使用具有被打断的葡糖脱氢酶基因(GMS01)的微生物来生产生物质的工艺

摘要

本发明涉及经遗传工程改造的微生物，其被改造来增加从碳源(例如葡萄糖)生产生物质的产率和效率。本发明还提供了产生此类微生物的方法。本发明还涉及包含下述基因的多核苷酸序列，所述基因编码涉及诸如葡萄糖的碳源向生物质的生物转化的蛋白质。本发明还涉及：包含该新颖基因的全长多核苷酸序列的多核苷酸及其片段，所述多核苷酸编码的新颖的多肽及其片段，以及它们的功能等同物。本发明还包括使用多核苷酸和经修饰的多核苷酸序列转化宿主微生物的方法，由此产生具有降低的碳源转移的微生物，即从碳源(例如葡萄糖)进行的生物质生产的产率和/或效率更高。

权利要求

1.选自Gluconobacter oxydans的微生物，其中编码具有葡糖脱氢酶活性的多肽的多核苷酸被打断，所述多核苷酸是选自下组的多核苷酸：(a)编码如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

(b)如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的多核苷酸；和(c)多核苷酸，其核苷酸序列可使用来自Gluconobacter的基因组DNA作为模板，并使用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的引物组，通过聚合酶链式反应获得；

或者是此类多核苷酸的互补链。

2.如权利要求1所述的微生物，其以至少0.2g生物质/g葡萄糖的产率从葡萄糖生产生物质。

3.如权利要求2所述的微生物，其中所述产率为至少0.3g生物质/g葡萄糖。

4.根据权利要求1所述的微生物，其是Gluconobacter oxydans DSM17078。

5.如权利要求1所述的微生物用于从碳源生产生物质的用途。

6.如权利要求5所述的用途，其中，所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、纤维素、纤维二糖、乳糖、异麦芽糖、葡聚糖、海藻糖及其混合物构成的组。

7.用根据权利要求1所述的微生物生产生物质的工艺，其中，在水性营养培养基中，在允许从碳源生产生物质的条件下培养所述微生物。

8.如权利要求7所述的工艺，其中，所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、纤维素、纤维二糖、乳糖、异麦芽糖、葡聚糖、海藻糖及其混合物构成的组。

说明书

使用具有被打断的葡糖脱氢酶基因(GMS 01)的微生物来

生产生物质的工艺

[0001] 本发明涉及经遗传工程改造的微生物，其被改造来增加从碳源(例如葡萄糖)生产生物质(biomass)的产率和效率。本发明还提供了产生此类微生物的方法。本发明还涉及包含下述基因的多核苷酸序列，所述基因编码涉及碳源生物转化，例如葡萄糖向生物质的生物转化的蛋白质。本发明还涉及：包含该新颖基因的全长多核苷酸序列的多核苷酸及其片段，所述多核苷酸编码的新颖的多肽及其片段，以及它们的功能等同物。本发明还包括使用多核苷酸和经修饰的多核苷酸序列转化宿主微生物的方法，由此产生具有降低的碳源转移(diversion)的微生物，即从碳源(例如葡萄糖)进行的生物质生产的产率和/或效率更高。

[0002] 碳源的生物转化可能涉及很多不同代谢途径，以及涉及若干酶促步骤，以产生生物质，其中，酶可位于宿主细胞的胞质溶胶中、膜上或周质空间中。此外，转运蛋白也可能在碳源向生物质的高效转化中具有重要作用。

[0003] 例如，在乙酸细菌(其是专性需氧的革兰氏阴性微生物，属于Acetobacter、Gluconobacter和Gluconacetobacter属)的情况下，这些微生物能通过与膜结合的D-葡糖脱氢酶在周质膜水平上将D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸盐/酯，并将D-葡萄糖酸盐/酯转运进胞质溶胶。然后通过葡萄糖酸激酶将D-葡萄糖酸盐/酯磷酸化为D-葡萄糖酸盐/酯-6-磷酸盐/酯。除此之外，人们相信，D-葡萄糖可被直接转运进胞质溶胶，然后通过胞质溶胶中的NAD(P)-依赖性D-葡萄糖脱氢酶将其转化为D-葡萄糖酸盐/酯。此外，转运进胞质溶胶的D-葡萄糖还可先被磷酸化为D-葡萄糖-6-磷酸盐/酯，然后再被脱氢成D-葡萄糖酸盐/酯-6-磷酸盐/酯。D-葡萄糖酸盐/酯-6-磷酸盐/酯可进入磷酸戊糖途径，其被进一步代谢，产生以NAD(P)H形式存在的还原能量和生长及维持所必需的三羧基化合物。

[0004] 在葡萄糖代谢中具有活性的蛋白质，尤其是酶，在本文中被称为涉及葡萄糖代谢系统(Glucose Metabolization System)。此类蛋白质在本文中被缩写为GMS蛋白，其在碳源(例如葡萄糖)向生物质的直接代谢或生物转化中发挥作用。

[0005] 但是，此类生物转化的一个缺点在于，碳源或中间产物通过所述生物转化过程转移，使得，例如，下一个(酶促)步骤不能以最优方式进行，导致损失了可获得的用于向生物质的转化的碳底物材料，以及由此导致的能量(以例如ATP或NADPH的形式存在)损失。在例如葡萄糖向生物质的生物转化的情况下，该损失可能是由于将葡萄糖或其中间产物转运出胞质溶胶导致的，或者是使用葡萄糖或得到的中间产物作为不导致产生生物质的其它途径的底物而导致的。

[0006] 本发明的一个目的是提供被改造的微生物，是以下述方式对其进行改造的，所述方式使得经过碳源(例如葡萄糖)的生物转化的碳源转移被改变，例如，通过降低碳源转移，从而从此类碳源生产更高产量和/或产率的生物质。

[0007] 令人吃惊地，现已发现，GMS蛋白或此类蛋白的具有针对或涉及碳源(例如，葡萄糖)生物转化的活性的亚基在对生物质的生产中具有重要作用。

[0008] 在一种实施方式中，本发明的GMS蛋白选自氧化还原酶[EC 1]，优选选自在供体+ +的CH-OH上发挥作用的氧化还原酶[EC 1.1]，更优选选自用NAD 或NADP 作为受体的氧化还原酶[EC 1.1.1]以及具有醌或类似化合物受体的氧化还原酶[EC 1.1.5]，最优选是NADP依赖性葡糖脱氢酶[EC1.1.1.47]和PQQ依赖性葡糖脱氢酶[EC 1.1.5.2]，或者，本发明的GMS蛋白选自转移酶[EC 2]，优选地，转移含磷基团的转移酶[EC 2.7]，更优选地，具有醇基团受体的磷酸转移酶[EC 2.7.1]，最优选地，葡萄糖酸激酶[EC 2.7.1.12]。

[0009] 此外，GMS蛋白或此类蛋白的具有针对或涉及碳源(例如，葡萄糖)向生物质的生物转化的活性的亚基可选自与膜结合的PQQ依赖性D-葡糖脱氢酶，NAD(P)-依赖性D-葡糖脱氢酶，胞质D-葡糖激酶，具有针对或涉及D-葡萄糖酸盐/酯同化的活性的酶或酶亚基，例如与膜结合的FAD依赖性D-葡萄糖酸盐/酯脱氢酶(形成2-酮基-D-葡萄糖酸盐/酯)，与膜结合的PQQ依赖性D-葡萄糖酸盐/酯脱氢酶(形成5-酮基-D-葡萄糖酸盐/酯)，胞质D-葡萄糖酸盐/酯脱氢酶，具有针对或涉及2KD同化的活性的酶或酶亚基，例如与膜结合的FAD依赖性2-酮基-D-葡萄糖酸盐/酯脱氢酶，NAD(P)-依赖性葡糖-1-脱氢酶，含核黄素的葡萄糖酸盐/酯-2-脱氢酶，葡萄糖酸盐/酯-5-脱氢酶(5-酮基-D-葡萄糖酸盐/酯还原酶)和胞质NAD(P)-依赖性2-酮基-D-葡萄糖酸盐/酯脱氢酶构成的组。

[0010] 特别地，现已发现，具有下述核苷酸序列的多核苷酸编码的GMS蛋白在碳源(例如，葡萄糖)向生物质的生物转化中具有重要作用，该核苷酸序列能在优选高度严谨条件下与SEQ ID NO：1所示的序列杂交。现还已发现，通过在微生物(例如Gluconobacter)中对根据本发明的此类核苷酸进行遗传改变，可很大程度地提高所述微生物所述生物转化的的效率，导致，例如，从碳源(例如，葡萄糖)到生物质的更高的产量和/或产率。

[0011] 随后，本发明涉及选自下述组的多核苷酸或此类多核苷酸的互补链，所述组由：

[0012] (a)编码包含根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

[0013] (b)包含根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列的多核苷酸；

[0014] (c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用来自微生物的基因组DNA作为模板，并使用根据SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4的引物组，通过核酸扩增(例如聚合酶链式反应)来获得；

[0015] (d)多核苷酸，其包含编码被(a)至(c)中任一项的多核苷酸编码的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一个或多个氨基酸残基较之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有氧化还原酶[EC 1]，优选在供体的CH-OH上发挥作用的氧化还原酶[EC 1.1](GMS 01)的活性；

[0016] (e)编码氧化还原酶[EC 1]，优选在供体的CH-OH上发挥作用的氧化还原酶[EC1.1](GMS 01)的多核苷酸，其互补链能在严谨条件下与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸互补；以及

[0017] (f)编码氧化还原酶[EC 1]，优选在供体的CH-OH上发挥作用的氧化还原酶[EC1.1](GMS 01)的多核苷酸，其与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸至少70％相同，例如85％、90％或95％相同；

[0018] 构成。

[0019] 我们发现，本文中描述的SEQ ID NO：2示出的从Gluconobacteroxydans DSM17078分离的GMS蛋白是特别有用的GMS蛋白，因为编码所述GMS蛋白的基因看起来在微生物(特别是细菌，例如乙酸细菌，例如Gluconobacter，Acetobacter和Gluconacetobacter)中碳源(例如葡萄糖)向生物质的生物转化中发挥关键作用。因此，本发明涉及编码根据SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸。该蛋白可由SEQ ID NO：1示出的核苷酸序列编码。本发明因此还涉及包含根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列的多核苷酸。

[0020] 上文确定的核苷酸序列和氨基酸序列被用作为“查询序列”，以便用来自National Center for Biotechnology[NCBI]的BLAST或Blast2程序(版本2)针对数据库PROSW-SwissProt(完全发布版本加上增加的更新)进行搜索。根据这些搜索结果，将根据SEQ ID NO：1的GMS 01多核苷酸标注为编码具有与膜结合的PQQ-依赖性葡糖脱氢酶活性的蛋白。

[0021] 可使用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板，使用合适的寡核苷酸引物(例如根据SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的核苷酸引物)，按照标准PCR扩增技术，通过核酸扩增来获得根据本发明的核酸。由此扩增出的核酸可被克隆进合适的载体，并通过DNA序列分析对其进行表征。

[0022] 用于反应的模板可以是通过对从已知包含或怀疑包含根据本发明的多核苷酸的菌株制备的mRNA进行逆转录获得的cDNA。PCR产物可被亚克隆和测序，以确保扩增出的序列代表本文所述的新的核酸序列或其功能等同物的序列。

[0023] 然后可通过多种已知方法，用PCR片段分离全长cDNA克隆。例如，可标记扩增出的片段，用其筛选噬菌体或粘粒(cosmid)cDNA文库。或者，经标记的片段可用于筛选基因组文库。

[0024] 因此，本发明涉及包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用来自微生物的基因组DNA作为模板，并使用根据SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的引物组，通过核酸扩增(例如聚合酶链式反应)来获得。

[0025] 本发明还涉及下述多核苷酸，其包含编码本文所述的多核苷酸编码的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一个或多个氨基酸残基较之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有GMS多肽(优选地，GMS 01多肽)的活性。

[0026] 本发明还涉及下述多核苷酸，其编码GMS多肽(优选地，GMS 01多肽)，其互补链能在严谨条件下与本文定义的多核苷酸互补。

[0027] 本发明还涉及下述多核苷酸，其与本文定义的多核苷酸至少70％相同，并且其编码GMS多肽；本发明还涉及是上文定义的多核苷酸的互补链的多核苷酸。

[0028] 本发明还涉及可用于扩增或探测根据本发明的DNA以及用于鉴定也携带此类基因的相关微生物种或科的引物、探针和片段。

[0029] 本发明还涉及包括本发明多核苷酸的载体和用所述多核苷酸或所述载体遗传工程改造过的微生物。

[0030] 本发明还涉及生产能表达上文定义的多核苷酸编码的多肽的微生物和上文定义的多核苷酸编码的多肽的工艺。

[0031] 本发明还涉及下述微生物，其中，GMS多肽(优选地，GMS 01多肽)的活性降低或消失，使得从通过从碳源(例如葡萄糖)的生物转化生产的生物质的产率和/或产量增加。

[0032] 可转化为生物质的合适碳源可以例如是葡萄糖或选自下述碳源，所述碳源的同化导致葡萄糖(特别是D-葡萄糖)形成，它们例如是蔗糖、麦芽糖、淀粉、纤维素、纤维二糖、乳糖、异麦芽糖、葡聚糖、海藻糖或其混合物。

[0033] 技术人员将知道如何使GMS蛋白(优选地，GMS 01蛋白)的活性降低或消失。这例如可以通过使GMS蛋白(优选地，GMS 01蛋白)的比活性减少或消失来完成，或者通过对宿主生物进行遗传修饰来完成，所述遗传修饰以较之野生型生物产生更少或不产生GMS蛋白(优选地，GMS 01蛋白)的拷贝的方式来进行。

[0034] 在下述说明书中，将对达到此目的(即，通过使GMS 01蛋白的活性降低或消失，增加通过从碳源(例如葡萄糖)的生物转化生产的生物质的产率和/或产量)的方案进行详细描述。在进行必要修正后，这些方案可应用于其它GMS蛋白。

[0035] 为获得产生更少拷贝的或不产生GMS 01基因和/或蛋白的生物所进行的修饰包括：使用弱启动子，或者对GMS 01基因(的部分)或其调控元件加以突变(例如，插入、缺失或点突变)。使GMS 01蛋白比活性降低或消失也可通过本领域已知的方法来完成。此类方法可包括对GMS 01基因(的部分)的突变(例如，插入、缺失或点突变)。

[0036] 本领域中还已知可以通过将GMS 01蛋白与特定抑制剂相接触或与能与GMS 01蛋白发生特异性相互作用的其它物质相接触，来使给定蛋白质活性降低或消失。为鉴定出此类特定抑制剂，可表达GMS 01蛋白，并对存在怀疑能抑制GMS 01蛋白活性的化合物时的活性加以测试。可能的抑制用化合物可例如是针对GMS 01蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体。此类抗体可通过对合适的实验动物进行常规免疫方案来获得。

[0037] 本发明可以在携带有GMS 01基因或其同源体的任何微生物中进行。合适的微生物可选自酵母、藻类和细菌构成的组，它们可以是野生型菌株或通过标准的诱变方法和选择方法获得的突变体菌株以及重组菌株。此类酵母的例子可以是，例如，Candida、Saccharomyces、Zygosaccharomyces、Schizosaccharomyces 或 Kluyveromyces。 此 类藻类的例子可以是，例如，Chlorella。此类细菌的例子可以是，例如，Gluconobacter、Acetobacter、Gluconacetobacter、Ketogulonicigenium、Pantoea、Pseudomonas(例 如，Pseudomonas putida)和Escherichia(例如Escherichia coil)。优选的是Gluconobacter或 Acetobacter aceti，例 如，G.oxydans、G.cerinus、G.frateurii、A.aceti subsp.xylinum或A.aceti subsp.orleanus，优选地，G.oxydans DSM 17078。已按照《布达佩斯条约》，于2005年1月26日将Gluconobacter oxydans DSM 17078(以前称作Gluconobacter oxydans N44-1)保藏至Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)，Mascheroder Weg lB，D-38124Braunschweig，Germany。

[0038] 可用于本发明的微生物可被公众从不同来源获得，例如，DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)，Mascheroder Weg1B，D-38124Braunschweig，Germany、American Type Culture Collection(ATCC)，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108USA 或 Culture CollectionDivision，NITE Biological Resource Center，2-5-8，Kazusakamatari，Kisarazu-shi，Chiba，292-0818，Japan( 以 前 是 Institue for Fermentation，Osaka(IFO)，17-85，Juso-honmachi 2-chome，Yodogawa-ku，Osaka
532-8686，Japan)。保存到IFO的优选的细菌的例子例如是Gluconobacter oxydans(以前被称为G.melanogenus)IFO3293、Gluconobacter oxydans(以前被称为G.melanogenus)IFO3292、Gluconobacter oxydans(以前被称为G.rubiginosus)IFO3244、Gluconobacter frateurii( 以 前 被 称 为G.industrius)IFO3260、Gluconobacter cerinus IFO3266、Gluconobacter oxydans IFO 3287和Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO 3259，上述这些都于1954年4月5日被保藏；1975年10月22日保藏的Acetobacter aceti
subsp.xylinum IFO13693和1977年12月8日保藏的Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773。菌株Acetobacter sp.ATCC 15164也是优选细菌的例子，其被保藏于ATCC。菌株Gluconobacter oxydans(以前被称为G.melanogenus)N44-1是优选细菌的另一个例子，其是菌株IFO 3293的衍生物，在Sugisawa et al.，Agric，Biol.Chem.54：1201-1209，1990中对其有所描述。

[0039] 本发明的微生物可在DNA水平或蛋白质水平上携带其它修饰(见上文所述)，只要此类修饰对从底物(例如葡萄糖)生产生物质的产率、产量和/或效率具有直接影响即可。此类其它修饰可以例如影响编码上文所述的氧化还原酶或异构酶的其它基因，特别是，编码NAD(P)-葡糖脱氢酶、PQQ依赖性葡糖脱氢酶、FAD依赖性葡萄糖酸盐/酯-2-脱氢酶、NAD(P)-葡萄糖酸盐/酯-2-脱氢酶、葡萄糖酸盐/酯-5-脱氢酶、2-酮基葡萄糖酸盐/酯脱氢酶、2，5-二酮基葡萄糖酸盐/酯脱氢酶、葡萄糖酸盐/酯氧化酶、磷酸葡糖异构酶的基因，或编码涉及磷酸戊糖途径的其它酶，例如，6-磷酸葡萄糖酸盐/酯脱氢酶、6-磷酸葡糖内酯酶、核酮糖-5-磷酸盐/酯3-差向异构酶、转醛醇酶或转酮醇酶的基因，或者编码将磷酸戊糖途径与其它碳代谢途径连起来的酶，例如6-磷酸葡萄糖酸盐/酯脱水酶、果糖-1，6-二磷酸盐/酯或磷酸果糖激酶的基因。进行此类修饰的方法是本领域已知的，一些例子在本文中有进一步描述。

[0040] 根据本发明的另一目的，提供了本文定义的多核苷酸或者已用此类多核苷酸进行过遗传工程改造的微生物在从碳源高效生产生物质中的用途。

[0041] 本发明还涉及在微生物中表达内源基因的工艺，涉及在微生物中生产上文定义的多肽的工艺，以及生产能在给定碳源(例如葡萄糖)上生长的微生物的工艺。所有这些工艺都可包含改变微生物的步骤，其中，本文中使用的“改变”包括下述工艺，该工艺以使得生物质的产率和/或生产能力较之野生型生物有所提高的方式来进行“遗传改变”或“改变细胞培养基的组成和/或改变用于培养的方法”。本文中使用的“生物质的提高的产率”表示较之野生型微生物(即，没有被遗传改变的微生物)而言增加至少5％、10％、25％、30％、40％、50％、75％、100％、200％或者甚至超过500％，这取决于用于生长的碳源。

[0042] 术语“遗传工程改造”或“遗传改变”表示对活的生物体中遗传物质结构的科学改变。这包括生产和使用重组DNA。更特别地，这用于描述来自天然存在的生物而经遗传工程改造或修饰的生物。遗传工程改造可通过本领域已知的多种方法来进行，例如，基因替换，基因扩增，基因打断，使用质粒、病毒或其它载体进行的转化、转染。经遗传修饰的生物，例如，经遗传修饰的微生物通常还被称作重组生物，例如重组微生物。本发明的有利的实施方式通过从属权利要求而显而易见。根据本发明的教导，本领域技术人员将明白本发明的上述和其它方面以及上述和其它实施方式。

[0043] 通过对从Gluconobacter oxydans DSM 17078获得的基因组克隆进行测序，来测定包含编码GMS 01蛋白的SEQ ID NO：1的核苷酸序列的基因的序列。

[0044] 本发明还涉及编码SEQ ID NO：2所示的GMS 01多肽的至少一个生物活性片段或衍生物的多核苷酸。

[0045] 本文中使用的“生物活性片段或衍生物”表示保留有与SEQ ID NO：2所示的多肽基本相同的生物功能或活性的多肽。生物活性的例子可以例如是酶活、信号传递活性或抗体反应活性。术语“相同的生物功能”或“功能等同物”在本文中使用时表示蛋白质与SEQ ID NO：2所示的多肽具有基本相同的生物活性，例如，酶活性、信号传递活性或者抗体反应活性。

[0046] 本发明的多肽和多核苷酸优选以经分离的形式提供，优选地，被纯化至均质。

[0047] 术语“经分离的”表示：物质被移出其原来的环境(例如，如果其天然存在的话，就是天然环境)。例如，活的微生物中存在的天然存在的多核苷酸或多肽不是经分离的，但与天然系统中的一些或全部共存物质分开的同样的多核苷酸或多肽就是经分离的。此类多核苷酸可以是载体的一部分和/或此类多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，但仍然是经分离的，因为此类载体或组合物并非其天然环境的一部分。

[0048] 本文中使用的经分离的多核苷酸或核酸可以是这样的DNA或RNA，它们与从中获得该多核苷酸或核酸的生物的天然存在的基因组中紧密相邻的两条编码序列(5’末端一条，3’末端一条)并非紧密相邻。因此，在一种实施方式中，核酸包括与编码序列紧密相邻的5’非编码(例如，启动子)序列的一些或全部。术语“经分离的多核苷酸”因此包括，例如，加入到载体中、加入到自主复制质粒或病毒中，或者加入到原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA，或者作为独立于其它序列的单独分子(例如，通过PCR或限制性内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)存在的重组DNA。其还包括是杂合体基因的一部分的重组DNA，所述基因编码基本不含细胞物质、病毒物质或培养基(当通过重组DNA技术生产时)或化学前体或其它化学物质(当通过化学方式合成时)的额外多肽。此外，“经分离的核酸片段”是这样的核酸片段：其天然并不作为片段存在，并且将不会在天然状态被发现。

[0049] 本文中使用的术语“多核苷酸”、“基因”和“重组基因”指可与染色体DNA分离开的、包括编码蛋白质(例如，G.oxydans DSM 17078GMS蛋白)的开放读码框的核酸分子。多核苷酸可包括，例如，SEQ IDNO：1所示的多核苷酸序列或其片段以及基因序列上游或下游的区域，所述区域可包括，例如，对于由其获得的多肽的适当表达和稳定来说重要的启动子区域、调控子区域和终止子区域。

[0050] 基因可包括编码序列、非编码序列(例如，位于基因编码区域3’末端和5’末端的非翻译序列)和调控序列。此外，基因指本文定义的经分离的核酸分子。技术人员还将理解，导致GMS蛋白氨基酸序列的变化的DNA序列多态性可存在于种群(population)中，例如，Gluconobacter oxydans种群中。GMS 01基因中的此类遗传多态性可由于天然变异存在于种群的个体间，或者存在于不同种群的细胞中。典型地，此类天然变异可导致GMS 01基因核苷酸序列中1-5％的变化度。作为天然变异结果的、并且不会改变GMS蛋白的功能活性的GMS 01中的任何以及全部此类核苷酸变异和由此得到的氨基酸多态性也包括在本发明的范围内。

[0051] 本文中使用的术语“多核苷酸”或“核酸分子”意欲包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。可使用寡核苷酸类似物或衍生物(例如，肌苷或磷硫酰核苷酸)来合成核酸。此类寡核苷酸可用于：例如，制备具有改变的碱基配对能力或增加的对核酸酶的抗性的核酸。

[0052] 本文中提供的序列信息不应被狭义理解为需要包括进被错误鉴定的碱基。本文公开的特定序列可以很容易地用于从能将给定碳源(例如葡萄糖)转化为生物质的微生物(特别是Gluconobacter oxydans，优选地，Gluconobacter oxydans DSM 17078)中分离出完整基因，随后可容易地对该基因进行进一步的序列分析，由此鉴定出测序错误。

[0053] 除非特别指明，本文中通过对DNA分子进行测序来确定的所有核苷酸序列都是用自动DNA测序仪测定的，并且，本文测定的DNA分子编码的多肽的所有氨基酸序列都是通过对按照上文所述测定的DNA序列进行翻译来推测的。因此，如本领域所已知的，对由该自动方法所测定的任何DNA序列而言，本文所测定的任何核苷酸序列都可能含有一些错误。典型地，通过自动方法测出的核苷酸序列与被测序的DNA分子的实际核苷酸序列至少大约
90％同源，更典型地，至少大约95％至至少大约99.9％相同。通过其它方法，包括本领域内公知的人工DNA测序方法，可对实际序列进行更为精确的测定。也如本领域所已知的，测得的核苷酸序列中较之实际序列的单个插入或缺失将会导致核苷酸序列翻译中的读码框位移，使得：从此类插入或缺失的点开始，测得的核苷酸序列编码的预计氨基酸序列完全不同于被测序的DNA分子实际编码的氨基酸序列。

[0054] 本领域技术人员能鉴定出此类被错误鉴定的碱基，并且知道如何改正此类错误。

[0055] 根据本发明的核酸分子可以仅包含本发明提供的核酸序列(例如，SEQ ID NO：1示出的序列)的一部分或片段，例如，可用作为探针或引物的片段(例如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4)或编码根据本发明的蛋白的一部分的片段。从对GMS 01基因的克隆测定的核苷酸序列允许产生被设计来鉴定和/或克隆GMS 01家族其它成员以及来自其它物种的GMS01同源体的探针和引物。典型地，该探针/引物包含基本纯化的寡核苷酸，其典型地包含与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或其片段或衍生物的至少大约12或15个、优选大约18或20个、更优选大约22或25个、进一步更优选大约30、35、40、45、50、55、60、65或75个或更多个连续核苷酸杂交(优选地，在高度严谨条件下杂交)的核苷酸序列区域。

[0056] 还可通过聚合酶链式反应(PCR)，使用基于本文含有的序列信息设计的合成寡核苷酸引物，分离出包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的全部或一部分的核酸分子。

[0057] 可按照标准PCR扩增技术，用cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板，使用合适的寡核苷酸引物，来扩增本发明的核酸。由此扩增的核酸可被克隆进合适的载体，并通过DNA序列分析加以表征。

[0058] 根据本发明的多核苷酸的片段还可包含不编码功能多肽的多核苷酸。此类多核苷酸可作为探针或引物用于PCR反应。

[0059] 不管其编码功能或非功能多肽，根据本发明的核酸都可用作为杂交探针或聚合酶链式反应(PCR)引物。不编码具有GMS 01活性的多肽的本发明核酸分子的用途包括：(1)从cDNA文库(例如来自除Gluconobacter oxydans外的其它生物)分离编码本发明蛋白的基因或其等位变体，以及(2)用于探测特定细胞中所述蛋白的mRNA的表达的Northern印迹分析，或(3)用于消除和/或改变同源GMS 01基因在所述其它生物中的功能或活性。

[0060] 基于本文提供的核苷酸序列的探针可用于检测编码同样或同源蛋白(例如，其它生物中的)的转录本或基因组序列。可基于其与本文公开的G.xoydans GMS 01核酸的同源性，使用G.oxydans DNA或其一部分作为杂交探针，按照标准杂交技术，优选在高度严谨杂交条件下，分离出对应于本发明的G.xoydans GMS 01DNA的天然变体或非G.oxydans同源体的核酸分子，它们也包括在本发明内。

[0061] 在优选的实施方式中，探针还包含与其附着的标记基团，例如，标记基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶的辅助因子。

[0062] 例如，可使用基于本文教导的核苷酸序列设计的两套简并寡核苷酸引物库，进行PCR来分离同源基因序列。

[0063] 用于反应的模板可以是通过对从已知能表达或怀疑能表达根据本发明的多核苷酸的菌株制备的mRNA进行逆转录获得的cDNA。PCR产物可被亚克隆及测序，以确保扩增出的序列代表本文所述的新的核酸序列或其功能等同物的序列。

[0064] 然后可通过多种已知方法，用PCR片段分离全长cDNA克隆。例如，可标记扩增出的片段，用其筛选噬菌体或粘粒cDNA文库。或者，经标记的片段可用于筛选基因组文库。

[0065] PCR技术还可用于从其它生物分离全长cDNA。例如，可按照标准方案，从合适的细胞或组织来源分离RNA。可在RNA上进行逆转录反应，其中使用与扩增片段的5’最末端具有特异性的寡核苷酸引物，以引导第一链合成。

[0066] 然后可使用标准的末端转移酶反应，对得到的RNA/DNA杂交体“加尾”(例如，用鸟嘌呤)，可用RNaseH消化杂交体，然后可(例如，用poly-C引物)引导第二链合成。由此，可容易地分离扩增的片段上游的cDNA序列。关于有用的克隆策略的综述，参见，例如上文所述的Sambrook et al.和上文所述的Ausubel et al.。

[0067] 此外，编码GMS 01家族其它成员、具有与根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列不同的核苷酸序列的核酸也在本发明的范围内。此外，编码来自其它物种的GMS 01蛋白、具有与SEQ ID NO：1示出的核苷酸序列不同的核苷酸序列的核酸也在本发明的范围内。

[0068] 本发明还涉及经分离的多核苷酸，其可在严谨条件下(优选地，高度严谨条件下)与本发明的多核苷酸(例如，SEQ ID NO：1所示的多核苷酸)杂交。有利地，此类多核苷酸可从能将给定的碳源(例如葡萄糖)转化为生物质的微生物(特别是Gluconobacter oxydans，优选地，Gluconobacter oxydans DSM 17078)中获得。

[0069] 本文中用到的术语“杂交”被用来描述杂交和洗涤，在所述杂交和洗涤条件下，典型地，互相之间同源性为至少约50％、至少约60％、至少约70％、更优选为至少约80％、进一步优选为至少约85％到90％、最优选为至少95％的核苷酸序列保持相互杂交的状态。

[0070] 在一种实施方式中，本发明的核酸与SEQ ID NO：1所示的核酸序列或其互补序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源或更同源。

[0071] 此类杂交条件的一个优选的非限制的例子是在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，大约45℃下杂交，随后在1x SSC、0.1％SDS中，50℃下进行一次或多次洗涤，洗涤优选在55℃下，更优选在60℃下，进一步优选在65℃下进行。

[0072] 高度严谨条件包括，例如，在溶液中，例如含或不含100μg/ml的鲑鱼精DNA的DigEasyHyb溶液(Roche Diagnostics GmbH)中，或包含50％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、0.02％十二烷基磺酸钠、0.1％N-月桂酰肌氨酸和2％封闭试剂(Roche DiagnosticsGmbH)的溶液中，使用地高辛(DIG)标记的DNA探针(例如通过用Roche Diagnostics GmbH，68298Mannheim，Germany的DIG标记系统来制备的)在42℃温育2小时至4天，接着在2x SSC和0.1％SDS中，于室温下，洗两次膜，每次5至15分钟，然后在
65-68℃，于0.5x SSC和0.1％SDS或0.1x SSC和0.1％SDS中洗两次，每次15-30分钟。

[0073] 优选地，与本发明的核苷酸序列杂交(优选在高度严谨条件下杂交)的本发明的经分离的核酸对应于天然存在的核酸分子。本文中使用的“天然存在的”核酸分子指具有天然存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如，编码天然蛋白质)。在一种实施方式中，核酸编码天然的G.oxydans GMS 01蛋白。

[0074] 技术人员知道何种条件适合用于严谨杂交条件及高度严谨杂交条件。本领域中易于获得关于此类条件的其它指导，例如，在Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，N.Y.；和Ausubel et al.(eds.)，1995，Current Protocols in Molecular Biology，(John Wiley & Sons，N.Y.)中。当然，仅与poly(A)序列(例如mRNA的3’末端poly(A)区)或仅与T(或U)残基的互补性延伸区段(stretch)杂交的多核苷酸将不会被包括在用于与本发明核酸的一部分特异性杂交的本发明多核苷酸中，因为此类多核苷酸将与任何含有poly(A)延伸区段的核酸分子或其互补序列(例如，实际上是任何双链的cDNA克隆)杂交。

[0075] 采用典型手段，可以对从其它生物，例如能将给定碳源(例如葡萄糖)转化为生物质的微生物(特别是其它Gluconobacter物种)构建的基因组DNA或cDNA文库进行筛选。

[0076] 例如，可以通过Northern印迹分析来对Gluconobacter的菌株进行筛选获得同源多核苷酸。在探测到与本发明多核苷酸同源的转录本之后，可以利用本领域技术人员公知的标准技术，由分离自合适菌株的RNA来构建cDNA文库。或者，可以使用能与本发明多核苷酸杂交的探针来对全基因组DNA文库进行筛选。

[0077] 可使用标准的分子生物学技术以及本文提供的序列信息，来分离本发明的核酸序列，例如SEQ ID NO：1所示的核酸分子或其片段或衍生物。例如，可使用标准杂交和克隆技术(例如，Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2nd，ed.，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989所述)，使用SEQ ID NO：1所示的核酸分子的全部或一部分作为杂交探针，分离根据本发明的核酸分子。

[0078] 此外，可通过标准合成技术(例如，使用自动DNA合成仪)来制备对应于本发明的核苷酸序列的寡核苷酸或可与本发明的核苷酸序列杂交的寡核苷酸。

[0079] 术语“同源性”或“相同性百分比”在本文中可互换使用。就本发明的目的而言，在此定义：为确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的相同性百分比，本着最优比较的目的(例如，可以在第一条氨基酸序列或核苷酸序列上引入缺口，以与第二条氨基酸序列或核苷酸序列达到最佳的比对)，对序列进行比对。然后对相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸进行比较。如果第一条序列上某位置的氨基酸残基或核苷酸与第二条序列上相应位置的相同，那么这些分子在此位置就是相同的。两条序列间的相同性百分比是所述序列共有的相同位置的数量的函数(即，％相同性＝相同位置的数量/位置(即重叠位置)总数×100)。优选地，这两条序列长度相同。

[0080] 技术人员会知道有若干计算机程序可被用于确定两条序列间的同源性。例如，可以使用数学算法来完成对序列的比对和对两条序列间相同性百分比的确定。在一种优选的实施方式中，使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970))算法来确定两条氨基酸序列间的相同性百分比，所述算法已被合并到GCG软件包(可从http://www.accelrys.com获得)的GAP程序中，其中使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。技术人员会意识到：上述的所有不同参数将导致有细微区别的结果，但是使用不同算法时两条序列的总体％相同性不会有显著改变。

[0081] 在又一种实施方式中，使用GCG软件包(可从http://www.accelrys.com获得)的GAP程序来确定两条核苷酸序列间的相同性百分比，其中使用NWSgapdna.CMP矩阵，缺口权重为40、50、60、70或80，长度权重为1、2、3、4、5或6。在另一种实施方式中，使用E.Meyers和W.Miller(CABIOS，4：11-17(1989))的算法来确定两条氨基酸序列或核苷酸序列的相同性百分比，所述算法已被合并到ALIGN程序(2.0版)(可从http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi获得)中，其中使用PAM120权重残基表，缺口长度惩罚(penalty)为12，缺口惩罚为4。

[0082] 本发明的核酸和蛋白质序列可以进一步地被用作“查询序列”来进行针对公众数据库的搜索，例如，去鉴定相关序列或家族中其它成员。可以使用Altschul，et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的BLASTN和BLASTX程序(2.0版)来进行此类搜索。可以用BLASTN程序，以分数＝100，字长(word length)＝12来进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用BLASTX程序，以分数＝50，字长＝3来进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。本着比较的目的，为获得有缺口的比对，可以利用Altschul et al.，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中描述的Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序(例如BLASTX和BLASTN)的缺省参数。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。

[0083] 在另一种优选的实施方式中，本发明的经分离的核酸分子包含是本发明的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO：1所示的序列)的互补序列的核酸分子。与本文公开的核苷酸序列互补的核酸分子是这样的序列：其与SEQID NO：1所示的核苷酸序列足够互补，从而其可与所述核苷酸序列杂交，由此形成稳定的双链体(duplex)。

[0084] 在另一种优选的实施方式中，SEQ ID NO：1所示的本发明的核酸或其互补序列含有至少一处突变，所述突变导致基因产物具有经修饰的功能/活性。所述至少一处突变可通过本文所述的方法引入。在一个方面，所述至少一处突变导致产生这样的GMS 01蛋白：其功能和/或活性较之野生型副本而言被部分或全部破坏。用于引入此类突变的方法是本领域公知的。

[0085] 本文中使用的术语——活性的“降低”包括：减少生产生物中一种或多种多肽的活性，所述多肽是本文所述的相应的多核苷酸编码的。本领域中可获得用于降低给定蛋白(在本文的情况下是GMS 01蛋白)活性的多种方法。通常，可减少蛋白质的比活性或者可以减少蛋白质的拷贝数。

[0086] 为协助这种减少，对应于本文所述多核苷酸的基因的拷贝数可被减少，例如，通过基因的欠表达(underexpressed)或者对基因的打断来实现。如果基因的转录水平较之野生型基因降低，所述基因就被说成是“欠表达”。这可以通过例如Northern印迹杂交分析来测量，Northern印迹杂交分析对作为基因表达指示的mRNA的量进行定量。在本文中，如果产生的mRNA的量较之野生型基因产生的mRNA的量减少了至少1％、2％、5％、10％、25％、50％、75％、100％、200％或者甚至超过500％，那么该基因就是欠表达的。或者，可使用弱启动子来指导多核苷酸的表达。在另一种实施方式中，基因上游的启动子、调控区域和/或核糖体结合位点可被改变，以获得对表达的负调。还可以通过减少信使RNA的相对半寿期来降低表达。在另一种实施方式中，还可以通过在多肽氨基酸序列中利用能减少活性的一处或多处突变来减少多肽自身的活性。例如，改变多肽与其相应底物的亲和性可导致活性降低。类似地，可减少肽的相对半寿期。在基因表达降低或者活性降低的情况下，可通过改变细胞培养基的组成和/或用于培养的方法来达成这种降低。本文中使用的“降低的表达”或“降低的活性”表示较之野生型蛋白、多核苷酸、基因、或多核苷酸或多肽被降低之前存在的蛋白的活性和/或浓度而言，至少5％、10％、25％、50％、75％、100％、200％或者甚至超过500％的减少。还可通过将蛋白与其活性的特异性或一般性抑制剂相接触来降低GMS 01蛋白的活性。术语“降低的活性”、“减少的或消失的活性”在本文中可互换使用。

[0087] 本发明的另一方面涉及载体，所述载体含有编码本发明蛋白质的核酸或其功能等同物或一部分。在本文中使用的术语“载体”指能运送连接到其上的另一个核酸分子的核酸分子。一种载体类型是“质粒”，“质粒”指环状的双链DNA环，另外的DNA片断可以连接到所述的环上。另一种载体的类型是病毒载体，其中，另外的DNA片断可以连接到病毒基因组中。某些载体能在其被引入的宿主细胞中进行自主复制(例如，具有细菌的复制起点的细菌载体)。其它载体在被引入宿主细胞之后就被整合进宿主细胞的基因组中，因此它们与宿主基因组一同复制。

[0088] 此外，某些载体能指导将与其可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“表达载体”。通常，用于重组DNA技术的表达载体通常是质粒的形式。术语“质粒”和“载体”在本文中可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。但是，本发明意欲包括表达载体的此类其它形式，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们提供等同的功能。

[0089] 本发明的重组表达载体包含本发明的核酸，所述核酸存在的形式适合于该核酸在宿主细胞中的表达，这意味着该重组表达载体包括一段或多段调控序列，所述调控序列是基于将用于表达的宿主细胞来选择的，其被可操作地连接到将要表达的核酸序列上。在重组表达载体中，“可操作地连接”被用来表示：人们感兴趣的核苷酸序列被连接到调控序列上，所述的连接以允许该核苷酸序列表达(例如，在体外转录/翻译系统中表达，或者当载体被引入宿主细胞中时，在该宿主细胞中的表达)的方式进行。术语“调控序列”将包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，弱化子)。例如，在Goeddel；Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中对此类调控序列进行了描述。调控序列包括在很多种宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型或诱导型表达的调控序列，也包括仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的调控序列(例如，组织特异性调控序列)。本领域的技术人员将意识到，对表达载体的设计可能取决于以下因素：例如：对将被转化的宿主细胞的选择，期望获得的蛋白质的表达水平等。本发明的表达载体可以被引入宿主细胞，由此生产本文所述的核酸编码的蛋白质或肽，其包括但不限于：本文所述的核酸编码的突变体蛋白、其片段、其变体或功能等同物以及融合蛋白，例如，GMS
01蛋白、GMS 01蛋白的突变体形式、融合蛋白等。

[0090] 为了在合适的微生物中表达GMS 01蛋白，可对本发明的重组表达载体加以设计。例如，根据本发明的蛋白可在细菌细胞中表达，例如，在属于Gluconobacter、Gluconacetobacter或Acetobacter属的菌株中表达。在本发明中有用的表达载体包括源自染色体、游离体和病毒的载体，例如源自细菌质粒、噬菌体的载体和源自上述物质的组合的载体，例如源自质粒和噬菌体遗传元件的载体，例如粘粒和噬菌粒(phagemid)。

[0091] DNA插入应当被可操作地连接到合适的启动子上，启动子可以是组成型启动子或可诱导的启动子。技术人员知道如何选择合适的启动子。表达构建体可以含有用于转录起始、终止的位点，还可在转录区域含有核糖体结合位点，以用于翻译。由构建体表达的成熟转录本的编码部分可优选包括处于起点的起始密码子，以及恰当地定位于待翻译的多肽末尾的终止密码子。

[0092] 可通过传统的转化或转染技术将载体DNA引入合适的宿主细胞。本文中使用的术语“转化”、“转桥联(transconjugation)”和“转染”意指本领域内已知的、用于将外源核酸(例如DNA)引入到宿主细胞中的多种技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、转导、感染、脂质转染、阳离子脂介导的转染或电穿孔。用于对宿主细胞进行转化和转染的合适方法可在Sambrook，et al.(上文所述的)，Davis et al.，Basic Methods in Molecular Biology(1986)及其它实验手册中找到。

[0093] 为对已将外源DNA整合进它们基因组的细胞进行鉴定和选择，通常，将编码选择标记(例如，对抗生素的抗性)的基因与感兴趣的基因一起引入宿主细胞。优选的选择标记包括赋予对药物(例如卡纳霉素、四环素、氨苄青霉素和链霉素)抗性的那些。编码选择标记的核酸优选在与编码根据本发明的蛋白的载体相同的载体上引入宿主细胞，或者其可在单独的载体上引入，该载体例如是自杀性载体，其不能在宿主细胞中复制。可通过药物选择鉴定出经过引入的核酸稳定转染的细胞(例如，已合并有选择标记基因的细胞将存活，而其它细胞会死亡)。

[0094] 本发明还提供了经分离的多肽，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或可通过在合适的宿主中表达本发明的多核苷酸(例如，SEQ IDNO：1所示的多核苷酸序列)获得的氨基酸序列。

[0095] 根据本发明的多肽可仅含对SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸的保守取代，或对非关键氨基酸的取代、插入或缺失。因此，非关键氨基酸是SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中可被改变、且不会对生物功能造成实质性影响的残基。例如，在本发明的蛋白质之间保守的氨基酸残基被预计为对改变特别不敏感。此外，在根据本发明的蛋白质和其它GMS 01蛋白之间保守的氨基酸也可能对改变不太敏感。

[0096] 术语“保守取代”用于表示下述取代，其中，氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所取代。这些家族是本领域已知的，其包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸和谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、带beta支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。

[0097] 如上所述，本发明的多核苷酸可用于对合适的宿主细胞进行遗传工程改造，使其在碳源(例如葡萄糖)向生物质的生物转化中更好且更有效，即，降低生物转化过程期间的碳源转移。

[0098] 根据本发明，提供了经遗传工程改造/重组产生的宿主细胞(也被称为重组细胞或经转化细胞)，其携带有此类经修饰的多核苷酸，其中，相连的蛋白的功能较之野生型细胞而言被显著修饰，使得从碳源(例如葡萄糖)对生物质的生产的产率和/或生产能力被提高。宿主细胞可选自能将给定的碳源(例如葡萄糖)转化为生物质的微生物，特别是Gluconobacteroxydans，优选地，G.oxydans DSM 17078。

[0099] “经转化细胞”或“重组细胞”是已通过重组DNA技术向其(或其祖先细胞)中引入了根据本发明的核酸的细胞，或者是其中GMS 01蛋白的活性已被降低和/或消失的细胞。合适的宿主细胞包括能将给定碳源(例如葡萄糖)转化为生物质的微生物的细胞。特别地，其包括来自Pseudomonas、Pantoea、Escherichia、Corynebacterium、Ketogulonicigenium属的菌株，以及乙酸细菌，例如Gluconobacter、Acetobacter或Gluconacetobacter，优选地，Acetobacter sp.、Acetobacteraceti、Gluconobacter frateurii、Gluconobacter cerinus、Gluconobacterthailandicus、Gluconobacter oxydans，更优选地，G.oxydans，最优选地，G.oxydans DSM 17078。

[0100] 为提高某重组宿主细胞对生物质的生产，即，降低生物转化过程期间碳底物的转移，可在该生物中抑制GMS 01基因的表达，这例如通过靶向与GMS 01核苷酸序列的调控区域(例如，GMS 01启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列，以形成三螺旋结构，阻止靶细胞中GMS 01基因的转录来实现。一般而言，见Helene，C.(1991)Anticancer DrugDes.6(6)：569-84；Helene，C.et al.(1992)Ann.N.Y Acad Sci.660：27-36和Maher，L.J.(1992)Bioassays 14(12)：807-15。

[0101] 还可通过对GMS 01基因加以修饰来抑制或阻止基因表达，例如，通过向GMS 01基因中引入一处或多处突变来实现，其中所述突变导致产生较之野生型蛋白而言功能显著降低的GMS 01蛋白。

[0102] 因此，在另一种实施方式中，从SEQ ID NO：1所示的多核苷酸或其等同物获得携带至少一处突变的多核苷酸。

[0103] 本文中使用的突变可以是导致功能更弱或更不稳定的多肽(例如，功能更弱或更不稳定的GMS 01基因产物)的任何突变。这可包括，例如，在微生物基因组中的下述改变：其干扰了GMS 01的合成，或者导致GMS01蛋白以改变的氨基酸序列表达，该改变使得该蛋白的功能较之具有未被改变的氨基酸序列的野生型副本而言被完全或部分破坏。干扰可在转录水平、翻译水平或翻译后水平上发生。

[0104] 微生物基因组中的改变可例如通过单交叉重组或双交叉重组用含有改变的DNA序列替换野生型DNA序列来进行。为了能方便地选择出基因组被改变的微生物转化子，该改变可以例如是编码抗生素抗性基因的DNA序列，或者编码补足微生物可能的营养缺陷型的基因的DNA序列。突变可包括但不限于：缺失-插入突变。

[0105] 还可通过下述方法获得微生物基因组中导致功能更弱或没有功能的多肽的改变：使用例如化学诱变剂、辐射或转座子对微生物基因组进行随机诱变，以及选择或筛选出是生物质的更好的或更有效的生产菌株的突变体。用于筛选和选择的标准方法是技术人员已知的。

[0106] 在一种特定实施方式中，需要敲除本发明的GMS 01基因，即，其中，当引入合适的宿主细胞时，其基因表达被人工遏制，以提高对生物质产的产率和/或效率。用于提供敲除的方法以及提供携带此类被遏制基因的微生物的方法是本领域公知的。可通过缺失掉基因或其调控区域的至少一部分，来诱导对内源GMS 01基因的遏制。本文中使用的“对基因表达的遏制”包括完全遏制和部分遏制，以及在特定条件下的遏制，还包括对两个等位基因中任何一个的表达的遏制。

[0107] 为制造其中GMS 01基因的表达被人工遏制的敲除微生物，首先可克隆GMS 01基因，然后可使用该基因来构建用于同源重组的载体，以在靶标微生物中失活内源GMS 01基因。用于同源重组的载体含有设计来使靶标微生物中内源GMS 01基因失活的核酸序列。此核酸序列可以是：例如，含有至少部分缺失突变的GMS 01基因或其调控区域(例如，将被失活的基因侧翼存在的区域(顺式情况下)或单独存在的(反式情况下))的核酸序列，或者其可以是含有其它基因的GMS O1基因或其调控区域。优选地，选择还可用作为标记发挥作用的基因作为将被插入进GMS 01基因或其调控区域的基因。将使用的插入基因包括，例如，前文定义的药物抗性基因。对于基因可插入到GMS 01基因中的位置没有特别限制，只要在该位置的插入能导致对靶标中内源GMS 01基因表达的遏制即可。为避免插入的极性作用，可通过使用例如sacB系统，或通过长侧翼同源性PCR来引入同框沉默缺失。这些技术是本领域技术人员公知的。

[0108] 用于GMS 01蛋白的上述诱变策略可导致生物质的产率和/或产量增加。这些策略的列出并不意味着限制；对这些诱变策略的变化对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。可通过这些机制，用本发明的核酸和蛋白质分子产生出微生物，例如表达经突变GMS01核酸和蛋白分子的Gluconobacter oxydans或细菌的相关菌株，使得对从碳源(例如葡萄糖)对生物质的生产的产率、效率和/或生产能力被提高。

[0109] 可使用本领域技术人员已知的多种方法来测量生物质浓度，例如，测量例如600nm的波长下各细胞悬浮液的光密度(OD600)，或者测量干或湿细胞物质浓度，或者通过对各细胞悬浮液的细胞数量进行计数来实现。此类测量方法是本领域已知的。因此，可例如在孔径为例如0.45μm的经干燥配衡(tared)的硝酸纤维素滤膜(在其上过滤培养液)上测量细胞干重(CDW)[g/l]。用水洗滤膜之后，再次测定经干燥滤膜的重量，按照下式计算CDW：

[0110] CDW＝m(培养液过滤之后，经干燥的滤膜)-m(在培养液过滤之前经干燥的滤膜)[0111] 在本发明的一个方面，提供了能进行此类提高的生物转化的微生物(特别是Gluconobacter、Gluconacetobacter和Acetobacter属的)。当通过本文所述的方法进行测量时，发现这些生物具有提高的从碳源(例如，葡萄糖)生产生物质的能力。这可以通过增加GMS多肽(优选地，GMS 01多肽)的活性来获得。当在24小时的培养时间后根据该方法进行测量时，从碳源(例如葡萄糖)生产的生物质的产率可以是大约0.1g或更多干生物质/g碳源，优选地，大约0.2g或更多干生物质/g碳源，或者甚至大约0.3g或更多干生物质/g碳源，例如，大约0.4g、0.5g、0.6g、0.7g或0.8g或1.0g或更多干生物质/g碳源。优选地，碳源是葡萄糖。

[0112] 携带有例如经修饰的GMS 01基因并且能以显著更高的产率、生产能力和/或效率从碳源(例如葡萄糖)生产生物质的重组微生物可在需氧条件下被培养于补充有合适营养物的水性培养基中。培养可以以，例如，分批、补料分批、半连续或连续模式来进行。培养时间可以例如随所用的宿主、pH、温度和营养培养基而变化，以分批或补料分批模式进行时，其优选为大约1天至大约10天之间。培养可进行于大约4.0至大约9.0的pH下，优选地，大约5.0至大约8.0。用于进行培养的优选的温度范围为大约13℃至大约36℃，优选地，大约18℃至大约33℃。通常，除了用作为主要碳源的例如D-葡萄糖之外，培养基可以含有其它可被吸收的碳源，例如，甘油、D-甘露醇、D-山梨糖醇、L-山梨糖、赤藻糖醇、核糖醇、木糖醇、阿糖醇、肌醇、半乳糖醇、D-核糖、D-果糖、蔗糖和乙醇，优选地，D-山梨糖醇、D-甘露醇、D-果糖、甘油和乙醇；以及含有可消化的氮源，例如，有机物质，例如，蛋白胨、酵母提取物和氨基酸。多种无机物质也可被用作为氮源，例如，硝酸盐和铵盐。此外，生长培养基通常含有无机盐，例如，硫酸镁、硫酸锰、磷酸钾和碳酸钙。

[0113] 本文所述的核酸分子、多肽、载体、引物和重组微生物可用于下述方法中的一种或多种：鉴定Gluconobacter oxydans以及相关的生物；绘制与Gluconobacter oxydans相关的生物的基因组图谱；对感兴趣的Gluconobacter oxydans序列进行鉴定和定位；进化研究；测定功能所需的GMS 01蛋白区域；调节GMS 01蛋白活性或功能；调节GMS途径的活性；以及调节从碳源(例如葡萄糖)对生物质的细胞内生产。

[0114] 本发明提供了筛选能调节GMS 01蛋白活性的分子的方法，这种调节或者通过与蛋白本身或底物或GMS 01蛋白的结合伴侣的相互作用或者通过调节本发明的GMS 01核酸分子的转录或翻译来实现。在此类方法中，将表达一种或多种本发明的GMS 01蛋白的微生物与一种或多种测试化合物接触，并评估每种测试化合物对于GMS 01蛋白表达水平或活性的影响。

[0115] 可通过技术人员公知的方法来测定GMS蛋白的生物活性、酶活性或其它活性，所述方法例如：在存在其底物、电子受体或供体(包括吩嗪硫酸甲酯(PMS)、二氯苯酚-吲哚苯酚(DCIP)、NAD、NADH、NADP、NADPH，可通过光度、色度或荧光方法对其消耗进行直接或间接测量)以及其它可能与活性的发展相关的无机组分的情况下，温育含有GMS蛋白的膜级分(membrane fraction)。因此，例如，可在下述试验中测量与膜结合的D-葡糖脱氢酶的活性，所述试验中，在存在pH 6的磷酸盐缓冲液、D-葡萄糖和人工电子受体DCIP和PMS的情况下，温育含有该酶的膜级分。可在600nm处测量DCIP的消耗速率，其与膜级分中存在的D-葡糖脱氢酶活性直接成正比。

[0116] 因此，本发明涉及本文所述的多核苷酸、多肽、载体、引物和重组微生物在生产生物质(即，碳源(例如葡萄糖)向生物质的生物转化)中的用途。在一种优选的实施方式中，本文所述的经修饰的多核苷酸、多肽、载体和重组微生物用于提高对所述生物质生产的产率、生产能力和/或效率。

[0117] 术语“产量”或“生产能力”是本领域已知的，其包括在给定的时间和给定的培养体积中从给定量或浓度的碳源(例如葡萄糖)形成的生物质浓度(例如，每升每小时的kg产物)。术语“生产效率”包括：获得的特定水平的生产所需要的时间(例如，细胞达到产物的特定速率输出所需时间有多长)。术语“产率”是本领域已知的，其包括碳源向生物质转化的效率。这通常写作，例如，kg生物质/kg碳源。“增加生物质的产率和/或产量”表示，给定的时间中给定量的培养物中生物质的增加。通过测量培养基中生物质浓度的增加和碳源浓度的减少，可以计算出基于所消耗的碳源的生物质产率；即通过生物转化给定重量的碳源(例如葡萄糖)获得的生物质重量，其被定义为对消耗的每kg碳源而言的kg生物质。为了确定碳源的消耗量，可以用本领域已知的方法(例如HPLC)测定生长培养基中剩余碳源的重量。可以用本领域已知的方法(例如在600nm处的光密度或测量样品干重)测定生物质的增加。

[0118] 术语“生物合成”或“生物合成途径”是本领域已知的，其包括：通过细胞，以可能是多步骤且被高度调控的过程，从中间产物化合物对化合物/产物(优选地，有机化合物)的合成。术语“生物转化”是本领域已知的，其包括：通过涉及到一种或多种酶和/或转运蛋白的一个或多个生物合成步骤获得的碳源(例如葡萄糖)向产物(即生物质)的转化。措辞“代谢”是本领域已知的，其包括对生物中发生的生化反应的总称。然后，特定化合物的代谢(例如，氨基酸(例如甘氨酸)的代谢)包含细胞中与该化合物相关的总的生物合成、修饰和降解途径。措辞“转运”或“运入”是本领域已知的，其包括一种或多种分子在协助下移动经过该分子本来不能经过或不能高效经过的细胞膜。

[0119] 在一种优选的实施方式中，本发明涉及从碳源(例如葡萄糖)生产生物质的方法，其中，将上文所述的经修饰多核苷酸序列引入合适的微生物，在允许以高生产能力、产率和/或效率生产生物质的条件下培养重组微生物。

[0120] 根据本发明的携带有例如经修饰的GMS基因(特别是经修饰的GMS01基因)并且能以显著更高的产率/生产能力和/或效率从碳源(例如葡萄糖)生产生物质的重组微生物可有利地用于多种应用。一种特别合适的应用是用于生产维生素C和/或其中间产物例如2-酮基-L-古洛糖酸(2-KGA)的方法。

[0121] 因此，本发明的一个方面是提供生产维生素C和/或2-KGA的方法，其中，将根据本发明的核苷酸或上文所述的经修饰多核苷酸序列引入上文所述的合适的微生物(其中，合适的碳源，例如葡萄糖被高效转化为生物质)，在允许以高生产能力、产率和/或效率生产维生素C和/或2-KGA的条件下培养重组微生物，从培养基中分离产生的发酵产物，以及可选地，进一步纯化。

[0122] 用于生产(1)生物质和(2)维生素C和/或2-KGA的碳源可以是相同的或可以不同。在一种优选的实施方式中，用于生产生物质的碳源不同于用于直接生产维生素C和/或2-KGA的碳源。这两种不同碳源可同时或顺序使用，其中，第一种碳源将用于生产生物质，然后可用该生物质将第二种碳源转化为维生素C和/或2-KGA。

[0123] 可直接转化为维生素C和/或2-KGA的合适碳源是可选自D-葡萄糖或D-山梨糖醇代谢途径，例如，D-葡萄糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖、L-山梨糖酮、D-葡萄糖酸盐/酯、2-酮基-D-葡萄糖酸盐/酯，或2，5-二酮基-葡萄糖酸盐/酯或其混合物。优选地，底物选自，例如，D-葡萄糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖、L-山梨糖酮或其混合物，更优选地，选自D-葡萄糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖或其混合物，以及最优选地，选自D-山梨糖醇、L-山梨糖或其混合物。

[0124] 本文中使用的维生素C可以是水溶液中发现的L-抗坏血酸的任何化学形式，例如未离解的、以其游离酸形式存在的或离解为阴离子的。L-抗坏血酸的溶解的盐形式的特征为：在通常发现于发酵上清液中的任何种类的阳离子(例如，钾、钠、铵或钙)存在时的阴离子。还包括在内的可以有L-抗坏血酸的游离酸形式的经过分离的晶体。另一方面，用其相应的盐的名称来命名L-抗坏血酸的盐形式的经过分离的晶体，即抗坏血酸钠、抗坏血酸钾、抗坏血酸钙等。

[0125] 在使用微生物进行上述工艺的方面，将合适的碳源转化为维生素C和/或2-KGA表示，通过微生物进行对碳源的转化，得到维生素C和/或2-KGA，即，碳源可被直接转化为维生素C和/或2-KGA。在允许从所述碳源进行此类转化的条件下培养所述微生物，这是技术人员已知的。

[0126] 本文中用于使用微生物进行的上述工艺的培养基可以是用来生产维生素C和/或2-KGA的任何合适培养基。典型地，培养基是包含例如盐、底物并具有一定pH的水性培养基。

[0127] 术语“直接转化”等意指微生物能通过一个或多个生物转化步骤将某碳源转化为特定的产物，而无需任何额外的化学转化步骤。例如，术语“将D-山梨糖醇直接转化为维生素C”意在描述下述过程，其中，微生物生产维生素C，并且，其中，D-山梨糖醇作为碳源提供，而无需中间产物化学转化步骤。能直接发酵维生素C的单种微生物是优选的。

[0128] 将通过下述实施例进一步阐述本发明，所述实施例不应被理解为起限制作用。本文提到的所有参考文献、专利申请、专利和公开的专利申请的内容都通过引用并入本文。

[0129] 实施例

[0130] 实施例1用于生物质和葡萄糖测定的分析方法

[0131] 为测定生物质产量，在含有25g/l甘露糖醇、5.0g/l酵母提取物(Difco)、3.0g/l细菌蛋白胨(Difco)和15g/l琼脂的MB琼脂上于27℃对G.oxydans的细胞进行3天的培养。将细胞重新悬浮于10％甘油(每平板10ml)中，分装为1ml的小份试样，贮存于-80℃。

[0132] 用1ml小份试样接种带挡板500ml摇瓶，瓶中有100ml No.5培养基，其含有50g/l D-葡萄糖、0.5g/l甘油、15g/l酵母提取物(Difco)、2.5g MgSO4·7H2O、0.3g/l KH2PO4、15g/l CaCO3和1滴消泡剂，在30℃和180rpm下于摇床上培养48小时。使用Spectronic
4001/N分光光度计来测定600nm处的光密度(OD600)，然后用该培养基接种同样的No.5培养基的摇瓶，使得第二瓶中的起始OD600为0.25。然后在30℃和180rpm下对第二瓶进行另外80小时的培养，每12小时取3ml样品来分析生物质和葡萄糖浓度，分析按照下文所述进行：

[0133] 通过测量样品干重来测定生物质产量。将反应管在40℃于真空下预先干燥48小时，测量空管重量[w1]。加入样品，测定总的管重[w2]。加入0.1ml 18.5％HCl，以溶解CaCO3。随后在13000rpm下对管离心3分钟。弃去上清液，加入0.5ml水，重新悬浮沉淀。再次在13000rpm对管进行3分钟离心，弃去上清液。在40℃于真空下对管进行48小时干燥，再次对含有沉淀的管进行称重[w3]。样品中生物质浓度[B]按照下式计算：

[0134] (w3-w1)/(w2-w1)×1000＝生物质浓度[g/kg]

[0135] 用具有与LiChrospher-100-RP18，5μm预柱(Merck，Darmstadt，Germany)组合的Aminex-HPX-78H(300×7.8mm)柱(Biorad，Reinach，Switzerland)，在Hewlett-Packard1100仪器上，通过HPLC来测量葡萄糖的浓度或量[G]。移动相为0.004M硫酸，以0.6ml/分钟的流速泵出。用折射率探测器来监测信号。基于峰面积应用外部标准校正。

[0136] 产率，即给定时间后从D-葡萄糖的转化获得的生物质的量(干重[g生物质/g D-葡萄糖])按照下式来计算，其中，(t1)定义了在培养期间或终点(例如，24或48小时后)测量的生物质和D-葡萄糖的各自的浓度，(t0)定义了在培养开始时的各自的浓度(见上文)：

[0137] [B(t1)-B(t0)]/[G(t1)-G(t0)]＝基于消耗的葡萄糖的生物质产率[g/g]

[0138] 定体积的生物质生产能力[g/kg/h]，即，每升培养液每单位时间生产的生物质的量，按照下式来计算：

[0139] [B(t1)-B(t0)]/(t0-t1)＝定体积的生物质生产能力[g/kg/h]

[0140] 实施例2制备染色体DNA以及通过PCR扩增DNA片段

[0141] 在由25g/l甘露糖醇、5g/l酵母提取物(Difco)和3g/l细菌蛋白胨(Difco)构成的液体甘露糖醇培养基(MB)中，于30℃对Gluconobacter oxydans DSM 17078的细胞进行一天的培养，通过Sambrooket al(1989)″Molecular Cloning：A Laboratory Manual/Second Edition″，ColdSpring Harbor Laboratory Press所述的方法，从培养的细胞制备Gluconobacter oxydans DSM 17078的染色体DNA。

[0142] 使用按照上文所述制备的染色体DNA以及一组引物——Pf(SEQ IDNO：3)和Pr(SEQ ID NO：4)，通过PCR来制备DNA片段。按照厂商说明书，用Expand High Fidelity PCR试剂盒(Roche Diagnostics)和10ng染色体DNA以100μl的总体积来进行反应，获得了含有GMS 01 DNA序列(SEQ ID NO：1)的PCR产物。从反应体系中回收PCR产物，并验证了其正确序列。

[0143] 实施例3在G.oxydans DSM 17078中打断GMS 01基因

[0144] 将实施例2中获得的PCR产物克隆进E.coli载体pCR2.1-TOPO，用于转化E.coli TG1，获得携带有pCR2.1-GMS 01的Apr转化子。

[0145] 然后，用连接酶将分离自pUC-4K(Amersham Bioscience，编号No.X06404)的Kmr盒插入目标基因的限制性位点之一，用得到的连接产物去转化E.coli TGI，获得携带有pCR2.1-GMS 01::Km的Apr Kmr转化子。用选自载体部分的多克隆位点的两种限制性酶来消化从转化子制备的pCR2.1-GMS 01::Km质粒。通过电穿孔，用得到的DNA片段转化G.oxydans DSM 17078，得到基因打断子，G.oxydans DSM 17078-GMS01::Km。

[0146] 实施例4在液体培养物中从D-葡萄糖来生产生物质

[0147] 按照上文所述培养G.oxydans DSM 17078和G.oxydans DSM 17078-GMS 01::km，测定所产生的生物质的产率以及定体积的生物质生产能力(见实施例1)，其中(t1)＝24小时。结果示于表1中。

[0148] 表1.从D-葡萄糖生产生物质

[0149]菌株 基于消耗的葡萄糖 定体积的生物质
的生物质产率[g/g] 生产能力[g/kg/h]
G.oxydans DSM 17078 0.032 0.052
G.oxydans DSM 17078-GMS 0.24 0.109
01::km

[0150] 实施例5GMS 01基因和等同物在其它生物中的存在

[0151] 可通过简单的DNA杂交实验来测定其它生物(而非本文前面公开的那些，例如表2中提到的生物)中SEQ ID NO：1和/或等同物的存在。

[0152] 在含有5g/l细菌蛋白胨(Difco)、5g/l酵母提取物(Difco)、5g/l葡萄糖、5g/l甘露糖醇、1g/l MgSO4·7H2O、5ml/l乙醇和15g/l琼脂的No.350培养基上，于27℃，对菌株Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693和IFO 13773进行3天的培养。在含有25g/l甘露糖醇、5g/l酵母提取物(Difco)、3g/l细菌蛋白胨(Difco)和18g/l琼脂(Difco)的甘露糖醇培养基(MB)型琼脂培养基上，于27℃，对所有其它Acetobacter、Gluconacetobacter菌株和所有Gluconobacter菌株进行3天的培养。在Luria Broth琼脂培养基上培养E.coli K-12。在厂商推荐的培养基上或者按照本领域已知的方法培养其它菌株/细胞。按照例如Sambrook et al，1989，″Molecular Cloning：A Laboratory Manual/Second Edition″，Cold SpringHarbor Laboratory Press所述，从合适的生物(例如表2提到的)提取基因组DNA。

[0153] 用限制性酶(例如EcoRI或HindIII)消化基因组DNA制备物，通过琼脂糖凝胶电泳(1％琼脂糖)分离出1μg的DNA片段。用0.25N HCl对凝胶进行15分钟的处理，接着再用0.5N NaOH处理30分钟，然后按照厂商说明书，用Vacuum Blotter Model 785(BIO-RAD Laboratories AG，Switzerland)将凝胶印到硝酸纤维素或尼龙膜上。然后用得到的印迹与含有探针(例如具有SEQ ID NO：1序列的DNA片段，或含有SEQ IDNO：1序列的部分或全部的DNA片段)的溶液接触或杂交，以从测试生物中探测阳性DNA片段。可按照实施例1，用PCR-DIG标记试剂盒(Roche Diagnostics)和引物组SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4来制备DIG标记的探针，例如SEQ ID NO：1。此印迹杂交结果示于表2中。

[0154] 杂交可在严谨条件或高度严谨条件下进行。此类条件的一个优选的非限制性的例子是在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，大约45℃下杂交，随后在1x SSC、0.1％SDS中，50℃下进行一次或多次洗涤，洗涤优选在55℃下，更优选在60℃下，进一步优选在65℃下进行。高度严谨条件包括，例如，在溶液中，例如在含或不含100μg/ml的鲑鱼精DNA的DigEasyHyb溶液(Roche Diagnostics GmbH)的溶液中，或包含50％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、0.02％十二烷基磺酸钠、0.1％N-月桂酰肌氨酸和2％封闭试剂(Roche Diagnostics GmbH)的溶液中，于42℃温育2小时至4天，接着在2x SSC和0.1％SDS中，于室温下，洗两次膜，每次5至15分钟，然后在65-68℃，于0.5x SSC和0.1％SDS或0.1x SSC和0.1％SDS中洗两次，每次15-30分钟。为检测出与探针DNA具有较低相同性的DNA片段，最后的洗涤步骤可在较低温度(例如50-65℃)进行较短的洗涤时间(例如
1-15分钟)。

[0155] 可通过本领域公知的PCR方法，对表2所示各生物中阳性信号对应的基因加以克隆，这使用此生物的基因组DNA与合适的引物组(例如，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)在实施例1所述条件下进行，或者按照这样进行：每个反应使用5至100ng基因组DNA(总体积50μl)。可用Expand High Fidelity PCR系统(Roche Diagnostics)，采用下述反应条件：94℃2分钟；30个循环的(i)94℃15秒的变性步骤，(ii)60℃30秒的退火步骤，(iii)72℃0.5至5分钟(取决于目标DNA长度，1分钟/1kb)的合成步骤；72℃延伸7分钟。或者，可以用简并引物来进行PCR，对简并引物的设计可基于SEQ ID NO：2或基于作为共有序列的氨基酸序列(通过对由序列搜索程序(例如BLASTP，或当核苷酸序列被用作“查询序列”时，BLASTX)获得的若干氨基酸序列进行比对选出的)，以找到与SEQ ID NO：2的蛋白相似的蛋白。对使用简并引物进行的PCR而言，第二个退火步骤的温度(见上文)可被降低至55℃，或者甚至50-45℃。此实验的结果如表2所示。

[0156] 通过琼脂糖凝胶电泳来分离PCR反应的样品，在用例如溴化乙啶染色后，用透照器(transilluminator)来观察条带，从凝胶对条带进行分离，验证正确的序列。

[0157] 上文提到的共有序列可以是属于若干蛋白质结构域/家族数据库的某些类的氨基酸序列，所述数据库例如PROSITE(蛋白质家族和结构域的数据库)、COGs(直向同源体组的簇)、CDD(保守结构域数据库)、pfam(多重序列比对和隐Markov模型的大集合，覆盖很多常见的蛋白质结构域和家族)。一旦可从含有此类数据库的结构域或家族的蛋白中选出与本发明的蛋白具有相同/相近功能的某些蛋白，即可使用蛋白序列或其核苷酸序列(当可从公众数据库获得时)通过PCR来扩增编码该蛋白的对应DNA。下述生物体可进一步提供可用作为本发明备选基因的基因：Burkholderia xenovorans LB400、Acinetobacter calcoaceticus LMD 79.41、Mesorhizobium loti MAFF303099、Sinorhizobium meliloti1021。

[0158] 实施例6在其它生物中打断GMS 01基因和等同物，用于生产生物质

[0159] 为提高合适的微生物中从碳源(例如葡萄糖)进行的生物质生产，可按照关于G.oxydans DSM 17078中的GMS 01基因所述的方法(见实施例2)，破坏GMS 01基因和等同物(例如，实施例5中获得的PCR产物，其在本文中被称为基因X)，以产生携带基因GMS 01等同基因::Km的敲除突变体。用于产生此类敲除突变体的合适的宿主细胞可选自，例如，表2列出的Gluconobacter菌株，特别是G.oxydans IFO3292、G.oxydans IFOATCC 621H、G.oxydans IFO 12528、G.oxydans IFO 3291、G.oxydans IFO3255、G.oxydans IFO 3244、G.cerinus IFO3266、G.frateurii IFO 3260、G.oxydans IFO 3287、Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO 3259、Acetobacteraceti subsp.xylinum IFO 13693、Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO 13773和Acetobacter sp.ATCC 15164。

[0160] 敲除突变体，例如，敲除突变体G.oxydans IFO 3292-GMS 01等同基因::Km可以按照下文所述来产生：将实施例5所述从G.oxydans IFO 3292获得的PCR产物克隆进rE.coli载体pCR2.1-TOPO，并用于转化E.coliTG1，以获得携带pCR2.1-基因X的Ap 转化r
子。然后，用连接酶将从pUC-4K(Amersham Bioscience，编号X06404)分离的Km 盒插入目标基因的限制性位点之一，用得到的连接产物转化E.coli TG1，以获得携带pCR2.1-基因r r
X::Km的ApKm 转化子。用选自载体部分的多克隆位点的两种限制性酶消化从转化子制备的pCR2.1-基因X::Km质粒，以分离出含有基因X::Km的DNA片段。通过电穿孔用得到的DNA片段转化携带有基因X的宿主菌株，以获得携带有GMS 01等同基因::Km的基因打断子(disruptant)。

[0161] 可产生进一步的修饰，包括对所述菌株中涉及将碳源(例如葡萄糖)转化为生物质的基因进行的修饰，以提高此类菌株的生物质产量。

[0162] 按照实施例4，使用敲除突变体的细胞(例如G.oxydanss IFO 3292-GMS 01等同基因::Km的细胞)和对应的野生型菌株(例如G.oxydansIFO 3292)进行从碳源(例如葡萄糖)到生物质的生产。

[0163] 在用5％葡萄糖作为碳源的反应中，较之野生型菌株而言，突变体菌株生产的生物质可至少超过250％。

[0164] 表2：其它生物体中GMS 01基因的等同物

[0165]菌株 信号1 信号2 信号3
G.oxydans DSM 17078 + + +
G.oxydans IFO 3293 + + +
G.oxydans IFO 3292 + + +
G.oxydans ATCC 621H + + +
G.oxydans IFO 12528 + + +
G.oxydans G 624 + + +
G.oxydans T-100 + + +
G.oxydans IFO 3291 + + +
G.oxydans IFO 3255 + + +
G.oxydans ATCC 9937 + + +
G.oxydans IFO 3244 + + +
G.cerinus IFO 3266 + + +
G.frateurii IFO 3260 + + +
G.oxydans IFO 3287 + + +
Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO 3259 + - +
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO 13693 + - +
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO 13773 + - +
Acetobacter sp.ATCC 15164 + - +
G.thailandicus NBRC 100600 + + +
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC 14835 + + +
Gluconacetobacter polyoxogenes NBI 1028 + + +
Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC 49037 + + +
Gluconacetobacter europaeus DSM 6160 + + +
Acetobacter aceti 1023 + - +
Acetobacter pasteurianus NCI 1193 + - +
Pseudomonas putida ATCC 21812 + - +
Pseudomonas aeroginosa PAO1 + - +
Pseudomonas fluorescens DSM 50106 + - +
Pseudomonas syringae B728a + - +

[0166]Rhodopseudomonas palustris CGA009 + - +
Pantoea citrea 1056R + - +
E.coli K12 + - +
Saccharomyces cerevisiae - - -
Aspergillus niger - - -
小鼠 - - -

[0167] 信号1：在使用不同菌株的基因组DNA，用SEQ ID NO：1作为经标记探针进行的印迹杂交试验上对DNA的探测。信号2：使用引物对SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4在PCR反应中对不同菌株DNA的探测。信号3：使用简并引物进行的PCR反应中对不同菌株DNA的探测。更多解释参见文本。