一种木糖异构酶及其编码基因与应用转让专利
申请号 : CN200810138563.1
文献号 : CN101323858B
文献日 : 2010-06-02
发明人 : 鲍晓明 , 沈煜
申请人 : 河南天冠企业集团有限公司 , 山东大学
摘要 :
本发明涉及一种木糖异构酶及其编码基因与应用，属酶基因工程技术领域。一种编码木糖异构酶的DNA序列，它是在纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)157-2中的木糖异构酶基因xylA(Genebank EU643621)的部分位点突变获得。以及该DNA序列所编码的酶及在化工、食品、医药领域的应用。本木糖异构酶比传统木糖异构酶在酿酒酵母中的活性提高了2.8倍。
权利要求 :
1.一种分离的木糖异构酶的突变基因，其特征在于，基因序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种由权利要求1所述的突变基因编码的木糖异构酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
3.一种插入上述SEQ ID NO.1所示基因序列的基因载体。
4.一种重组细胞，其特征在于，含有如权利要求3所述的基因载体。
说明书 :
技术领域
本发明涉及一种木糖异构酶及其编码基因与应用，属酶基因工程技术领域。
背景技术
木糖异构酶(D-Xylose Isomerase，XI)在体内催化五碳糖D-木糖转化为D-木酮糖，在体外催化六碳糖D-葡萄糖转化为D-果糖的异构化反应，又称葡萄糖异构酶(GlucoseIsomerase，GI)，广泛存在于细菌、少部分真菌中。
木质纤维素(lignocelluiosic)是地球上最丰富的可再生资源，主要存在于农副产品及林产业的木质废弃物中。其主要成分为：纤维素(cellulose)、半纤维素(hemicellulose)及木质素(lignin)。纤维素是由葡萄糖残基经β-1，4糖苷键连接成的不分支结晶状多聚体；半纤维素是包括木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖等多种五碳糖为主的非结晶异质多聚体，其中木糖含量在不同原料中占6％-28％，仅次于葡萄糖含量。可逆的木糖异构化反应把木糖异构化成木酮糖，木酮糖进入三羧酸循环，发酵生产乙醇。此外，葡萄糖异构化反应是工业上大规模以淀粉制备高果糖浆(high fructose corn syrup，HFCS)的关键反应。
多种来源的木糖异构酶基因被克隆表达，如Escherichia coli， Bacillus subtilis，Thermotoga species，Streptomyces species，Actinoplanes missouriensis，Thermus species和Arthrobacter species等等。但迄今为止只有少数几种且多为嗜热细菌的木糖异构酶基因在乙醇生产传统菌株——酿酒酵母(Saccharomyces cevisiae)中得到活性表达，而且，在30℃左右的乙醇发酵温度下普遍由于活性太低而成为木糖代谢途径的限速步骤，因此新型木糖异构酶的开发和酶分子改造十分必要。
中温型细菌纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)，是粘细菌中唯一能降解纤维素的菌种，在土壤中广泛分布。S.cellulosum能够在隐含有结晶纤维素(如滤纸)或木聚糖的简单无机盐平板上生长并能有效地降解大分子底物。前期工作中，我们克隆了S.cellulosum的木糖异构酶基因xylA，其在酿酒酵母中能够表现出活性，但比酶活不够高，因而有必要进行进一步的改造。
木质纤维素(lignocelluiosic)是地球上最丰富的可再生资源，主要存在于农副产品及林产业的木质废弃物中。其主要成分为：纤维素(cellulose)、半纤维素(hemicellulose)及木质素(lignin)。纤维素是由葡萄糖残基经β-1，4糖苷键连接成的不分支结晶状多聚体；半纤维素是包括木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖等多种五碳糖为主的非结晶异质多聚体，其中木糖含量在不同原料中占6％-28％，仅次于葡萄糖含量。可逆的木糖异构化反应把木糖异构化成木酮糖，木酮糖进入三羧酸循环，发酵生产乙醇。此外，葡萄糖异构化反应是工业上大规模以淀粉制备高果糖浆(high fructose corn syrup，HFCS)的关键反应。
多种来源的木糖异构酶基因被克隆表达，如Escherichia coli， Bacillus subtilis，Thermotoga species，Streptomyces species，Actinoplanes missouriensis，Thermus species和Arthrobacter species等等。但迄今为止只有少数几种且多为嗜热细菌的木糖异构酶基因在乙醇生产传统菌株——酿酒酵母(Saccharomyces cevisiae)中得到活性表达，而且，在30℃左右的乙醇发酵温度下普遍由于活性太低而成为木糖代谢途径的限速步骤，因此新型木糖异构酶的开发和酶分子改造十分必要。
中温型细菌纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)，是粘细菌中唯一能降解纤维素的菌种，在土壤中广泛分布。S.cellulosum能够在隐含有结晶纤维素(如滤纸)或木聚糖的简单无机盐平板上生长并能有效地降解大分子底物。前期工作中，我们克隆了S.cellulosum的木糖异构酶基因xylA，其在酿酒酵母中能够表现出活性，但比酶活不够高，因而有必要进行进一步的改造。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种木糖异构酶及其编码基因与应用。
一种编码木糖异构酶的DNA序列，它是在纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)157-2中的木糖异构酶基因xylA(Genebank EU643621)的53位由C突变为T；219位由C突变为A；243位由G突变为A；265位由A突变为G；437位由G突变为T；503位由T突变为A；596位由G突变为A；635位由A突变为T；755位由A突变为G；914位由G突变为T；930位由C突变为T；1006位由G突变为A；1175位由G突变为A；1255位由A突变为G。
一种编码木糖异构酶的DNA序列，基因序列如下：
atgaccgtcg tgattggaaa caaagggtac ttccccggtg tcggcaagat cctctacgag 60
gggcccgagt ccgacaaccc cgtcgccttc aagtggtacg acgagagccg cgtcgtcgcc 120
ggcaagccca tgaaggacca cttcaagttc gccgtgtgtt actggcacac cttctgtggt 180
cgtgggcacg accccttcgg tccggggacg atcaacttac cctgggacga ggggaaggac 240
ccactgaccc gcgctcgcat gaaggcggac gcgaacttcg agttcatcac caagctgggc 300
gcgacgcact actgtttcca cgacatcgac ctggtggagg agggcgacag ccgcgccgag 360
acgtcgcgcc gccttcaggg catcgtcggg tacgccaagc agaagcaagc gcagtcgggc 420
gtcaagctgc tgtgggtcac ggcgaacttg ttctccaacc cgcgctacat gaacggcgcc 480
tccacgaacc cggatttctc cgaggtggcc tacgccggcg cccagctgaa ggacgccctc 540
gacgccacca tcgcgctgaa cggtgagaac tacgtgttct ggggcggccg cgaggattac 600
atgagcctgc tgaacacgga catgaagcgc gagatggagc acttcgcgcg cttcttgacc 660
atggcgcgcg actacgcgcg cgcccggggc ttcaagggga ccttcttcat cgagcccaag 720
ccgatggagc cgtcgaagca ccagtacgac ttcggcgccg agaccgtgat cgggttcctg 780
cgccagcacg gcctggacaa ggacttcaag ctcaacctgg agacgaacca cgcgacgctc 840
gctggccaca ccatggagca cgagatgcag gtggccgcgg acgccggcat gctcggcagc 900
atcgacgcga acctcggcga ctaccagaat gcgtgggaca ccgatcagtt cccctacaac 960
atcaacgaga cggtggagat gatgctcatc ctcctccgca gcggcaggtt ccagggtggc 1020
ggcgtcaact tcgacgcgaa gcgccgccgc aactcgacgg acctgatcga caccttccac 1080
ggccacatcg gcggcatgga cgtgttcgcc cgcgcgctca tcatcgccgg cgacctgatc 1140
cgcaagtcgc cgctcgagtc gatgcgcaag gctcattacg cgtcgttcga cggcggcaag 1200
ggcgcggagt tcgagcaggg gaagctcacg ctggagcagc tggccgagat cggcgacgcc 1260
ggcggcgagg tcaagctcac gagcggtcag caagagctgt acgagaacat cgtcaatcgg 1320
tggatccgg 1329。
一种木糖异构酶，它是在纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)157-2中的木糖异构酶基因xylA编码的多肽(Genebank ACC99633)的突变酶，与突变前比较，有十二个位点的氨基酸残基发生了变化，它包括：18位由P突变为L、73位由F突变为L、89位由T突变为A、146位由G突变为V、168位由V突变为E、199位由G突变为D、212位由K突变为M、252位由D突变为G、305位由R突变为L、336位由G突变为R、392位由R突变为H以及419位由N突变为D。
一种木糖异构酶，氨基酸序列如下：
MTVVIGNKGY FPGVGKILYE GPESDNPVAF KWYDESRVVA GKPMKDHFKF AVCYWHTFCG 60
RGHDPFGPGT INLPWDEGKD PLTRARMKAD ANFEFITKLG ATHYCFHDID LVEEGDSRAE 120
TSRRLQGIVG YAKQKQAQSG VKLLWVTANL FSNPRYMNGA STNPDFSEVA YAGAQLKDAL 180
DATIALNGEN YVFWGGREDY MSLLNTDMKR EMEHFARFLT MARDYARARG FKGTFFIEPK 240
PMEPSKHQYD FGAETVIGFL RQHGLDKDFK LNLETNHATL AGHTMEHEMQ VAADAGMLGS 300
IDANLGDYQN AWDTDQFPYN INETVEMMLI LLRSGRFQGG GVNFDAKRRR NSTDLIDTFH 360
GHIGGMDVFA RALIIAGDLI RKSPLESMRK AHYASFDGGK GAEFEQGKLT LEQLAEIGDA 420
GGEVKLTSGQ QELYENIVNR WIR 443。
本发明还保护含有上述DNA片段的基因载体。
本发明还保护含有上述基因载体的转化细胞。
上述木糖异构酶、DNA序列、基因载体和转化细胞在化工、食品、医药领域的应用。
本发明提供的木糖异构酶基因mxylA是从纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)157-2中克隆得到木糖异构酶基因xylA(Genebank EU643621)，然后通过易错PCR同DNA改组相结合的体外分子定向进化技术引入突变点，筛选获得，具体步骤如下：
i、目的基因的获得：
(1)从纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)157-2中提取总DNA：
收集0.1g菌体，加入0.75mL GTE缓冲液(25％蔗糖，50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L乙二胺四乙酸，pH 8.0)和适量玻璃珠，漩涡振荡，充分混匀菌体。转移菌体至5mL的离心管中，补加0.5mL GTE，漩涡振荡器混匀后加入10％SDS(十二烷基磺酸钠)150μL，20mg/mL的蛋白酶K 15μL，充分混匀，37℃保温1h。期间每隔一定时间颠倒混匀。加0.25mL 5mol/LNaCl，混匀后静置10min，然后加0.25mL CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)/NaCl(10％CTAB/0.7mol/L NaCl)，混匀，65℃保温20min(CTAB事先放入65℃水浴中保温)。等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提两次，轻混30min左右5000g离心10min，上清转移至新管。加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，室温静置10min，10000g离心10min，加入70％乙醇洗涤，室温干燥20min，加入200μL TE，-20℃保存。
(2)根据纤维堆囊菌157-2木糖异构酶基因开放式阅读框(ORF)设计扩增引物：
引物1：5’-ATCGAGATCTATGACCGTCGTGATTGGA-3’
引物2：5’-TTCGGAGCTCTTACCGGATCCACCGATT-3’；
以步骤(1)中获得的总DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃变性2min；94℃变性1min；62℃退火1min；72℃延伸90sec；反应进行30个循环，最后一个循环延伸时间为5min。PCR反应体系中，dATP浓度为0.2mmol/L，dGTP浓度为0.2mmol/L，dTTP浓度为1mmol/L，dCTP浓度为1mmol/L，MgCl2浓度为7mmol/L，MnCl2为浓度0.3mmol/L。经回收纯化后，用终浓度为0.01U/μL的DNAaesI处理总量约5μg的DNA，15℃处理4-5min后立即置于80℃下灭活10min，得DNA小片段。
(3)将步骤(2)获得的DNA小片段在2wt％的琼脂糖凝胶中电泳，回收100-200bp之间的DNA片段，并放入没有引物的PCR体系中，进行DNA片段重组反应。
(4)以步骤(3)获得的重组反应产物为模板，以步骤(2)提供的引物1，引物2为引物，进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃变性2min；94℃变性1min；62℃退火1min；72℃延伸90sec；反应进行30个循环，最后一个循环延伸时间为5min。获得的PCR产物电泳后回收1.4kb附近的条带，得目的基因。
ii、目的基因的表达：
(1)将目的基因的提取步骤中获得的目的基因以BglII、SacI酶切，采取定向连接技术与经过BglII、SacI酶酶切处理的质粒载体pYPX251(GenBank AY178046)定向连接，构建木糖异构酶基因突变文库；
(2)将步骤(1)获得的木糖异构酶基因突变文库转化大肠杆菌HB101(ATCC 33694)；并涂布在以木糖为唯一碳源的加有50mg/L氨苄素的M9平板上，经过20～40小时的培养，平板上出现单菌落；依据菌落大小进行初筛，选择菌落较大菌落；所述的固体M9培养基具体配方为：NH4Cl 5g/L，Na2HPO4 30g/L，KH2PO4 15g/L，NaCl 2.5g/L，MgSO4. 7H2O 0.25g/L，木糖20g/L，琼脂15g/L。
(3)从步骤(2)筛选到的较大菌落中，通过如下方式进行酶液的提取，37℃下在LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.0)中培养较大菌落10～12小时至对数期，8000转离心5min收集菌体，用0.9％NaCl洗涤两次，然后溶于新配制的裂解缓冲液(1mM PMSF，50mmol/L Tris-HCl，pH7.0)，加入适量玻璃珠(直径0.5mm)，在细胞破碎仪最大速度下处理30～50s，冰浴5min，破碎重复3～5次，10000g离心10min，收集上清，即为酶液。
对上述酶液的酶活进行测定：
700mmol/L D-木糖，0.01-0.025U木糖异构酶，含10mmol/L MnCl2的50mmol/L Tris-HClpH7.0缓冲液中，分别在45℃反应20min，加入150μL 50％三氯乙酸终止反应和185μL 2MNa2CO3中和反应缓冲液。取0.5mL加入0.04U SDH(山梨醇脱氢酶，sigma公司)和0.15mM NADH(还原型烟胺酸腺嘌呤二核苷酸)，立即混匀，在340nm下检测NADH被氧化的量(即在340nm做时间扫描)。根据标准曲线求得木酮糖量。木糖异构酶(XI)的一个比活力单位(U/mg)定义为：每mg酶蛋白每分钟转化底物的μmol/L数。
通过酶活测定进行复筛获得一株突变体，提取其质粒，对xylA部分测序，测序的结果是SEQ NO.1所示的序列(mxylA)，编码SEQ NO.2所示的多肽，即得木糖异构酶。
本发明提供的木糖异构酶基因mxylA是从纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)157-2中克隆得到木糖异构酶基因xylA(Genebank EU643621)，然后通过易错PCR同DNA改组相结合的体外分子定向进化技术引入突变点，筛选获得。其具有SEQ NO.1所示的核苷酸序列，ORF长为1329bp，编码443个氨基酸的蛋白(SEQ NO.2)。与Genebank EU643621比较，它包括：53位C→T；219位C→A；243位G→A；265位A→G；437位G→T；503位T→A；596位G→A；635位A→T；755位A→G；914位G→T；930位C→T；1006位G→A；1175位G→A；1255位A→G。本发明涉及的DNA序列，除了SEQ NO.1所示的核苷酸序列以外还应当包括：与SEQ NO.1互补的序列、因密码子的简并性引起的能够编码本发明涉及的突变的木糖异构酶(SEQ NO.2)的其他DNA序列以及以上各个位置的点突变的各种组合。
本发明提供新的多肽，其含有上述核苷酸序列所编码的氨基酸序列，即含有SEQ NO.2所示的序列，编码蛋白为突变的纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)木糖异构酶(S1)。此多肽与基因xylA编码的多肽(Genebank ACC99633)比较，有十二个位点的氨基酸残基发生了变化，它包括：P18-L、F73-L、T89-A、G146-V、V168-E、G199-D、K212-M、D252-G、R305-L、G336-R、R392-H以及N419-D。本发明涉及的多肽序列也包括以上各个位置的点突变的各种组合。
本发明所述木糖异构酶比传统木糖异构酶的优点如下：一种中温的可以在酿酒酵母中表达出活性的木糖异构酶，在酿酒酵母可耐受的生长温度条件下仍能够表现出较高的活性，并且，经过本发明涉及的突变，其在酿酒酵母中的活性比突变前提高了2.8倍。
一种编码木糖异构酶的DNA序列，它是在纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)157-2中的木糖异构酶基因xylA(Genebank EU643621)的53位由C突变为T；219位由C突变为A；243位由G突变为A；265位由A突变为G；437位由G突变为T；503位由T突变为A；596位由G突变为A；635位由A突变为T；755位由A突变为G；914位由G突变为T；930位由C突变为T；1006位由G突变为A；1175位由G突变为A；1255位由A突变为G。
一种编码木糖异构酶的DNA序列，基因序列如下：
atgaccgtcg tgattggaaa caaagggtac ttccccggtg tcggcaagat cctctacgag 60
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一种木糖异构酶，它是在纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)157-2中的木糖异构酶基因xylA编码的多肽(Genebank ACC99633)的突变酶，与突变前比较，有十二个位点的氨基酸残基发生了变化，它包括：18位由P突变为L、73位由F突变为L、89位由T突变为A、146位由G突变为V、168位由V突变为E、199位由G突变为D、212位由K突变为M、252位由D突变为G、305位由R突变为L、336位由G突变为R、392位由R突变为H以及419位由N突变为D。
一种木糖异构酶，氨基酸序列如下：
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RGHDPFGPGT INLPWDEGKD PLTRARMKAD ANFEFITKLG ATHYCFHDID LVEEGDSRAE 120
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IDANLGDYQN AWDTDQFPYN INETVEMMLI LLRSGRFQGG GVNFDAKRRR NSTDLIDTFH 360
GHIGGMDVFA RALIIAGDLI RKSPLESMRK AHYASFDGGK GAEFEQGKLT LEQLAEIGDA 420
GGEVKLTSGQ QELYENIVNR WIR 443。
本发明还保护含有上述DNA片段的基因载体。
本发明还保护含有上述基因载体的转化细胞。
上述木糖异构酶、DNA序列、基因载体和转化细胞在化工、食品、医药领域的应用。
本发明提供的木糖异构酶基因mxylA是从纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)157-2中克隆得到木糖异构酶基因xylA(Genebank EU643621)，然后通过易错PCR同DNA改组相结合的体外分子定向进化技术引入突变点，筛选获得，具体步骤如下：
i、目的基因的获得：
(1)从纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)157-2中提取总DNA：
收集0.1g菌体，加入0.75mL GTE缓冲液(25％蔗糖，50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L乙二胺四乙酸，pH 8.0)和适量玻璃珠，漩涡振荡，充分混匀菌体。转移菌体至5mL的离心管中，补加0.5mL GTE，漩涡振荡器混匀后加入10％SDS(十二烷基磺酸钠)150μL，20mg/mL的蛋白酶K 15μL，充分混匀，37℃保温1h。期间每隔一定时间颠倒混匀。加0.25mL 5mol/LNaCl，混匀后静置10min，然后加0.25mL CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)/NaCl(10％CTAB/0.7mol/L NaCl)，混匀，65℃保温20min(CTAB事先放入65℃水浴中保温)。等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提两次，轻混30min左右5000g离心10min，上清转移至新管。加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，室温静置10min，10000g离心10min，加入70％乙醇洗涤，室温干燥20min，加入200μL TE，-20℃保存。
(2)根据纤维堆囊菌157-2木糖异构酶基因开放式阅读框(ORF)设计扩增引物：
引物1：5’-ATCGAGATCTATGACCGTCGTGATTGGA-3’
引物2：5’-TTCGGAGCTCTTACCGGATCCACCGATT-3’；
以步骤(1)中获得的总DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃变性2min；94℃变性1min；62℃退火1min；72℃延伸90sec；反应进行30个循环，最后一个循环延伸时间为5min。PCR反应体系中，dATP浓度为0.2mmol/L，dGTP浓度为0.2mmol/L，dTTP浓度为1mmol/L，dCTP浓度为1mmol/L，MgCl2浓度为7mmol/L，MnCl2为浓度0.3mmol/L。经回收纯化后，用终浓度为0.01U/μL的DNAaesI处理总量约5μg的DNA，15℃处理4-5min后立即置于80℃下灭活10min，得DNA小片段。
(3)将步骤(2)获得的DNA小片段在2wt％的琼脂糖凝胶中电泳，回收100-200bp之间的DNA片段，并放入没有引物的PCR体系中，进行DNA片段重组反应。
(4)以步骤(3)获得的重组反应产物为模板，以步骤(2)提供的引物1，引物2为引物，进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃变性2min；94℃变性1min；62℃退火1min；72℃延伸90sec；反应进行30个循环，最后一个循环延伸时间为5min。获得的PCR产物电泳后回收1.4kb附近的条带，得目的基因。
ii、目的基因的表达：
(1)将目的基因的提取步骤中获得的目的基因以BglII、SacI酶切，采取定向连接技术与经过BglII、SacI酶酶切处理的质粒载体pYPX251(GenBank AY178046)定向连接，构建木糖异构酶基因突变文库；
(2)将步骤(1)获得的木糖异构酶基因突变文库转化大肠杆菌HB101(ATCC 33694)；并涂布在以木糖为唯一碳源的加有50mg/L氨苄素的M9平板上，经过20～40小时的培养，平板上出现单菌落；依据菌落大小进行初筛，选择菌落较大菌落；所述的固体M9培养基具体配方为：NH4Cl 5g/L，Na2HPO4 30g/L，KH2PO4 15g/L，NaCl 2.5g/L，MgSO4. 7H2O 0.25g/L，木糖20g/L，琼脂15g/L。
(3)从步骤(2)筛选到的较大菌落中，通过如下方式进行酶液的提取，37℃下在LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.0)中培养较大菌落10～12小时至对数期，8000转离心5min收集菌体，用0.9％NaCl洗涤两次，然后溶于新配制的裂解缓冲液(1mM PMSF，50mmol/L Tris-HCl，pH7.0)，加入适量玻璃珠(直径0.5mm)，在细胞破碎仪最大速度下处理30～50s，冰浴5min，破碎重复3～5次，10000g离心10min，收集上清，即为酶液。
对上述酶液的酶活进行测定：
700mmol/L D-木糖，0.01-0.025U木糖异构酶，含10mmol/L MnCl2的50mmol/L Tris-HClpH7.0缓冲液中，分别在45℃反应20min，加入150μL 50％三氯乙酸终止反应和185μL 2MNa2CO3中和反应缓冲液。取0.5mL加入0.04U SDH(山梨醇脱氢酶，sigma公司)和0.15mM NADH(还原型烟胺酸腺嘌呤二核苷酸)，立即混匀，在340nm下检测NADH被氧化的量(即在340nm做时间扫描)。根据标准曲线求得木酮糖量。木糖异构酶(XI)的一个比活力单位(U/mg)定义为：每mg酶蛋白每分钟转化底物的μmol/L数。
通过酶活测定进行复筛获得一株突变体，提取其质粒，对xylA部分测序，测序的结果是SEQ NO.1所示的序列(mxylA)，编码SEQ NO.2所示的多肽，即得木糖异构酶。
本发明提供的木糖异构酶基因mxylA是从纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)157-2中克隆得到木糖异构酶基因xylA(Genebank EU643621)，然后通过易错PCR同DNA改组相结合的体外分子定向进化技术引入突变点，筛选获得。其具有SEQ NO.1所示的核苷酸序列，ORF长为1329bp，编码443个氨基酸的蛋白(SEQ NO.2)。与Genebank EU643621比较，它包括：53位C→T；219位C→A；243位G→A；265位A→G；437位G→T；503位T→A；596位G→A；635位A→T；755位A→G；914位G→T；930位C→T；1006位G→A；1175位G→A；1255位A→G。本发明涉及的DNA序列，除了SEQ NO.1所示的核苷酸序列以外还应当包括：与SEQ NO.1互补的序列、因密码子的简并性引起的能够编码本发明涉及的突变的木糖异构酶(SEQ NO.2)的其他DNA序列以及以上各个位置的点突变的各种组合。
本发明提供新的多肽，其含有上述核苷酸序列所编码的氨基酸序列，即含有SEQ NO.2所示的序列，编码蛋白为突变的纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)木糖异构酶(S1)。此多肽与基因xylA编码的多肽(Genebank ACC99633)比较，有十二个位点的氨基酸残基发生了变化，它包括：P18-L、F73-L、T89-A、G146-V、V168-E、G199-D、K212-M、D252-G、R305-L、G336-R、R392-H以及N419-D。本发明涉及的多肽序列也包括以上各个位置的点突变的各种组合。
本发明所述木糖异构酶比传统木糖异构酶的优点如下：一种中温的可以在酿酒酵母中表达出活性的木糖异构酶，在酿酒酵母可耐受的生长温度条件下仍能够表现出较高的活性，并且，经过本发明涉及的突变，其在酿酒酵母中的活性比突变前提高了2.8倍。
附图说明
图1本发明所述木糖异构酶基因突变文库的构建流程图；
图2本发明所述木糖异构酶的最适pH；图3重组载体pHX-S1/pHX-SXI的构建图。
图2本发明所述木糖异构酶的最适pH；图3重组载体pHX-S1/pHX-SXI的构建图。
具体实施方式
实施例1
本发明提供的木糖异构酶基因mxylA是从纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)157-2中克隆得到木糖异构酶基因xylA(Genebank EU643621)，然后通过易错PCR同DNA改组相结合的体外分子定向进化技术引入突变点，筛选获得，具体步骤如下：
(1)从纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)157-2中提取总DNA：
收集0.1g菌体，加入0.75mL GTE缓冲液(25％蔗糖，50mmol/L Tris-Cl，100mmol/LEDTA，PH 8.0)和适量玻璃珠，漩涡振荡，充分混匀菌体。转移菌体至5mL的离心管中，补加0.5mL GTE，漩涡振荡器混匀后加入10％SDS 150μL，20mg/mL的蛋白酶K 15μL，充分混匀，37℃保温1h。期间每隔一定时间颠倒混匀。加0.25mL 5mol/L NaCl，混匀后静置10min，然后加0.25mL CTAB/NaCl(10％CTAB/0.7mol/L NaCl)，混匀，65℃保温20min(CTAB事先放入65℃水浴中保温)。等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提两次，轻混30min左右5000g离心10min，上清转移至新管。加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，室温静置10min，10000g离心10min，加入70％乙醇洗涤，室温干燥20min，加入200μL TE，-20℃保存。
(2)根据纤维堆囊菌157-2木糖异构酶基因ORF设计扩增引物：
引物1：5’-ATCGAGATCTATGACCGTCGTGATTGGA-3’
引物2：5’-TTCGGAGCTCTTACCGGATCCACCGATT-3’。
(3)利用步骤(2)中提供的引物1，引物2和Taq DNA合成酶，以步骤(1)中获得的纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)总DNA为模板，在含有0.2mmol/L的dATP，0.2mmol/L的dGTP，1mmol/L的dTTP，1mmol/L的dCTP，7mmol/L的MgCl2，0.3 mmol/L的MnCl2，其他均为正常条件的PCR反应体系下进行PCR扩增。
(4)将多个独立的步骤(3)中反应体系获得的PCR产物分别回收纯化，然后等量混匀，用终浓度为0.01U/μL的DNAaesI处理总量约5μg的DNA，15℃处理4m30s后立即置于80℃下灭活10min。
(5)将步骤(4)获得的DNA小片段在2％的琼脂糖凝胶中电泳，回收100-200bp之间小片段，在没有引物的体系中以溶解的DNA小片段为模板进行类似PCR样的DNA片段重组反应。
(6)以步骤(5)获得的重组反应产物为模板，以步骤(2)提供的引物1，引物2为引物，进行PCR扩增。
(7)步骤(6)获得的PCR产物电泳后回收1.4kb附近的条带。
(8)将步骤(7)获得的片段以BglII、SacI酶切，采取定向连接策略与同样酶切处理的质粒载体pYPX251(GenBank AY178046)定向连接，构建木糖异构酶基因突变文库(图1)。
(9)步骤(7)获得的木糖异构酶基因突变文库转化大肠杆菌HB101(ATCC 33694)，大肠杆菌HB101遗传特性为supE44，hsdS20(rB- mB-)，recA13，ara-14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1。
(10)步骤(9)转化后的菌液涂布在以木糖为唯一碳源的加有50mg/L氨苄素的M9平板上，经过20～40小时的培养，平板上出现单菌落。依据菌落大小进行初筛，选择菌落较大的进行下一轮复筛。所用到的固体M9培养基具体配方为：NH4Cl 5g/L，Na2HPO4 30g/L，KH2PO4 15g/L，NaCl 2.5g/L，MgSO4.7H2O 0.25g/L，木糖20g/L，琼脂15g/L。
(11)从步骤(10)筛选突变体，37℃下在LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.0)中培养重组菌10～12小时至对数期，8000转离心5min收集菌体，用0.9％NaCl洗涤两次，然后溶于新配制的裂解缓冲液(1mM PMSF，50mmol/L Tris-Cl，pH7.0)，加入适量玻璃珠(直径0.5mm)，在细胞破碎仪最大速度下处理30～50s，冰浴5min。破碎重复3～5次。10000g离心10min，收集上清，即为粗酶液；
采用XI-SDH方法测定酶活力，步骤如下：
将700mmol/L D-木糖，0.01-0.025U木糖异构酶，含10mmol/L MnCl2的50mmol/LTris-HCl pH7.0缓冲液中，分别在45℃反应20min，加入150μL 50％三氯乙酸终止反应和185μL 2M Na2CO3中和反应缓冲液。取0.5mL加入0.04U SDH(sigma)和0.15mM NADH，立即混匀，在340nm下检测NADH被氧化的量(即在340nm做时间扫描)。根据标准曲线求得木酮糖量。木糖异构酶(XT)的一个比活力单位(U/mg)定义为：每mg酶蛋白每分钟转化底物的μmol/L数。
通过酶活测定进行复筛获得一株突变体，提取其质粒，对xylA部分测序，测序的结果是SEQ NO.1所示的序列(mxylA)，编码SEQ NO.2所示的多肽，该多肽为木糖异构酶的进化酶，命名为S1，带有S1编码基因的相应重组载体为pYPX251-S1，含有重组载体的重组菌株为HBl01-S1。
实施例2
进化酶S1的酶活测定：
(1)以纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)157-2的总DNA为模板，利用引物l和引物2扩增野生型木糖异构酶基因xylA，以BglII、SacI酶切，采取定向连接策略与同样酶切处理的质粒载体pYPX251(GenBank AYl78046)定向连接，获得重组质粒pYPX25l-SXI。
(2)步骤(1)中的重组质粒转化大肠杆菌HBl01，获得重组菌株HBl01-SXI。
(3)按照实施例l中步骤(11)中描述的酶活测定方式，在不同温度下测定不同菌株来源的粗酶液中含有的木糖异构酶的比活力见表l。
表1在不同温度下不同菌株中的木糖异构酶比活力
(4)按照实施例1中步骤(11)中描述的酶活测定方式，调整测定缓冲液的pH分别
在pH等于5、6、7、8、9和10的条件下测定进化酶S1的最适pH为7.0(附图2)。实施例3突变木糖异构酶基因在酿酒酵母中的活性表达
(1)根据酿酒酵母基因组数据库中HXT7基因上游-375bp--1bp序列设计引物：
引物3：5’GATCCCCGGGCGGGCCCCTGCGTG-3’
引物4：5’TTGCGGTACCTTTTTGATTAAAATTAAAAAAAC-3’
以酿酒酵母染色体为模板，PCR扩增HXT7启动子(HXT7p)片段，并用SmaI和KpnI双酶切PCR产物。
(2)根据SEQ NO.1所示的核苷酸序列设计引物：
引物5：5’AGCTGGTACCATGACCGTCGTGATTGGAAAC-3’
引物6：5’-TTGCAGATCTTTACCGGATCCACCGATTGAC-3’
以pYPX251-S1为模板，PCR扩增mxylA，并用KpnI和BglII双酶切PCR产物。
(3)根据SEQ NO.1所示的核苷酸序列设计引物：
引物5：5’AGCTGGTACCATGACCGTCGTGATTGGAAAC-3’
引物6：5’-TTGCAGATCTTTACCGGATCCACCGATTGAC-3’
以纤维堆囊菌染色体为模板，PCR扩增xylA，并用KpnI和BglII双酶切PCR产物。
(4)根据酿酒酵母基因组数据库中PGK1基因下游1bp-279bp序列设计引物：
引物7：5’-GCTAGATCTTAACGAACGCAGAATTTTCG-3’
引物8：5’-TTGAAGCTTTAAATTGAATTGAATTGAAAT-3’
以酿酒酵母染色体为模板，PCR扩增PGK1终止子(PGK1t)，用HindIII和BglII双酶切PCR产物。
(5)将步骤(1)，(2)，(4)中获得的产物等量连接混合物作为模板，用引物3和引物8扩增，回收2000bp处的片段，用HindIII和SmaI双酶切。
(6)质粒YEp24用HindIII和SmaI双酶切，并和步骤(5)获得的产物连接，转化大肠杆菌，经在大肠杆菌中扩增后的重组载体验证正确后命名为pHX-S1。
(7)步骤(6)获得的重组载体pHX-SXI转化酿酒酵母H158，重组菌株命名为H158-S1。
(8)将步骤(1)，(3)，(4)中获得的产物等量连接混合物作为模板，用引物3和引物8扩增，回收2000bp处的片段，用HindIII和SmaI双酶切。
(9)质粒YEp24用HindIII和SmaI双酶切，并和步骤(8)获得的产物连接，转化大肠杆菌，经在大肠杆菌中扩增后的重组载体验证正确后命名为pHX-SXI。
(10)步骤(9)获得的重组载体pHX-SXI转化酿酒酵母H158，重组菌株命名为H158-SXI。
(11)按照实施例1中步骤(11)所使用的方法制备H158-SXI和H158-S1的粗酶液并测定XI酶活，两种XI在酿酒酵母中都有活性表达，H158-SXI中的XI酶活为0.11，H158-S1中的XI的酶活为0.039，经过改造的进化酶S1的活性是野生型SXI的2.8倍。
序列表
<110>山东大学
<120>一种木糖异构酶及其编码基因与应用
<160>2
<170>PatentIn Version 3.3
<210>1
<211>1329
<212>DNA
<213>纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)
<400>1
atgaccgtcg tgattggaaa caaagggtac ttccccggtg tcggcaagat cctctacgag 60
gggcccgagt ccgacaaccc cgtcgccttc aagtggtacg acgagagccg cgtcgtcgcc 120
ggcaagccca tgaaggacca cttcaagttc gccgtgtgtt actggcacac cttctgtggt 180
cgtgggcacg accccttcgg tccggggacg atcaacttac cctgggacga ggggaaggac 240
ccactgaccc gcgctcgcat gaaggcggac gcgaacttcg agttcatcac caagctgggc 300
gcgacgcact actgtttcca cgacatcgac ctggtggagg agggcgacag ccgcgccgag 360
acgtcgcgcc gccttcaggg catcgtcggg tacgccaagc agaagcaagc gcagtcgggc 420
gtcaagctgc tgtgggtcac ggcgaacttg ttctccaacc cgcgctacat gaacggcgcc 480
tccacgaacc cggatttctc cgaggtggcc tacgccggcg cccagctgaa ggacgccctc 540
gacgccacca tcgcgctgaa cggtgagaac tacgtgttct ggggcggccg cgaggattac 600
atgagcctgc tgaacacgga catgaagcgc gagatggagc acttcgcgcg cttcttgacc 660
atggcgcgcg actacgcgcg cgcccggggc ttcaagggga ccttcttcat cgagcccaag 720
ccgatggagc cgtcgaagca ccagtacgac ttcggcgccg agaccgtgat cgggttcctg 780
cgccagcacg gcctggacaa ggacttcaag ctcaacctgg agacgaacca cgcgacgctc 840
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atcgacgcga acctcggcga ctaccagaat gcgtgggaca ccgatcagtt cccctacaac 960
atcaacgaga cggtggagat gatgctcatc ctcctccgca gcggcaggtt ccagggtggc 1020
ggcgtcaact tcgacgcgaa gcgccgccgc aactcgacgg acctgatcga caccttccac 1080
ggccacatcg gcggcatgga cgtgttcgcc cgcgcgctca tcatcgccgg cgacctgatc 1140
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<210>2
<211>443
<212>PRT
<213>纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)
<400>2
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TSRRLQGIVG YAKQKQAQSG VKLLWVTANL FSNPRYMNGA STNPDFSEVA YAGAQLKDAL 180
DATIALNGEN YVFWGGREDY MSLLNTDMKR EMEHFARFLT MARDYARARG FKGTFFIEPK 240
PMEPSKHQYD FGAETVIGFL RQHGLDKDFK LNLETNHATL AGHTMEHEMQ VAADAGMLGS 300
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GGEVKLTSGQ QELYENIVNR WIR 443
<210>3
<211>28
<212>DNA
<213>人工合成
<400>3
ATCGAGATCT ATGACCGTCG TGATTGGA 28
<210>4
<211>28
<212>DNA
<213>人工合成
<400>4
TTCGGAGCTC TTACCGGATC CACCGATT 28
<210>5
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<213>人工合成
<400>5
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<210>6
<211>33
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<213>人工合成
<400>6
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<210>7
<211>31
<212>DNA
<213>人工合成
<400>7
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<210>8
<211>31
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<210>9
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<212>DNA
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<400>9
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<210>10
<211>30
<212>DNA
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<400>10
TTGAAGCTTT AAATTGAATT GAATTGAAAT 30
本发明提供的木糖异构酶基因mxylA是从纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)157-2中克隆得到木糖异构酶基因xylA(Genebank EU643621)，然后通过易错PCR同DNA改组相结合的体外分子定向进化技术引入突变点，筛选获得，具体步骤如下：
(1)从纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)157-2中提取总DNA：
收集0.1g菌体，加入0.75mL GTE缓冲液(25％蔗糖，50mmol/L Tris-Cl，100mmol/LEDTA，PH 8.0)和适量玻璃珠，漩涡振荡，充分混匀菌体。转移菌体至5mL的离心管中，补加0.5mL GTE，漩涡振荡器混匀后加入10％SDS 150μL，20mg/mL的蛋白酶K 15μL，充分混匀，37℃保温1h。期间每隔一定时间颠倒混匀。加0.25mL 5mol/L NaCl，混匀后静置10min，然后加0.25mL CTAB/NaCl(10％CTAB/0.7mol/L NaCl)，混匀，65℃保温20min(CTAB事先放入65℃水浴中保温)。等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提两次，轻混30min左右5000g离心10min，上清转移至新管。加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，室温静置10min，10000g离心10min，加入70％乙醇洗涤，室温干燥20min，加入200μL TE，-20℃保存。
(2)根据纤维堆囊菌157-2木糖异构酶基因ORF设计扩增引物：
引物1：5’-ATCGAGATCTATGACCGTCGTGATTGGA-3’
引物2：5’-TTCGGAGCTCTTACCGGATCCACCGATT-3’。
(3)利用步骤(2)中提供的引物1，引物2和Taq DNA合成酶，以步骤(1)中获得的纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)总DNA为模板，在含有0.2mmol/L的dATP，0.2mmol/L的dGTP，1mmol/L的dTTP，1mmol/L的dCTP，7mmol/L的MgCl2，0.3 mmol/L的MnCl2，其他均为正常条件的PCR反应体系下进行PCR扩增。
(4)将多个独立的步骤(3)中反应体系获得的PCR产物分别回收纯化，然后等量混匀，用终浓度为0.01U/μL的DNAaesI处理总量约5μg的DNA，15℃处理4m30s后立即置于80℃下灭活10min。
(5)将步骤(4)获得的DNA小片段在2％的琼脂糖凝胶中电泳，回收100-200bp之间小片段，在没有引物的体系中以溶解的DNA小片段为模板进行类似PCR样的DNA片段重组反应。
(6)以步骤(5)获得的重组反应产物为模板，以步骤(2)提供的引物1，引物2为引物，进行PCR扩增。
(7)步骤(6)获得的PCR产物电泳后回收1.4kb附近的条带。
(8)将步骤(7)获得的片段以BglII、SacI酶切，采取定向连接策略与同样酶切处理的质粒载体pYPX251(GenBank AY178046)定向连接，构建木糖异构酶基因突变文库(图1)。
(9)步骤(7)获得的木糖异构酶基因突变文库转化大肠杆菌HB101(ATCC 33694)，大肠杆菌HB101遗传特性为supE44，hsdS20(rB- mB-)，recA13，ara-14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1。
(10)步骤(9)转化后的菌液涂布在以木糖为唯一碳源的加有50mg/L氨苄素的M9平板上，经过20～40小时的培养，平板上出现单菌落。依据菌落大小进行初筛，选择菌落较大的进行下一轮复筛。所用到的固体M9培养基具体配方为：NH4Cl 5g/L，Na2HPO4 30g/L，KH2PO4 15g/L，NaCl 2.5g/L，MgSO4.7H2O 0.25g/L，木糖20g/L，琼脂15g/L。
(11)从步骤(10)筛选突变体，37℃下在LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.0)中培养重组菌10～12小时至对数期，8000转离心5min收集菌体，用0.9％NaCl洗涤两次，然后溶于新配制的裂解缓冲液(1mM PMSF，50mmol/L Tris-Cl，pH7.0)，加入适量玻璃珠(直径0.5mm)，在细胞破碎仪最大速度下处理30～50s，冰浴5min。破碎重复3～5次。10000g离心10min，收集上清，即为粗酶液；
采用XI-SDH方法测定酶活力，步骤如下：
将700mmol/L D-木糖，0.01-0.025U木糖异构酶，含10mmol/L MnCl2的50mmol/LTris-HCl pH7.0缓冲液中，分别在45℃反应20min，加入150μL 50％三氯乙酸终止反应和185μL 2M Na2CO3中和反应缓冲液。取0.5mL加入0.04U SDH(sigma)和0.15mM NADH，立即混匀，在340nm下检测NADH被氧化的量(即在340nm做时间扫描)。根据标准曲线求得木酮糖量。木糖异构酶(XT)的一个比活力单位(U/mg)定义为：每mg酶蛋白每分钟转化底物的μmol/L数。
通过酶活测定进行复筛获得一株突变体，提取其质粒，对xylA部分测序，测序的结果是SEQ NO.1所示的序列(mxylA)，编码SEQ NO.2所示的多肽，该多肽为木糖异构酶的进化酶，命名为S1，带有S1编码基因的相应重组载体为pYPX251-S1，含有重组载体的重组菌株为HBl01-S1。
实施例2
进化酶S1的酶活测定：
(1)以纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)157-2的总DNA为模板，利用引物l和引物2扩增野生型木糖异构酶基因xylA，以BglII、SacI酶切，采取定向连接策略与同样酶切处理的质粒载体pYPX251(GenBank AYl78046)定向连接，获得重组质粒pYPX25l-SXI。
(2)步骤(1)中的重组质粒转化大肠杆菌HBl01，获得重组菌株HBl01-SXI。
(3)按照实施例l中步骤(11)中描述的酶活测定方式，在不同温度下测定不同菌株来源的粗酶液中含有的木糖异构酶的比活力见表l。
表1在不同温度下不同菌株中的木糖异构酶比活力
(4)按照实施例1中步骤(11)中描述的酶活测定方式，调整测定缓冲液的pH分别
在pH等于5、6、7、8、9和10的条件下测定进化酶S1的最适pH为7.0(附图2)。实施例3突变木糖异构酶基因在酿酒酵母中的活性表达
(1)根据酿酒酵母基因组数据库中HXT7基因上游-375bp--1bp序列设计引物：
引物3：5’GATCCCCGGGCGGGCCCCTGCGTG-3’
引物4：5’TTGCGGTACCTTTTTGATTAAAATTAAAAAAAC-3’
以酿酒酵母染色体为模板，PCR扩增HXT7启动子(HXT7p)片段，并用SmaI和KpnI双酶切PCR产物。
(2)根据SEQ NO.1所示的核苷酸序列设计引物：
引物5：5’AGCTGGTACCATGACCGTCGTGATTGGAAAC-3’
引物6：5’-TTGCAGATCTTTACCGGATCCACCGATTGAC-3’
以pYPX251-S1为模板，PCR扩增mxylA，并用KpnI和BglII双酶切PCR产物。
(3)根据SEQ NO.1所示的核苷酸序列设计引物：
引物5：5’AGCTGGTACCATGACCGTCGTGATTGGAAAC-3’
引物6：5’-TTGCAGATCTTTACCGGATCCACCGATTGAC-3’
以纤维堆囊菌染色体为模板，PCR扩增xylA，并用KpnI和BglII双酶切PCR产物。
(4)根据酿酒酵母基因组数据库中PGK1基因下游1bp-279bp序列设计引物：
引物7：5’-GCTAGATCTTAACGAACGCAGAATTTTCG-3’
引物8：5’-TTGAAGCTTTAAATTGAATTGAATTGAAAT-3’
以酿酒酵母染色体为模板，PCR扩增PGK1终止子(PGK1t)，用HindIII和BglII双酶切PCR产物。
(5)将步骤(1)，(2)，(4)中获得的产物等量连接混合物作为模板，用引物3和引物8扩增，回收2000bp处的片段，用HindIII和SmaI双酶切。
(6)质粒YEp24用HindIII和SmaI双酶切，并和步骤(5)获得的产物连接，转化大肠杆菌，经在大肠杆菌中扩增后的重组载体验证正确后命名为pHX-S1。
(7)步骤(6)获得的重组载体pHX-SXI转化酿酒酵母H158，重组菌株命名为H158-S1。
(8)将步骤(1)，(3)，(4)中获得的产物等量连接混合物作为模板，用引物3和引物8扩增，回收2000bp处的片段，用HindIII和SmaI双酶切。
(9)质粒YEp24用HindIII和SmaI双酶切，并和步骤(8)获得的产物连接，转化大肠杆菌，经在大肠杆菌中扩增后的重组载体验证正确后命名为pHX-SXI。
(10)步骤(9)获得的重组载体pHX-SXI转化酿酒酵母H158，重组菌株命名为H158-SXI。
(11)按照实施例1中步骤(11)所使用的方法制备H158-SXI和H158-S1的粗酶液并测定XI酶活，两种XI在酿酒酵母中都有活性表达，H158-SXI中的XI酶活为0.11，H158-S1中的XI的酶活为0.039，经过改造的进化酶S1的活性是野生型SXI的2.8倍。
序列表
<110>山东大学
<120>一种木糖异构酶及其编码基因与应用
<160>2
<170>PatentIn Version 3.3
<210>1
<211>1329
<212>DNA
<213>纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)
<400>1
atgaccgtcg tgattggaaa caaagggtac ttccccggtg tcggcaagat cctctacgag 60
gggcccgagt ccgacaaccc cgtcgccttc aagtggtacg acgagagccg cgtcgtcgcc 120
ggcaagccca tgaaggacca cttcaagttc gccgtgtgtt actggcacac cttctgtggt 180
cgtgggcacg accccttcgg tccggggacg atcaacttac cctgggacga ggggaaggac 240
ccactgaccc gcgctcgcat gaaggcggac gcgaacttcg agttcatcac caagctgggc 300
gcgacgcact actgtttcca cgacatcgac ctggtggagg agggcgacag ccgcgccgag 360
acgtcgcgcc gccttcaggg catcgtcggg tacgccaagc agaagcaagc gcagtcgggc 420
gtcaagctgc tgtgggtcac ggcgaacttg ttctccaacc cgcgctacat gaacggcgcc 480
tccacgaacc cggatttctc cgaggtggcc tacgccggcg cccagctgaa ggacgccctc 540
gacgccacca tcgcgctgaa cggtgagaac tacgtgttct ggggcggccg cgaggattac 600
atgagcctgc tgaacacgga catgaagcgc gagatggagc acttcgcgcg cttcttgacc 660
atggcgcgcg actacgcgcg cgcccggggc ttcaagggga ccttcttcat cgagcccaag 720
ccgatggagc cgtcgaagca ccagtacgac ttcggcgccg agaccgtgat cgggttcctg 780
cgccagcacg gcctggacaa ggacttcaag ctcaacctgg agacgaacca cgcgacgctc 840
gctggccaca ccatggagca cgagatgcag gtggccgcgg acgccggcat gctcggcagc 900
atcgacgcga acctcggcga ctaccagaat gcgtgggaca ccgatcagtt cccctacaac 960
atcaacgaga cggtggagat gatgctcatc ctcctccgca gcggcaggtt ccagggtggc 1020
ggcgtcaact tcgacgcgaa gcgccgccgc aactcgacgg acctgatcga caccttccac 1080
ggccacatcg gcggcatgga cgtgttcgcc cgcgcgctca tcatcgccgg cgacctgatc 1140
cgcaagtcgc cgctcgagtc gatgcgcaag gctcattacg cgtcgttcga cggcggcaag 1200
ggcgcggagt tcgagcaggg gaagctcacg ctggagcagc tggccgagat cggcgacgcc 1260
ggcggcgagg tcaagctcac gagcggtcag caagagctgt acgagaacat cgtcaatcgg 1320
tggatccgg 1329
<210>2
<211>443
<212>PRT
<213>纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)
<400>2
MTVVIGNKGY FPGVGKILYE GPESDNPVAF KWYDESRVVA GKPMKDHFKF AVCYWHTFCG 60
RGHDPFGPGT INLPWDEGKD PLTRARMKAD ANFEFITKLG ATHYCFHDID LVEEGDSRAE 120
TSRRLQGIVG YAKQKQAQSG VKLLWVTANL FSNPRYMNGA STNPDFSEVA YAGAQLKDAL 180
DATIALNGEN YVFWGGREDY MSLLNTDMKR EMEHFARFLT MARDYARARG FKGTFFIEPK 240
PMEPSKHQYD FGAETVIGFL RQHGLDKDFK LNLETNHATL AGHTMEHEMQ VAADAGMLGS 300
IDANLGDYQN AWDTDQFPYN INETVEMMLI LLRSGRFQGG GVNFDAKRRR NSTDLIDTFH 360
GHIGGMDVFA RALIIAGDLI RKSPLESMRK AHYASFDGGK GAEFEQGKLT LEQLAEIGDA 420
GGEVKLTSGQ QELYENIVNR WIR 443
<210>3
<211>28
<212>DNA
<213>人工合成
<400>3
ATCGAGATCT ATGACCGTCG TGATTGGA 28
<210>4
<211>28
<212>DNA
<213>人工合成
<400>4
TTCGGAGCTC TTACCGGATC CACCGATT 28
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成
<400>5
GATCCCCGGG CGGGCCCCTG CGTG 24
<210>6
<211>33
<212>DNA
<213>人工合成
<400>6
TTGCGGTACC TTTTTGATTA AAATTAAAAA AAC 33
<210>7
<211>31
<212>DNA
<213>人工合成
<400>7
AGCTGGTACC ATGACCGTCG TGATTGGAAA C 31
<210>8
<211>31
<212>DNA
<213>人工合成
<400>8
TTGCAGATCT TTACCGGATC CACCGATTGA C 31
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<211>29
<212>DNA
<213>人工合成
<400>9
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<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工合成
<400>10
TTGAAGCTTT AAATTGAATT GAATTGAAAT 30