一种农杆菌介导基因转化苏丹草的方法

摘要

本发明为一种农杆菌介导基因转化苏丹草的方法，属于生物技术领域。利用农杆菌介导法进行苏丹草外源基因转化时，以苏丹草幼穗离体培养诱导的淡黄色颗粒状愈伤组织为受体材料，经农杆菌感染和共培养，在附加抗生素500mg/L的羧苄青霉素的继代培养基中，经10～20mg/L卡那霉素抗性筛选获得抗性愈伤组织，将抗性愈伤组织转入附加抗生素500mg/L的羧苄青霉素的分化培养基中获得再生植株，壮苗、生根培养、移栽成活后经PCR检测，获得了转基因植株。本发明建立的苏丹草遗传转化方法，转化效率达到3％以上，为应用农杆菌介导法进行多用途苏丹草转基因育种奠定基础。

权利要求

1.一种农杆菌介导基因转化苏丹草的方法，其特征在于，(1)以幼穗为材料诱导的颗粒状愈伤组织为受体材料取苏丹草1～5cm长的幼穗，在无菌条件下用体积比70％的酒精彻底擦拭包在幼穗外的叶鞘，剥出幼穗并切成2～3mm段，把幼穗切段接种在愈伤组织诱导培养基上，培养室温度为26℃～28℃，每天光照16h，在散射光下培养，20～25d后获得白色或淡黄色、颗粒状愈伤组织，选用淡黄色颗粒状愈伤组织为受体材料；

(2)愈伤组织诱导、继代和分化培养基

基本培养基：MS大量元素、MS微量元素、B5有机成分、活性碳0.05％、蔗糖3％、琼脂条的用量为0.8％；

愈伤组织诱导培养基和继代培养基SI：基本培养基附加2，4-二氯苯氧乙酸3mg/L和激动素0.2mg/L；

绿苗分化培养基SD：基本培养基附加6-苄基氨基嘌呤2mg/L和萘乙酸0.01mg/L；

壮苗、生根培养基SR：基本培养基附加苯基脲类细胞分裂素CPPU 2mg/L和萘乙酸

0.01mg/L；

培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8；

(3)农杆菌转化和共培养

将携带质粒的农杆菌菌液1mL从-70℃的冰箱中取出后，接种到5mLYEB液体培养基中，26℃、200rpm振荡培养24h进行活化，再取活化液1mL接种到50mL YEB液体培养基中，继续振荡培养6h至OD600约0.6，用无菌蒸馏水将菌液稀释至OD600约为0.3，加入终浓度为100μM的乙酰丁香酮，继续振荡培养2h，将淡黄色颗粒状愈伤组织在农杆菌菌液中浸泡

2min，用无菌水冲洗3～5次，无菌滤纸吸去多余菌液后接种于愈伤组织继代培养基上培养

20～24h；

(4)卡那霉素抗性愈伤组织的筛选

经农杆菌转化和共培养的淡黄色颗粒状愈伤组织，当观察到愈伤组织周围培养基上出现农杆菌菌落时，转入含500mg/L羧苄青霉素的愈伤组织继代培养基，经10-20mg/L卡那霉素抗性筛选，获得具有卡那霉素抗性的愈伤组织；

(5)卡那霉素抗性愈伤组织的分化

将经卡那霉素抗性筛选的颗粒状愈伤组织，转入含500mg/L羧苄青霉素的分化培养基中，26℃～28℃，每天光照16h，在散射光下培养30～40d；

(6)抗性苗的壮苗、生根培养

把具有3片以上叶的抗性苗，转入壮苗、生根培养基SR：MS基本培养基+苯基脲类细胞分裂素CPPU2.00mg/L+萘乙酸0.01mg/L，26℃～28℃，每天光照16h，在散射光下培养30～

40d至幼苗高度为5cm以上；

(7)抗性苗的移栽及分子检测

去掉封口的棉花塞，加自来水，以水面略高于培养基为宜，冬季在18～25℃的智能温室炼苗2d后，用自来水冲洗干净再生植株根部所带的培养基，移栽至装有大田土壤的塑料盆中；

取移栽成活、综合农艺性状优良的植株幼嫩叶片，提取DNA并进行PCR检测，获得含有目标基因的转化植株；

(8)目的基因表达的转基因植株的获得

对含有目标基因的转化植株，进行目标性状鉴定，获得目标基因表达的转基因植株。

说明书

一种农杆菌介导基因转化苏丹草的方法

一、技术领域

[0001] 本发明涉及一种农杆菌介导基因转化苏丹草的方法，属于基因工程利用技术领域。二、技术背景

[0002] 苏丹草(Sorghum sudanense)为高粱属一年生禾本科牧草，可青饲、青贮和调制干草，为各类草食畜禽及草食性鱼类所喜食。苏丹草世界各地均有种植，中国南至海南，北至内蒙古均能栽培，是长江中下游地区最主要的暖季型牧草，占该区域暖季型牧草种植面积的70％以上，同时苏丹草作为生物质能源作物近年来正在日益受到重视。而南方农区人多地少、人畜争地争粮矛盾突出，充分利用大面积的盐渍土发展牧草种植，是当前草食畜禽养殖业中急需解决的问题。已有研究表明：苏丹草在1‰的滨海盐渍土壤上出苗并正常发育，＞2‰生长受抑制，产草量明显下降。

[0003] 同时叶斑病是苏丹草种植区普遍发生的病害。我国长江中下游地区由于高温高湿气候的影响，特别在7～9月养殖业需草高峰期，叶斑病发生尤为严重，致使供青期缩短、饲草品质和产草量下降。每亩鲜草减产量在500～1000公斤以上，以每公斤鲜草0.08元计，每年仅此一项，长江中下游地区损失纯利润达4000万元～8000万元。苏丹草叶斑病目前尚无特效药物防治。

[0004] 采用常规技术选育苏丹草耐盐和抗病品种不仅周期长，工作量大，而且由于缺乏近缘耐盐和抗病材料，苏丹草抗性育种进展缓慢。植物基因工程是在基因水平上定向改造植物的遗传物质，可打破物种之间的生殖隔离障碍，提高育种的目的性和可操作性，已成为现代育种的重要途径。在各种植物转基因方法中，由于农杆菌介导法具有易操作、低费用、高效率、插入片段确定性好和转基因拷贝数低等独特优点，已成为转基因策略中的首选方法。但由于苏丹草为高粱属牧草，与其它作物相比，通过组织培养获得高频再生植株相对更难一些，苏丹草农杆菌介导法转基因育种国内尚未见正式报道。三、发明内容

[0005] 技术问题本发明的目的在于提供一种利用农杆菌介导基因转化苏丹草的技术体系，该方法能够使苏丹草颗粒状愈伤组织基因转化效率达到大于1％的实用化程度，为采用转基因方法对多用途苏丹草进行遗传改良提供研究基础和技术支撑。

[0006] 技术方案

[0007] 1、一种农杆菌介导基因转化苏丹草的方法，其特征在于：

[0008] (1)以幼穗为材料诱导颗粒状愈伤组织为受体材料

[0009] 取苏丹草1～5cm长的幼穗，在无菌条件下用70％的酒精彻底擦拭包在幼穗外的叶鞘，剥出幼穗并切成2～3mm段，把幼穗切段接种在愈伤组织诱导培养基上，培养室温度为26℃～28℃，每天光照16h，在散射光下培养，20～25d后获得白色或淡黄色、颗粒状愈伤组织，选用淡黄色、疏松的颗粒状愈伤组织为受体材料；

[0010] (2)愈伤组织诱导、继代和分化培养基

[0011] 基本培养基：MS大量元素、MS微量元素、B5有机成分，活性碳0.05％，蔗糖3％，琼脂条的用量为0.8％；

[0012] 愈伤组织诱导培养基和继代培养基(SI)：基本培养基附加2，4-二氯苯氧乙酸3mg/L和激动素0.2mg/L；

[0013] 绿苗分化培养基(SD)：基本培养基附加6-苄基氨基嘌呤2mg/L和NAA 0.01mg/L；

[0014] 培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8；

[0015] (3)农杆菌感染和共培养

[0016] 将携带质粒的农杆菌菌液1mL从-70℃的冰箱中取出后，接种到5mLYEB液体培养基中，26℃、200rpm振荡培养24h进行活化，再取活化液1mL接种到50mL YEB液体培养基中，继续振荡培养6h至OD600约0.6，用无菌蒸馏水将菌液稀释至OD600约为0.3，加入终浓度为100μM的乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)，继续振荡培养2h，将淡黄色颗粒状愈伤组织在农杆菌菌液中浸泡2min，用无菌水冲洗3～5次，无菌滤纸吸去多余菌液后接种于愈伤组织继代培养基上培养20～24h。

[0017] (4)卡那霉素抗性愈伤组织的筛选

[0018] 经农杆菌感染和共培养的淡黄色颗粒状愈伤组织，当观察到愈伤组织周围培养基上出现农杆菌菌落时，转入含500mg/L羧苄青霉素的愈伤组织继代培养基，经10-20mg/L卡那霉素抗性筛选，获得抗性愈伤组织。

[0019] (5)卡那霉素抗性愈伤组织的分化

[0020] 将经卡那霉素抗性筛选的颗粒状愈伤组织，转入含500mg/L羧苄青霉素的分化培养基中，26℃～28℃，每天光照16h，在散射光下培养30～40d。

[0021] (6)再生转化苗的壮根培养

[0022] 把具有3片以上叶的抗性苗，转入壮苗、生根培养基(SR)：MS基本培养基+CPPU2.00mg/L+NAA 0.01mg/L，26℃～28℃，每天光照16h，在散射光下培养30～40d至幼苗高度为5cm以上。

[0023] (7)抗性苗的移栽及分子检测

[0024] 去掉封口的棉花塞，加自来水，以水面略高于培养基为宜，冬季在18～25℃的智能温室炼苗2d后，用自来水冲洗干净再生植株根部所带的培养基，移栽至装有大田土壤的塑料盆中。

[0025] 取移栽成活、综合农艺性状优良的植株幼嫩叶片，提取DNA并进行PCR检测，获得具有外源基因的转化植株。

[0026] (8)目的基因表达的转基因植株的获得

[0027] 对经PCR检测含有目标基因的转化植株，进行相应目标性状的鉴定，获得目标基因表达的转基因植株。

[0028] 有益效果 本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果：

[0029] 本发明以优质牧草及重要的生物质能源作物苏丹草的幼穗为材料，在离体培养条件下，获得颗粒状愈伤组织，通过选用淡黄色、较疏松干燥的颗粒状愈伤组织，有效地解决了经农杆菌感染和共培养的颗粒状愈伤组织，在卡那霉素抗性筛选过程中迅速恶化，无法获得抗性愈伤组织的难题。

[0030] 通过选用对愈伤组织生长抑制作用不明显、对愈伤组织分化有促进作用，同时能有效控制农杆菌生长的抗生素500mg/L羧苄青霉素，以及经15～20mg/L卡那霉素抗性筛选，抗性愈伤组织的分化和转化效率较高，为苏丹草农杆菌介导法基因转化工程提供了技术保证。

[0031] 使用本发明方法诱导和选用的浅黄色、疏松干燥的颗粒状愈伤组织，在农杆菌感染和共培养过程中能保持浅黄色、疏松干燥的颗粒状结构，经小于20mg/L卡那霉素抗性筛选后，绿苗分化率大于3％，淡黄色颗粒状愈伤组织的保持率超过20％，为开展苏丹草农杆菌介导法基因转化工作提供了重要的技术条件。四、附图说明

[0032] 图1外表呈疏松干燥、淡黄色颗粒状愈伤组织

[0033] 图2卡那霉素浓度对绿芽和绿苗生长的影响

[0034] 图3不同卡那霉素抗性植株的NPTII基因的PCR检测

[0035] 1.CK非转化植株；2～9.具有卡那霉素抗性的植株；10.质粒；M.标记[0036] 图4耐盐3‰以上的苏丹草转BADH植株

[0037] 图5叶斑病抗性强的苏丹草转GO基因植株五、具体实施方式

[0038] 本发明以幼穗为材料，采用离体培养诱导获得颗粒状胚性愈伤组织，通过优化农杆菌介导基因转化条件，明确适宜的抗生素和卡那霉素筛选剂浓度，获得经农杆菌侵染、适宜卡那霉素筛选的抗性愈伤组织，经分化培养得到再生植株，转化苗经壮根培养，移栽成活后经PCR检测，获得基因转化植株，根据目标性状鉴定获得目的基因表达的植株。

[0039] 基本培养基：MS无机盐和B5有机成分组成，活性碳0.05％，蔗糖3％，琼脂条的用量为0.8％；

[0040] 愈伤组织诱导培养基和继代培养基(SI)：基本培养基附加2，4-二氯苯氧乙酸3mg/L和激动素0.2mg/L；

[0041] 绿苗分化培养基(SD)：基本培养基附加6-苄基氨基嘌呤2mg/L和NAA 0.01mg/L。

[0042] 培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8。

[0043] 实施例1

[0044] 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株为LBA4404。重组植物表达质粒pCAMATBADH682(何晓兰，吴纪中，刘桂华，等.三角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶基因克隆及植物表达载体的构建[J].江苏农业学报，2003，19(4)：237-241.)结构为：RB-Gus-35SP-BADH3-NosT-35SP-NPT II-NosT-LB，转化体为苏丹草2098(钟小仙，顾洪如，周卫星，等.抗叶斑病苏丹草杂交制种技术及其种质创新[J].江苏农业学报，2001，17(3)：
184-187.)，苏丹草2098为日本育成的苏丹草杂交种Green ACE的父本恢复系(Katsuba Z，Nakagawa H，Maeda M，et al.A(Sorghum sudanense)line“2098-2-4-4”as apollen parent for developing hybrid sorghum cultivars[J].Bulletin of the Hiroshima PrefecturalAgriculture Research Center，1998，66：15～23.)，1996年从日本引进。具体转化过程如下：

[0045] 1.幼穗离体培养诱导颗粒状愈伤组织

[0046] 取1～5cm长的苏丹草2098幼穗，在无菌条件下用70％的酒精彻底擦拭包在幼穗外的叶鞘，无菌条件下剥出幼穗并切成2～3mm段，把幼穗切段接种在愈伤组织诱导培养基SI上，培养室温度为26℃～28℃，每天光照16h，在散射光下培养，20～25d后获得白色或淡黄色、颗粒状愈伤组织，出愈率达到80％～90％。

[0047] 2.农杆菌感染和共培养

[0048] a.将携带pCAMATBADH682质粒的农杆菌LBA4404菌液1mL从-70℃的冰箱中取出后，接种到5mLYEB液体培养基中，26℃、200rpm振荡培养24h进行活化，再取活化液1mL接种到50mL YEB液体培养基中，继续振荡培养6h至OD600约0.6，用无菌蒸馏水将菌液稀释至OD600约为0.3，加入终浓度为100μM的乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)，继续振荡培养2h。

[0049] b.将淡黄色颗粒状愈伤组织在农杆菌菌液中浸泡2min，用无菌水冲洗3～5次，无菌滤纸吸去多余菌液后接种于愈伤组织继代培养基SI上培养20～24h。

[0050] 3.适宜抗生素的确定

[0051] 附加500mg/L羧苄青霉素的继代培养基上，20d后颗粒状愈伤组织的褐化率为44.1％，比对照褐化率41.8％提高了5.5％。在添加500mg/L的羧苄青霉素的分化培养基上，愈伤组织绿苗分化率为27.5％，比对照绿苗分化率24.5％提高了13.6％。经农杆菌感染和共培养的淡黄色颗粒状愈伤组织，当观察到愈伤组织周围培养基上出现农杆菌菌落时，转入含500mg/L羧苄青霉素的愈伤组织继代培养基中，在继代培养过程中能有效抑制农杆菌的生长。500mg/L羧苄青霉素是农杆菌介导苏丹草转化适宜的抗生素。

[0052] 4.卡那霉素抗性愈伤组织的筛选

[0053] 经农杆菌感染和共培养的淡黄色颗粒状愈伤组织，当观察到愈伤组织周围培养基上出现农杆菌菌落时，用筛选培养基(愈伤组织诱导培养基+500mg/L羧苄青霉素+15mg/L卡那霉素)对愈伤组织进行筛选。14d时，大部分淡黄色愈伤组织恶化，30d时淡黄色愈伤组织的比例为21％，每次转化的淡黄色颗粒状愈伤组织200小块，共转化6次。

[0054] 5.卡那霉素抗性愈伤组织的分化

[0055] 将经卡那霉素抗性筛选的淡黄色颗粒状愈伤组织，转入含500mg/L羧苄青霉素的分化培养基中，26℃～28℃，每天光照16h，在散射光下培养15～20d时有绿色小芽出现，30d时即可生长为具有3片完整叶的幼苗，抗性愈伤组织的绿苗分化率为24.3％。

[0056] 6.抗性苗的壮苗、生根培养

[0057] 把具有3片以上叶的幼苗，转入壮苗、生根培养基(SR)：MS基本培养基CPPU2.00mg/L+NAA 0.01mg/L+250mg/L羧苄青霉素，26℃～28℃，每天光照16h，在散射光下培养20～30d至幼苗高度达到5cm以上。6次转化共获得再生植株85株。

[0058] 7.抗性苗的移栽及分子检测

[0059] 去掉封口的棉花塞，加自来水，以水面略高于培养基为宜，冬季在18～25℃的智能温室炼苗1d后，用自来水冲洗干净再生植株根部所带的培养基，移栽至装有大田土壤的塑料盆中株再生植株共移栽成活78株。

[0060] 取移栽成活、综合农艺性状优良的植株幼嫩叶片，参照Gustine的方法粗提 DNA(David L.，Gustine，Robert T Sherwood，et al.Isozyme，Protein，and RAPD Markerswithin a half-sib Family of Bufelgrass Segregating for Apospory[J].Crop Science，1996，36：723-727.)，再参照Gunter方法对DNA进行纯化(Gunter L E，Tuskan GA.Wullschleger S D.Diversity among populations of switchgrass based on RAPDmarkers[J].Crop Science 1996，36(4)：1017-1022.)。

[0061] 根 据NPT II选 择 标 记 基 因 设 计 的 扩 增引 物 序 列：正 向 引 物 为5′-AGGCTATTCGGCTATGACTGG-3′，反向引物为：5′-GCGGTCCGCCACACCCAGCCG-3′，引物由上海生工生物技术有限公司合成。PCR扩增程序为：95℃预变性3分钟；94℃变性30秒，
55℃复性30秒，72℃延伸1分钟，30个循环；最后，72℃延伸5分钟。经PCR检测，共获得阳性植株46株，转化效率约为3.8％。

[0062] 8.目的基因表达的转基因植株的获得

[0063] 对移栽成活PCR检测呈阳性的植株，刈割再生后3d，开始用添加3g/L海盐的1/2Hoagland营养液处理，每隔7d浇灌1次，连续处理3周后对照株全部枯死，共获得耐盐转基因植株8株，成活率17.4％。

[0064] 实施例2：

[0065] 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株为LBA4404。重组植物表达质粒pBGO(佘建明，张保龙，梁流芳，等.草地早熟禾转葡萄糖氧化酶基因植株的获得[J].江苏农业学报，2006，22(3)：217-221.)结构为：RB-Nos.P-Npt II-Nos.T-35SP-Ω-GO-Nos.T-LB。转化体为苏丹草2098。具体转化过程如下：

[0066] 1.幼穗离体培养诱导颗粒状愈伤组织(同实施例1)

[0067] 2.农杆菌感染和共培养

[0068] 将携带pBGO质粒的农杆菌LBA4404菌液1mL从-70℃的冰箱中取出后，接种到5mLYEB液体培养基中，26℃、200rpm振荡培养24h进行活化，再取活化液1mL接种到50mL YEB液体培养基中，继续振荡培养6h至OD600约0.6，用无菌蒸馏水将菌液稀释至OD600约为
0.3，加入终浓度为100μM的乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)，继续振荡培养2h。将淡黄色颗粒状愈伤组织在农杆菌菌液中浸泡2min，用无菌水冲洗3～5次，无菌滤纸吸去多余菌液后接种于愈伤组织继代培养基SI上培养20～24h。

[0069] 3.适宜抗生素的确定

[0070] 选用500mg/L的羧苄青霉素为抗生素。

[0071] 4.卡那霉素抗性愈伤组织的筛选

[0072] 经农杆菌感染和共培养的淡黄色颗粒状愈伤组织，当观察到愈伤组织周围培养基上出现农杆菌菌落时，用筛选培养基(愈伤组织诱导培养基+500mg/L羧苄青霉素+15mg/L卡那霉素)对愈伤组织进行筛选。每次转化的淡黄色颗粒状愈伤组织60小块，共转化6次。

[0073] 5.卡那霉素抗性愈伤组织的分化

[0074] 将经卡那霉素抗性筛选的淡黄色颗粒状愈伤组织，转入含500mg/L羧苄青霉素的分化培养基中，26℃～28℃，每天光照16h，在散射光下培养。15～20d时有绿色小芽出现，30d时有部分绿芽长成具有3片叶的完整植株。把绿芽转入含500mg/L羧苄青霉素的分化培养基中，具有3片叶的完整绿苗转入壮根培养基，重复3-5次。

[0075] 6.抗性苗的壮苗、生根培养

[0076] 把具有3片以上叶的幼苗，转入壮苗、生根培养基(SR)：MS基本培养基CPPU2.00mg/L+NAA 0.01mg/L+250mg/L羧苄青霉素，26℃～28℃，每天光照16h，在散射光下培养20～30d至幼苗高度达到5cm以上。6次转化共获得再生植株25株。

[0077] 7.抗性苗的移栽及分子检测

[0078] 去掉封口的棉花塞，加自来水，以水面略高于培养基为宜，冬季在18～25℃的智能温室炼苗1d后，用自来水冲洗干净再生植株根部所带的培养基，移栽至装有大田土壤的塑料盆中株再生植株共移栽成活24株。

[0079] 取移栽成活、综合农艺性状优良的植株幼嫩叶片，提取DNA后，根据GO基因设计的扩增引物序列：正向引物为5′-上链GTCTTTGGAAATGAGGGCTGGAA-3′，反向引物为5′-CTCCAGGATG GACTTCATTCCGATA-3′。PCR扩增程序为：94℃ 30S，58℃ 50S，72℃ 80S，
35个循环。经PCR检测，共获得阳性植株8株。

[0080] 8.目的基因表达的转基因植株的获得

[0081] 对移栽成活经PCR检测呈阳性的植株，刈割再生后1周左右，进行过氧化氢检测，具体步骤为：取幼嫩叶片切成约1cm长的片段，平铺在经过高压灭菌的淀粉-碘化钾(2.5％淀粉、100mmol/L KI、1％琼脂糖、1％葡萄糖)上，观察叶片片段切口处的颜色变化。8株PCR检测阳性植株叶片切口处显现深蓝色，对照试管再生植株的叶片片段在淀粉-碘化钾上呈黄褐色。

[0082] 对苏丹草叶斑病大田调查结果表明，对照苏丹草2098病斑占叶片总面积70～80％，抗病级别为8级；8株PCR检测阳性植株，其中1株病斑占叶片总面积为20～30％，抗病性为5级；3株病斑占叶片总面积30～50％，抗病级别为6级；3株病斑占叶片总面积
50～70％，抗病级别为7级；1株病斑占叶片总面积70～80％，抗病级别为8级。4株抗病性为5～6级的PCR检测阳性植株，过氧化氢检测叶片切口处显现蓝色。

[0083] 经农杆菌介导基因转化方法，获得了叶斑病抗性比对照提高2～3级的转GO基因新种质。

[0084] 序列表

[0085] <110>江苏省农业科学院

[0086] <120>一种农杆菌介导基因转化苏丹草的方法

[0087] <130>说明书

[0088] <140>00

[0089] <141>2008-04-12

[0090] <160>4

[0091] <170>PatentIn version 3.1

[0092] <210>1

[0093] <211>21

[0094] <212>DNA

[0095] <213>人工合成

[0096] <220>

[0097] <221>NPTII基因扩增引物正向引物

[0098] <222>(1)..(21)

[0099] <223>

[0100] <400>1

[0101] aggctattcg gctatgactg g 21

[0102] <210>2

[0103] <211>21

[0104] <212>DNA

[0105] <213>人工合成

[0106] <220>

[0107] <221>NPTII基因扩增引物反向引物

[0108] <222>(1)..(21)

[0109] <223>

[0110] <400>2

[0111] gcggtccgcc acacccagcc g 21

[0112] <210>3

[0113] <211>23

[0114] <212>DNA

[0115] <213>人工合成

[0116] <220>

[0117] <221>GO基因扩增引物正向引物

[0118] <222>(1)..(23)

[0119] <223>

[0120] <400>3

[0121] gtctttggaa atgagggctg gaa 23

[0122] <210>4

[0123] <211>25

[0124] <212>DNA

[0125] <213>人工合成

[0126] <220>

[0127] <221>GO基因扩增引物反向引物

[0128] <222>(1)..(25)

[0129] <223>

[0130] <400>4

[0131] ctccaggatg gacttcattc cgata 25