红景天苷及其杂质的分离方法和红景天苷及其杂质的RP-HPLC分析法

摘要

一种红景天苷杂质的分离方法，它是先用硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇梯度洗脱，分四段收集，然后用半制备型高效液相色谱分离纯化，其中半制备型高效液相色谱条件为：色谱柱：ODS C18，5μm，250×10.0mm(I.D.)，流动相组成体积比：甲醇∶水＝11∶89，流速：3.0mL/min，柱温：25℃，检测波长：UV275nm，进样量：50μL。分段收集流出液。红景天苷及其杂质的高效液相色谱分析法，采用反相高效液相色谱法，色谱条件为：色谱柱：ODS C18，5μm，150×4.6mm(I.D.)，流动相：甲醇∶水＝15∶85，流速：1.0mL/min，柱温：25℃，检测波长：UV275nm，进样量：20μL。采用本发明的红景天苷及其杂质的高效液相色谱分析法可以同时准确测定红景天苷样品中salidroside及其杂质HEPG、HPAG及PAPG的含量。为生产进程中的质量控制分析提供了简单可靠的方法。

权利要求

1.一种分离红景天苷原料药中红景天苷和三个杂质的方法，所述的三个杂质分别为：对羟乙基苯基-4-氧-β-D-葡萄糖苷、对羟苯乙酰氧基-β-D-吡喃葡萄糖苷和对乙酰基苯基-4’-氧-β-D-葡萄糖苷，其特征是它由下列步骤组成：步骤1.用硅胶柱色谱分离

步骤1.1.拌样：称取100目硅胶倒入蒸发皿中，再倒入含量97％的红景天苷的甲醇饱和溶液以正好覆盖为宜，搅拌均匀蒸去大部分甲醇，在60℃的真空干燥箱中干燥至恒重，步骤1.2.装柱：将200-300目硅胶225g用氯仿湿法装柱，平衡，步骤1.3.上样：取拌样硅胶，加于色谱柱顶端，步骤1.4.洗脱：氯仿∶甲醇梯度洗脱，流速为3-4滴/秒，分4段收集，步骤2.用半制备型高效液相色谱分离纯化红景天苷及其杂质，其中半制备型高效液相色谱条件为：色谱柱：ODS C18，5μm，250×10.0mm内径，流动相组成体积比：甲醇∶水＝11∶89，流速：3.0mL/min，

柱温：25℃，

检测波长：UV 275nm，

进样量：50μL，

分段收集流出液，HPLC跟踪检测。

2.一种红景天苷及其杂质的高效液相色谱定量分析法，所述的杂质为：对羟乙基苯基-4-氧-β-D-葡萄糖苷、对羟苯乙酰氧基-β-D-吡喃葡萄糖苷和对乙酰基苯基-4’-氧-β-D-葡萄糖苷，其特征是采用反相高效液相色谱法，高效液相色谱条件为：色谱柱：ODS C18，5μm，150×4.6mm内径，流动相组成体积比：甲醇∶水＝15∶85，流速：1.0mL/min，

柱温：25℃，

检测波长：UV 275nm，

进样量：20μL。

说明书

红景天苷及其杂质的分离方法和红景天苷及其杂质的

RP-HPLC分析法

技术领域

[0001] 本发明涉及红景天苷和其三个杂质的分离及其高效液相色谱分析法。

背景技术

[0002] 红景天苷，英文名salidroside，化学名“对羟苯乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-hydroxyphenethyl-β-D-glucoside)”，系统命名：1-(4-羟基)苯乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷，主要从高原药用植物“红景天”(Rhodiola sachalinensis)和常用中药“女贞子”(Ligustrum lucidum)中提取获得[徐宝军，郑毅男，李向高.红景天属植物研究新进展.中药材，2000，23(9)：580-584；石力夫，蔡溱，曹颖瑛，等.中药女贞子的化学成分及其药理作用.药学实践杂志，1997，15(4)：197-200]。药理实验表明，红景天提取物红景天苷有良好的心血管系统作用[甄志军，李志华，李剑.红景天苷对大鼠血管平滑肌细胞增殖和TGF-B表达的影响.心脏杂志，2002，14(5)：458；邹琛，吴翔，姜敏辉，等.红景天苷对乳鼠心肌细胞过氧化损伤的保护作用.南通医学院学报，2003，23(4)：193-195；王晓松，房家智，张晓艳，等.红景天苷，酮对大鼠心血管功以有的影响.白求恩医科大学学报，1996，22(1)：7-9]，在脑缺血、缺氧，神经元细胞凋亡方面均有一定的保护作用[宋月英，齐刚，李亚萍，等.红景天苷对全脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织肿瘤坏死因子-α表达的影响.中草药，2006，37(6):907-908；王华，姚文兵，钱云飞，等.红景天苷对NaCN及缺糖诱导PC12细胞凋亡的保护作用.中国药科大学学报，2007，38(3)：273-276；陈宏，陈建宗，厚荣荣.红景天苷对百草枯所致PC12细胞凋亡的抑制作用及相关机制.中国药理学与毒理学杂志，2007，21(3)：190-196]。因此，大力开发红景天苷的药用价值，生产红景天苷原料药已成为一种趋势。

[0003] 目前，国内外对红景天属植物的化学成分研究较多，已先后从各种红景天中分离得到40多种化学成分，其主要成分为红景天苷(salidroside)及其苷元酪醇(Ptyrosol)、酪萨维(Rosavin或Rosavidine)、二苯甲基六氢吡啶(Pyridrde)、红景天素即草质素-7-氧-(3-氧-β-D吡喃葡萄糖基)-α-L-吡喃鼠李糖苷(Rhodiosin)和草质素-7-氧-α-L-吡喃鼠李糖苷(Rhodionin)[张晓丹，余自云，张茹.红景天属植物的化学成分研究进展.航空航天医药，2006，17(1)：61-63]。其中大花红景天的主要化学成分为红景天苷、酪醇、大花红景天素、异戊烯-3-O-β-D-葡萄糖苷、6-O-galloysalidroside、没食子酸、1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-β-D-glucopyranoside、草质素-7-O-D-L-吡喃鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖[骆传环，舒融.红景天中糖组份的分析.中国医药工业杂志，1997，28(10)：463-464；王曙，王锋鹏.大花红景天化学成分的研究.药学学报，1992，27(2)：117-120]。

[0004] 红景天苷含量测定的方法主要有高效液相色谱法、薄层色谱法、比色法、高效毛细管电泳法、气相色谱法和极谱法[赵慧，贾凌云，孙长山，等.RP-HPLC法测定复方红景天片剂中红景天苷的含量.沈阳药科大学学报，2005，22(1)：23-25；徐晓莹，李宝明，何丽一.红景天中红景天苷的薄层光密度测定法的研究.药物分析杂志，1996，16(4)：272-273；邓昌国，孙殿甲，堵年生.重氮盐比色法测定红景天胶囊中酚性成分的含量.中成药，1995，
17(6)：36-37；王洪伦，明永飞，李玉林，等.红景天中红景天苷和酪醇的毛细管电泳法分析.分析实验室，2005，24(1)：40-41；康胜利，王晋，张坚，等.气相色谱法测定红景天属植物中红景天苷及百脉根苷的含量.中国中药杂志，1998，23(6)：365-366；熊晓燕，向仕学，汤晓勤.保健酒中功效成分红景天苷的极谱分析.中国公共卫生，1998，14(12)：749]，其中应用最广泛的仍为高效液相色谱法。但大多数含量测定主要针对的是单味药材或复方制剂中红景天苷的含量，同时测定红景天苷原料药中红景天苷及其共存杂质含量的方法尚未见报道。

[0005] 红景天苷已被开发上市的剂型主要有片剂(圣莲牌红景天片剂)、胶囊剂(中脉红景天胶囊)、注射剂(大株红景天注射液)、口服液(雪山红景天口服液)及功能性饮料。本发明所用的红景天苷主要用于冻干粉针的原料，根据当前欧美国家的GMP要求，所有在欧美国家申请销售的药品，包括原料药和生产中间体均应有它的杂质列表，对生产制造和精制的工艺中产生的，含量超过0.1％的杂质需要进行结构确证，因此分离红景天苷原料药中杂质并对其进行结构确证是非常有必要的。

[0006] 一般药物杂质的分离多采用硅胶柱色谱法，但此法分离效果较差。本发明首先采用硅胶柱色谱对红景天苷原料药中杂质进行富集，然后再用高效液相色谱对其制备纯化，1 13
所得3个杂质单体经过紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、质谱(MS)、核磁共振谱(H NMR、C
1 1
NMR、H-H COSY、DEPT、HSQC和HMBC)表征，分别推测为对羟乙基苯基-4-氧-β-D-葡萄糖苷(4-(2-hydroxylethyl)-phenol-1-O-β-D-glucopyranoside，HEPG)，对羟苯乙酰氧基-β-D-吡喃葡萄糖苷(4′-hydroxyphenacylβ-D-gluopyranoside，HPAG)及对乙酰基苯基-4′-氧-β-D-葡萄糖苷(para acetylphenyl-O-βD-glucopyranoside，PAPG)，与淫羊藿次苷、对羟苯乙酰氧基-β-D-吡喃葡萄糖苷、云杉素比较，结构得到确认，且均为从红景天属植物中首次发现。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供分离红景天苷原料药中三个杂质的方法，及其红景天苷和三个杂质的高效液相色谱分析法。

[0008] 本发明的技术方案如下：

[0009] 一种分离红景天苷原料药中红景天苷和三个杂质的方法，它由下列步骤组成：

[0010] 步骤1.用硅胶柱色谱分离

[0011] 步骤1.1.拌样：称取100目硅胶倒入蒸发皿中，再倒入含量约97％的红景天苷的甲醇饱和溶液以正好覆盖为宜(红景天苷样品与硅胶比为1∶0.68，w/w)，搅拌均匀蒸去大部分甲醇，在60℃的真空干燥箱中干燥至恒重，

[0012] 步骤1.2.装柱：将200—300目硅胶225g用氯仿湿法装柱，平衡，

[0013] 步骤1.3.上样：取拌样硅胶(约含有相当于5g样品)，加于色谱柱顶端，[0014] 步骤1.4.洗脱：氯仿∶甲醇梯度洗脱(14∶1→10∶1→6∶1)，流速为3—4滴/秒，分4段收集，

[0015] 步骤2.用半制备型高效液相色谱分离纯化红景天苷及其杂质，其中半制备型高效液相色谱条件为：

[0016] 色谱柱：ODS C18，5μm，250×10.0mm(I.D.)，

[0017] 流动相组成体积比：甲醇∶水＝11∶89，

[0018] 流速：3.0mL/min，

[0019] 柱温：25℃，

[0020] 检测波长：UV275nm，

[0021] 进样量：50μL。

[0022] 分段收集流出液，HPLC跟踪检测。

[0023] 一种红景天苷及其杂质的高效液相色谱分析法，其特征是采用反相高效液相色谱法，高效液相色谱条件为：

[0024] 色谱柱：ODS C18，5μm，150×4.6mm(I.D.)，

[0025] 流动相组成体积比：甲醇∶水＝15∶85，

[0026] 流速：1.0mL/min，

[0027] 柱温：25℃，

[0028] 检测波长：UV275nm，

[0029] 进样量：20μL。

[0030] 测定主成分含量时，溶液浓度太大会导致主峰超线性而使定量不准，故将样本稀释4倍后测定。

[0031] 采用本发明的红景天苷及其杂质的高效液相色谱分析法可以同时准确测定红景天苷样品中salidroside及其杂质HEPG、HPAG及PAPG的含量。为生产进程中的质量控制分析提供了简单可靠的方法。

附图说明

[0032] 图1为红景天苷及其杂质的紫外图谱，其中(A)红景天苷；(B)HEPG；(C)HPAG；(D)PAPG。

[0033] 图2为不同制备色谱条件的色谱图，其中色谱柱：(A)Kromasil C18；(B)LichrospherC18；(C)Phenomenex C18；色谱柱Phenomenex C18流动相：(D)12％甲醇-88％水；(E)11％甲醇-89％水；(F)10％甲醇-90％水；色谱柱Phenomenex C18柱温：(G)30℃；(H)25℃；(I)20℃；进样量：(J)50μL；(K)100μL。

[0034] 图3为分离后的3个杂质纯品的色谱图，其中(A)HEPG；(B)HPAG；(C)PAPG。

[0035] 图4为红景天苷的标准曲线。

[0036] 图5为HEPG的标准曲线。

[0037] 图6为HPAG的标准曲线。

[0038] 图7为PAPG的标准曲线。

[0039] 图8为红景天苷的对照品的色谱图。

[0040] 图9为样品中主成分红景天苷含量测定的色谱图。

[0041] 图10为HEPG、HPAG、PAPG对照品混合液的色谱图。

[0042] 图11为样品中杂质HEPG、HPAG、PAPG含量测定的色谱图。

具体实施方式

[0043] 实验仪器及色谱条件：

[0044] UV-2450型紫外-可见分光光度仪(日本岛津公司)。

[0045] 岛津半制备型高效液相色谱仪，配备LC-6AD，SPD-10Avp，CTO-10ASvp，(日本岛津公司)。色谱分离系统的控制和记录由HW-2000色谱工作站完成。

[0046] 色谱柱选用的是Phenomenex C18(Phenomenex公司)，5μm，250×10.0mm(I.D.)。流动相：甲醇∶水＝11∶89(v/v)；流速：3.0mL/min；柱温：25℃；检测波长：UV275nm。

[0047] 岛津分析型高效液相色谱仪，配备LC-10ATvp，SPD-10Avp，CTO-10ASvp(日本岛津公司)。色谱分离系统的控制和记录由HW-2000色谱工作站完成。

[0048] 色谱柱选用的是Shim-pack C18(岛津公司)，5μm，150×4.6mm(I.D.)。流动相：甲醇∶水＝15∶85(v/v)；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；检测波长：UV275nm。

[0049] 试剂与药品：

[0050] 红景天苷原料药由四川恒星生物医药有限公司提供，红景天苷，HEPG，HPAG及PAPG对照品为自制。所有的对照品均经过紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、质谱(MS)、核磁共振谱(NMR)表征，并与红景天苷、淫羊藿次苷、对羟苯乙酰氧基-β-D-吡喃葡萄糖苷、云杉素比较，结构得到确认。氯仿(分析级)，甲醇(分析级)，甲醇(色谱级)购自江苏汉邦科技股份有限公司。实验中流动相和溶液用水均为双蒸水。

[0051] 实施例1.硅胶柱色谱富集杂质

[0052] 拌样：称取适量100目硅胶倒入蒸发皿中，再倒入适量含量约97％的红景天苷的甲醇饱和溶液以正好覆盖为宜(样品与硅胶比为1∶0.68，w/w)，搅拌均匀蒸去大部分甲醇，在60℃的真空干燥箱中干燥至恒重。

[0053] 装柱：将200—300目硅胶225g用氯仿湿法装柱，平衡。

[0054] 上样：取8.5g拌样硅胶(约相当于5g样品)，加于色谱柱顶端。

[0055] 洗脱：氯仿∶甲醇梯度洗脱(14∶1→10∶1→6∶1)，流速为3—4滴/秒，分4段收集。

[0056] 实施例2.高效液相色谱制备杂质

[0057] 2.1半制备型高效液相色谱条件的选择

[0058] 供试品溶液制备∶取含量约97％红景天苷原料药适量，加甲醇制成每1mL含有0.2g的溶液，作为供试品溶液，微孔滤膜过滤，分别在不同条件下进样。

[0059] 2.1.1检测波长

[0060] 用UV-2450型紫外-可见分光光度仪在200-400nm进行连续扫描，可知红景天苷在275nm处有最大吸收，HEPG、HPAG及PAPG分别在270、280及265处有较强的吸收。兼顾三者测定的灵明度，故选择检测波长为275nm(见图1)。

[0061] 2.1.2色谱柱

[0062] 不同厂家的色谱柱由于采用的填料不同，柱效相差较大。即使流动相条件一致，用不同填料的色谱柱重复测试时，不仅分离效果大不相同，而且保留时间的迁移也比较明显。本实验比较了3个不同的色谱柱[Kromasil C18(250×10.0mm，5μm)；LichrospherC18(250×10.0mm，5μm)；Phenomenex C18(250×10.0mm，5μm)]。见图2A-图
2C，结果表明Phenomenex C18柱色谱分离较好。

[0063] 2.1.3流动相

[0064] Phenomenex C18，柱温25℃，流速3.0mL/min，检测波长275nm，进样量50μL。

[0065] 本实验比较了3个比例的流动相：甲醇∶水＝(12∶88，v/v)、甲醇∶水＝(11∶89，v/v)和甲醇∶水＝(10∶90，v/v)。见图2D-图2F，结果表明：甲醇∶水＝11∶89分离效果较好。2.1.4柱温

[0066] Phenomenex C18，甲醇∶水11∶89，流速3.0mL/min，检测波长275nm，进样量50μL。

[0067] 柱温往往会影响分离的效果，考虑到苷类物质在高温下不稳定，易发生水解，因此本实验柱温只在20～30℃范围内考察，从试验了三个温度(20℃、25℃和30℃)下的色谱分离情况看，25℃下有较好分离，最终确定柱温为25℃，见图2G-图2I。

[0068] 2.1.5进样量

[0069] Phenomenex C18，柱温25℃，甲醇∶水11∶89，流速3.0mL/min，检测波长275nm。

[0070] 在供试品浓度达到0.2g/mL同时增加进样体积，考察进样超载情况，从进样100μL的色谱图看色谱峰峰宽增加，分离效果变差，最终确定进样量为50μL(0.2g/mL)，见图2J-图2K。

[0071] 2.2制备杂质

[0072] 色谱条件：柱温25℃，流动相甲醇∶水11∶89，流速3.0mL/min，检测波长275nm，进样量50μL。

[0073] 将实施例1所得4部分接收液除去溶剂，用适量甲醇溶解，微孔滤膜过滤，按上述色谱条件分段收集流出液，HPLC跟踪检测纯度，符合规定要求，见图3和图8。

[0074] 实施例3.结构鉴定

[0075] 3个杂质均经过红外光谱(IR)、质谱(MS)、核磁共振谱(1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、DEPT、HSQC和HMBC)表征，其波谱数据与文献报道的淫羊藿次苷、对羟苯乙酰氧基-β-D-吡喃葡萄糖苷、云杉素的波谱数据一致[参见：Toshio Miyase；Akira Ueno；Nobuo Takizawa.Phytochemistry.1989，28，3484-3485.Pan，H.-F.Phytochemistry.1995，
39，1423-1428.Roger，A.D.；Lucia，V.H.；Arnold，J.V.Phytochemistry.1986，25，
1201-1204]，确定其分别为淫羊藿次苷、对羟苯乙酰氧基-β-D-吡喃葡萄糖苷、云杉素。

[0076] 实施例4.分析型色谱条件的选择

[0077] 为了兼顾主成分含量与杂质含量的测定，在测定杂质时，样品的浓度必须较大，足以使杂质能够出峰；测定主成分含量时，溶液浓度太大会导致主峰超线性而使定量不准，故将样品稀释4倍后测定，试验准确度(见表1)令人满意。

[0078] 实施例5.标准曲线

[0079] 对照品溶液的配制：取红景天苷对照品适量，精密称定，加流动相制成1mL含有1.0mg的对照品储备液，分别精密移取适量储备液用流动相配制成系列对照品溶液。

[0080] 分别取HEPG、HPAG和PAPG对照品适量，精密称定，加流动相制成1mL含有1.0mg的储备液。精密移取6.00mL HPEG、1.00mL HPAG和0.60mL PAPG储备液加入同一10mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为HEPG、HPAG及PAPG浓度分别为0.60mg/mL、0.10mg/mL、0.06mg/mL的混合对照品储备液，进行HPLC分析，结果见图10。再逐级稀释得系列对照品溶液。

[0081] 在红景天苷对照品溶液浓度范围为0.03～1.0mg/mL，取20μL进样，以峰面积对浓度作图(见图4)，回归方程为：

[0082] Asalidroside(area)＝14948+3E6Csalidroside，r＝0.9999

[0083] 在HEPG、HPAG及PAPG对照品溶液浓度范围分别为0.001～0.03mg/mL、0.0003～0.005mg/mL及0.0001～0.003mg/mL，取混合对照品溶液20μL进样，以峰面积对浓度作图(见图5、6、7)，回归方程分别为：

[0084] AHEPG(area)＝-49.071+2E6CHEPG，r＝0.9994

[0085] AHPAG(area)＝163.66+5E6CHPAG，r＝0.9990

[0086] APAPG(area)＝58.623+2E7CPAPG，r＝0.9993

[0087] 当信噪比S/N＝3时，测得HEPG、HPAG、PAPG及红景天苷的最低检测限分别为0.00005mg/mL、0.00001mg/mL、0.00001mg/mL和0.0001mg/mL。

[0088] 实施例6.样品测定

[0089] 3.1主含量的测定

[0090] 样品溶液的制备：取红景天苷试样适量，精密称定，加流动相制成1mL含有1.0mg溶液，摇匀备用。移取25mL上述溶液置于100mL容量瓶中，加流动相至刻度，摇匀备用。

[0091] 选择5个批号的样品，按上述方法配制样品溶液，在最佳试验条件下进行HPLC分析，进样量为20μL(见图9)。

[0092] 3.1杂质测定

[0093] 样品溶液的制备：取红景天苷试样适量，精密称定，加流动相制成1mL含有1.0mg溶液，摇匀备用。

[0094] 选择5个批号的样品，按上述方法配制样品溶液，在最佳试验条件下进行HPLC分析，进样量为20μL(见图11)。

[0095] 样品中主成分及杂质的检测结果见表1。

[0096] 表1.检测结果

[0097]