一株产辅酶Q10的类球红细菌突变株及培养方法

摘要

一株辅酶Q10的类球红细菌突变株及其培养方法，属于微生物技术领域。突变株命名为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)Shenzhou6，保藏编号为CGMCC No.2458。该突变株的16S rDNA部分的序列的GenBank登录号是EU649703。相比出发菌株，该突变株在发酵生产辅酶Q10时，辅酶Q10的产量被大幅度提高，是出发菌株的1.3倍，发酵单位达到了0.8g/L。

权利要求

1.一株产辅酶Q10的类球红细菌突变株，突变株命名为类球红 细菌(Rhodobactersphaeroides)Shenzhou6，保藏编号为CGMCC No.2458。

2.按照权利要求1所述的产辅酶Q10的类球红细菌突变株，其形态特征为：革兰氏阴性球菌，多为单体存在；在类球红细菌专用培养基上菌落呈深粉红色，圆形有凸起，表面湿润有光泽，边缘整齐；菌株为微好氧菌，革兰氏阴性，接触酶阳性，氧化酶阳性，脲酶阴性，半乳酶阴性，不产生H2S，不能还原硝酸盐；类球红细菌shenzhou6的发酵液为褐色；从该菌的发酵液提取辅酶Q10时，辅酶Q10的发酵单位比出发菌株的提高了30％。

3.一种培养权利要求1所述的类球红细菌突变株的培养方法，其特征在于，步骤为：(1)固体培养基质量％：葡萄糖0.10-0.28，牛肉膏0.10-0.45，鱼蛋白胨0.20-1.7，酵母膏0.15-0.80，氯化钠0.25-0.90，琼脂粉0.5-2.0，pH5.0-8.5；

(2)种子液质量％：葡萄糖1.0-3.5，鱼蛋白胨0.5-2.0，酵母粉0.3-1.8，氯化钠

0.20-0.80，碳酸钙0.3-0.8，pH4.7-8.8；500毫升三角瓶分装，8层纱布封口灭菌；

(3)发酵液质量％：葡萄糖1.7-3.5，白砂糖1.0-3.5，玉米浆1.0-6.5，硫酸铵0.2-1.5，磷酸二氢钾0.01-0.09，磷酸氢二钾0.04-0.08，硫酸镁0.005-0.025；500毫升三角瓶分装，

8层纱布封口灭菌；

(4)固体培养条件：菌种接种到带有固体培养基的培养皿或试管中，于28-37℃培养

2-7天；

(5)种子液培养条件：用无菌接种环从培养皿或斜面中取菌体适量，接种到已灭菌的种子液中，28-40℃，120-300rpm摇床培养6-48小时；

(6)发酵培养条件：按照2-10％接种比例，将培养好种子液接种到发酵培养基中，

28-40℃，150-300rpm摇床培养3-8天。

说明书

一株产辅酶Q10的类球红细菌突变株及培养方法

技术领域

[0001] 本发明属于微生物技术领域，涉及一株产辅酶Q10的类球红细菌突变株及培养方法，通过空间搭载诱变手段获得的类球红细菌突变株。本发明的突变株命名为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)Shenzhou6，保藏编号为CGMCC No.2458，保藏时间：2008年4月16日，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明还涉及所述突变株在生产辅酶Q10方面的应用。

背景技术

[0002] 辅酶Q10是一种广泛存在于生物体细胞中的化学组分，无毒副作用。它是人体细胞能量制造的基础，具有代谢性强心作用，效果确切。辅酶Q10主要用于治疗急慢性病毒性肝炎、急性肝坏死的治疗，对心血管疾病和高血压有非常好的疗效，它还可以用于癌症的综合治疗，同时在抗衰老、抗疲劳、减肥和美容等方面独具功效。

[0003] 生产辅酶Q10原料的方法主要有四种：生物提取法、茄呢醇半合成法和微生物发酵法，其中微生物发酵法被公认为最具有优势和潜力的一种技术工艺。

[0004] 微生物发酵法制备辅酶Q10实现工业化生产主要有两方面的要求：一是要有稳定的规模化生产高质量辅酶Q10的菌种；。二是要有高精度分离仪器和技术。不断提高菌株产辅酶Q10的量，是降低生产成本最有效、最直接的手段之一。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一株产辅酶Q10的类球红细菌突变株及培养方法，提供的菌株能够大大提高辅酶Q10的发酵单位，辅酶Q10的发酵单位能够达到0.8g/L。

[0006] 本发明将出发菌株——类球红细菌SBL-11(实验室编号)随“实践八号”航天育种卫星回收舱在太空飞行15天，从回收样品中筛选得到了一株类球红细菌突变株，达到了本发明的目的。

[0007] 所述的类球红细菌突变株的培养方法为：

[0008] (1)固体培养基质量％：葡萄糖0.10-0.28，牛肉膏0.10-0.45，鱼蛋白胨0.20-1.7，酵母膏0.15-0.80，氯化钠0.25-0.90，琼脂粉0.5-2.0，pH5.0-8.5；

[0009] (2)种子液质量％：葡萄糖1.0-3.5，鱼蛋白胨0.5-2.0，酵母粉0.3-1.8，，氯化钠0.20-0.80，碳酸钙0.3-0.8，pH4.7-8.8。500毫升三角瓶分装，8层纱布封口灭菌；

[0010] (3)发酵液质量％：葡萄糖1.7-3.5，白砂糖1.0-3.5，玉米浆1.0-6.5，硫酸铵0.2-1.5，磷酸二氢钾0.01-0.09，磷酸氢二钾0.04-0.08，硫酸镁0.005-0.025。500毫升三角瓶分装，8层纱布封口灭菌；

[0011] (4)固体培养条件：菌种接种到带有固体培养基的培养皿或试管中，于28-37℃培养2-7天；

[0012] (5)种子液培养条件：用无菌接种环从培养皿或斜面中取菌体适量，接种到已灭菌的种子液中，28-40℃，120-300rpm摇床培养6-48小时；

[0013] (6)发酵培养条件：按照2-10％接种比例，将培养好种子液接种到发酵培养基中，28-40℃，150-300rpm摇床培养3-8天。

[0014] 本发明的类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides Shenzhou6)具有如下性质：

[0015] 1、形态特征：

[0016] 革兰氏阴性球菌，多为单体存在。

[0017] 2、与出发菌株在专用固体培养基上的菌落特征比较：

[0018] 本发明的类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides space shenzhou6)在类球红细菌专用培养基上菌落呈深粉红色，圆形有凸起，表面湿润有光泽，边缘整齐。

[0019] 而出发菌株——类球红细菌(Rhodobacter sphaeroide SBL-11)在类球红细菌专用培养基上菌落呈乳白色。

[0020] 3、生理生化特征

[0021] 该菌株为微好氧菌，革兰氏阴性，接触酶阳性，氧化酶阳性，脲酶阴性，不产生H2S，不能还原硝酸盐。

[0022] 其16S rDNA部分的序列的GenBank登录号是EU649703。

[0023] 4、碳源利用

[0024] 能以蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖等为碳源；不能利用鼠李糖、密二糖、精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、D-木糖等为碳源。

[0025] 5、在辅酶Q10生产中的比较

[0026] 出发菌株发酵生产辅酶Q10的发酵液为浅红色，而本发明的类球红细菌shenzhou6的发酵液为褐色。从该菌的发酵液提取辅酶Q10时，辅酶Q10的发酵单位比出发菌株的提高了30％。

[0027] 表1 是本发明的shenzhou6的微生物学特性的具体检测内容及结果：

[0028] 表1 微生物学特性

[0029]

[0030]

[0031] 注：“+”表示阳性，“-”表示阴性

[0032] 用本发明的突变菌发酵生产辅酶Q10时，从发酵液中提取、测定辅酶Q10的方法是：

[0033] 向发酵液中加入酸，可选用盐酸、硫酸、磷酸中的一种或几种的混合物，调pH值到1-5，之后加入碱，可选用氢氧化钠、氢氧化钾、氨水中的一种或几种的混合物，使pH值回复到6-8，将菌液离心后取菌体，加入有机溶剂混合均匀，溶剂可选用石油醚、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醚中的一种或几种的混合物。20-50℃，100-200rpm条件下提取1-10小时。提取液离心后取上清液旋转蒸发至干。将蒸发后的干物质用无水乙醇溶解，按照中华人民共和国药典中辅酶Q10的检测方法进行。

[0034] 菌种保藏信息：

[0035] 名称：类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)Shenzhou6，保藏编号为CGMCC No.2458。

[0036] 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

[0037] 保藏时间：2008年4月16日。具体实施方式：

[0038] 类球红细菌突变株空间诱变育种

[0039] 1、实践九号搭载样品准备

[0040] 取生长良好的类球红细菌SBL-11菌体培养物在无菌条件下转移到搭载专用管中，拧紧管盖，接口处用封口膜封口后装入搭载用大管，送交搭载前于4℃保存。此搭载管放入“实践八号”航天育种卫星的实验装置中，在太空中随卫星飞行15天后回收。

[0041] 2、搭载的空间环境

[0042] 在本次育种卫星飞行过程中，空间环境的相关数据为：卫星姿态控制为三轴稳定姿态，其中卫星的I象限指向地面，卫星回收舱小头为飞行方向。育种卫星轨道为椭圆形倾斜轨道，卫星运行在近地点高度为180km远地点高度为460km的轨道上，轨道倾角为63°，近地点位置在北纬35°附近，卫星飞行15天，共飞行236圈，236圈通过回收区中心。测试结果表明，本次飞行试验期间空间辐射剂量最大为5.893mGy，最小2.484mGy。平均日剂量在0.401～0.169mGy之间。卫星在轨期间种子测温点的最大温度为20.72℃，最低温度为7.21℃。

[0043] 3、空间试验条件设置

[0044] 本研究中考虑的空间诱变因素为微重力和辐照两个方面。因此设计空间单一辐照、单一微重力以及辐照和微重力复合因素等三个试验条件。

[0045] 在育种卫星中安放1g离心机，以克服空间微重力的影响，营造单一辐照条件；在卫星中放置铅罐，屏蔽掉空间绝大部分辐射剂量，营造单一微重力条件；样品直接放置在种子星铁罐中，使其处于辐照和微重力复合条件下。

[0046] 4、类球红细菌SBL-11突变株的地面筛选、分离、提取

[0047] 1)、地面筛选

[0048] 在无菌条件下取培养面积为0.5平方厘米的搭载回收样品，用5毫升无菌水洗脱菌体到无菌离心管中，用移液器吸打均匀菌体洗脱液，取0.5毫升该菌液到4.5毫升无菌水-4 -5中，吸打均匀，以此类推，做倍比稀释。取10 和10 稀释液涂布到平板培养基，每块平板上涂50-250微升稀释菌液，每个稀释梯度涂多块平板。待菌液被培养基吸收后于培养箱中
28-45℃倒置培养2-7天。

[0049] 待平板上长出菌落后，挑选颜色变深或呈粉色，且菌落较大的用小量摇瓶发酵，进行初筛。初筛菌株的发酵液于8000rpm条件下离心8分钟，取沉淀60-80℃烘干，研磨后按质量体积比(1∶100)加入无水乙醇，超声处理1-2小时。处理液8000rpm条件下离心10分钟，取上清液利用高效液相色谱进行检测。挑选辅酶Q10含量比对照菌株高的深颜色菌落进行复筛。

[0050] 在平板培养物中共获得328个单菌落，其中颜色深、菌落大的73个。将此73个菌