具有降胆固醇及抑菌能力的鼠李糖乳杆菌grx10及其用途

摘要

具有降胆固醇及抑菌能力的鼠李糖乳杆菌grx10及其用途，涉及生物技术领域，从新疆传统乳制品——酸骆驼奶中分离出乳酸菌；比较分离出的乳酸菌的加工和生长特性，筛选出凝乳、产酸、产香、产粘良好乳酸菌；通过体外比较不同分离菌株分解胆固醇能力，筛选出具有降胆固醇能力强的乳酸菌，即为鼠李糖乳杆菌grx10。本发明无论制成品为食品或药品或发酵乳都具有良好的抗致病菌特性、耐酸和胆汁酸盐能力、并具有良好发酵特性的安全乳酸菌，具有明显降低血清总胆固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯含量的作用。

权利要求

1.具有降胆固醇及抑菌能力的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)grx10，其特征在于，保藏号为CGMCC No：2526。

2.如权利要求1所述具有降胆固醇及抑菌能力的鼠李糖乳杆菌grx10的用途，用于制备具有调节血脂功能的食品。

3.如权利要求1所述具有降胆固醇及抑菌能力的鼠李糖乳杆菌grx10的用途，用于制备具有调节血脂功能的药品。

4.如权利要求1所述具有降胆固醇及抑菌能力的鼠李糖乳杆菌grx10的用途，用于制备具有调节血脂功能的发酵乳。

说明书

具有降胆固醇及抑菌能力的鼠李糖乳杆菌grx10及其用途

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及具有降胆固醇、调节血脂功能和抑制腐败微生物作用的鼠李糖乳杆菌的分离、筛选及鉴定方法，以及在食品和药品生产中的应用。技术背景

[0002] 随着社会经济的不断发展，人们对自身健康的日益重视，加之保健医学的不断发展，越来越注重食品的天然和健康特性，这势必给微生态制品的开发和应用带来契机。尤其是可作为食品和药品的益生菌制品，因其特有的无毒副作用和良好生理功效的特点，将愈来愈受到人们的青睐。

[0003] 益生菌在自然界分布广泛，特别新疆、内蒙一带长期的游牧生活积累了很多优良功能的益生菌资源，新疆的很多传统发酵乳制品，如酸牛奶、酸马奶、酸羊奶、酸骆驼奶、奶疙瘩、马奶酒等，存在很多优良益生菌。

[0004] 因此，在新疆传统发酵乳制品筛选具优良特性的菌株，如降胆固醇、抑制致病菌生长、耐酸耐胆盐等方面进行研究，筛选优良乳酸菌，不仅具有广阔的应用前景，同时亦具有重要的社会意义。

发明内容

[0005] 本发明目的在于发明一种具有降胆固醇、调节血脂功能和抑制腐败微生物作用的鼠李糖乳杆菌，以期进一步开发利用。

[0006] 本发明鼠李糖乳杆菌grx10，于2008年5月28日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No：2526。

[0007] 本发明具有综合性能的菌株.该菌株具有优异的抗致病菌特性、降胆固醇作用、耐酸和胆汁酸盐能力、并具有良好发酵特性、弱的后酸化程度的安全乳酸菌；通过细菌形态学、生理学和培养特征，结合法国梅埃里公司API150CHL鉴定试剂条和16srDNA序列测定并进行比对分析，最终确定该菌株为为鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)。

[0008] 本发明的另一目的是提供一种制得具有综合良好特性的鼠李糖乳杆菌grx10的方法。

[0009] 本发明方法包括以下步骤：

[0010] 1)从新疆传统乳制品——酸骆驼奶中分离出乳酸菌；

[0011] 2)比较分离出的乳酸菌的加工和生长特性，筛选出凝乳、产酸、产香、产粘良好乳酸菌；

[0012] 3)通过体外比较不同分离菌株分解胆固醇能力，筛选出具有降胆固醇能力强的乳酸菌，即为鼠李糖乳杆菌grx10。

[0013] 本发明的第三个目的在于开发鼠李糖乳杆菌grx10的应用：

[0014] 用于制备具有调节血脂功能的食品。

[0015] 经试验证明制成的食品具有预防和治疗由大肠杆菌和其它肠道致病性细菌引起的肠炎、结肠炎和直肠炎的功能。

[0016] 也可用于制备具有调节血脂功能的药品。具有辅助治疗或预防高胆固醇(调节血脂)的作用。

[0017] 还可用于制备具有调节血脂功能的发酵乳。产品不仅具有较弱的后酸和良好的感观特性，同时具有降胆固醇(调节血脂)功能。

[0018] 经动物试验，本发明无论制成品为食品或药品或发酵乳都具有良好的抗致病菌特性、耐酸和胆汁酸盐能力、并具有良好发酵特性的安全乳酸菌，通过动物试验，进一步证实本发明菌株发酵乳对实验小鼠血清中的血糖没有影响，具有明显降低血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、甘油三酯(TG)含量，同时具有升高血清中高密度脂蛋白(HDL-C)含量；具有降低肝匀浆MDA含量含量，对肝匀浆SOD含量具有升高作用。

附图说明

[0019] 图1为本发明菌株的形态图。

[0020] 图2为空白对照组小鼠肝切片病理电镜图。

[0021] 图3为模型组小鼠肝切片病理电镜图。

[0022] 图4为阳性对照组小鼠肝切片病理电镜图。

[0023] 图5为乳酸菌DM组小鼠肝切片病理电镜图。

[0024] 图6为本发明菌组小鼠肝切片病理电镜图。

[0025] 图7为本发明鼠李糖乳杆菌grx10的16srDNA的电泳鉴定图。

具体实施方式

[0026] 本发明提供具有优异的耐酸耐胆盐、降胆固醇和抗细菌特性的鼠李糖乳杆菌grx10。较佳的是，本发明的鼠李糖乳杆菌grx10对致泻性大肠杆菌(E.coliSDZC07)、沙门氏菌(Salmonella WX29)、志贺氏菌(Shigella JX117)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolytiaus 05168)的生长具有抑制作用；通过体外和动物试验证实具有很强的降胆固醇能力。

[0027] 为了获得所述鼠李糖乳杆菌grx10，本发明提供了一种制备这种乳杆菌的方法，具体而言，它采用下述步骤制得：(1)从新疆传统乳制品中分离的乳酸菌；(2)比较他们的加工和生长特性，筛选出具有优异的降胆固醇、抗致病菌特性、耐酸和胆汁酸盐能力、并具有良好发酵特性的安全乳酸菌；(3)通过动物试验，表明本发明菌株发酵乳对实验小鼠血清中的血糖没有影响，具有明显降低血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、甘油三酯(TG)含量，同时具有升高血清中高密度脂蛋白(HDL-C)含量；具有降低肝匀浆MDA含量含量，对肝匀浆SOD含量具有升高作用。(4)通过法国梅埃里公司API 150CHL鉴定试剂条和16srDNA序列测定并进行序列比对分析，确定该菌株为为鼠李糖乳杆菌grx10；(5)通过安全性实验，发现该菌对动物安全无毒。

[0028] 相关培养基配方

[0029] (1)脱脂乳培养基：精确称取脱脂乳粉12g，加88mL的蒸馏水溶解，pH值调至6.8，115℃灭菌15min，冷却备用。

[0030] (2)MRS固体培养基：精确称取牛肉膏10.0g，酵母浸膏5.0g，蛋白胨10.0g，无水醋酸钠5.0g，碳酸钙1.0g，K2HPO42.0g，琼脂15g，量取吐温-801mL，盐液A 5mL，蒸馏水1000mL。制法：将除琼脂以外的其它成分加入蒸馏水中加热溶解，调pH6.4，再加入琼脂煮沸溶解，121℃灭菌15min，冷却备用。

[0031] 其中盐液A按称取11.5g MgSO4·7H2O，2.8gMnSO4·4H2O，加蒸馏水定容至1000mL方法配置。

[0032] (3)PTYG培养基：精确称取胰胨5.0g，大豆蛋白胨5.0g，酵母提取物10.0g，葡萄糖10.0g，半胱氨酸0.5g，琼脂15g，量取盐溶液B 40mL，吐温-801mL，蒸馏水1000mL。制法：
将除琼脂以外的其它成分加入水中加热溶解。调pH6.8，再加入琼脂煮沸溶解，121℃灭菌
15min，冷却备用。

[0033] 其中盐溶液B为：无水CaCl20.2g，MgSO4·7H2O 0.48g，K2HPO41.0g，KH2PO41.0g，NaHCO310.0g，NaCl 2.0g。制法：先将无水CaCl2和MgSO4·7H2O混合溶解于300mL蒸馏水中，量取500mL蒸馏水，一边搅拌一边缓慢加入其它盐类。继续搅拌直到全部溶解，加200mL蒸馏水，混合后置于4℃保存备用。

[0034] (4)Elliker液体培养基：精确称取胰胨20g，蔗糖5.0g，酵母提取物5.0g，NaCl4.0g，明胶2.5g，乙酸钠1.5g，抗坏血酸0.5g，葡萄糖5.0g，乳糖5.0g，琼脂15g，量取蒸馏水100mL。制法：将除琼脂以外的其它成分加入水中加热溶解，调pH6.8，再加入琼脂煮沸溶解，121℃灭菌15min，冷却备用。

[0035] (5)改良MRS：将液体MRS培养基加入0.2％的山梨酸钾并调pH至5.7，加入琼脂后于121℃下灭菌15min，冷却备用。

[0036] (6)M17培养基：精确称取植质蛋白胨5.0g，酵母提取物5.0g，聚蛋白胨5.0g，抗坏血酸0.5g，牛肉浸膏2.5g，β-甘油磷酸二钠19g，琼脂15g，量取1.0mol/L MgSO4·7H2O1.0mL，蒸馏水1000mL。制法：将除琼脂以外的其它成分加入水中加热溶解，调pH7.1，再加入琼脂煮沸溶解，121℃灭菌15min，冷却备用。

[0037] (7)缓冲液A：精确称取蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，K2HPO42.0g，KH2PO42.0g，量取蒸馏水1000mL。制法：混合各成分，115℃灭菌20min，冷却备用。

[0038] (8)LB培养基：精确称取胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g。制法：混合各成分，调pH7.0，115℃灭菌15min，冷却备用。

[0039] (9)富胆固醇培养基：在1000mL PTYG液体培养基中加入：胆固醇1g，蔗糖酯1g，胆盐1.5g，量取吐温-8010mL，冰乙酸5mL。制法：胆固醇、蔗糖酯、胆盐混合后加入5mL冰乙酸，超声音处理15min，一起加入到PTYG液体培养基中，调pH6.8，115℃灭菌15min，冷却备用。

[0040] (10)高脂症小鼠饲料：基础饲料93.8％，胆固醇1％，猪油6％，胆盐0.3％。

[0041] (11)硫酸铁铵显色剂：溶解4.463g硫酸铁铵100mL 85％磷酸中，取10mL溶液用浓硫酸稀释至100mL，放入硅胶干燥皿中备用。

[0042] 具体步骤：

[0043] 1、样品来源

[0044] 本发明鼠李糖乳杆菌grx10分离自我国新疆传统乳制品酸骆驼奶中。

[0045] 新疆的游牧民族多集中在山区草原地带，长期的游牧生活也积累了很多传统乳制品如酸牛奶、酸马奶、酸羊奶、酸骆驼奶、奶疙瘩、马奶酒等。

[0046] 2、样品采集

[0047] 将样品采集后液体样品放入事先准备好的缓冲溶液中，冷藏，5天之内对样品进行分离；固体样品直接冷藏取样，进行乳酸菌分离。

[0048] 3、菌株的分离

[0049] 将样品浸入表1各培养基中，经过表1的分离条件分离出菌株158株，经过纯化，染色，记录菌株的形态和发酵特性。

[0050] 表1菌株分离的培养基和培养条件

[0051]

[0052] 本发明菌株的培养条件是，PTYG/MRS培养基，42℃温度下培养，菌株形态如附图1所示。

[0053] 分离菌株添加15％脱脂乳的肉汤培养物，培养，加入冷冻保护剂后冻干并保存在-18℃，然后用于细菌各种特征分析和特性研究。

[0054] 4、革兰氏染色及培养特性

[0055] 采用革兰氏染色法检测菌株的特征。结果表明本发明菌株为革兰氏阳性、杆状，为无芽孢，大小为1.0-1.5um，这是乳杆菌属的典型特征。

[0056] 然后，研究该乳酸菌，以阐明其培养特征。结果是，该菌株在MRS或PTTG琼脂平板上长成直径为1-2mm的乳白色菌落，最佳培养温度为42℃。

[0057] 5、加工特性

[0058] (1)凝乳及产酸特性

[0059] 将分离获得的乳酸菌接种到脱脂乳中培养，本发明菌株具有凝乳特性，且在42℃温度下培养，在11.5％的NFS脱脂乳中发酵18h，酸度为75-90°T。

[0060] (2)产香特性分析

[0061] 采用气相色谱法，具体方法如下：取4mL发酵乳样品6000r/min离心15min，取上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，取0.2μL滤液进行色谱分析，检测样品中风味物质乙醛、丙酮、乙酸乙酯、丁二酮、异戊醇的含量。色谱条件为：DB-WAX 0.53mm×30mm×1.25μm大口径毛细管，程序升温，初始温度35℃，保持2min，3℃/min加温到60℃保持到结束。FID检测器：温度300℃，进样温度250℃；载气条件：高纯N2，程序升压，初始压力50KPa，保持2min，以15KPa/min的速度升压至120KPa，保持3min。

[0062] 通过检测，本发明菌株发酵乳样品，都能检出丁二酮、乙醛和丙酮，在储藏12h时含量达到最高，分别为25.66ppm、12.43ppm、25.27ppm。

[0063] (3)产粘特性测定

[0064] 利用博力飞粘度计(美国BROOKFIELD ENGINEERINGLABORATORIES)对发酵乳的粘度进行测定，发现本发明菌株发酵结束时的粘度为其产粘能力较好为900-1200cp，在4℃下冷藏12h超过1400cp，24h超过1600cp，4d超过2000cp。

[0065] (4)后酸化特性分析

[0066] 称取5g酸乳样品，记录确切质量m，用40mL蒸馏水稀释，并加酚酞指示剂，用0.01mol/L的NaOH滴定，记录体积V，采用公式酸度＝V/m×100计算样品酸度。

[0067] 本发明菌株(L.rhantarum grx10)后酸化程度比较弱，在15d后酸度较凝乳时只提高了7.2％(即从凝乳时的83°T提高到15天时仅为95°T)。

[0068] 6、功能特性

[0069] (1)耐酸耐胆盐特性

[0070] 对本发明菌株进行耐盐能力和耐胆酸能力的检测，将MRS液体培养基用HCl分别调节pH值为：pH2.0，pH3.0；分别加入0.2％、0.3％牛胆酸盐，115℃灭菌20分钟待用。将乳酸菌接入上述培养基中，6h测定活菌数量，观察其耐酸耐胆酸盐能力。结果显示，本发明4
菌株在pH2.0、0.3％的牛胆酸盐中，在37℃下经6h培养，活菌数量超过10cfu/mL。

[0071] (2)对致病性微生物抑制特性

[0072] 发酵乳对大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌和副溶血弧菌的抑制作用，采用单层琼脂平板扩散法(AWDA)进行实验，具体方法如下：将冻融后的大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌和副溶血弧菌吸取少量于LB培养基液体培养基中，置于密封罐中37℃培养，测量其生长曲7
线。选择浓度为10cfu/mL数量级时取出待实验用。

[0073] 吸取菌液0.5mL于LB培养基平板上，用无菌涂抹棒于超净工作台内通无菌空气，8
放置1h，待表面的菌液固定后打孔，孔直径1cm，孔深0.5cm，加入200μL调制到10cfu/mL的发酵乳，于37℃培养48h，观察结果并测量抑菌圈直径。

[0074] 经比较可见本发明菌株的抑菌能力比较好，对大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌和副溶血弧菌的抑制圈都大于20mm，而一般菌株均小于18mm左右。

[0075] (3)体外降胆固醇实验

[0076] 将菌株经过在MRS培养基中的活化3代后，并将菌体浓度稀释到108cfu/mL，将菌液以1％接种量接种到富含胆固醇培养基中，培养72小时。结果表明对照样，依然浑浊，而接入乳酸菌的样品明显清晰透亮。

[0077] 通过研究菌株间降胆固醇能力差异较大，从分离获得的良好加工特性45株乳酸菌中，有4株降胆固醇能力超过33％，其中本发明菌株降胆固醇能力最高，达到45.24％。

[0078] (4)降胆固醇动物实验

[0079] 7周龄小鼠140只，雌雄各半，每只20±2g，将小鼠分A、B、C、D、E、F、G组，每组20只，雌雄各半分笼饲养，A组喂基础饲料，其余喂高脂饲料，第14天起，给A、B组罐生理盐水9
0.4mL，C组灌辛伐他汀0.4mL，其他各组灌对应的四种乳酸菌，浓度是10cfu/mL，4mL。在4周后对小鼠眼眶采血，测定总胆固醇(TC)含量。

[0080] 在4周后对小鼠测定如下指标：(1)肝的解剖图观察；(2)摘眼球取血，分离血清测总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)和甘油三脂(TG)。(3)10％肝匀浆的丙二醛MDA、超氧化物歧化化酶SOD及肝切片观察。

[0081] 小鼠肝脏解剖图的观察

[0082] 对小鼠进行解剖，肉眼观察肝组织的形态结构及病理改变，肝脏组织的解剖。A图(模型组)的肝脏颜色比较白，出现局灶型脂肪浸润，在肝左下方有肉眼可见粒，呈灰白色；而B图(本发明菌株组)肝脏颜色鲜红且形状正常，显示喂食益生菌后，对高脂模型小鼠肝脏脂肪沉积有预防或改善作用，且在一定程度上可预防肝脏脂肪浸润，表明本发明菌株具有较好的调节血脂、降胆固醇作用。

[0083] 血清生化指标的测定

[0084] 实验前12h小鼠禁食不禁水，实验时摘眼球取血，血液静置10min后置37℃水浴孵育30min，取出后3000r/min离心20分钟，取血清样品10μL于7060全自动生化分析仪测定TC、HDL-C、LDL-C和TG。结果如表2-7所示。

[0085] 表2对血清总胆固醇(TC)含量的影响(mmol/L)

[0086]

[0087] 注：P1：与空白组对照比较；P2：与模型组B组对照；P3：与阳性对照组对照；“*”为显著性差异(P＜0.05)；“**”为极显著性差异(P＜0.01)。

[0088] 从表2可以看出：(1)模型组血清中胆固醇含量明显升高，与空白对照组比较差异极显著(P＜0.01)，表明建模成功；(2)LAB组及阳性对照组与模型组比较胆固醇含量明显降低，说明LAB与阳性对照辛伐他汀均可降低胆固醇，且各组菌与阳性对照组之间无显著差异，表明各组菌均有较强的降胆固醇能力；(4)各菌株中以鼠李糖乳杆菌grx10降胆固醇效果为最好(P＜0.01)。

[0089] 表3对血清HDL-C含量的影响(mmol/L)

[0090]

[0091] 注：同表2。

[0092] 从表3可以看出：(1)模型组中HDL-C含量明显低于空白对照组，有显著性差异(P＜0.05)；(2)在各LAB组和阳性对照中HDL-C含量明显升高，表明LAB和阳性对照辛伐他汀有较好的调节血脂和降低胆固醇作用；(3)鼠李糖乳杆菌grx10菌组升高HDL-C含量比较显著，与阳性对照效果相当。

[0093] 表4LAB对血清LDL-C含量的影响(mmol/L)

[0094]

[0095] 注：同表2。

[0096] 从表4可以看出：(1)模型组中LDL-C含量升高，且明显高于空白对照组，差异非常显著(P＜0.01)；(2)各LAB组的LDL-C含量明显减低，与模型组比较有显著性差异，说明LAB可调节血脂和降低胆固醇，且各组菌较阳性对照降低LDL-C作用更加明显，证明各组菌的具有较好的降低LDL-C能力。

[0097] 表5LAB对血清TG含量的影响(mmol/L)

[0098]

[0099] 注：同表2。

[0100] 从表5可以看出：(1)模型组中甘油三酯明显高于空白对照组，两组间比较有极显著性差异(P＜0.05)；(2)各LAB组与阳性对照组甘油三脂含量明显低于模型组，说明可降低甘油三酯，且各组菌与阳性对照之间无显著差异，证明各组菌的降甘油三酯能力比较强。

[0101] 肝脏匀浆的指标测定

[0102] 分离小鼠肝脏完整取出，取肝左叶称取0.4g，用4mL生理盐水稀释制作成10％肝匀浆，3000r/min离心20分钟取上清液紫外分光光度计测定MDA和SOD含量，结果见表6-7。

[0103] 表6LAB对肝匀浆MDA含量的影响(nmol/mgprot)

[0104]

[0105] 注：同表2。

[0106] 从表6可以看出：(1)模型组MDA明显升高，与空白对照组比较有显著性差异(P＜0.05)；(2)除X5菌低浓度组外各LAB组及阳性对照组的MDA明显低于模型组，与模型组比较有显著性差异(P＜0.05)，说明可以降低MDA含量，且与阳性对照组之间无显著差异，说明X1、grx10、X5菌的降MDA能力比较强，对脂肪沉积、脂质代谢紊乱有调节作用。

[0107] 表7LAB对肝匀浆SOD活性的影响(U/mgprot)

[0108]

[0109] 注：同表3-17。

[0110] 从表7看出：(1)模型组中SOD活性明显低于空白对照组且有极显著性差异(P＜0.01)；(2)各LAB组及阳性对照组SOD活性明显高于模型组，与模型组比较有显著性差异(P＜0.05)，且与阳性对照组的SOD活性基本接近，无显著性差异，说明各菌组的肝组织匀浆中的SOD活性比较高。

[0111] 肝脏切片观察分析

[0112] 小鼠喂食四周后，处死后将肝脏取出，制作小鼠肝切片，放置于200倍电镜下观察病理情况，结果如图2-6所示。

[0113] 图2所示，空白对照组的肝切片形态结构无异常改变，肝小叶境界清楚，中央静脉位于肝小叶中间，肝细胞板呈放射状排列，肝细胞胞质丰满，呈嗜酸性，胞质中无网状结构，可见糖原颗粒，双核细胞较多，肝血窦无充血现象，可见巨嗜细胞，门管区见三种管道伴行，无炎症细胞浸润，属于正常肝组织。

[0114] 图3所示，模型组肝小叶境界模糊，中央静脉直径缩小，肝细胞板排列紊乱，细胞质中充满了大量的脂滴，细胞核呈固缩现象，肝血窦有充血、水肿现象。门管区可见炎症细胞浸润，增粗的胶原纤维。提示肝组织脂肪浸润严重，出现明显病变。

[0115] 图4所示，阳性对照组的肝细胞脂肪化现象较模型组有所改善，中央静脉周围肝细胞形态正常，未见明显脂肪病变。说明辛伐他汀对高脂状态下造成的肝脂肪变性具有预防或修复作用。

[0116] 图5所示，为乳酸菌DM组，肝切片明显好于模型组，但稍差于对照空白组和阳性对照组。

[0117] 图6所示，我们可以看出，本发明菌组的肝切片明显好于模型组，但稍差于空白对照组，接近阳性对照。

[0118] 综合分析可以得出：综合各项指标，四种菌的降胆固醇效果是grx10＞X1＞Y5＞X5；本发明菌株鼠李糖乳杆菌grx10发酵乳对小鼠降胆固醇能力最好，且肝切片的效果也最好。

[0119] 7、乳酸菌的鉴定

[0120] (1)使用APIKIT 50CHL进行菌株的鉴定

[0121] 糖发酵结果见表8，经过分析，表明本发明菌株99.9％为鼠李糖乳杆菌。

[0122] 表8本发明菌株的糖发酵结果

[0123]0 GLY ERY DARA LARA RIB DXYL LXYL ADO MDX GAL
- - - + - + - - - - +
GLU FRU MNE SBE RHA DUL INO MAN SOR MDM MDG
+ + + + + + + + + -
NAG AMY ARB ESC SAL CEL MAL LAC MEL SAC TRE
+ + + + + + + + - + +
INU MLZ RAF AMD GLYG XLT GEN TUR LYX TAG DFUC
- + - - - - + - - + -
LFUC DARL LARL GNT 2KG 5KG
+ - - + - -

[0124] (2)16srDNA序列测定进行菌株的鉴定

[0125] 将制备的乳酸菌基因组DNA作为PCR扩增的模板，采用50μl反应体系进行PCR扩增。模板DNA5μl，2.5mM dNTP 4μl，10×buffer 5μl，10pmol上下游引物各1.5μl，Taq酶1.5U，Mg2+3μl，以ddH2O补至50μl。PCR循环参数为：94℃预变性5min；94℃变性1min，64℃退火45s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸8min。吸取PCR产物5μl与1μl Loading buffer混合，用1.0％琼脂糖凝胶电泳，电压为80V。电泳结束后用溴化乙锭EB染色20-30min，拍照。可见约1500bp的条带即为目标条带，见图7。

[0126] 将PCR产物送上海生物工程公司进行测序。测序结果：其核苷酸长度为1476bp，经过序列比对，表明本发明菌株99.93％为鼠李糖乳杆菌grx10。

[0127] 将鼠李糖乳杆菌grx10于2008年5月28日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No：2526。

[0128] 8、乳酸菌的安全性

[0129] 为了检测本发明菌株的安全性，选择使用ICR小鼠。具体是，将本发明菌株接种到11％脱脂乳中培养24h(活菌数约为5×109cfu/mL)，取健康小鼠20只，雌雄各半，体重20±2g，饲养观察一日，活动正常，进食状况良好，实验前禁食12h后称重，分别按0.4ml/10g灌服样品，2次/d，给药后即对动物的精神状态、毛色、自主活动、呼吸、饮食、二便、口鼻分泌物等一般状况及死亡情况进行观察，连续喂养7天，2个月后检测其安全性，结果如表9所示。

[0130] 表9本发明的乳酸菌的安全性

[0131]

[0132] 由表9可见，小鼠对该菌发酵液的最大耐受量为80mL/kg。给药后小鼠未出现不适症状，小鼠活动正常，在整个观察期间精神状态良好、毛色光洁、活动自如、呼吸均匀、口鼻内无异常分泌物，动物饮食量正常，便软，小便无异常。观察一周后，称体重，周体重增长率为：25.1％。于2个月后脱颈椎处死动物，并对所有动物进行尸检，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等内脏器官均未见任何异常。

[0133] 将给药小鼠的胃、小肠和大肠中的粘液涂布到MRS琼脂平板上，于37℃培养48小时，从给药组中分离出大量的乳酸菌，但在对照组中未检测到。

[0134] 应用实施例

[0135] 下面的实施例阐述了本发明的实践和目前优选的实施方式。

[0136] 1、含本发明菌株酸乳的制作方法

[0137] 将鲜乳加热到50℃以上，加入6％的白砂糖搅拌至完全溶解，预热到60～65℃，20Mpa压力均质，90℃左右杀菌5-8分钟，冷却至42～45℃，接种鼠李糖乳杆菌grx10。接种数量为2～3％。40～42℃发酵至pH值为4.2～4.5，冷却、冷藏，即制成凝固型酸乳。
发酵结束后经搅拌，添加果酱果汁等，冷藏，即制成含活性鼠李糖乳杆菌grx10酸乳。

[0138] 2、含本发明菌株乳酸菌饮料的制作方法

[0139] 按应用实施例1制备好酸乳，将酸乳用杀菌并冷却的水、糖浆、乳化稳定剂等混合物稀释3-4倍左右，制成可直接饮用的含活性鼠李糖乳杆菌grx10的乳酸菌饮料。

[0140] 3、含本发明菌株冰淇淋的制作方法

[0141] 按应用实施例1制备好酸乳，冰淇淋原料配比如表5所示。

[0142] 表5 1000kg冰淇淋配方

[0143]原料 质量百分比(％)
鼠李糖乳杆菌grx10 400kg
白砂糖 75kg
原料 质量百分比(％)
全脂奶粉 62.5kg
黄奶油 31.25kg
椰子油 23kg
糖浆 26.25kg
乳化稳定剂 6kg
水 276kg

[0144] 将除酸乳以外的其它物料混合，预热到60～65℃，采用20Mpa～30Mpa进行均质，然后在80℃/20s杀菌，冷却到40～50℃，与酸乳混合，采用20Mpa～30Mpa进行均质，在2℃～4℃时，老化时间6h，经凝冻后经过硬化的为硬质冰淇淋，不经硬化的为软质冰淇淋。

[0145] 4、本发明菌种粉末状产品的制作方法

[0146] 将鼠李糖乳杆菌grx 10酸乳冷冻至-40℃～-60℃，经干燥，至含水量为3％-5％，压碎成粉末状，可将粉末状产品加入奶粉、低聚糖、麦芽糊精、风味剂等制成粉末状或片块状产品，用于日常食用或作为药品、保健品。

[0147] 以上本发明提供的菌株发酵的各种产物可起到降胆固醇的作用，该菌株发酵的牛奶，获得的经乳酸菌发酵的各种发酵乳产品、乳酸菌饮料产品等，都获得了具有不同程度的降胆固醇的特性。

[0148] <110>扬州大学

[0149] <120>具有降胆固醇及抑菌能力的鼠李糖乳杆菌grx10及其制备方法、用途[0150] <160>1

[0151] <210>1

[0152] <211>1476

[0153] <212>DNA

[0154] <213>乳酸菌

[0155] <220>

[0156] <223>从新疆传统乳制品——酸骆驼奶中分离

[0157] <400>1

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