广泛应用于病毒、细菌、激素、药物残留等各个方面检测。

[0003] 但目前使用的ELISA试剂盒因抗体、酶标记物等试剂为液体，因而需要在冰箱中冷藏保存，在邮寄过程中也需要采用冰袋、保温箱等降温措施以防试剂盒失效；而且通常在使用前需要使用者本人用常用的实验试剂临时配制一些缓冲液；目前碱性磷酸酶标记的ELISA试剂目前缺少合适的指示剂，操作过程容易出差错；其通常用终止液为强碱(3mol/l氢氧化钠)，具有腐蚀性；试验过程需要购买价格昂贵的移液器，从而导致ELISA试剂盒仅局限于在有条件的实验室内由有ELISA操作经验的检测人员使用。

[0004] 综上所述，现有ELISA试剂盒存在着以下不足：

[0005] 1、因试剂盒含抗体溶液、酶标记物溶液、样品稀释缓冲液(浓缩液)等多种液体试剂，使试剂盒需要冷藏保存，导致携带、邮寄不方便；而且试剂盒在使用过程中的反复回温使抗体和酶的效价易受影响，多次吸取溶液的过程中易造成损失和污染，有时因停电或冰箱故障会造成所有试剂盒失效。

[0006] 2、生物安全性差：目前常用的植物病毒检测试剂盒的质控样是通过将阳性或阴性样品提取物直接进行冷冻干燥制得。虽然病毒在常温中干燥条件下易被灭活，但若冷冻后再进行真空干燥，则可使病毒长期存活。

[0007] 3、ELISA是一种操作要求非常精细的试验，目前碱性磷酸酶标记的ELISA试剂目前缺少合适的指示剂，操作过程容易出差错，尤其在TSA-ELISA(三抗夹心型)试剂盒中含有检测抗体和酶标抗-抗体两种无色微量贵重试剂，若不加以明显的区别标识，更容易出差错。

[0008] 4、目前常用的3mol/L氢氧化钠终止碱性磷酸酶反应，结果只能保持数小时，而且氢氧化钠具有腐蚀性。

发明内容

[0009] 本发明要解决的上述技术问题并提供一种用于现场检测的ELISA试剂盒，该ELISA试剂盒携带、使用更方便，安全性好，且能满足现场检测需求。

[0010] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于现场检测的ELISA试剂盒，包括盒体，在盒体内设有抗体检测板、样品稀释试剂、阳性/阴性对照、洗涤试剂、酶结合物试剂、底物试剂、终止试剂、一次性滴管和盖板膜，底物试剂由底物、底物稀释剂和指示剂II组成；底物稀释剂为浓缩液，样品稀释试剂、洗涤试剂、酶结合物试剂、终止试剂、底物和指示剂II均为固态。

[0011] 作为本发明的用于现场检测的ELISA试剂盒的改进：阳性/阴性对照为经病毒/病菌灭活的质控样，所用的灭活剂为β-丙内酯，灭活剂与试样体积比为1∶1000～1∶6000。

[0012] 作为本发明的用于现场检测的ELISA试剂盒的进一步改进：试剂盒为双抗夹心型，酶结合物试剂含酶标抗体和酶结合物稀释剂，在酶结合物稀释剂中添加指示剂I。或者试剂盒为三抗夹心型，酶结合物试剂含检测抗体、酶标抗-抗体和酶结合物稀释剂；先将指示剂I与无关蛋白发生疏水结合，再将检测抗体或酶标抗-抗体与上述结合处理后的指示剂I保存在一起。

[0013] 作为本发明的用于现场检测的ELISA试剂盒的进一步改进：酶结合物稀释剂在实际使用时稀释成常规的酶结合物稀释缓冲液，指示剂I在酶结合物稀释缓冲液中的浓度为0.01mg/mL～0.1mg/mL，指示剂I为甲基橙、甲基红、苯酚红、溴甲酚绿、溴百里香酚兰、茶酚绿、酸性铬兰K或亚甲基兰。

[0014] 作为本发明的用于现场检测的ELISA试剂盒的进一步改进：底物稀释剂在实际使用时稀释成常规的底物稀释液，指示剂II为孔雀石绿，临用前加入底物稀释液中，指示剂II在底物稀释液中浓度为0.05mg/mL～0.06mg/mL。

[0015] 作为本发明的用于现场检测的ELISA试剂盒的进一步改进：抗体用碱性磷酸酶标记，终止试剂在实际使用时稀释成终止液，所述终止液为含0.5～2.0mol/L碳酸钠和0.1g/L～5g/L亚硫酸钠的水溶液。

[0016] 作为本发明的用于现场检测的ELISA试剂盒的进一步改进：盖板膜为规格是8cm×12cm的防水遮光不干胶膜。

[0017] 作为本发明的用于现场检测的ELISA试剂盒的进一步改进：一次性滴管包括1～3mL一次性塑料刻度滴管和0.20～0.50mL一次性塑料刻度小滴管。可分2～4袋包装，用于移液，吹打溶液，使试剂溶解，并增加试剂盒的抗震性能。

[0018] 本发明的关键在于：在以方便实用的固态形式高效地保存检测抗体和酶结合物的基础上，再对试剂盒的其它组件和方法进行改进和创新，使整个ELISA试剂盒达到可常温保存且具有高灵敏度、稳定的检测结果目的。因抗体和酶均为具有生物活性的大分子物质，其结构复杂，许多因素如高/低温、与指示剂、塑料等在一定条件下接触都可能使其活性降低或丧失，因而现有的技术在用户手上均以液态、冷藏保存。在申请号为94103930.7专利中，将抗血清直接加在滤纸上，抗血清中有其它无关蛋白或其它物质存在，会使抗体效价降低相对较少，且抗血清价格相对低廉；但用现代生物技术制备的高纯度抗体，直接用滤纸片保存会引起抗体效价降低且复溶效果较差，批间差异大。因此，发明人在经过大量实验的基础上获得了本发明的现场检测ELISA试剂盒。

[0019] 本发明的用于现场检测的ELISA试剂盒，具有以下特点：

[0020] 1.盒内除底物稀释剂为浓缩液外，其它试剂均以固态形式提供，使本发明的试剂盒可在常温下较长时间存放，增加了试剂盒对温度的耐受范围。

[0021] 2.阳性/阴性对照为经病毒/病菌灭活的质控样，防止因质控样的携带而引起病毒/病菌的传播。因此不但增加了生物安全性，还能较好地保留阳性对照的抗原性。

[0022] 3.防止差错发生：在双抗夹心ELISA试剂盒的酶结合物稀释剂中加入了指示剂I。在三抗夹心ELISA型试剂盒的检测抗体或酶标抗-抗体中有效克服了抗体与指示剂I之间的疏水作用，成功添加了指示剂I。发现了8种不影响检测效果的指示剂I作为酶结合物指示剂，指示剂I可选用甲基橙、甲基红、苯酚红、溴甲酚绿、溴百里香酚兰、茶酚绿、酸性铬兰K或亚甲基兰。

[0023] 4.防止了因指示剂I与抗体(检测抗体或酶标抗-抗体)间发生疏水结合而使抗体效价降低。

[0024] 5.发现了一种合适的底物指示剂(即指示剂II)------孔雀石绿及使用方法。

[0025] 6.发明了一种新的碱性磷酸酶终止液------含0.5～2.0mol/L碳酸钠和0.1g/L～5g/L亚硫酸钠的水溶液。

[0026] 7.用可反复使用的防水遮光不干胶膜代替目前孵育使用的湿盒。

[0027] 8.试剂盒内提供一次性滴管代替昂贵的移液器，从而进一步达到现场检测的目标。并增加试剂盒的抗震性能。

[0028] 在本发明中，除了样品稀释试剂和洗涤试剂以试剂包的形式存在以外，其余的每种试剂各自存放在一个所对应的试剂瓶中。所有的试剂瓶均带有标志贴和识水线。标志贴标识内容含试剂简易代码和试剂名称，试剂简易代码为数字或由数字和字母组成，试剂按代码数字从小到大取用；相同的数字，不同字母的代码的试剂同时使用。如此设计，旨在引导试剂盒的用户有序地进行操作，防止紊乱和误用试剂而导致实验失败。识水线(即加水刻度线)是用于方便向瓶中加水，当水位线至识水线时停止加水，即完成在原试剂瓶中定容过程。样品稀释试剂和洗涤试剂(以固体形式的试剂包，以减少试剂盒重量，延长保存期)利用最常见的500～600mL的纯净水和瓶身作为试剂溶剂和容器。

[0029] 采用本发明的用于现场检测的ELISA试剂盒，能使ELISA试验在离开固定实验室设施条件的情况下亦可进行现场检测。本发明的ELISA试剂盒可分为以下2种：双抗夹心ELISA试剂盒、三抗夹心ELISA(TAS-ELISA)试剂盒。目前，三抗夹心ELISA(TAS-ELISA)方法在特异性和灵敏度具有领先性，但现有技术的操作较繁琐，出差错机会多，将本发明应用于TAS-ELISA试剂盒，检测操作的简化程度和差错率降低更明显。

[0030] 在本发明的用于现场检测的ELISA试剂盒中，阳性/阴性对照为经病毒/病菌灭活的阳性/阴性质控样；使其丧失侵染能力，而只保留抗原性，以防止致病菌/病毒的传播，从而提高了试剂盒的生物安全性。在酶结合物试剂和底物试剂等无色试剂中添加了指示剂，用以减少差错的发生机会，还能杜绝使用危险化学试剂，从而提高试验的稳定性。

[0031] 实际使用时，检测人员依靠试剂盒内提供的盖板膜和一次性滴管等实验器材，再自行配备剪刀、纯净水、杯子、面巾纸及简易研磨或粉碎工具，就可在生产基地或野外完成试验；而无需像现有的ELISA试剂盒那样必须在实验室内完成。因此，本发明具有适用性强、操作方便、成本低廉等优点。

[0032] 下面，对本发明的用于现场检测的ELISA试剂盒中的内容物作具体表述：

[0033] 1、样品稀释试剂装入一个试剂包中，以固态的形式被保存。此样品稀释试剂的制作方法如下：

[0034] 在基础稀释液中可以加入一定量的防腐抑菌剂后，再浓缩固化后所形成。实际使用时，只需将包装内所有的试剂溶入一瓶纯净水中；即可形成水溶的样品稀释试剂。

[0035] 基础稀释液根据样品性质和实验目的而定(此为现有技术)，防腐抑菌剂可选用青霉素、链霉素或叠氮钠等。

[0036] 本发明中的样品稀释试剂可常温保存12个月以上，若在洁净条件下密封包装，保存期更长；稀释后的使用液可冷藏保存放1个月以上。

[0037] 2、抗体检测板，其制备方法如下：

[0038] 按照常规方法：用离子强度为0.05mol/L～0.10mol/L，pH9.0～pH9.6碳酸盐缓冲液稀释包被抗体，将适量的包被抗体溶液加在聚苯乙烯酶标板、聚氯乙烯酶标板或硝酸纤维素膜等固相载体上，4℃过夜。次日，加磷酸盐缓冲液洗板后，拍干，(用包被液量150％～200％体积比的无关蛋白溶液封闭)(此为现有技术)。然后，在硅胶干燥器内放置过夜，加干燥剂密封包装。

[0039] 本发明中的抗体检测板可稳定保存18个月以上。

[0040] 3、阳性/阴性对照：

[0041] 阳性对照装入一个试剂瓶(该试剂瓶为保存阳性对照专用)中，以固态的形式被保存。此阳性对照的制作方法如下：

[0042] 取阳性样品，加样品提取液匀浆用，双层无菌纱布过滤，取滤液或离心，取上清液；，经病毒/病菌灭活，冷冻干燥，分装，加干燥剂保存。临用前加水至识水线，溶解即可使用。

[0043] 同理，阴性对照装入一个试剂瓶(该试剂瓶为保存阴性对照专用)中，以固态的形式被保存。此阴性对照的制作方法如下：

[0044] 取阴性样品，加样品提取液匀浆，为防止其它未知病毒/病菌的传播，也需经灭活后，其处理过程同阳性对照。

[0045] 4、洗涤试剂：

[0046] 洗涤试剂装入一个试剂包中，以固态的形式被保存。此洗涤试剂的制作方法如下：

[0047] 其为混合磷酸盐、Tween-20等组成的无水试剂，临用前指定量的水溶解上述无水试剂，即可制成PH值、离子强度稳定的洗涤缓冲液。

[0048] 5、酶结合物试剂：

[0049] 酶结合物试剂可分为双抗夹心ELISA型和三抗夹心ELISA型。

[0050] 双抗夹心ELISA型(DAS-ELISA)含酶标抗体和酶结合物稀释剂。

[0051] 三抗夹心ELISA型(TAS-ELISA)含检测抗体、酶标抗-抗体和酶结合物稀释剂。

[0052] 制作方法具体如下：

[0053] 制备抗体的临时固态载体：酶标抗-抗体或检测抗体附着于固态载体保存，临时固态载体可选用脱脂棉、滤纸、塑料容器或其它固体材料，但必须经过合适的处理使之与酶标抗体只是简单附着，不发生化学反应，在溶液中两者可分开。制备过程：将搓成小球状的脱脂棉、裁剪成固定大小和形状的滤纸小片在含1g/L～5g/L白蛋白的酶标抗体稀释液中20±5℃浸泡2～4小时，取出滤纸片在洗涤缓冲液中浸洗4～6次，阴干；将塑料小离心管用常规的白蛋白溶液或脱脂奶粉浊液封闭，用洗涤缓冲液清洗4～6次，阴干。

[0054] 检测抗体和酶标抗-抗体溶液(含0.2g/L～1g/L的防腐剂)分别滴加在不同临时固态载体上，在硅胶干燥剂的容器里控制在≤20℃，4小时内阴干，放入装有稀释剂的同一容器内。稀释剂含(按使用液体积计)包括0.01～0.1g/L的指示剂I、0.5～50g/L封闭剂、1～4g/L的防腐剂，其余为10～30g/L稳定剂和基础缓冲液，制成固态，分装。临用前加水至刻度溶解试剂即可使用。酶结合物制干过程注意点：一是酶标抗体和检测抗体(用于TAS-ELISA)的浓度不宜过低，在使用液的200倍以上的浓缩液可不必考虑损耗，否则须将损耗计算在内；二是酶标抗体滴加的量要使液体布满整个载体又不溢出，如在6mm*6mm的经处理的中速定性滤纸片上，每次滴加6～10微升/片为宜；三是为保证酶标抗体控制在≤20℃，4小时内在洁净条件尽快阴干，以防变质或变性。

[0055] ECI试剂制备：先制成浓缩液调节PH值，分装(或分装后再冷冻干燥)，加水稀释后(即还原成酶结合物稀释缓冲液)在每升稀释液中含1g/L～5g/L血清蛋白、20g/L分散剂、0.2g/L～5g/L防腐剂抑菌剂和0.01g/L～0.1g/L指示剂。

[0056] 所述的抗体稀释液(ECI)中的指示剂I为0.01g/L～0.1g/L甲基橙、甲基红、苯酚红、溴甲酚绿、溴百里香酚兰、茶酚绿、酸性铬兰K或亚甲基兰。指示剂I选择要求为：颜色易区别且不影响检测结果(避免使用可能影响检测结果的指示剂，如灿烂绿和中性红可能造成假阳性结果或使空白值增加)。制备过程：称取甲基橙、苯酚红、茶酚绿、酸性铬兰K或亚甲基兰0.10克加水100mL溶解；0.10克甲基红、溴甲酚绿或溴百里香酚兰用0.1～0.2mL 3mol/L NaOH溶解，加水至100mL，再在ECI试剂中加入终浓度为0.01g/L～0.1g/L的指示剂。

[0057] 在TAS-ELISA中，还可以将指示剂I与检测抗体放在同一滤纸片上，以方便区分检测抗体和酶标抗体。具体制备方法：1克/升的指示剂溶液中溶入2g/L～5g/L血清蛋白，取适量滴加在小滤纸片上先阴干，再滴加检测抗体，阴干。应避免未经处理的高浓度的指示剂与高浓度的检测抗体长时间直接接触，两者发生疏水作用会使抗体效价降低。

[0058] 6、底物试剂

[0059] 含底物片、底物稀释剂和指示剂II。

[0060] 底物稀释剂指基础试剂(通常含镁盐、增效剂)加防腐剂制成的浓缩液，分装；底物使用片剂或粉剂。底物片、底物稀释剂和指示剂II可分装或合放。

[0061] 本发明同时公布一种碱性磷酸酶标记的ELISA指示剂---孔雀石绿。孔雀石绿变色范围pH值11.0(绿)～13.5(无色)。添加方法：用乙腈或乙酸等溶剂溶解孔雀石绿晶体后，滴加于载体(通常是滤纸片或容器)上，阴干，避光保存。

[0062] 在用碱性磷酸酶标记的ELISA反应过程中，碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸盐(p-nitropheny phosate，pNPP)，磷酸对硝基苯在碱性磷酸酶的作用下，可以水解成磷酸盐和对硝基苯酚。在一定底物浓度范围内，磷酸对硝基苯的水解产物对硝基苯酚会引起405nm处吸光度的上升，其上升速率与碱性磷酸酶的活力成正比。

[0063] 碱性磷酸酶

[0064] 磷酸对硝基苯(无色)+H2O----------→磷酸盐+对硝基苯酚(黄色)

[0065] 显色底物溶液：将pNPP以10mmol/L的浓度溶于含1mmol/L MgCl的0.1mol/L二乙醇胺缓冲液(pH 9.8)，即可应用；但此溶液无色，容易漏加或错加，添加0.05～0.06g/L孔雀石绿使溶液呈蓝绿色。当终止酶促反应时，加入适量碳酸钠-亚硫酸盐溶液或1～3mol/L氢氧化钠溶液，碱性条件下pNPP的光吸收增强，当PH＞11可使碱性磷酸酶迅速失活，而且使绿色的孔雀石绿转化为隐色孔雀石绿，从而同一指示剂在添加底物溶液和终止液同时起到指示作用。

[0066] 7、终止试剂为固体，加水至识水线使用。

[0067] 本发明同时公布一种ELISA终止液配方：在碱性磷酸酶标记的ELISA试剂盒中，终止试剂为0.5～2.0mol/L碳酸钠0.1g/L～5g/L亚硫酸钠溶液。

[0068] 碱性磷酸酶标记的ELISA试验中，通常以3mol/L氢氧化钠(PH 13.5～13.7)溶液使碱性磷酸酶失活，终止酶促反应，但氢氧化钠为腐蚀性物质；也有报道用0.5mol/L碳酸钠溶液(PH 11.6～11.8)作为终止液，但效果不如前者，若在底物稀释液中加孔雀石绿作为指示剂，0.5mol/L碳酸钠溶液还不能使孔雀石绿迅速转化为隐色孔雀石绿。试验证明在0.5～1.0mol/L碳酸钠溶液加入少量(每10mL溶液中加入5～100mg)亚硫酸盐，不仅安全性比使用氢氧化钠高，而且碳酸钠-亚硫酸盐溶液能使较高浓度的孔雀石绿溶液迅速褪色，终止酶促反应的效果、稳定性均明显优于氢氧化钠溶液。以每10mL1.0mol/L碳酸钠溶液中加入10mg亚硫酸钠作为终止液与3mol/L氢氧化钠对比试验(样本数为12)结果为：在1小时内，阳/阴性质控样光吸收值比值比后者增加9.7％，波动范围仅为后者的32％；四天后碳酸钠-亚硫酸钠空白组光吸收值增加16.85％，阳/阴性质控样吸收比降低
20％，而氢氧化钠组则空白光吸收值增加34.99％，阳/阴性质控比光吸收值降低37％；同时前者使孔雀石绿褪色速度也快于后者。可见碳酸钠-亚硫酸钠终止液在实验效果和安全性方面都优于氢氧化钠终止液，且在试剂保存期间氢氧化钠固体易吸水潮解，而(无水)碳酸钠-(无水)亚硫酸钠混合物相对较稳定。

[0069] 8、盖板膜为8cm*12cm遮光防水不胶膜，可在潮湿环境下多次使用。自行设计定制(8cm×12cm)防水遮光不干胶膜作为盖板膜代替常用的湿盒孵育，此孵育方法可用于任何ELISA试验中，此方法与湿盒孵育相比较的优点：不但质轻，占用体积小，具有一定的遮光效果，而且可避免摇板或开盒过程震动过大使液体飞溅而引起的污染；孵育后，酶标板的底部是干燥的，无需在用酶标仪机读前小心擦拭酶标板的底部的水珠；观察显色程度较方便。

[0070] 9、一次性滴管，包括1～3mL一次性塑料刻度滴管数支和0.2～0.5mL一次性塑料刻度数十支。将其用作移液工具方便现场检测使用并增加试剂盒运输过程抗震性。

[0071] 所有试剂在盒内按使用顺序摆放，使用时，各试剂按顺序在临用前数分钟加水至识水线，溶解后使用。当然，样品稀释试剂和洗涤试剂是分别使用500mL的容器进行溶解步骤。

[0072] 本发明有益的积极效果是：使ELISA试剂盒可较长时间常温保存，轻便，生物安全性高，操作简单，携带方便，且试剂盒研发过程还充分考虑的防错设计，使用实验过程不易出错，不需购买化学试剂和价格昂贵的移液器，结合ELISA试验的特异性强，敏感性高和结果肉眼可见性，从而使ELISA试剂盒适用于现场和基层实验室检测，易于大范围推广应用。

[0073] 为了证明本发明方法的正确性，发明人作了如下的实例：

[0074] 实例1

[0075] 本实验说明病毒可在低温下存活

[0076] 取含建兰花叶病毒的植物提取液，经液氮冻(-196℃)存30天后，解冻，并将该提取液涂抹在建兰花叶病毒阴性植物叶片的伤口上，3周后，被接种阴性植物其它部位检出了建兰花叶病毒，实验表明建兰花叶病毒经-196℃冻存仍具有活性，因此有必要对质控样做适当的病毒灭活处理。

[0077] 实例2

[0078] 本实验为不同灭活方法对病毒灭活(核酸变性)效果和抗原性损失(蛋白质变性)程度比较。

[0079] 实验目标：将病毒灭活(核酸变性)，但需要保留其抗原性。试验三种方法病毒灭活建兰花叶病毒、齿兰环斑病毒：①加热灭活：50℃、56℃、60℃、62℃、65℃、68℃、75℃，处理30分钟；②甲醛灭活：0.1％(体积比)、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％，37℃处理24小时③β-丙内酯灭活，1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶6000、1∶8000，4℃处理2小时。灭活效果：①60℃以上，30分钟加热均可完全灭活病毒，但抗原性也比处理前有所下降，68℃以上，抗原性消失，②0.2％以上甲醛均可完全灭活病毒，但抗原性也比处理前有所下降，且残留甲醛去除较麻烦，③β-丙内酯灭活，1∶1000～1∶6000均可完全灭活病毒，抗原性也比处理前无显著差异，相比之下用β-丙内酯能较好达到灭活和保留抗原性的效果，且残留β-丙内酯在37℃水浴2.5小时即可完全水解。

[0080] 实例3、

[0081] 本实验证明碳酸钠-亚硫酸钠溶液与传统的3mol/L氢氧化钠终止效果好。

[0082] 以每10mL1.0mol/L碳酸钠溶液中加入10mg亚硫酸钠作为终止液与3mol/L氢氧化钠进行对比试验(样本数为12)，结果为：在1小时内，阳/阴性质控样光吸收值者增加9.7％，波动范围仅为后者的32％；四天后碳酸钠-亚硫酸钠空白组光吸收值增加16.85％，阳/阴性质控样吸收比降低20％，而氢氧化钠组则空白光吸收值增加34.99％，阳/阴性质控比光吸收值降低37％；同时前者使孔雀石绿褪色速度也快于后者。可见碳酸钠-亚硫酸钠终止液在实验效果和安全性方面都优于氢氧化钠终止液，且在试剂保存期间氢氧化钠固体易吸水潮解，而(无水)碳酸钠-(无水)亚硫酸钠混合物相对较稳定。

具体实施方式

[0083] 实施例1

[0084] TAS-ELISA检测建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus，简称CyMV)现场检测试剂盒的制备和使用，试剂盒中含①抗体检测板、②样品稀释试剂、③洗涤试剂、④质控物(阳/阴性对照)、⑤酶结合物试剂(包括检测抗体、酶标抗-抗体、稀释剂)、⑥底物试剂、⑦终止试剂、⑧一些辅助设备。

[0085] 1.具体制备过程如下：

[0086] 1.1抗体检测板：

[0087] 配制包被缓冲液，含Na2CO3 1.59g/L，Na2HCO3 2.93g/L，NaN3 0.2g/L调节pH 9.6。取包被抗体(兔抗建兰花叶病毒，由美国agdia公司生产)50微升，以包被缓冲液1∶200倍稀释(即每50μL加9.95mL包被缓冲液，配制成10mL使用液)，在可拆卸型96孔高亲和力酶标板(加拿大产)上，每反应孔加100微升，4℃过夜。次日，加磷酸盐洗涤缓冲液洗板6次后，拍干，在硅胶干燥器内放置过夜，加干燥剂一包，以密封袋包装，密封袋外加标识为“①检测板”，干燥条件下可保存12个月以上。

[0088] 1.2样品稀释试剂(GEB)：

[0089] 试剂盒内含样品稀释试剂(GEB)一包(约27±1g).每包GEB中含Na2HPO40.560±0.005g、KH2PO4 0.100±0.005g、NaCl 4.00g、KCl 0.10g、Na2SO3 0.65g、NaN3
0.10g、鸡蛋清粉1.0±0.2g、聚乙烯吡咯烷酮K30 10±1g、吐温-20 10±1g。

[0090] 制备过程分3个步骤完成：

[0091] 1.2.1预测：先用万分天平精确称取Na2HPO4 0.560g、KH2PO4 0.100g，及NaCl4.00g、KCl 0.10g、Na2SO3 0.65g、NaN3 0.10g、鸡蛋清粉1.0±0.2g、聚乙烯吡咯烷酮K30
10±1g、吐温-20 10±1g。用500毫升纯净水溶解试剂，混合均匀，用PH计测量PH值，根据所测得PH值适当增减Na2HPO4或KH2PO4：配制0.10g/mL Na2HPO4和0.02g/mL KH2PO4分别溶液放入不同滴定管中，当所得缓冲液PH＜7.40时，适当滴加0.10g/mL Na2HPO4溶液；当所得缓冲液PH＞7.40时，适当滴加0.02g/mL KH2PO4溶液，直到PH调整到7.38～7.42范围内.此后该批试剂量按调整量准确称取。

[0092] 1.2.2包装：先包装袋在天平上“去皮”后，将吐温-20直接称入包装袋内，再按调整量准确称取称取其它试剂(如Na2HPO4 0.560±0.005g，即精确到0.005g；NaCl 4.00g，即精确到0.01g)，一起放入包装袋内，抽真空，密封保存，试剂袋外加标识为“②样品稀释试剂”，干燥条件下可保存18个月以上。

[0093] 1.2.3检验：全数进行包装密封性检查并按比例分段抽取②号试剂袋进行PH检测，当批量较少时，抽检数不少于5包，当加水定容至500毫升时，PH应范围在7.36～7.44之间，实测批内PH值波动＜0.03；当加不同的蒸馏水或纯净水定容至400～600毫升时，实测PH范围在7.32～7.46之间。

[0094] 1.2.4实际使用时，先取一容器，将②号试剂袋小心用50～100毫升纯净水溶解；最后加水定容至500毫升，摇匀；即得样品稀释缓冲液的使用浓度，此溶液可在2～6℃存放1个月。

[0095] 1.3洗涤试剂(PBST)：

[0096] 试剂盒含5±0.05g的洗涤试剂一包，其成分为：Na2HPO4 0.575±0.005g、KH2PO40.100±0.005g、KCl 0.10g、NaCl 4.0g、Tween-20 0.25±0.05g。(PBST的预测、包装、检验步骤同GEB制备过程)，试剂袋外加标识为“③洗涤试剂”，干燥条件下可保存24个月以上。

[0097] 实际临用前，将每包洗涤试剂与500毫升的纯净水在容器中溶解，得PH7.35～7.45的洗涤缓冲液(PBST)。

[0098] 1.4质控物(含阳性对照和阴性对照)：

[0099] 质控物制备过程：

[0100] 1.4.1阳性对照：称取0.50克葡萄糖，溶于100mL上述样品稀释缓冲液(GEB使用液)中，加5mL二甲基亚砜，混合均匀，制成提取液→采集含CyMV兰科植物叶片→加提取液，以叶片与提取液重量：体积比1∶10(g/mL)在电动匀浆机上匀浆→用双层无菌纱布过滤→将滤注液3000rpm离心6分钟→取上清液，以上清液：β-丙内酯体积比为2000∶1加入灭活剂(即每100mL上清液加50μLβ-丙内酯)，4℃放置120分钟灭活病毒→37℃水浴2.5小时，水解β-丙内酯→分装，每管0.5mL分装于2.0mL冷冻管中→-20℃预冻过夜→-46℃冷冻干燥，加盖密封保存，冷冻管外加标识为“④-a阳性对照”。

[0101] 临用前加水至0.5mL刻度线，用小吸管吹打数次使试剂溶解并混合均匀即可使用。

[0102] 1.4.2阴性对照：取样前先将所用器械，用70％酒精浸泡或沸水浴30min，→采集不含CyMV兰科植物叶片，加提取液研磨(后续制备过程同阳性对照制备过程)。冷冻管外加标识为“④-b阴性对照”。

[0103] 1.5酶结合物试剂(含酶结合物稀释剂、检测抗体和酶标抗-抗体)：

[0104] 检测抗体为鼠抗建兰花叶病毒(agdia公司生产)，酶标抗-抗体为碱性磷酸酶结合物兔抗-鼠抗建兰花叶病毒，两者均为无色液体，每1000孔的量各为0.525mL(其中0.025mL的损耗备用量)，相当于每100孔0.05mL。

[0105] 1.5.1制备酶结合物稀释剂(ECI)：称取Na2HPO4 0.620g、KH2PO4 0.100g，及NaCl4.00g、KCl 0.10g、NaN3 0.10g、牛血清蛋白1.0g、聚乙烯吡咯烷酮K30 10+1g、吐温-20
0.25±0.05g→用80毫升纯净水溶解试剂，混合均匀→用0.10g/mL Na2HPO4溶液；或
0.02g/mL KH2PO4溶液调节PH到7.03→定容至100mL，得ECI 5倍浓缩液→测试：取2mL加水稀释至10mL，即得酶结合物稀释缓冲液(PH 7.40～7.42)→每瓶2mL分装于总容量为
15mL，最大刻度为10mL透明玻璃试剂瓶中，冷冻干燥制成逢松状固体。得酶结合物稀释剂。
瓶身外加标识为“⑤-a酶结合物稀释剂”，干燥条件下可保存12个月以上。

[0106] 实际使用时，将每份酶结合物稀释剂加纯净水定容至10mL刻度线，用吸管吹打数次至试剂完全溶解，即成酶结合物稀释缓冲液。

[0107] 在可控温、除湿、消毒、防止空气流通的洁净环境下完成以下1.5.2～1.5.4的操作。

[0108] 1.5.2制备抗体的临时固态载体：在10毫升酶结合物稀释缓冲液中溶入0.05克光明牌脱脂奶粉→放入双圈牌中速定性滤纸裁剪成10mm*10mm的小片，浸泡2小时，期间每隔30钟搅拌一次→取出滤纸片在洗涤缓冲液中浸洗2～3次→在洁净载玻片上摊开，在干燥器中阴干，在干燥器中保存备用。从而获得抗体的临时固态载体。

[0109] 1.5.3制备含指示剂I和检测抗体的滤纸片：称取0.02g BSA溶入10毫升1克/升的甲基橙指示剂溶液中，接着将ECI处理的滤纸片浸入指示剂溶液中，取出，阴干后滤纸片呈橙色。将橙色滤纸片分开平放在洁净玻片上，在每片滤纸上分2次滴加25微升/片的检测抗体(用移液器吸取抗体溶液，第一次，每片滤纸上加12.5微升抗体溶液，放置片刻，约5～10分钟，当滤纸上液体基本干燥后，再加12.5微升抗体溶液)，在干燥器里4～20℃阴干，得橙色片，2片/份密封包装，外加标识为“⑤-b抗体A”，在室温干燥、避光条件下可保存12个月以上。

[0110] 1.5.4制备含酶标抗-抗体的滤纸片：在上述在干燥器中保存备用的临时固态载体，分2次滴加25微升/片的碱性磷酸酶标记的抗-抗体，在干燥器里阴干，得白色滤纸片B，2片/份密封包装，外加标识为“⑤-c抗体B”，在室温干燥、避光条件下可保存12个月以上。

[0111] 1.5.5使用时，每5毫升酶结合物稀释缓冲液中分别加入橙色片A和白色片B各1片，约够50反应孔的量。浸泡5～10分钟，摇匀即可使用。

[0112] 1.6底物试剂(含底物片、指示剂II和底物稀释剂)：

[0113] 1.6.1底物片：底物为硝基苯磷酸盐，市购底物片5mg/片，2片/盒，贮于棕色1mL试剂瓶中，外加标识为“⑥-a底物”。外包黑色塑料膜，密封、避光保存。每片可用底物稀释液稀释成5mL，约够50反应孔的量。

[0114] 1.6.2孔雀石绿指示剂片(指示剂II)的制备：称取0.1g孔雀石绿晶体→加10mL乙腈(或0.5mL乙酸+0.5mL乙腈)溶解后，取10μL吸于6mm×6mm的中速定性滤纸片)上，避光条件下室温干燥，制得深蓝色指示剂片→2片每份贮于小封口袋中，外加标识为“⑥-b指示剂”。与上述底物片一起包在黑色塑料膜内。避光条件下可保存12个月以上[0115] 1.6.3底物稀释剂的制备：称取MgCl·6H2O 0.1g、NaN3 0.2g溶于10mL蒸馏水→加97mL二乙醇胺，80mL蒸馏水搅拌均匀→以3.0mol/L盐酸溶液调节PH值至10.03→加蒸馏水定容至200mL，即制得5倍浓缩液(-20℃为液态)→2mL每瓶分装于10mL刻度棕色瓶中→密封，外加标识为“⑥-c底物稀释剂”。避光条件下可保存12个月以上。使用时，加纯净水至10mL刻度线，即得PH值9.6～9.8的底物稀释液(使用液可在2-6℃保存30天)。

[0116] 1.6.4实际使用时，将2mL的底物稀释剂用纯净水定容至10mL(即恢复成底物稀释剂原液的浓度)，得PNP缓冲液；然后再放入上述的2片底物片和孔雀石绿指示剂片(指示剂II)，在暗处静置5～10分钟，混匀。

[0117] 1.7终止试剂：

[0118] 称取1.20g Na2CO3、10mg Na2SO3，贮于10mL刻度试剂瓶中，加标识为“⑦终止液试剂”实际使用前，加纯净水至10mL刻度线即可使用。

[0119] 将以上1.2～1.7所述的GEB、PBST、质控物、酶结合物试剂、底物试剂(除底物稀释剂外)和终止试剂一起密封包装加干燥剂保存，将底物稀释剂棕色瓶外套PE气泡袋保存。

[0120] 1.8辅助设备(含防水膜和一次性刻度滴管)：

[0121] 每个试剂盒含定制的8cm×12cm的银灰色遮光防水不干胶膜2片、3mL一次性塑料刻度滴管8支(1包，用于稀释试剂)和0.2mL一次性塑料刻度滴管18～20支×3包(用于加样液)，分别放于试剂盒四侧，以增加试剂盒抗震性。3mL一次性塑料刻度滴管带为数字刻度，0.2mL一次性塑料刻度小滴管上的刻度无数字标识，总容量为0.25mL，其第一刻度为100μL，第二刻度为200μL。

[0122] 2使用过程：

[0123] 2.1准备工作

[0124] 2.1.1配制样品提取液：先取一容器，剪开②号试剂袋，将GEB试剂倒入一次性水杯中，用约50～100mL纯净水分数次将试剂袋中残留试剂洗入水杯，用3mL滴管搅拌至试剂完全溶解；混合均匀；最后加水定容至500毫升，摇匀；得样品稀释缓冲液(GEB)。

[0125] 2.1.2将④-a阳性对照冻干品临用前加水(或上述GEB)至0.5mL刻度线，用小吸管吹打数次使试剂完全溶解，得阳性质控物溶液。

[0126] 2.1.3将④-b阴性对照冻干品临用前加水(或上述GEB)至0.5mL刻度线，用小吸管吹打数次使试剂完全溶解，得阴性质控物溶液。

[0127] 2.1.4剪开③号试剂袋，将PBST试剂与500毫升的纯净水在容器中溶解得洗涤液(PH7.35～7.45)，即PBST缓冲液。

[0128] 2.2样品的提取

[0129] 2.2.1样品的提取

[0130] ----尽可能选择出现症状的植物组织作为样品，通常将叶片作为ELISA实验的检测样品，其它植物组织也可用于ELISA实验。

[0131] ----样品中加入10～30倍GEB(水分含量高的植物，如蝴蝶兰、卡特兰组织加入10倍GEB，水分含量较低的植物，如蕙兰加入30倍GEB)研磨或匀浆，制得样品待测溶液。

[0132] ----在每份样品匀浆后请彻底清洗剪刀和匀浆工具，以免造成样品间的相互污染。

[0133] ----每个反应孔需要100μL的样品提取稀释液，样品准备不少于0.5mL待测溶液以利于吸取。

[0134] 2.3点样及孵育

[0135] 2.3.1点样

[0136] ----事先设计各待测样品、阴性对照和阳性对照各自的反应孔位置。

[0137] ----拆开①号检测板的包装，取下足够的反应孔条子(其它反应孔条子放回原包装袋内，拉上封口保存)。

[0138] ----根据实验设计，用0.2mL的小滴管取100μL(3滴，滴管第一刻度为100μL，第二刻度为200μL)样品提取稀释液加入抗体检测板的反应孔中。

[0139] ----取100μL阴性质控物溶液加入相应反应孔中。

[0140] ----取100μL阳性质控物溶液加入相应反应孔中。

[0141] 2.3.2孵育

[0142] ----在检测板上贴防水膜，并在防水膜上用手掌轻轻按压一遍以封住反应孔，[0143] ----在水平台面按住检测板，以圆圈运动形式轻轻摇动检测板16～18次，[0144] ----室温下孵育2小时。

[0145] 2.4酶标记物的制备

[0146] ----往⑤-a酶结合物稀释剂瓶中加纯净水至10mL刻度线，用滴管吹打至试剂完全溶解，得ECI缓冲液。

[0147] ----将含检测抗体的橙色⑤-b滤纸片A和酶标记物白色⑤-c滤纸片B加到上述ECI缓冲液中，浸泡5～10分钟，得酶标记物稀释液。

[0148] 2.5洗板

[0149] ----孵育结束后，在酶标上小心取下防水膜(不要使皱折，可重复使用2～4次)，将反应孔中的试剂倒出，将检测板倒扣在吸水纸上以控干孔中残留液体。

[0150] ----加入200～250μL的PBST缓冲液，之后快速倒出，并在吸水纸上以控干孔中残留液体，重复6次。

[0151] 2.6加酶标记物稀释液及孵育

[0152] ----将2.4所述酶标记物稀释液摇匀；

[0153] ----在各反应孔中加入100μL酶标记物稀释液；

[0154] ----在酶标上贴上防水膜，室温下孵育2小时。

[0155] 2.7PNP底物的制备

[0156] ----孵育结束前的10～15分钟，在⑥-c 2mL底物稀释剂瓶中加纯净水至10mL刻度线，摇匀，得PNP缓冲液。

[0157] ----在PNP缓冲液中加入PN⑥-a底物片和b指示剂片；在暗处静置5～10分钟，混匀，得PNP底物溶液。

[0158] 注意：请勿直接接触PNP底物片或将底物溶液暴露在强光下，直接接触或强光刺激会在阴性反应孔中导致背景色干扰。

[0159] 2.8洗板、加PNP底物溶液及孵育

[0160] 2.8.1洗板

[0161] ----同2.5

[0162] 2.8.2加PNP底物溶液

[0163] ----在各反应孔中加入100μL PNP底物溶液(避免强光)。

[0164] 2.8.3孵育

[0165] ----在酶标上贴上防水膜，在避光孵育15～180分钟，根据室温条件，至阳性质控出现明显颜色变化为止。

[0166] 9终止反应

[0167] ----在⑦终止液试剂瓶中加纯净水至10mL刻度线，摇匀。

[0168] ----当阳性颜色变化时，孵育结束后，在各反应孔中加入100μL终止液。

[0169] 10.结果

[0170] ----直接用肉眼观察或用酶标仪在405nm波长下测量结果

[0171] 阳性结果：反应孔中有明显颜色变化(呈黄色)。

[0172] 阴性结果：反应孔中没有明显颜色变化

[0173] 注意：只有在阳性质控孔得到阳性结果，阴性质控孔不发生颜色变化的时候，实验结果才是可靠的。加终止液后，贴上防水膜结果在暗处可保持2～3天(只要阴性质控孔不发生颜色变化)。

[0174] 实施例2

[0175] TAS-ELISA检测CyMV现场检测试剂盒的制备和使用，以下仅述与实施例1的不同之处：所用的载体为脱脂棉小球；检测抗体不含指示剂，在酶标抗-抗体上加指示剂I；所用的指示剂I为酸性铬兰K；指示剂II在小离心管中保存。

[0176] 1.5.2制备抗体的临时固态载体：在10毫升酶结合物稀释缓冲液中溶入0.05克光明牌脱脂奶粉→将脱脂棉搓成3～4mm(绿豆大小)的小球，浸泡2小时，期间每隔30钟搅拌一次→在洗涤缓冲液中浸洗4～6次→控干水分，在洁净载玻片上摊开，在干燥器中阴干，在干燥器中保存备用。从而获得抗体的临时固态载体。

[0177] 1.5.3制备含检测抗体的脱脂棉小球：取上述临时固态载体，每个脱脂棉小球滴加25微升的检测抗体，在干燥器里阴干，得白色小球，2片/份密封包装，外加标识为“⑤-b抗体A”，干燥、避光条件下可保存12个月以上。

[0178] 1.5.4制备含指示剂I的酶标抗-抗体脱脂棉小球：称取0.02g BSA溶入10毫升1克/升的酸性铬兰K溶液中→每个脱脂棉小球滴加25微升指示剂溶液中，阴干后呈紫色→滴加25微升/片的酶标抗-抗体抗体→在干燥器内阴干→外加标识为“⑤-c抗体B”，干燥、避光条件下可保存12个月以上。

[0179] 1.5.5使用时，每5毫升酶结合物稀释缓冲液中分别加入白色球A和紫色球B各1个，浸泡5～10分钟，用滴管吹打数次，即可使用。

[0180] 1.6.2孔雀石绿指示剂(指示剂II)的制备：称取0.1g孔雀石绿晶体→加10mL乙腈溶解后，取10μL放于0.5mL小离心管中，避光条件下氮气吹干→1管/盒，外加标识为“⑥-b指示剂”。与底物片一起包在黑色塑料膜内。避光条件下可保存12个月以上。

[0181] 临用时，用少量水或底物稀释液将小离心管孔雀石绿溶解，与底物一并加入底物稀释液中混匀使用。

[0182] 其使用过程同实施例1。

[0183] 实施例3

[0184] DAS-ELISA检测马铃薯卷叶病毒(Potato Leaf Roll Virus)(抗体由agdia公司生产)现场检测试剂盒的制备和使用。以下仅述与实施例1的不同之处：1、酶结合物试剂仅含酶标抗体和酶结合物稀释剂；2、指示剂加在酶结合物稀释剂中，所用的指示剂为甲基红。

[0185] 1.制备酶结 合物稀释剂：称取Na2HPO4 0.620g、KH2PO4 0.100g，及NaCl4.00g、KCl0.10g、NaN3 0.10g、牛血清蛋白1.0g、聚乙烯吡咯烷酮K3010±1g、吐温-20
0.25±0.05g→用80毫升纯净水溶解试剂→加入1g/L甲基红指示剂1mL，混合均匀→用
0.10g/mL Na2HPO4溶液；或0.02g/mL KH2PO4溶液调节PH到7.03→定容至100mL，得ECI 5倍浓缩液→测试：取2mL加水稀释至10mL，即得酶结合物稀释缓冲液(PH 7.40～7.42)→每瓶2mL分装于总容量为15mL，最大刻度为10mL透明玻璃试剂瓶中，冷冻干燥制成逢松状固体。得酶结合物稀释剂。瓶身外加标识为“⑤-a酶结合物稀释剂”，干燥条件下可保存12个月以上。实际使用时，将每份酶结合物稀释剂纯净水用定容至10mL，溶解试剂，即配制成酶结合物稀释缓冲液(ECI)。

[0186] 2.制备抗体：先将1.5毫升离心管用1毫升含2g/mL脱脂乳粉的PBST封闭过夜，用PBST清洗4～8次→加入0.05毫升酶标抗体→将离心管置于铺有硅胶干燥剂的密封容器中4℃放置3～7天使用酶标抗体充分阴干→将离心管加盖密封，外加标识。使用时，加1毫升ECI用滴管反复吹打抗体复溶于ECI，并吸取复溶的抗体溶液加入酶结合物稀释剂试剂瓶中，摇匀备用。

[0187] 使用方法参照实施例1。

[0188] 实施例4

[0189] DAS-ELISA检测齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus，简称ORSV)现场检测试剂盒的制备和使用。试验所用的抗体由荷兰primediagnostic公司生产，以下仅述与实施例1的不同之处：

[0190] 1、抗体检测板：

[0191] 抗体的稀释比为1∶500(20μL包被抗体加包被缓冲液稀释成10mL)。检测板用抗体包被→洗板→每孔加100μL含20～50g/L脱脂乳粉PBST封闭反应孔多余的结合位点→洗板。

[0192] 2.制备酶结合物稀释剂：称取Na2HPO4 0.620g、KH2PO4 0.100g，及NaCl 4.00g、KCl0.10g、NaN3 0.10g、牛血清蛋白1.0g、聚乙烯吡咯烷酮K30 10±1g、吐温-200.25±0.05g→用80毫升纯净水溶解试剂→加入1g/L甲基橙溶液1mL(或1g/L甲基红/苯酚红/溴甲酚绿/溴百里香酚兰/酸性铬兰K/亚甲基兰1mL，或1g/L茶酚绿2mL)，混合均匀→用0.10g/mL Na2HPO4溶液；或0.02g/mL KH2PO4溶液调节PH到7.03→定容至100mL，得ECI 5倍浓缩液→测试：取2mL加水稀释至10mL，即得酶结合物稀释缓冲液(PH 7.40～
7.42)→每瓶2mL分装10mL透明玻璃试剂瓶中，冷冻干燥制成橙色的ECI试剂。

[0193] 3.制备含酶标抗体的滤纸片：双圈牌慢速定性滤纸裁剪成6mm*6mm的小片，用ECI浸泡2小时，每隔30钟搅拌一次→洗涤缓冲液浸洗2～3次→阴干，放在洁净玻片上→在