一种抗癌抗癌转移及癌细胞分化诱导的中成药

摘要

一种抗癌抗癌转移及癌细胞分化诱导的中成药，它的有效成份的重量份原料组成是：丹参15～30份、三七10～23汾、莪术10～23份、土鳖虫10～23份、人参6～16份、制首乌10～23份；可制成胶囊剂或片剂、丸剂、颗粒剂、口服液等。它具有双重抗癌作用，既是癌分化诱导剂，又具有细胞减毒作用，同时还具有抗癌转移的功效。

权利要求

1.一种抗癌抗癌转移及癌细胞分化诱导的中成药，其特征是，它的有效成份由下列重量份原料制成：丹参 15～30份，

三七 10～23份，

莪术 10～23份，

土鳖虫 10～23份，

人参 6～16份，

制首乌 10～23份。

2.根据权利要求1所述抗癌抗癌转移及癌细胞分化诱导的中成药，其特征是，它的优选重量份原料组成为：丹参22.23份、三七16.67份、莪术16.67份、土鳖虫16.67份、人参

11.12份、制首乌16.67份。

3.根据权利要求1所述抗癌抗癌转移及癌细胞分化诱导的中成药，其特征是，它为胶囊剂或片剂、丸剂、颗粒剂、口服液。

4.根据权利要求1或3所述抗癌抗癌转移及癌细胞分化诱导的中成药，其特征是，它是将所述全部原料一起用55～95％的乙醇回流提取，回收乙醇得到醇提物，再添加符合药用要求的常规辅料制成。

5.根据权利要求1或3所述抗癌抗癌转移及癌细胞分化诱导的中成药，其特征是，它是将所述全部原料先一起用55～95％的乙醇回流提取，回收乙醇得到醇提物，药渣再加水煎煮、过滤、浓缩，得到水提液，然后添加符合药用要求的常规辅料制成。

6.根据权利要求1或3所述抗癌抗癌转移及癌细胞分化诱导的中成药，其特征是，它是将原料中的莪术先提取挥发油，药渣与其余中药原料一起加水煎煮、过滤、浓缩，得到水提液，然后添加符合药用要求的常规辅料制成。

7.根据权利要求1或3所述抗癌抗癌转移及癌细胞分化诱导的中成药，其特征是，它是将原料中的莪术先提取挥发油，药渣与其余中药原料一起用55～95％的乙醇回流提取，回收乙醇得到醇提物，然后添加符合药用要求的常规辅料制成。

8.根据权利要求1或3所述抗癌抗癌转移及癌细胞分化诱导的中成药，其特征是，它是将原料中的莪术先提取挥发油，其余中药原料一起用55～95％的乙醇回流提取、回收乙醇得到醇提物，两项药渣合并后加水煎煮、过滤、浓缩，得到水提液，然后添加符合药用要求的常规辅料制成。

9.根据权利要求1或3所述抗癌抗癌转移及癌细胞分化诱导的中成药，其特征是，它是将所述全部中药原料一起用65～85％的乙醇回流提取、回收乙醇得到醇提物，药渣加水煎煮、过滤、浓缩，得到水提液，合并醇提物和水提液，浓缩至相对密度为1.30～1.35的稠膏；将稠膏干燥后粉碎成细粉；细粉中加入符合药用要求的辅料制粒，填充胶囊，制成胶囊成品。

说明书

一种抗癌抗癌转移及癌细胞分化诱导的中成药

技术领域

[0001] 本发明涉及一种中成药，具体来说是一种抗癌、抗癌转移、癌细胞诱导分化的中成药。

背景技术

[0002] 癌症是一种死亡率高、生存期短的重大疾病，已经成为危害人类健康和生命的主要杀手。目前，治疗癌症的方法主要依靠手术、放疗、化疗和中医中药治疗。近些年来，在癌症治疗的临床实践中，越来越多的病例证明，单纯的手术很难使肿瘤得到根治、复发率很高，而放疗、化疗的副作用太大，在杀灭癌细胞的同时也杀灭正常细胞，严重影响生存质量。比较而言，中医中药治疗癌症能够有效延长患者生存期、提高其生活质量，配合手术、放疗、化疗能够得到更好的临床效果、降低毒副反应、有效降低复发率，因而已经得到越来越多的临床应用，在癌症治疗领域有着光明的前景。

发明内容

[0003] 本发明的目的是，提供一种抗癌抗癌转移癌细胞诱导分化的中成药，它具有双重抗癌作用，既是癌分化诱导剂，又具有细胞减毒作用，同时还具有抗癌转移的功效。

[0004] 本发明的技术方案是，所述抗癌抗癌转移癌细胞诱导分化的中成药的有效成份由下列重量份原料制成：

[0005] 丹参 15～30份，

[0006] 三七 10～23份，

[0007] 莪术 10～23份，

[0008] 土鳖虫 10～23份，

[0009] 人参 6～16份，

[0010] 制首乌 10～23份。

[0011] 本发明所述中成药的优选重量份组成为：丹参22.23份、三七16.67份、莪术16.67份、土鳖虫16.67份、人参11.12份、制首乌16.67份。

[0012] 本发明中成药的有效成份的制备方法包括如下几种：

[0013] 1、将所述全部中药原料一起加水煎煮、过滤、浓缩，得到水提液，再采用适当常规工艺、使用符合药用要求的常规辅料进一步制备成最终制剂。

[0014] 2、将所述全部中药原料一起用55～95％的乙醇回流提取，回收乙醇得到醇提物，再采用适当常规工艺、使用符合药用要求的常规辅料进一步制备成最终制剂。

[0015] 3、将所述全部中药原料先一起用55～95％的乙醇回流提取，回收乙醇得到醇提物，药渣再加水煎煮、过滤、浓缩，得到水提液，然后采用适当常规工艺、使用符合药用要求的常规辅料进一步制备成最终制剂。

[0016] 4、将所述原料中的莪术先提取挥发油，药渣与其余中药原料一起加水煎煮、过滤、浓缩，得到水提液，再采用适当常规工艺、使用符合药用要求的常规辅料进一步制备成最终制剂。

[0017] 5、将所述原料中的莪术先提取挥发油，药渣与其余中药原料一起用55～95％的乙醇回流提取，回收乙醇得到醇提物，再采用适当常规工艺、使用符合药用要求的常规辅料进一步制备成最终制剂。

[0018] 6、将所述原料中的莪术先提取挥发油，其余中药原料一起用55～95％的乙醇回流提取、回收乙醇得到醇提物，两项药渣合并后加水煎煮、过滤、浓缩，得到水提液，然后采用适当常规工艺、使用符合药用要求的常规辅料进一步制备成最终制剂。

[0019] 7、在所述优选重量份组成方案中，本发明中成药的制备方法为：将所述全部中药原料一起用65～85％的乙醇回流提取、回收乙醇得到醇提物，药渣加水煎煮、过滤、浓缩，得到水提液，合并醇提物和水提液，浓缩至相对密度为1.30～1.35(60℃)的稠膏，将稠膏干燥后粉碎成细粉；细粉中加入符合药用要求的常规辅料制粒，填充胶囊，制成胶囊成品。每2000克中药原料制得1000粒胶囊成品(成品率±10％)。所述干燥可采用常规的喷雾干燥或减压干燥，或烘干。

[0020] 8、本发明的中成药可以将其有效成份配合符合药用要求的常规辅料一起制成各种常见口服剂型，例如胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂和口服液。

[0021] 根据中医理论及临床观察，肿瘤的发病机理可归纳为气滞、血瘀、痰结湿聚、毒热内结、脏腑失调、经络瘀阻等几个方面，其中血瘀是肿瘤发生、发展的一个重要发病机制，而且见之于病程各个阶段，虚瘀已成为恶性肿瘤的主要特征。活血化瘀药能改善微循环，降低血液粘度，调整凝血—纤溶—血小板系统平衡的紊乱、防止癌栓形成，故“活血即能消癥”，活血化瘀药能有效的治疗各种肿瘤。

[0022] 根据“破瘀消癥，扶正祛邪”的治则，本发明中成药所选择的原料中，丹参为唇形科植物丹参的干燥根及根茎，能祛瘀止痛、活血通经；三七为五加科植物三七的干燥根及根茎，能散瘀止血、消肿定痛；莪术为姜科植物蓬莪术、广西莪术或温郁金的干燥根茎，能行气破血、消积止痛；土鳖虫为鳖蠊科昆虫地鳖或冀地鳖的雌虫干燥体，能破瘀血；人参为五加科植物人参的干燥根及根茎，能补益元气；制首乌为蓼科植物何首乌干燥块根的炮制加工品，能补肝肾、益精血。

[0023] 在传统中医药理论的指导下，本发明研发人员通过反复的配伍试验，获得了所述技术方案；所述有效成份的原料组成经过合理工艺制备成适当剂型后，通过大量的动物试验和体外试验对其效果进行了验证，表明对气滞血瘀型及气虚血瘀型肿瘤有良好疗效，具有抗癌、抗癌转移及癌细胞分化诱导的作用，可单独使用或联合放疗、化疗使用，用于治疗呼吸系统、消化系统、生殖系统、免疫系统等肿瘤。

[0024] 由以上可知，本发明为一种抗癌抗癌转移及癌细胞分化诱导的中成药，它具有双重抗癌作用，既是癌分化诱导剂，又具有细胞毒作用，同时还具有抗癌转移的功效。

具体实施方式

[0025] 实施例1(胶囊剂A的制备)：

[0026] 称取下列重量的原料：丹参200g、三七150g、莪术150g、土鳖虫150g、人参100g、制首乌150g；将六味原料一起用65～85％的乙醇回流提取、回收乙醇得到醇提物，药渣加水煎煮、过滤、浓缩，得到水提液，合并醇提物和水提液，浓缩至相对密度为1.30～1.35(60℃)的稠膏，加入二氧化硅细粉，减压干燥，粉碎，浸膏粉加入适量淀粉或糊精，制粒，填充胶囊，制得450粒胶囊成品。

[0027] 实施例2(胶囊剂B的制备)：

[0028] 称取下列重量的原料：丹参200g、三七150g、莪术150g、土鳖虫150g、人参100g、制首乌150g；将六味原料一起用65～85％的乙醇回流提取、回收乙醇得到醇提物，浓缩至相对密度为1.30～1.35(60℃)的稠膏，加入二氧化硅细粉，减压干燥，粉碎，浸膏粉加入适量淀粉或糊精，制粒，填充胶囊，制得450粒胶囊成品。

[0029] 实施例3(胶囊剂C的制备)：

[0030] 称取下列重量的原料：丹参200g、三七150g、莪术150g、土鳖虫150g、人参100g、制首乌150g；先将莪术用共水蒸馏法提取挥发油，残渣与其余五味原料一起用65～85％的乙醇回流提取、回收乙醇得到醇提物，药渣加水煎煮、过滤、浓缩，得到水提液，合并醇提物和水提液，浓缩至相对密度为1.30～1.35(60℃)的稠膏，减压干燥，粉碎，浸膏粉加入莪术挥发油和适量淀粉或糊精，制粒，填充胶囊，制得450粒胶囊成品。

[0031] 实施例4(片剂A的制备)：

[0032] 称取下列重量的原料：丹参200g、三七150g、莪术150g、土鳖虫150g、人参100g、制首乌150g；将六味原料一起用65～85％的乙醇回流提取、回收乙醇得到醇提物，药渣加水煎煮、过滤、浓缩，得到水提液，合并醇提物和水提液，浓缩至相对密度为1.30～1.35(60℃)的稠膏，减压干燥，粉碎，浸膏粉加入适量淀粉或糊精，制粒，再加入适量硬脂酸镁，压片，制得500片成品。

[0033] 实施例5(片剂B的制备)：

[0034] 称取下列重量的原料：丹参200g、三七150g、莪术150g、土鳖虫150g、人参100g、制首乌150g；先将莪术用共水蒸馏法提取挥发油，残渣与其余五味原料一起用65～85％的乙醇回流提取、回收乙醇得到醇提物，药渣加水煎煮、过滤、浓缩，得到水提液，合并醇提物和水提液，浓缩至相对密度为1.30～1.35(60℃)的稠膏，减压干燥，粉碎，浸膏粉加入莪术挥发油和适量淀粉或糊精，制粒，再加入适量硬脂酸镁，压片，制得500片成品。

[0035] 实施例6(丸剂的制备)：

[0036] 称取下列重量的原料：丹参200g、三七150g、莪术150g、土鳖虫150g、人参100g、制首乌150g；将六味原料一起用65～85％的乙醇回流提取、回收乙醇得到醇提物，药渣加水煎煮、过滤、浓缩，得到水提液，合并醇提物和水提液，浓缩至相对密度为1.30～1.35(60℃)的稠膏，减压干燥，粉碎，浸膏粉加入适量蜂蜜，制成大蜜丸、小蜜丸或浓缩丸。

[0037] 实施例7(颗粒剂A的制备)：

[0038] 称取下列重量的原料：丹参200g、三七150g、莪术150g、土鳖虫150g、人参100g、制首乌150g；将六味原料一起用65～85％的乙醇回流提取、回收乙醇得到醇提物，药渣加水煎煮、过滤、浓缩，得到水提液，合并醇提物和水提液，浓缩至相对密度为1.30～1.35(60℃)的稠膏，减压干燥，粉碎，浸膏粉加入适量淀粉或糊精，制粒，分装，制得150包颗粒剂成品。

[0039] 实施例8(颗粒剂B的制备)：

[0040] 称取下列重量的原料：丹参200g、三七150g、莪术150g、土鳖虫150g、人参100g、制首乌150g；先将莪术用共水蒸馏法提取挥发油，残渣与其余五味原料一起用65～85％的乙醇回流提取、回收乙醇得到醇提物，药渣加水煎煮、过滤、浓缩，得到水提液，合并醇提物和水提液，浓缩至相对密度为1.30～1.35(60℃)的稠膏，减压干燥，粉碎，浸膏粉加入莪术挥发油和适量淀粉或糊精，制粒，分装，制得150包颗粒剂成品。

[0041] 实施例9(口服液A的制备)：

[0042] 称取下列重量的原料：丹参200g、三七150g、莪术150g、土鳖虫150g、人参100g、制首乌150g；将六味原料一起用65～85％的乙醇回流提取、回收乙醇得到醇提物，药渣加水煎煮、过滤、浓缩，得到水提液，合并醇提物和水提液，浓缩至1500ml，加入适量蜂蜜或甜菊糖矫味，分装成10ml口服液150支，灭菌，即得。

[0043] 实施例10(口服液B的制备)：

[0044] 称取下列重量的原料：丹参200g、三七150g、莪术150g、土鳖虫150g、人参100g、制首乌150g；先将莪术用共水蒸馏法提取挥发油，残渣与其余五味原料一起加水煎煮，水提液过滤、浓缩至约1450ml，加入莪术挥发油，用适量蜂蜜或甜菊糖矫味，分装成10ml口服液150支，灭菌，即得。

[0045] 本发明的药效实验说明如下。

[0046] 实验用药A及其制备：称取下列重量的原料：丹参200g、三七150g、莪术150g、土鳖虫150g、人参100g、制首乌150g；将六味原料一起用75％的乙醇回流提取、回收乙醇得到醇提物，药渣加水煎煮、过滤、浓缩，得到水提液，合并醇提物和水提液，浓缩至3.33L，制得药液浓度相当于270mg生药/ml的试验用药(浸膏)。

[0047] 实验1：对动物移植性肿瘤的抑制作用

[0048] 1、对小鼠肉瘤S180(实体型)生长的抑制作用

[0049] 取昆明种小鼠50只(一级动物，体重18～22g，雌雄各半，鼠龄6～8周；成都中医药大学实验动物中心提供)，随机分成5组(肿瘤对照组，本中成药大、中、小剂量组，环磷酰胺组)、每组10只，分别接种瘤株(小鼠肉瘤S180，成都中医药大学病理实验室细胞培养室提供)。接种后24小时，肿瘤对照组灌服等体积生理盐水(0.4ml/20g体重)，每日一次，连续10天；环磷酰胺组灌服环磷酰胺(15mg/Kg)，每日一次，连续10天；试验组小鼠按0.9g生药/Kg、2.7g生药/Kg、5.4g生药/Kg的剂量灌服，药液浓度分别为45mg生药/ml、135mg生药/ml和270mg生药/ml，给药体积均为0.4ml/20g体重，每日一次，连续10天。

[0050] 末次给药后24小时，处死动物，剖瘤称重，按下列公式计算肿瘤抑制率：

[0051] 肿瘤抑制率＝(对照组瘤重—治疗组瘤重)÷对照组瘤重×100％

[0052] 试验重复三次。

[0053] 结果显示，本发明中成药(0.9、2.7、5.4g生药/Kg)对S180小鼠实体瘤有不同程度抑制作用，抑制率分别为34～60％。和对照组比较，均有显著性差异(P<0.01或P<0.05)。同时，本发明中成药各剂量组(0.9、2.7、5.4g生药/Kg)肿瘤细胞核分裂明显减少或消失，与肿瘤对照组比较，有极显著性差异(P<0.01)；本发明中成药各剂量组均出现显著的淋巴细胞浸润和纤维组织增生，小剂量与对照组比较，有显著性差异(P<0.05)，中剂量和大剂量与对照组比较，有极显著性差异(P<0.01)，提示动物细胞免疫功能增强，纤维组织增生可能对肿瘤细胞的浸润过程有所延缓，限制了癌细胞侵入血管内或淋巴管内，从而减少了扩散机会。

[0054] 上述试验结果表明，本发明中成药各剂量组(0.9、2.7、5.4g生药/Kg)对S180小鼠实体瘤有明显抑制作用。

[0055] 2、对小鼠Lewis肺癌的抑制作用

[0056] 取C57BL/6小鼠50只(一级动物，体重18～22g，雌雄各半，鼠龄6～8周；成都中医药大学实验动物中心提供)，随机分成5组(肿瘤对照组，本中成药大、中、小剂量组，环磷酰胺组)、每组10只，分别接种瘤株(Lewis肺癌，四川省抗菌素工业研究所药理研究室提供)。接种后24小时，肿瘤对照组灌服等体积生理盐水(0.4ml/20g体重)，每日一次，连续10天；环磷酰胺组灌服环磷酰胺(15mg/Kg)，每日一次，连续10天；试验组小鼠按0.9g生药/Kg、2.7g生药/Kg、5.4g生药/Kg的剂量灌服，药液浓度分别为45mg生药/ml、135mg生药/ml和270mg生药/ml，给药体积均为0.4ml/20g体重，每日一次，连续10天。

[0057] 末次给药后24小时，处死动物，剖瘤称重，按下列公式计算肿瘤抑制率：

[0058] 肿瘤抑制率＝(对照组瘤重—治疗组瘤重)÷对照组瘤重×100％

[0059] 试验重复三次。

[0060] 结果显示，本发明中成药(0.9、2.7、5.4g生药/Kg)对Lewis肺癌小鼠实体瘤有不同程度抑制作用，抑制率分别为34～57％。和对照组比较，均有显著性差异(P<0.01或P<0.05)。同时，本发明中成药各剂量组(0.9、2.7、5.4g生药/Kg)与肿瘤对照组比较，对Lewis肺癌细胞核分裂均有极显著抑制作用，其数目明显少于肿瘤对照组(P<0.01)；本发明中成药各剂量组均出现显著的淋巴细胞浸润和纤维组织增生，与对照组比较，有极显著性差异(P<0.01)，提示动物细胞免疫功能增强，纤维组织增生可能对肿瘤细胞的浸润过程有所延缓，限制癌细胞侵入血管内或淋巴管内，从而减少了扩散机会。

[0061] 上述试验结果表明，本发明中成药各剂量组(0.9、2.7、5.4g生药/Kg)对Lewis肺癌小鼠实体瘤有明显抑制作用。

[0062] 3、对小鼠肉瘤S180(腹水型)的抑制作用

[0063] 取昆明种小鼠50只(一级动物，体重18～22g，雌雄各半，鼠龄6～8周；成都中医药大学实验动物中心提供)，随机分成5组(肿瘤对照组，本中成药大、中、小剂量组，环磷酰胺组)、每组10只，分别接种瘤株(小鼠肉瘤S180瘤株，成都中医药大学病理实验室细胞培养室提供)。接种后24小时，肿瘤对照组灌服等体积生理盐水(0.4ml/20g体重)，每日一次，连续10天；环磷酰胺组灌服环磷酰胺(15mg/Kg)，每日一次，连续10天；试验组小鼠按0.9g生药/Kg、2.7g生药/Kg、5.4g生药/Kg的剂量灌服，药液浓度分别为45mg生药/ml、
135mg生药/ml和270mg生药/ml，给药体积均为0.4ml/20g体重，每日一次，连续10天。

[0064] 末次给药后24小时，停药观察小鼠死亡情况，并逐日定时记录。待全部动物死亡后，计算各组动物平均存活天数，按下列公式计算生命延长率：

[0065] 生命延长率＝(治疗组平均存活天数—对照组平均存活天数)÷对照组平 均存活天数×100％

[0066] 试验重复三次。

[0067] 结果显示，本发明中成药(0.9、2.7、5.4g生药/Kg)对S180(腹水型)均有明显抑制作用，小鼠生命延长率为42～108％。

[0068] 4、对小鼠肝癌H22(腹水型)的抑制作用

[0069] 取昆明种小鼠50只(一级动物，体重18～22g，雌雄各半，鼠龄6～8周；成都中医药大学实验动物中心提供)，随机分成5组(肿瘤对照组，本中成药大、中、小剂量组，环磷酰胺组)、每组10只，分别接种瘤株(小鼠肝癌H22瘤株，成都中医药大学病理实验室细胞培养室提供)。接种后24小时，肿瘤对照组灌服等体积生理盐水(0.4ml/20g体重)，每日一次，连续10天；环磷酰胺组灌服环磷酰胺(15mg/Kg)，每日一次，连续10天；试验组小鼠按0.9g生药/Kg、2.7g生药/Kg、5.4g生药/Kg的剂量灌服，药液浓度分别为45mg生药/ml、
135mg生药/ml和270mg生药/ml，给药体积均为0.4ml/20g体重，每日一次，连续10天。

[0070] 末次给药后24小时，停药观察小鼠死亡情况，并逐日定时记录。待全部动物死亡后，计算各组动物平均存活天数，按下列公式计算生命延长率：

[0071] 生命延长率＝(治疗组平均存活天数—对照组平均存活天数)÷对照组平 均存活天数×100％

[0072] 试验重复三次。

[0073] 结果显示，本发明中成药(0.9、2.7、5.4g生药/Kg)对肝癌H22(腹水型)均有明显抑制作用，小鼠生命延长率为56～103％。

[0074] 5、对小鼠子宫颈癌U14的影响

[0075] 取昆明种小鼠50只(一级动物，体重18～22g，雌雄各半，鼠龄6～8周；成都中医药大学实验动物中心提供)，随机分成5组(肿瘤对照组，本中成药大、中、小剂量组，环磷酰胺组)、每组10只，分别接种瘤株(小鼠子宫颈癌U14，成都中医药大学病理实验室细胞培养室提供)。接种后24小时，肿瘤对照组灌服等体积生理盐水(0.4ml/20g体重)，每日一次，连续10天；环磷酰胺组灌服环磷酰胺(15mg/Kg)，每日一次，连续10天；试验组小鼠按0.9g生药/Kg、2.7g生药/Kg、5.4g生药/Kg的剂量灌服，药液浓度分别为45mg生药/ml、
135mg生药/ml和270mg生药/ml，给药体积均为0.4ml/20g体重，每日一次，连续10天。

[0076] 末次给药后24小时，处死动物，剖瘤称重，按下列公式计算肿瘤抑制率：

[0077] 肿瘤抑制率＝(对照组瘤重—治疗组瘤重)÷对照组瘤重×100％

[0078] 试验重复三次。

[0079] 结果显示，本发明中成药(0.9、2.7、5.4g生药/Kg)对U14小鼠实体瘤显示不同程度抑制作用，抑制率中剂量组为12～34％、大剂量组为41～44％；本发明中成药(0.9、2.7、5.4g生药/Kg)对U14小鼠实体瘤有促进凋亡的作用(凋亡率51～72％)。

[0080] 上述试验结果表明，本发明中成药各剂量组(0.9、2.7、5.4g生药/Kg)对U14小鼠实体瘤的生长有明显抑制作用。

[0081] 实验2：对肿瘤细胞体外生长的抑制作用

[0082] 1、对肿瘤细胞的形态、核分裂指数、细胞存活率的影响

[0083] 将人巨细胞肺癌(A2)细胞株(北京大学肿瘤研究所提供)、人肝癌(SMMC—7721)细胞株(中国科学院上海细胞生物研究所细胞库提供)培养于含20％小牛血清的RPMI-1640和青、链霉素各100单位的培养液内，分9组接种(对照组、5—FU组、VCR组、DDP组、本发明中成药5个剂量组：0.5mg生药/ml、1.0mg生药/ml、2.0mg生药/ml、4.0mg生药/ml、8.0mg生药/ml)，每组6孔。各组均在加药后继续培养，分别在第3、6、12、24、48、
72小时取样，作Giemsa染色，在光学显微镜下观察癌细胞形态学变化；在高倍镜下，计500个细胞中的活细胞数和死亡细胞数；计1000个细胞中的核分裂指数(计算核分裂细胞的百分率)。并按以下公式计算细胞存活率：

[0084] 细胞存活率＝(加药组细胞存活数/对照组细胞存活数)×100％

[0085] 结果显示：

[0086] 本发明中成药0.5mg生药/ml～8.0mg生药/ml处理24小时，均可使两株人癌细胞体积缩小、变圆，胞质空泡化，核固缩、核碎裂，核分裂明显减少，细胞稀疏，表明本发明中成药0.5mg生药/ml～8.0mg生药/ml均可使两株人癌细胞发生变性或坏死。

[0087] 不同剂量本发明中成药处理两株癌细胞后，癌细胞的有丝分裂活性降低，剂量越大，核分裂指数下降越明显，表明本发明中成药0.5mg生药/ml～8.0mg生药/ml均能明显抑制人巨细胞肺癌(A2)和人肝癌(SMMC—7721)的有丝分裂。

[0088] 经本发明中成药0.5mg生药/ml～8.0mg生药/ml处理后，人巨细胞肺癌(A2)和人肝癌(SMMC—7721)的细胞存活率均明显降低，并有明显的剂量相关性和时间相关性，表明本发明中成药的剂量越大、作用时间越长，人巨细胞肺癌(A2)和人肝癌(SMMC—7721)的细胞存活率越低。

[0089] 2、对两株人癌细胞(SMMC-7721、A2)的杀伤作用(MTT法检测)

[0090] 取人巨细胞肺癌(A2)细胞株(北京大学肿瘤研究所提供)、人肝癌(SMMC—7721)细胞株(中国科学院上海细胞生物研究所细胞库提供)培养4天(处于对数生长期)，各取1瓶，分别加入0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％的胎牛血清RPMI-1640培养液配成单个细胞悬液，37℃培养24小时后分10组加药(对照组、5—FU组、VCR组、DDP组、本发明中成药5个剂量组：0.5mg生药/ml、1.0mg生药/ml、2.0mg生药/ml、4.0mg生药/ml、8.0mg生药/ml；空白对照组)，继续培养24小时，在终止培养前4小时，分别加入MTT液50μl。终止培养后，分别加入DMSO150μl，振荡使结晶物充分溶解。选择570mm波长，在酶联免疫检测仪上测定各样品光吸收值。细胞存活率是将各样品OD值减去本底OD值(完全培养基+MTT，无细胞)。

[0091] 细胞存活率＝(加药细胞OD值/对照细胞OD值)×100％

[0092] 结果显示：

[0093] 本发明中成药0.5mg生药/ml～8.0mg生药/ml对人肝癌SMMC—7721细胞有明显的杀伤作用，与对照组相比较有显著性差异(P<0.01)。

[0094] 本发明中成药0.5mg生药/ml～8.0mg生药/ml对人巨细胞肺癌A2细胞有明显的杀伤作用，与对照组相比较有显著性差异(P<0.01)。

[0095] 3、对两株人癌细胞(SMMC-7721、A2)集落形成能力的影响

[0096] 取人巨细胞肺癌(A2)细胞株(北京大学肿瘤研究所提供)、人肝癌(SMMC—7721)细胞株(中国科学院上海细胞生物研究所细胞库提供)培养4天(处于对数生长期)，各取1瓶，分别加入0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％的胎牛血清RPMI-1640培养液配成单个细胞悬液，分7组加药(对照组、5—FU组、本发明中成药5个剂量组：0.5mg生药/ml、1.0mg生药/ml、2.0mg生药/ml、4.0mg生药/ml、8.0mg生药/ml)，37℃培养7天，在倒置显微镜下观察，以50个细胞的团块为1个集落，计算集落数。按以下公式求得集落形成相当率：

[0097] 集落形成相当率＝(实验组集落数/对照组集落数)×100％

[0098] 结果显示：

[0099] 本发明中成药0.5mg生药/ml～8.0mg生药/ml对人肝癌SMMC—7721干细胞有明显的杀伤作用(使集落形成数明显减少)。以2.0mg生药/ml～8.0mg生药/ml的杀伤作用最强。

[0100] 本发明中成药0.5mg生药/ml～8.0mg生药/ml对人巨细胞肺癌A2干细胞有明显的杀伤作用(使集落形成数明显减少)。以4.0mg生药/ml和8.0mg生药/ml的杀伤作用最强。

[0101] 实验3：对癌细胞的分化诱导作用

[0102] 1、对人早幼粒细胞白血病(HL-60、NB4)细胞NBT还原能力的影响

[0103] HL-60(四川大学华西医学中心免疫研究室提供)、NB4(四川大学华西医学中心血液病研究室提供)细胞培养于含10％小牛血清的RPMI-1640培养液中，收集对数生长期细5
胞，以2.4×10 个/ml活细胞浓度每株细胞接种7瓶，培养24小时换培养液，分7组加药(对照组、RA组、本发明中成药5个剂量组：0.5mg生药/ml、1.0mg生药/ml、2.0mg生药/ml、4.0mg生药/ml、8.0mg生药/ml)，37℃培养6天，在终止培养前3小时，每瓶加入0.2％NBT及TPA各600μg/ml，37℃水浴保温3小时离心制片，每个样本涂片2张，冰醋酸与甲醇固定，May-Giemsa染色，光学显微镜油镜下观察。HL-60及NB4细胞向粒细胞方向分化成熟时，能将可溶性淡黄色NBT还原为不溶性的formozan，呈蓝紫色颗粒沉积于细胞浆内，称NBT还原反应阳性细胞。NBT还原反应阳性细胞越多，表明HL-60及NB4细胞向正常中性粒细胞方向分化成熟度越高。每个样品检查200个细胞，计算阳性细胞率。

[0104] 结果显示：

[0105] 对HL-60细胞而言，培养6天后，对照组仅有6.5％～9.5％NBT阳性细胞，表明细胞株符合要求；维甲酸(RA)NBT阳性细胞达95％；本发明中成药0.5mg生药/ml～8.0mg生药/ml NBT阳性细胞从78％到94％，并有明显的剂量相关性。2.0mg生药/ml～8.0mg生药/ml NBT阳性细胞率在本实验条件下与RA无显著性差异(P>0.05)。结果表明，本发明中成药可使94％的HL-60细胞向粒细胞方向分化成熟，其成熟程度在本实验条件下与RA相似。

[0106] 对NB4细胞而言，培养6天后，对照组仅有7.0％～7.5％NBT阳性细胞，表明细胞株符合要求；维甲酸(RA)NBT阳性细胞达94％；本发明中成药0.5mg生药/ml～8.0mg生药/ml NBT阳性细胞从77.5％到93％，并有明显的剂量相关性。2.0mg生药/ml～8.0mg生药/ml NBT阳性细胞率在本实验条件下与RA无显著性差异(P>0.05)。结果表明，本发明中成药可使93％的NB4细胞向粒细胞方向分化成熟，其成熟程度在本实验条件下与RA相似。

[0107] 2、对人早幼粒细胞白血病(HL-60、NB4)细胞吞噬功能的影响

[0108] HL-60(四川大学华西医学中心免疫研究室提供)、NB4(四川大学华西医学中心血液病研究室提供)细胞培养于含10％小牛血清的RPMI-1640培养液中，收集对数生长期细5
胞，以2.0×10 个/ml活细胞浓度每株细胞接种7瓶，分7组加药(对照组、RA组、本发明中成药5个剂量组：0.5mg生药/ml、1.0mg生药/ml、2.0mg生药/ml、4.0mg生药/ml、8.0mg生药/ml)，培养6天，离心弃上清液，每份加入聚苯乙烯乳胶颗粒溶液2ml(用无血清培养液RPMI-1640，按2μl/ml混合)，混匀后37℃保温4小时离心弃上清液，用PBS反复洗3～4次，离心弃上清液，取沉淀涂片，加1滴0.5％伊红PBS液，在显微镜下计300个活细胞(伊红着色者为死细胞)，细胞内含5个以上黑色颗粒者为吞噬阳性细胞。计算出阳性细胞率。

[0109] 结果表明：

[0110] 人早幼粒白血病HL-60细胞经本发明中成药不同剂量处理6天，对照组细胞吞噬聚苯乙烯乳胶颗粒的阳性细胞为6.7％～7.7％，RA组为93.7％～94.3％，本发明中成药0.5mg生药/ml～8.0mg生药/ml为77.7％～92.7％，并有明显的剂量相关性。在本实验条件下，本发明中成药2.0mg生药/ml～8.0mg生药/ml对人早幼粒白血病HL-60细胞吞噬功能的影响与RA相似。

[0111] 人早幼粒白血病NB4细胞经本发明中成药不同剂量处理6天，对照组细胞吞噬聚苯乙烯乳胶颗粒的阳性细胞为5.67％～7.0％，RA组为79.67％～87.63％，本发明中成药0.5mg生药/ml～8.0mg生药/ml为74.3％～86.7％，并有明显的剂量相关性。在本实验条件下，本发明中成药2.0mg生药/ml～8.0mg生药/ml对人早幼粒白血病NB4细胞吞噬功能的影响与RA相似。

[0112] 3、对人早幼粒细胞白血病(HL-60、NB4)分化诱导的细胞形态学观察[0113] HL-60(四川大学华西医学中心免疫研究室提供)、NB4(四川大学华西医学中心血液病研究室提供)细胞培养于含10％小牛血清的RPMI-1640培养液中，分7组加药(对照组、RA组、本发明中成药5个剂量组：0.5mg生药/ml、1.0mg生药/ml、2.0mg生药/ml、4.0mg生药/ml、8.0mg生药/ml)后接种，37℃培养6天，离心弃上清液，取细胞沉淀涂片，迅速风干，甲醇固定。Wright-Giemsa染色10分钟，蒸馏水冲洗，风干。光学显微镜油镜下每片观察200个细胞，按其分化成熟度分类。分化细胞包括：中幼粒、晚幼粒、杆状核、分叶核细胞。细胞分化成熟度越高，晚幼粒、杆状核、分叶核细胞所占比例越大，表明分化剂的效果越好。

[0114] 结果显示：

[0115] 对HL-60细胞而言，经本发明中成药处理6天后，细胞向粒系统方向分化成熟。对照组早幼粒细胞占93.5％，细胞株符合实验要求；维甲酸(RA)分化率为94％，成熟度55％；本发明中成药0.5mg生药/ml～8.0mg生药/ml可使71％～89.5％的HL-60细胞分化成熟，成熟程度57％。本实验条件下，本发明中成药2.0mg生药/ml和4.0mg生药/ml对HL-60细胞的分化诱导作用强度与RA相似。

[0116] 对NB4细胞而言，对照组早幼粒细胞占91％，仅有9％的细胞分化，细胞株符合实验要求；维甲酸(RA)处理6天，有92.5％的细胞分化成熟，成熟度52.5％；本发明中成药0.5mg生药/ml～8.0mg生药/ml处理6天，可使81.5％～92.5％的细胞分化成熟，其分化成熟度可由30％到54％。本实验条件下，本发明中成药2.0mg生药/ml～8.0mg生药/ml对NB4细胞的分化诱导作用强度与RA相似。

[0117] 4、对两株人早幼粒细胞白血病(HL-60、NB4)细胞集落形成能力的影响[0118] HL-60(四川大学华西医学中心免疫研究室提供)、NB4(四川大学华西医学中心血液病研究室提供)细胞培养于含10％小牛血清和青、链霉素各100单位的RPMI-1640培养4
液内，稀释成2.5×10 个/ml，分7组加药(对照组、RA组、本发明中成药5个剂量组：0.5mg生药/ml、1.0mg生药/ml、2.0mg生药/ml、4.0mg生药/ml、8.0mg生药/ml)后培养21天，在倒置显微镜下观察，以50个细胞的团块为1个集落，计算集落数。按以下公式求得集落形成相当率：

[0119] 集落形成相当率＝(实验组集落数/对照组集落数)×100％

[0120] 结果显示：

[0121] 本发明中成药0.5mg生药/ml～8.0mg生药/ml均可使人早幼粒细胞白血病HL-60细胞集落形成数明显减少，与对照组相比较有极显著性差异(P<0.01)。2.0mg生药/ml～8.0mg生药/ml对人早幼粒细胞白血病HL-60干细胞有明显的杀伤作用。本实验条件下，其作用强度与RA相似。

[0122] 本发明中成药0.5mg生药/ml～8.0mg生药/ml均可使人早幼粒细胞白血病NB4细胞集落形成数明显减少，与对照组相比较有极显著性差异(P<0.01)。1.0mg生药/ml～8.0mg生药/ml对人早幼粒细胞白血病NB4干细胞有明显的杀伤作用。本实验条件下，其作用强度与RA相似。

[0123] 5、对人肝癌细胞(SMMC-7721)的分化诱导作用

[0124] 人肝癌(SMMC—7721)细胞株(中国科学院上海细胞生物研究所细胞库提供)培5
养于含20％小牛血清和青、链霉素各100单位的RPMI-1640培养液内，每份接种1.0×10 个/ml活细胞，分7组加药(对照组、RA组、本发明中成药5个剂量组：0.5mg生药/ml、1.0mg生药/ml、2.0mg生药/ml、4.0mg生药/ml、8.0mg生药/ml)后培养6天，取出盖片，迅速风干，甲醇固定，Giemsa染色10分钟，光镜下观察。

[0125] 取对数生长期细胞以2.5×105个/ml接种14瓶，培养24小时后换培养液，分7组加药(对照组、RA组、本发明中成药5个剂量组：0.5mg生药/ml、1.0mg生药/ml、2.0mg生药/ml、4.0mg生药/ml、8.0mg生药/ml)，培养6天，用0.25％胰蛋白酶消化，收集细胞，3000r/min离心10分钟，弃上清液，加入0.3％戊二醛固定10分钟，10000r/min离心10分钟，弃上清液，加入3％戊二醛作透射电镜观察。

[0126] 结果显示：

[0127] 光镜观察：经本发明中成药不同剂量处理后，细胞核变小，胞浆增多，细胞形态趋向均匀，核浆面积比值从对照组的0.6900降至0.4670，与同期RA核浆面积0.4570比较，已无显著性差异(P>0.05)。提示细胞形态趋向正常。

[0128] 透射电镜观察：经本发明中成药不同剂量处理后，细胞核逐渐变规则，多数仅有一个核仁，细胞浆内线粒体增多，其形态改变与RA相似，提示细胞形态趋向正常。

[0129] 实验4：抗癌细胞转移

[0130] 1、对Lewis肺癌小鼠自发性肺、肝、肾转移的影响

[0131] 取C57BL/6小鼠50只(一级动物，体重18～22g，雌雄各半，鼠龄6～8周；成都中医药大学实验动物中心提供)，随机分成5组(肿瘤对照组，本中成药大、中、小剂量组，环磷酰胺组)、每组10只，分别接种瘤株(Lewis肺癌，四川省抗菌素工业研究所药理研究室提供)。接种后24小时，肿瘤对照组灌服等体积生理盐水(0.4ml/20g体重)，每日一次，连续21天；环磷酰胺组灌服环磷酰胺(15mg/Kg)，每日一次，连续21天；试验组小鼠按0.9g生药/Kg、2.7g生药/Kg、5.4g生药/Kg的剂量灌服，药液浓度分别为45mg生药/ml、135mg生药/ml和270mg生药/ml，给药体积均为0.4ml/20g体重，每日一次，连续21天。

[0132] 末次给药后24小时，处死动物，解剖出肺、肝、肾，显微处理，光镜下观察计数。

[0133] 试验重复三次。

[0134] 结果显示，本发明中成药(0.9、2.7、5.4g生药/Kg)对小鼠Lewis肺癌的肺、肝、肾转移有明显抑制作用，并有明显的剂量相关性，即药物剂量越大，抑制癌转移的作用越强。

[0135] 2、对子宫颈癌U14小鼠自发性肺、肝、肾转移的影响

[0136] 取昆明种小鼠50只(一级动物，体重18～22g，雌雄各半，鼠龄6～8周；成都中医药大学实验动物中心提供)，随机分成5组(肿瘤对照组，本中成药大、中、小剂量组，环磷酰胺组)、每组10只，分别接种瘤株(小鼠子宫颈癌U14，成都中医药大学病理实验室细胞培养室提供)。接种后24小时，肿瘤对照组灌服等体积生理盐水(0.4ml/20g体重)，每日一次，连续21天；环磷酰胺组灌服环磷酰胺(15mg/Kg)，每日一次，连续21天；试验组小鼠按0.9g生药/Kg、2.7g生药/Kg、5.4g生药/Kg的剂量灌服，药液浓度分别为45mg生药/ml、
135mg生药/ml和270mg生药/ml，给药体积均为0.4ml/20g体重，每日一次，连续21天。

[0137] 末次给药后24小时，处死动物，解剖出肺、肝、肾，显微处理，光镜下观察计数。

[0138] 试验重复三次。

[0139] 结果显示，本发明中成药(0.9、2.7、5.4g生药/Kg)对小鼠U14子宫颈癌的肺、肝、肾转移有明显抑制作用。

[0140] 实验例5：对环磷酰胺(CTX)和顺铂(DDP)的增效、减毒作用

[0141] 1、与化疗药物联用的增效作用

[0142] 取昆明种小鼠50只(一级动物，体重18～22g，雌雄各半，鼠龄6～8周；成都中医药大学实验动物中心提供)，随机分成5组(肿瘤对照组，顺铂小剂量组，环磷酰胺小剂量组，本中成药小剂量+顺铂小剂量组，本中成药小剂量+环磷酰胺小剂量组)，每组10只，分别接种瘤株(小鼠肉瘤S180，成都中医药大学病理实验室细胞培养室提供)。接种后24小时，肿瘤对照组灌服等体积生理盐水(0.4ml/20g体重)，每日一次，连续10天；顺铂小剂量组按1mg/Kg体重腹腔注射(0.4ml/20g体重)，分别于第1、5、9天给予，共3次；环磷酰胺小剂量组按10mg/Kg体重灌服环磷酰胺(0.4ml/20g体重)，每日一次，连续10天；本中成药小剂量+顺铂小剂量组，本中成药小剂量+环磷酰胺小剂量组，分别按本中成药小剂量(900mg生药/Kg)+环磷酰胺(10mg/Kg)、中成药小剂量(900mg生药/Kg)+顺铂(1mg/Kg)的用量，给药体积为0.4ml/20g体重，其中本中成药、环磷酰胺经口灌服，每日一次，连续10天；顺铂腹腔注射，分别于第1、5、9天给予，共3次。

[0143] 末次给药后24小时，处死动物，剖瘤称重，按下列公式计算肿瘤抑制率：

[0144] 肿瘤抑制率＝(对照组瘤重—治疗组瘤重)÷对照组瘤重×100％

[0145] 试验重复三次。

[0146] 结果显示：顺铂小剂量组抑瘤率36～42.8％，本中成药小剂量+顺铂小剂量组抑瘤率提高到52.3～60％，环磷酰胺小剂量组抑瘤率38.4～42.5％，本中成药小剂量+环磷酰胺小剂量组抑瘤率提高到57.6～63％。可见，本中成药与化疗药物联用后，抑瘤率显著提高，提示有明显增效作用。

[0147] 2、与化疗药物联用的减毒作用

[0148] 取昆明种小鼠90只(一级动物，体重18～22g，雌雄各半，鼠龄6～8周；成都中医药大学实验动物中心提供)，随机分成9组(肿瘤对照组，顺铂大剂量组，环磷酰胺大剂量组，本中成药大、中、小剂量+顺铂大剂量组，本中成药大、中、小剂量+环磷酰胺大剂量组)，每组10只，分别接种瘤株(小鼠肉瘤S180，成都中医药大学病理实验室细胞培养室提供)。接种后24小时，肿瘤对照组灌服等体积生理盐水(0.4ml/20g体重)，每日一次，连续10天；顺铂大剂量组按2mg/Kg体重腹腔注射(0.4ml/20g体重)，分别于第1、5、9天给予，共3次；环磷酰胺大剂量组按20mg/Kg体重灌服环磷酰胺(0.4ml/20g体重)，每日一次，连续10天；本中成药小、中大剂量+环磷酰胺大剂量组，本中成药分别按0.9g生药/Kg、2.7g生药/Kg、5.4g生药/Kg体重的剂量给予，联用的环磷酰胺用法与前同，两者总给药体积
0.4ml/20体重，每日一次，连续10天；本中成药小、中、大剂量+顺铂大剂量组，两者总给药体积为0.4ml/20g体重，其中本中成药用法与前同，每日一次，连续10天，联用的顺铂亦与前用法同，分别于第1、5、9天腹腔注射，共3次。

[0149] 末次给药后24小时，检测血常规，处死动物，取脾脏和胸腺称重，计算脏器指数：

[0150] 脏器指数＝脏器重量(g)÷动物体重(g)×100％

[0151] 试验重复三次。

[0152] 结果显示：本中成药与化疗药物联用后，具有保护并改善造血系统的功能，可明显减轻化疗药物对肝脏、胰腺和肾小管的损伤，并对产生T细胞的免疫器官有明显的激活作用。

[0153] 实验6：对荷瘤小鼠免疫功能的影响

[0154] 1、对PHA诱导小鼠体内淋巴细胞转化作用的影响

[0155] 取昆明种雄性小鼠60只(一级动物，体重18～22g，鼠龄6～8周；成都中医药大学实验动物中心提供)，随机分成6组(正常对照组，肿瘤对照组，本中成药大、中、小剂量组，环磷酰胺组)、每组10只，除正常对照组外均接种瘤株(小鼠肉瘤S180，成都中医药大学病理实验室细胞培养室提供)。24小时后，所有接种小鼠注射PHA，每日一次，连续3天；正常对照组注射生理盐水。接种瘤株24小时后，正常对照组和肿瘤对照组灌服等体积生理盐水(0.4ml/20g体重)，每日一次，连续8天；环磷酰胺组灌服环磷酰胺(15mg/Kg)，每日一次，连续8天；试验组小鼠按0.9g生药/Kg、2.7g生药/Kg、5.4g生药/Kg的剂量灌服，药液浓度分别为45mg生药/ml、135mg生药/ml和270mg生药/ml，给药体积均为0.4ml/20g体重，每日一次，连续8天。

[0156] 末次给药后24小时，称重，取血，显微镜下计数100个淋巴细胞，统计淋巴母细胞及过渡态细胞数。

[0157] 试验重复三次。

[0158] 结果表明：本中成药各剂量组均具有提高荷S180小鼠细胞免疫功能的作用。

[0159] 2、对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

[0160] 取昆明种小鼠60只(一级动物，体重18～22g，雌雄各半，鼠龄6～8周；成都中医药大学实验动物中心提供)，随机分成6组(正常对照组，肿瘤对照组，本中成药大、中、小剂量组，环磷酰胺组)、每组10只，除正常对照组外均接种瘤株(小鼠肉瘤S180，成都中医药大学病理实验室细胞培养室提供)。24小时后，正常对照组和肿瘤对照组灌服等体积生理盐水(0.4ml/20g体重)，每日一次，连续10天；环磷酰胺组灌服环磷酰胺(15mg/Kg)，每日一次，连续10天；试验组小鼠按0.9g生药/Kg、2.7g生药/Kg、5.4g生药/Kg的剂量灌服，药液浓度分别为45mg生药/ml、135mg生药/ml和270mg生药/ml，给药体积均为0.4ml/20g体重，每日一次，连续10天。末次给药后1～2小时，每只小鼠腹腔注射0.4ml鸡红细胞，8～12小时后，处死动物，取腹腔洗液处理后镜检，每只动物计巨噬细胞数100个，按下式计算其吞噬指数与吞噬百分率：

[0161] 吞噬百分率＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/100个巨噬细胞×100％

[0162] 吞噬指数＝被吞噬的鸡红细胞总数/100个巨噬细胞

[0163] 试验重复三次。