冻干甲型肝炎减毒活疫苗及其制备方法

摘要

本发明涉及一种冻干甲型肝炎减毒活疫苗及其制备方法，所述疫苗由下列体积比的原料组成：甲型肝炎减毒活疫苗∶冻干保护剂＝1∶0.5～1.5，其中冻干保护剂即海藻糖与甘氨酸的混合水溶液的组成为：海藻糖2～10克/100毫升，甘氨酸3.2～16克/100毫升，溶剂为水，其中溶质甘氨酸与海藻糖的质量比即甘氨酸∶海藻糖≥1.6。将疫苗与冻干保护剂混合合，经过冻干工艺制得。本发明提供的冻干甲型肝炎减毒活疫苗与现有的液体疫苗相比，冻干后其感染性滴度无显著变化，但其热稳定性显著提高，并且经动物实验证实具有良好的安全性与免疫原性。冻干甲型肝炎减毒活疫苗的有效期可延长至18个月，而液体剂型只为6个月，具有重大经济效益和应用价值。

权利要求

1.一种冻干甲型肝炎减毒活疫苗，由下列体积比的原料组成：甲型肝炎减毒活疫苗∶冻干保护剂＝1∶0.5～1.5，其特征在于所述冻干保护剂即海藻糖与甘氨酸的混合水溶液的组成为：海藻糖2～10克/100毫升，甘氨酸3.2～16克/100毫升，溶剂为水，其中溶质甘氨酸与海藻糖的质量比即甘氨酸∶海藻糖≥1.6。

2.根据权利要求1所述的冻干甲型肝炎减毒活疫苗，其特征在于所述甲型肝炎减毒活疫苗为市购产品。

3.根据权利要求1所述的冻干甲型肝炎减毒活疫苗，其特征在于所述海藻糖、甘氨酸均为市购产品。

4.根据权利要求1所述的冻干甲型肝炎减毒活疫苗，其特征在于所述水为纯水或者注射用水或者双蒸水。

5.一种如权利要求1所述的冻干甲型肝炎减毒活疫苗的制备方法，其特征在于经过下列工艺步骤：A、将甲型肝炎减毒活疫苗与冻干保护剂按1∶0.5～1.5的体积比进行混合，所述冻干保护剂即海藻糖与甘氨酸的混合水溶液的组成为；海藻糖2～10克/100毫升，甘氨酸

3.2～16克/100毫升，溶剂为水，其中溶质甘氨酸与海藻糖的质量比即甘氨酸∶海藻糖≥1.6；

B、将步骤A的混合物分装至西林瓶中，每瓶0.5ml，半加塞后放入冻干机腔体内，以

0.4～0.6℃/min的速度将温度降至-40±1℃，维持4～8小时；然后以0.8～1.2℃/min的速度升温至-15±1℃；再以0.04～0.06mbar真空度抽真空8～12小时，同时维持隔板温度-15±1℃；之后以1.4～1.6℃/min的速度升温至25±1℃，维持6～10小时，即得冻干甲型肝炎减毒活疫苗。

说明书

冻干甲型肝炎减毒活疫苗及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种冻干甲型肝炎减毒活疫苗及其制备方法，属于生物制品技术领域。

背景技术

[0002] 甲肝疫苗是预防甲型肝炎的有效手段。目前国内外生产的甲肝疫苗(包括灭活疫苗和减毒活疫苗)都是液体剂型，其基本特点是在保存和运输过程中必须依赖于冷链系统以保证其质量。我国作为一个人口众多、经济不发达、地理环境复杂、交通不方便的发展中国家，液体剂型的甲肝减毒活疫苗在保存和运输过程中难于处于严格的冷链环境中，常因此而影响疫苗的质量。利用冷冻干燥技术将甲型肝炎减毒活疫苗制成冻干剂型，能够更有效地保障疫苗的热稳定性和免疫原性。但当采用现有技术对疫苗进行冷冻干燥时，由于甲型肝炎病毒对热较为敏感，在冻干过程中疫苗的活性损失很大，冻干后病毒滴度很低。因此，有必要研究新的技术方案，以提高冻干后甲型肝炎减毒活疫苗的滴度，并且保证它的热稳定性。

发明内容

[0003] 本发明的第一个目的是提供了一种冻干甲型肝炎减毒活疫苗。

[0004] 本发明的第二个目的在于提供一种冻干甲型肝炎减毒活疫苗的制备方法。

[0005] 本发明的第一个目的通过下列技术方案实现：一种冻干甲型肝炎减毒活疫苗，由下列体积比的原料组成：甲型肝炎减毒活疫苗∶冻干保护剂＝1∶0.5～1.5，其特征在于所述冻干保护剂即海藻糖与甘氨酸的混合水溶液的组成为：海藻糖2～10克/100毫升，甘氨酸3.2～16克/100毫升，溶剂为水，其中溶质甘氨酸与海藻糖的质量比即甘氨酸：海藻糖≥1.6。

[0006] 所述甲型肝炎减毒活疫苗为市购产品。

[0007] 所述海藻糖、甘氨酸均为市购产品。

[0008] 所述水为现有技术中常规的纯水或者注射用水或者双蒸水。

[0009] 本发明的第二个目的通过下列技术方案实现：一种冻干甲型肝炎减毒活疫苗的制备方法，其特征在于经过下列工艺步骤：

[0010] A、将甲型肝炎减毒活疫苗与冻干保护剂按1∶0.5～1.5的体积比进行混合，其中冻干保护剂即海藻糖与甘氨酸的混合水溶液的组成为：海藻糖2～10克/100毫升，甘氨酸3.2～16克/100毫升，溶剂为水，其中溶质甘氨酸与海藻糖的质量比即甘氨酸∶海藻糖≥1.6；

[0011] B、将步骤A的混合物分装至西林瓶中，每瓶0.5ml，半加塞后放入冻干机腔体内，以0.4~0.6℃/min的速度将温度降至-40±1℃，维持4~8小时；然后以0.8~1.2℃/min的速度升温至-15±1℃；再以0.04~0.06mbar真空度抽真空8~12小时，同时维持隔板温度-15±1℃；之后以1.4~1.6℃/min的速度升温至25±1℃，维持6~10小时，即得冻干甲型肝炎减毒活疫苗。

[0012] 本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：1)冻干后疫苗的滴度不变；2)热稳定性好，通常在37℃放置7天时，液体疫苗的感染性滴度平均要下降0.8logCCID50/ml，而本发明提供的冻干疫苗其感染性滴度则不变；3)冻干疫苗具有良好的安全性和免疫原性，本发明配方成分明确，配方简单，制备方法简单易行，易于实施，疫苗制备工艺步骤可操作性强，利于产品的标准化大规模生产。

[0013] 本发明解决了下列技术难点：由于甲肝病毒对热敏感，在冻干过程中疫苗的活性损失很大，冻干后感染性滴度很低。另经研究表明，甲型肝炎病毒在蔗糖基质中冻干后，病毒的活性大大下降。因此选择冻干保护剂，这对冻干甲型肝炎减毒活疫苗起着至关重要的作用。又经研究表明，在干燥时海藻糖起着保护细胞与生物大分子的作用，例如，抗血清抗体在有海藻糖存在时，室温或37℃下空气干燥后，在室温贮存几年其生物活性仍不会发生明显变化。海藻糖是由两个葡萄糖分子通过半缩醛羟基缩合而成，无毒无害，化学性质非常稳定，在体内可被酶水解成葡萄糖而被利用。所以，本专利的发明人将海藻糖应用于甲型肝炎减毒活疫苗的冻干保护剂中，经过多年的潜心研究与实验，并付出了创造性的劳动，筛选到一组最佳的冻干保护剂，并将保护剂与甲型肝炎减毒活疫苗混合后进行冷冻干燥，获得的冻干疫苗感染性滴度(l0gCCID50/ml)与冻干前比较无明显差异(P>0.05)，具有较好的稳定性，冻干后疫苗的残余水份含量<3.0％，达到生物制品规程要求，经小白鼠安全性试验合格，经临床研究证实该冻干甲型肝炎减毒活疫苗具有良好的临床安全性和免疫原性。其结果如下：

[0014] 1、实施例2提供的冻干甲型肝炎减毒活疫苗的水分含量(W/V％)见表1.[0015] 2、实施例2提供的冻干甲型肝炎减毒活疫苗与冻干前的相同甲型肝炎减毒活疫苗的感染性滴度变化见表2。

[0016] 从表2看出：经过6批试验，冻干前感染性滴度平均值为7.115logCCID50/ml，冻干后感染性滴度平均值为7.073logCCID50/ml，两组无显著差异(P>0.05)。

[0017] 经反复验证，冻干前、后两组感染性滴度平均值无显著差异(P>0.05)。表明该保护剂组合对甲型肝炎减毒活疫苗(H2株)耐受冻干具有优良的保护作用。

[0018] 3、实施例2提供的冻干甲型肝炎减毒活疫苗在不同温度下感染性滴度变化：

[0019] 冻干甲型肝炎减毒活疫苗在45℃下感染性滴度变化，见表3。冻干甲型肝炎减毒活疫苗在37℃下感染性滴度变化，见表4。冻干甲型肝炎减毒活疫苗在室温下稳定性，见表5。冻干甲型肝炎减毒活疫苗在2~8℃下稳定性研究，结果见表6。

[0020] 从表3~表6可以看出，冻干甲型肝炎减毒活疫苗在2～8℃下24个月内其感染性滴度无显著变化(P>0.05)，说明其在2～8℃下具有较好的稳定性。而液体疫苗在6个月内无显著变化，但6个月后其感染性滴度则逐渐下降。到18个月时其感染性滴度平均下降3.5～4.0logCCID50/ml。

[0021] 结果表明：冻干甲型肝炎减毒活疫苗分别在45℃下1天、37℃下6天、室温下28天感染性滴度维持不变，而液体剂型的甲肝减毒活疫苗在同等条件下感染性滴度明显下降，说明其具有良好的热稳定性。冻干甲型肝炎减毒活疫苗在2～8℃下24个月内其感染性滴度无显著变化。说明其在2～8℃下保存2年内稳定，其感染性滴度无显著变化。此外，在45℃下、37℃下及室温下冻干甲型肝炎减毒活疫苗的稳定性明显优于液体疫苗。

[0022] 4、冻干甲型肝炎减毒活疫苗安全性研究

[0023] 本安全性试验使用实施例1、2、3共3批冻干甲型肝炎减毒活疫苗，每批成品用注射水溶解后混合均匀，每一批用5只17～20g小白鼠，每只腹腔注射0.5ml进行安全试验，每日观察，共观察7天。结果见表7。

[0024] 从表7可以看出，3批冻干甲型肝炎减毒活疫苗安全试验合格，证明H2株冻干甲型肝炎减毒活疫苗具有很好的安全性。

[0025] 5、冻干甲型肝炎减毒活疫苗冻干保护剂急性毒理反应研究

[0026] 本试验共使用实施例1、2、3的冻干保护剂及所制备的冻干疫苗，并各取2份作为样品共6个样品。冻干保护剂，系无色透明液体，人用剂量为1ml/次。通过皮下注射，肌肉注射和静脉注射三种给药途径，观察冻干保护剂的急性毒性反应。试验动物采用7周龄健康昆明种小鼠，每组20只。各组动物禁食不禁水12小时后，第一、二组以20ml/kg剂量在24小时内分别皮下注射和肌肉注射冻干保护剂3次，每次间隔8小时；第三组动物以20ml/kg剂量经尾静脉注射给受试物一次。结果见表8。

[0027] 各组动物给药后，其外观、行为活动、精神状态、食欲、大小便、被毛、肤色及呼吸等均无明显毒性反应。观察7天，无一动物死亡。处死解剖小鼠，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾脏内脏组织，也未见明显异常。

[0028] 试验结果表明：(1)小鼠一日内以20ml/kg的剂量3次皮下注射和肌肉注射冻干保护剂，无明显毒性反应发生。小鼠一日内皮下注射和肌肉注射冻干保护剂的最大耐受量为60ml/kg，此剂量相当于人用量的3000倍。(2)小鼠一次静脉注射冻干保护剂的最大耐受量为20ml/kg。所选用的冻干保护剂是根据《中华人民共和国药典》，并经急性毒理反应研究证明无毒副作用。

[0029] 6、冻干甲型肝炎减毒活疫苗的检定

[0030] 按《冻干剂型的甲肝减毒活疫苗制造与检定规程》进行检定，各项指标均合格。

[0031] (1)物理检查：为乳白色疏松体，溶解后为无色透明、澄清无异物液体。

[0032] (2)残余水份含量：冻干疫苗残余水份含量≤3％。

[0033] (3)病毒滴定及稳定性试验：每批冻干疫苗，取3～5支样品混合进行病毒滴定，再取3～5支放37℃7天，与前者同时进行病毒滴定，方法同前。37℃放置7天后滴度下降不超过1个logCCID50/ml。疫苗滴度不低于6.5logCCID50/ml。

[0034] (4)安全试验：用14～16g小白鼠4只，每只腹腔注射1ml，注射后密切观察，30分钟内无异常反应，观察3天均健存。

[0035] (5)残余牛血清蛋白含量测定：用检定所认可的方法测定，残余牛血清白蛋白含量≤50ng/ml。

[0036] 免疫原性

[0037] 以冻干疫苗和液体疫苗一人份剂量分别腹腔注射免疫小鼠，并设空白对照组，于免疫后1、2个月血清抗体检测结果显示冻干疫苗和液体疫苗抗体阳转率及血清抗体滴度无明显差异，见表9，表10。

[0038] 由上述一系列结果可以看出，冻干甲型肝炎减毒活疫苗具有良好的安全性和免疫原性。

具体实施方式

[0039] 下面结合实施例对本发明做进一步描述，但本发明之内容并不局限于此。

[0040] 实施例1

[0041] 冻干保护剂由下列成分组成：海藻糖2克，甘氨酸3.5克，加纯水溶解定容至100毫升；

[0042] 按甲型肝炎减毒活疫苗∶冻干保护剂＝1∶0.5的体积比，在甲型肝炎减毒活疫苗中加入上述冻干保护剂，混合后分装于西林瓶中，每瓶0.5ml，半加塞后放入冻干机腔体中，以0.4℃/min的速度将温度降至-40℃，维持4小时；然后以0.8℃/min的速度升温至-15℃；再以0.04mbar真空度抽真空8小时，维持隔板温度-15℃；随后以1.4℃/min速度升温至25℃，维持8小时，最后压塞后出箱，即得冻干甲型肝炎减毒活疫苗。

[0043] 实施例2

[0044] 冻干保护剂由下列成分组成：海藻糖5克，甘氨酸9克，加纯水溶解定容至100毫升；

[0045] 按甲型肝炎减毒活疫苗∶冻干保护剂＝1∶1的体积比，在甲型肝炎减毒活疫苗中加入上述冻干保护剂，混合后分装于西林瓶中，每瓶0.5ml，半加塞后放入冻干机腔体中，以0.5℃/min的速度将温度降至-40℃，维持6小时；然后以1℃/min的速度升温至-15℃；再以0.05mbar真空度抽真空10小时，隔板温度维持-15℃；随后以1.5℃/min速度升温至
25℃，维持8小时；最后压塞后出箱，即得冻干甲型肝炎减毒活疫苗。

[0046] 实施例3

[0047] 冻干保护剂由下列成分组成：海藻糖10克，甘氨酸16克，加纯水溶解定容至100毫升；

[0048] 按甲型肝炎减毒活疫苗∶冻干保护剂＝1∶1的体积比，在甲型肝炎减毒活疫苗中加入上述冻干保护剂，混合后分装于西林瓶中，每瓶0.5ml，半加塞后放入冻干机腔体中，以0.5℃/min的速度将温度降至-40℃，维持6小时；然后以1℃/min的速度升温至-15℃；再以0.05mbar真空度抽真空10小时，隔板温度维持-15℃；随后以1.5℃/min速度升温至
25℃，维持8小时；最后压塞后出箱，即得冻干甲型肝炎减毒活疫苗。

[0049] 实施例4

[0050] 冻干保护剂由下列成分组成：海藻糖2克，甘氨酸16克，加纯水溶解定容至100毫升；

[0051] 按甲型肝炎减毒活疫苗∶冻干保护剂＝1∶1.5的体积比，在甲型肝炎减毒活疫苗中加入上述冻干保护剂，混合后分装于西林瓶中，每瓶0.5ml，半加塞后放入冻干机腔体中，以0.6℃/min的速度将温度降至-40℃，维持8小时；然后以1.2℃/min的速度升温至-15℃；再以0.06mbar真空度抽真空12小时，隔板温度维持-15℃；随后以1.6℃/min速度升温至25℃，维持10小时；最后压塞后出箱，即得冻干甲型肝炎减毒活疫苗。

[0052] 表1 甲型肝炎减毒活疫苗冻干后水分含量(W/V％)

[0053]

[0054] 表2 甲型肝炎减毒活疫苗冻干前、后感染性滴度变化

[0055]

[0056] 表3 冻干与液体剂型的甲肝减毒活疫苗在45℃下感染性滴度变化

[0057]

[0058] 表4 冻干与液体剂型甲肝减毒活疫苗在37℃下感染性滴度变化

[0059]

[0060] 表5 冻干与液体甲型肝炎减毒活疫苗在室温下感染性滴度变化

[0061]

[0062] 表6 冻干疫苗与液体甲型肝炎减毒活疫苗2~8℃下感染性滴度变化，单位：logCCID50/ml

[0063]

[0064] 表7 不同批次冻干疫苗接种小白鼠反应观察

[0065]

[0066] 表8 6批冻干保护剂急性毒理反应结果

[0067]

[0068] 表9 免疫后不同时间的抗HAV阳转率

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