重组犬2型腺病毒转移载体、其构建方法及应用转让专利
申请号 : CN200710130090.6
文献号 : CN101358202B
文献日 : 2011-02-09
发明人 : 曲连东 , 姜骞 , 周洁 , 陈洪岩 , 刘家森 , 李昌文 , 张洪英 , 司昌德 , 刘立奎 , 韩凌霞 , 孟庆文
申请人 : 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
摘要 :
本发明公开了一种重组犬2型腺病毒转移载体、其构建方法及其用途。本发明重组犬2型腺病毒转移载体缺失了E3区的1412bp片段，可以插入大片段的外源基因，并且在所缺失的E3区片段位置插入hCMV IE启动子、多克隆位点、增强型绿色荧光蛋白基因和SV40早期转录Poly A信号序列。本发明成功构建了E3区缺失的重组CAV-2转移载体并获得了纯化的含有EGFP报告基因的重组犬2型腺病毒株，对其克隆纯化方法进行了优化，经鉴定该重组病毒生物学特性稳定，为进一步开展CAV-2活载体疫苗研制及相关基础研究提供了技术平台。
权利要求 :
1.一种重组犬2型腺病毒转移载体，其特征在于：重组犬2型腺病毒转移载体缺失了E3基因从24954bp到26360bp之间的片段，并且在所缺失的E3区片段位置插入hCMV IE启动子、多克隆位点、增强型绿色荧光蛋白基因和SV40早期转录Poly A信号序列；其构建方法包括：(1)构建含有犬2型腺病毒E3区及其侧翼核苷酸序列的质粒pMD-E3；
(2)以质粒pMD-E3为模板，以SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3为引物进行PCR扩增，得到犬2型腺病毒上游同源重组臂基因；以质粒pMD-E3为模板，以SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：
5为引物进行PCR扩增，得到犬2型腺病毒下游同源重组臂基因；
(3)将步骤(2)扩增得到的犬2型腺病毒下游同源重组臂基因经Kpn I和HindIII双酶切与同样处理的PUC18质粒连接，转化感受态细胞，得到质粒PUC-X；将所扩增得到上游同源臂基因与PUC-X质粒同时进行EcoR I和Kpn I双酶切，将二者连接后得到质粒PUC-ΔE3；
(4)以pEGFP-N1载体为模板，以SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7为引物进行PCR扩增，将扩增得到的产物与PUC-ΔE3质粒同时进行Spe I酶切后再相连接，即得。
2.按照权利要求1的重组犬2型腺病毒转移载体，其特征在于：其全基因序列为SEQ ID NO：1所示。
3.按照权利要求1的重组犬2型腺病毒转移载体，其特征在于：步骤(1)中所述的犬2型腺病毒E3区及其侧翼核苷酸序列为SEQ IDNO：8所示。
4.含有权利要求1重组犬2型腺病毒转移载体的宿主细胞。
5.重组病毒rCAV-2ΔE3-EGFP，其微生物保藏号是CGMCCNO.2109。
说明书 :
重组犬2型腺病毒转移载体、其构建方法及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种重组病毒转移载体，尤其涉及一种重组犬2型腺病毒转移载体、其构建方法及应用，属于基因工程领域。
背景技术
[0002] E3区是腺病毒体外复制的非必需区，在E3区插入外源基因不影响病毒的生长特性，常被用于克隆外源基因的区域。人与动物腺病毒中，除羊腺病毒外(Vrati等，1995)E3区都位于腺病毒基因组L4区的pVIII蛋白基因和L5区纤维蛋白基因之间，但各种腺病毒基因组大小不同，其E3区的起始位点也有差别。E完整的腺病毒E3区含有9～12个开放阅读框架(ORF)，其中7个编码产物已在感染细胞中确定，分别为E3-12.5K、E3-6.7K、E3-gp19K、E3-11.6K、E3-10.4k、E3-14.5K、E3-14.7K。除了E3-12.5K(Dimitriov et al，1997；Tollefson et al，1996)。CAV-1和CAV-2的E3区结构均为部分缺失，CAV-1的E3区比CAV-2少约500bp。
[0003] CAV-2的E3区编码13.3kDa和40.7kDa的两个蛋白，但具体功能尚不清楚，其两侧分别为pVIII蛋白基因和纤维蛋白基因，二者所编码的蛋白均与病毒的毒力密切相关，是构建E3区缺失载体不可缺少的部分。
[0004] 腺病毒基因组含有早期转录基因(E1-E4)和晚期转录基因(L1-L5)，E1-E4区与病毒复制、病毒代谢调节有关。E1、E3和E4上游区都是外源基因主要的插入部位。E1区缺失的腺病毒虽然可使外源基因高效表达，但它是复制缺陷型的，不能在人和动物体内生长和繁殖，是在构建基因治疗性表达载体时最常用的外源基因插入部位。E4上游区存在一个转录沉默区，在该区域插入外源基因不影响病毒的复制，但插入的容量受到限制。E3区是腺病毒的体外复制非必需区，在E3区(或缺失部分E3区序列)插入外源基因构建的腺病毒载体为非依赖型可复制性载体，这种载体在体内各器宫及细胞中能自主复制和表达外源基因，被广泛应用于蛋白特性研究、诊断抗原和亚单位疫苗及重组活载体疫苗的制备。重组腺病毒载体疫苗作为一种新型疫苗，在各种人和动物病毒病、细菌病和寄生虫病的免疫预防中进行了大量的研究。目前在人病毒病的重组腺病毒载体疫苗研究中，已进行研究的病原主要有人/猿免疫缺陷病病毒(Human/Simianimmunodeficiencyvirus，HIV/SIV)、狂犬病病毒(Rabiesvirus，RV)，丙型肝炎病毒(Hapatitis C virus，HCV)、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)、SARS冠状病毒(SARS-coronavirus)、麻疹病毒(Measles virus)(Putz et al，2003)、登革病毒(Dengue virus)、巨细胞瘤病毒(Cytomegalovirus，CMV)(Shanley et al，2005)、EB病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)、埃博拉病毒(Ebola virus)等，重组腺病毒均可有效的表达上述病毒的抗原基因，在实验动物和非人灵长类动物体进行的免疫试验表明，可以刺激产生特异性的细胞免疫和体液免疫反应，其中HIV重组腺病毒载体疫苗已在人体进行了免疫试验(Robinson etal，2002)。在利用重组腺病毒表达人疟原虫(malaria)CS抗原蛋白进行免疫研究中证明，其免疫效果甚至比放射孢子体的免疫效果还要好(Bruna-Romero et al，2004)。在动物疫病的腺病毒活载体疫苗的研究中HAd5型复制缺陷型的腺病毒载体是最常应用的。用表达伪狂犬病毒gD糖蛋白的重组痘病毒和重组腺病毒载体疫苗进行对比试验，证明腺病毒在刺激特异性抗体应答和免疫保护方面要好于痘病毒(Gonin et al，1996)，并且可以多途径进行免疫，说明人腺病毒HAd5具有较广泛的细胞嗜性。而CAV-2的基本结构与人腺病毒相类似，具有人腺病毒的优点。且CAV-2只能感染犬，导致呼吸道疾病和腹泻，对人类及其它动物不具感染性和致病性，作为活病毒载体研制双价或多价疫苗有着明显的优势。
[0005] 从理论上讲，重组腺病毒核衣壳DNA的容量只有野生型腺病毒DNA的105％，即基因组大小为31323bp的CAV-2容纳外源基因的最大限度仅为1560bp左右。在腺病毒早期研究中，人们发现腺病毒复制和包装所必需的顺式作用元件仅在病毒基因组两端，即反向末端重复序列和包装信号所在，加起来长度不到1kb。这部分顺式作用元件称为病毒的最基本结构，除此之外的病毒基因组都可以被置换，其功能可用异位作用来补偿。腺病毒载体的构建策略通常为通过缺失基因组的部分区域而扩大插入外源基因容量，E3区是腺病毒的基因组中最大的复制非必需区，因此在E3区(或缺失部分E3区序列)插入外源基因构建非依赖型可复制性重组活载体具有重大的研究价值和应用前景。
[0006] 插入E3区的外源基因的转录受E3启动子或腺病毒MLP控制，一般不需要再加基因表达调控元件，且插入的外源基因与E3区和晚期转录同向，即从左向右才能高效表达。Johnson等(1988)在E3区构建了SV40启动子控制下的HSVgB蛋白表达载体，在人源细胞系上感染重组病毒后12～60h都能表达gB。转录分析发现gB基因直接受MLP和E3启动子控制，而SV40启动子被作为内含子，在RNA加工时被剪切掉。
[0007] Zakhartchouk等(1998)构建了缺失完整E3区的BAV3病毒，将不含外源性启动子的全长或截短的BHV-1糖蛋白gD基因插入BAV3.E3d的E3区，并使之与E3区同向，感染MDBK细胞后24h，用SDS-PAGE开始检测到gD的表达，且在感染MDBK细胞过程中一直持续表达。而在感染细胞中加入DNA合成抑制剂(AraC)时，gD的表达降低，说明gD的表达部分由病毒MLP和E3启动子控制。与上述研究结果不同的是，Reddy等(2002)[ps}首次将无任何调控序列的GFP基因分别插入PAV3不缺失E3区的Sac I和Snag I位点，并使之与E3转录方向一致，但仅能得到GFP基因插入SnagI位点的病毒，这说明Sac I位点所处的E3 ORF可能是病毒复制所需的。将无转录调控元件的PRV gD基因引入E3区缺失595bp的PAV3缺失E3区突变株后检测到，gD的表达是一过性的，仅在感染后12h时能检测到，说明该区域的表达是暂时调控的。Rasmussen等认为CAV-2如果完全缺失E1和E3区，理论上可插入5.8kb的外源DNA片段，但E3可缺失的最大极限还不十分清楚(1990)，Fischer等(2002)分别缺失了CAV-2 E3区684bp和1263bp，所构建的载体均能使外源基因获得表达。邱微等(2003)构建了缺失E3区1370bp表达载体，但外源基因的表达需要有外源启动子存在。
发明内容
[0008] 本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的重组犬2型腺病毒转移载体，该重组犬2型腺病毒转移载体能够将犬2型腺病毒E3区最大限度的缺失，从而可以插入和表达大片段的外源基因。
[0009] 本发明首先所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
[0010] 一种重组犬2型腺病毒转移载体，该重组犬2型腺病毒转移载体缺失了E3基因从24954bp到26360bp之间的片段，并且在所缺失的E3区片段位置插入hCMV IE启动子、多克隆位点、增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)和SV40早期转录Poly A信号。
[0011] 作为一种最优选的方案，本发明所述的重组犬2型腺病毒转移载体PUC-ΔE3-EGFP，其全基因序列为SEQ ID NO：1所示。
[0012] 本发明重组犬2型腺病毒转移载体对E3区进行了最大限度的缺失，即缺失了1412bp的E3区片段，使CAV-2 E3区的容量增加到将近3kb，为了保证外源基因的有效表达，本发明载体在E3区启动子的下游同向加入了hCMV IE启动子，使外源基因同时受到两个启动子的控制。
[0013] 用本发明重组犬2型腺病毒转移载体转染CAV-2亲本毒株感染的MDCK细胞，细胞病变后收取的病毒液经传代仍能观察到绿色荧光，证明所构建的转移载体与亲本CAV-2发生了同源重组。通过蚀斑筛选获得了遗传稳定表达绿色荧光蛋白的单一纯化重组病毒克隆株rCAV-2ΔE3-EGFP，重组病毒rCAV-2ΔE3-EGFP，其微生物保藏号是CGMCC NO.2109，分类命名是：表达EGFP缺失E3区的重组犬2型腺病毒(CanineAdeno-virusTypeII)；保藏时间是：2007年7月13日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所。
[0014] 本发明对所获得的重组病毒克隆株rCAV-2ΔE3-EGFP的生物学特性进行了分析，经鉴定该重组病毒生物学特性稳定，建立了表达外源基因的E3缺失重组CAV-2病毒表达系统及其克隆纯化方法，为进一步开展CAV-2活载体疫苗研制及相关基础研究提供了技术平台。
[0015] 本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种构建上述重组犬2型腺病毒转移载体PUC-ΔE3-EGFP的方法。
[0016] 本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下技术方案来实现的：
[0017] 一种构建上述重组犬2型腺病毒转移载体PUC-ΔE3-EGFP的方法，包括：
[0018] (1)制备含有犬2型腺病毒E3区及其侧翼核苷酸序列的质粒pMD-E3；
[0019] (2)以质粒pMD-E3为模板，以SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3为引物进行PCR扩增，得到犬2型腺病毒上游同源重组臂基因；以质粒pMD-E3为模板，以SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5为引物进行PCR扩增，得到犬2型腺病毒下游同源重组臂基因；
[0020] (3)扩增后得到的犬2型腺病毒下游同源重组臂基因经Kpn I和HindIII双酶切与同样处理的PUC18质粒连接，转化感受态细胞(DH5a)，得到质粒PUC-X；将所扩增得到上游同源重组臂基因与PUC-X质粒同时进行EcoR I和Kpn I双酶切，将二者连接后缺失了两同源重组臂之间的E3区序列，得到质粒PUC-ΔE3；
[0021] (4)以pEGFP-N1载体为模板，以SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：6为引物进行PCR扩增，将扩增得到的产物与PUC-ΔE3质粒同时进行Spe I酶切后相连接，即得。
[0022] 对于E3区的缺失，本发明也采用了新的方法，现有技术中，一般需要通过多步PCR进行序列突变、酶切、连接用以缺失E3区。而本发明通过在所选择的上、下游同源重组臂靠近缺失区域的一端引入相同的酶切位点，通过这两个片段之间的连接缺失掉了中间的E3区，与现有技术相比，本发明方法极大的减少了工作量。
[0023] 为了筛选有外源基因插入的重组病毒，人们发展了与外源基因同时插入筛选标记基因的方法，常见的有抗生素基因、可提供病毒蚀斑颜色的报告基因等。报告基因的应用，大大减少了筛选病毒的工作量，但其中的报告基因又给重组疫苗的应用带来许多弊端，如携带抗生素基因的重组病毒免疫动物很可能会使动物机体产生抗药性；用携带大肠杆菌lacZ基因的重组病毒免疫动物也可能由于lacZ基因的表达而干扰重组病毒的免疫效果因为在自然界中的绝大多数动物体内都有抗大肠杆菌的免疫。EGFP报告基因近年来被广泛用于体内外实验研究(Gedes et al，1996；Tsien etal，1998)，表达的EGFP在紫外光激发下能发出绿色荧光，用荧光显微镜便可直接观察到，方便检测。另外EGFP可作为融合蛋白显示目的蛋白的表达而不影响目的蛋白的性质，对细胞也没有毒性作用(Liu et al，1999)。CAV-2的E3区只有1521bp，尽管我们作了最大限度的缺失，但其包装容量仍然有限，而源自质粒pEGFP-N1的EGFP只有780bp，加上hCMVIE启动子、MCS和SV40poly-A信号仅1600bp，这也是本发明选用EGFP作报告基因的主要原因。本发明将质粒pEGFP-N1中所包括的各种表达元件按照与E3区转录相同的方向一并亚克隆至E3区缺失处，简化了载体构建的过程。
[0024] 本发明成功构建了E3区缺失的重组CAV-2转移载体并获得了纯化的含有EGFP报告基因的重组CAV-2毒株，对其克隆纯化方法进行了优化，经鉴定该重组病毒生物学特性稳定，为进一步开展CAV-2活载体疫苗研制及相关基础研究提供了技术平台。
附图说明
[0025] 图1CAV-2的E3区及其侧翼序列的扩增。
[0026] 图2质粒pEGFP-N1的物理图谱。
[0027] 图3本发明重组转移载体PUC-ΔE3-EGFP的构建示意图。
[0028] 图4上、下游同源重组臂序列的扩增产物电泳图谱；1.水对照；2.DL15000Marker；3.上游同源重组臂的PCR扩增结果；4.下游同源重组臂的PCR扩增结果。
[0029] 图5含有hCMV IE、MCS、EGFP和SV40 polyA信号的pEGFP-N1部分片段的扩增；1.水对照；2.PCR扩增产物；3.DL2000 Marker。
[0030] 图6PUC-X的酶切鉴定；1.DL15000 Marker；2.Kpn I消化结果；3.Kpn I/HindIII消化结果。
[0031] 图7PUC-ΔE3的酶切鉴定；1.DL15000 Marker；2.HindIII消化结果；3.Kpn I消化结果。
[0032] 图8HindIII酶切筛选正向重组质粒；1.外源表达元件反向插入；2.外源表达元件正向插入；3.DL15000 Marker。
[0033] 图9pUC-ΔE3-EGFP转染MDCK细胞24h后观察到的瞬时表达(100×)；A.EGFP在MDCK中的瞬时表达；B.MDCK细胞对照。
[0034] 图10rCAV-2ΔE3-EGFP在MDCK细胞上形成的蚀斑。
[0035] 图11荧光显微镜下观察到的rCAV-2ΔE3-EGFP在MDCK细胞上形成的蚀斑(100×)
[0036] 图12 重 组 病 毒rCAV-2ΔE3-EGFP 的 纯 化 (100×)；A.EGFP在 纯 化 后rCAV-2ΔE3-EGFP中的表达；B.MDCK对照。
[0037] 图13rCAV-2ΔE3-EGFP的PCR鉴定；
[0038] 1.引物EGFP-S/EGFP-X鉴定亲本CAV-2；2.DL 2000Marker；3.引物EGFP-S/EGFP-X鉴定rCAV-2ΔE3-EGFP；4.引物ΔE3-S/ΔE3-X鉴定rCAV-2ΔE3-EGFP；5.引物ΔE3-S/ΔE3-X鉴定CAV-2
[0039] 图14rCAV-2ΔE3-EGFP在MDCK细胞上形成的细胞病变；
[0040] 1.rCAV-2ΔE3-EGFP形成的细胞病变；2.正常的MDCK细胞；3.亲本CAV-2形成的细胞病变。
[0041] 图15细胞培养上清液中的腺病毒样颗粒。
[0042] 图16rCAV-2ΔE3-EGFP的MDCK细胞生长曲线图。
[0043] 图17第1-15代rCAV-2ΔE3-EGFP的PCR鉴定；A1，B2，C5.引物ΔE3-S/ΔE3-X扩增rCAV-2ΔE3-EGFP；A2，B1，C3.引物ΔE3-S/ΔE3-X扩增CAV-2；A3，B3，C4.DL15000 Marker；A4，B4，B2.引物EGFP-S/EGFP-X扩增rCAV-2ΔE3-EGFP；A5，B5，C1.引物EGFP-S/EGFP-X扩增CAV-2。
[0044] 图18EGFP在rCAV-2ΔE3-EGFP中表达的稳定性检测(100×)。
[0045] 图19试验犬接种亲本/重组病毒后病理变化的比较(40×)22。
[0046] 图20CDV F基因的扩增；
[0047] A：1.F1基因的PCR扩增结果；2.DL2000Marker；3.阴性对照。
[0048] B：1.F2基因的PCR扩增结果；2.阴性对照；3.DL 2000 Marker。
[0049] 图21 CDV H基因的扩增；1.H基因的PCR扩增结果；2.DL 2000Marker；3.阴性对照。
[0050] 图22 pUC-ΔE3-F的酶切鉴定；1.DL15000 Marker；2.Bgl II酶切结果(7550bp)；3.BglII/Not I酶切结果(5546bp+2004bp)。
[0051] 图23pUC-ΔE3-H的酶切鉴定；1.DL15000 Marker；2.Bgl II酶切结果(7430bp)；3.Bgl II/Not I酶切结果(5592bp+1838bp)。
[0052] 图24rCAV-2ΔE3-F和rCAV-2ΔE3-H在MDCK细胞上形成的细胞病变(100×)；A.rCAV-2ΔE3-F在MDCK上形成的CPE；B.rCAV-2ΔE3-H在MDCK上形成的CPE；C.CAV-2在MDCK上形成的CPE；D.正常的MDCK细胞。
[0053] 图25重组病毒rCAV-2ΔE3-F和rCAV-2ΔE3-H的PCR鉴定；1.引物rF-U/rF-L扩增rCAV-2ΔE3-F的结果；2.引物EGFP-S/EGFP-X扩增rCAV-2ΔE3-F的结果；3.DL2000 Marker；4.引物rH-U/rH-L扩增rCAV-2ΔE3-H的结果；5.引物EGFP-S/EGFP-X扩增rCAV-2ΔE3-H的结果。
[0054] 图26重组病毒在MDCK细胞上的间接免疫荧光(100×)；A.rCAV-2ΔE3-F；B.rCAV-2ΔE3-H；C.MDCK细胞。
[0055] 图27 rCAV-2ΔE3-F的Western blot分析；1.蛋白分子量标准；2.rCAV-2ΔE3-F接种的MDCK细胞；3.CAV-2接种的MDCK细胞。
[0056] 图28 rCAV-2ΔE3-H的Western blot分析；1.蛋白分子量标准；2.rCAV-2ΔE3-H接种的MDCK细胞；3.CAV-2接种的MDCK细胞。
具体实施方式
[0057] 以下通过具体实施方式对本发明进行进一步说明。这里想要指出的是，下面的具体实施方式仅用来说明本发明，本领域技术人员在理解本发明精神的前提下，可以根据本技术领域的现有技术和公知知识对本发明进行相应变换，这些技术方案均落入本发明的范围之内。
[0058] 实施例1 重组质粒pMD-E3的构建
[0059] 1 材料与方法
[0060] 1.1 细胞、病毒和菌种
[0061] MDCK细胞由本实验室传代培养，培养基为含10％胎牛血清的DMEM；CAV-2疫苗株由哈尔滨兽医研究所经济动物研究室提供(说明：本发明所用到CAV-2疫苗株也可按照下述文献所公开的方法分离得到：李六金等，犬腺病毒II型弱毒疫苗株的分离、鉴定与筛选.青海科技，2000年，6月，第7卷，增刊)，在MDCK细胞上增殖；受体菌DH5a由本实验室保存。
[0062] 1.2 主要试剂
[0063] PrimeSTAR HS DNA聚合酶，rTaqDNA聚合酶、pMD18-T vector，dNTP，IPTG，X-Gal均购自TaKaRa公司。DMEM购自GIBCO-BRL公司，胎牛血清购自天津灏洋生物公司。胶回收试剂盒(Gel Extraction Mini Kit)购自上海华舜生物工程有限公司，其它试剂为进口或国内分析纯产品。
[0064] 1.3 病毒扩增
[0065] 以0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA常规方法消化MDCK细胞，用含10％胎牛血清的DMEM 37℃静置培养，待细胞长满单层后，换成含2％胎牛血清的DMEM维持液，并按培养液量的1％接入CAV-2种毒，培养至80％的细胞出现病变时，收取细胞及维持液，将其反复冻融3次后，-70℃冻存备用。
[0066] 1.4 引物
[0067] 参照GenBank中犬2型腺病毒Toronto A26/61株的全基因序列，利用Oligo6.0设计一对引物，PCR扩增产物位于基因组24358～28152位，包括了E3区及其上游的pVIII基因和下游的部分fiber基因在内的侧翼序列。引物序列如下：
[0068] CAV-2U 5’TTT GTC AGG ACA ACC ACC AGA CAA GGC AC 3’
[0069] CAV-2L 5’GTT TTA AAC AGG GTA CCT CCG CTT AGT CT 3’
[0070] 1.5病毒基因组的提取
[0071] 用SDS-蛋白酶K裂解法提取病毒DNA。收获的细胞培养物12000rpm离心5分钟，吸取上清液437.5μl于1.5ml EP管中，然后加入20mg/ml的蛋白酶K12.5μl，10％SDS50μl(蛋白酶K使用浓度为500μg/ml，SDS使用浓度为1％)，轻轻混匀，55℃ 30min水浴后分别用等体积的酚/氯仿和氯仿各抽提一次，上层水相用1/10体积的3M NaAC(pH 5.2)、
2倍体积的冷乙醇沉淀，-20℃放置1h，4℃ 12000r/min离心15min，上清用75％乙醇洗涤，沉淀干燥后用适量TE重悬，-20℃保存。
2倍体积的冷乙醇沉淀，-20℃放置1h，4℃ 12000r/min离心15min，上清用75％乙醇洗涤，沉淀干燥后用适量TE重悬，-20℃保存。
[0072] 1.6目的基因的扩增
[0073] 以上述提取的CAV-2基因组为模板，扩增E3区及其侧翼序列。50μl反应体系2+
依次加入5倍PrimeSTAR Buffer(Mg Plus)10μl、PrimeSTARHS DNA Polymerase 1.25U、CAV-2U+CAV-2L(10mM)2μl、dNTP(各2.5mM)4μl、模板1μl。同时设立MDCK细胞DNA和无DNA水对照。循环参数为：95℃预热2min，98℃10S，68℃4min，30个循环，72℃延伸20min。
反应结束后在PCR管中加入0.5μl rTaqDNA聚合酶和0.5μl 2.5mM的d-ATP，72℃延伸
30min，取5ulPCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定。提取CAV-2基因组DNA，用特异性引物经PCR扩增后，得到的目的片段与预期大小一致(图1)。
依次加入5倍PrimeSTAR Buffer(Mg Plus)10μl、PrimeSTARHS DNA Polymerase 1.25U、CAV-2U+CAV-2L(10mM)2μl、dNTP(各2.5mM)4μl、模板1μl。同时设立MDCK细胞DNA和无DNA水对照。循环参数为：95℃预热2min，98℃10S，68℃4min，30个循环，72℃延伸20min。
反应结束后在PCR管中加入0.5μl rTaqDNA聚合酶和0.5μl 2.5mM的d-ATP，72℃延伸
30min，取5ulPCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定。提取CAV-2基因组DNA，用特异性引物经PCR扩增后，得到的目的片段与预期大小一致(图1)。
[0074] 1.7与pMD18-T的连接
[0075] PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，用华舜小量胶回收试剂盒回收目的片段与pMD18-T载体连接。 反应体系 为：Target DNA 4.5μl；pMD18-TVector 0.5μl；2×ligation Buffer 5μl，16℃连接1h。
[0076] 1.8大肠杆菌感受态细胞的制备
[0077] 用TSS(Transformation and Storage Solution)法制备E.coli DH5a感受态细胞。以无菌接种环取冻存的E.coli DH5a菌种划线接种于不加抗生素LB琼脂平板上，同时在含有抗性的培养基上划线作对照，37℃过夜培养。次日挑取生长良好的单个菌落，于含3mL LB培养基的试管中37℃振摇过夜培养。将培养物按1∶100接种于200mL LB培养基中37℃振摇培养约3h，至对数生长期。将培养物无菌分装于50mL离心管中，1000g 4℃离心10min弃上清，沉淀用原始培养体积10％的冰预冷的无菌1×TSS溶液(配制方法见附录)重悬，轻轻混匀(冰上操作)。用1.5mL离心管分装感受态细胞，100μL/管，-70℃保存备用。
[0078] 1.9转化
[0079] 取10μl连接产物加入100μl自制的DH-5a感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴30min，42℃热休克90秒后立即置于冰浴中2min，然后加入800μlSOC液体培养基，于37℃+
振荡培养45min。取100μl培养物涂布于含有IPTG、X-gal和Amp 的LB琼脂板上，37℃培养过夜。
振荡培养45min。取100μl培养物涂布于含有IPTG、X-gal和Amp 的LB琼脂板上，37℃培养过夜。
[0080] 1.10碱裂解法小量提取质粒DNA
[0081] 挑取生长于LB培养基平板上的数个白色菌落，接种于装有3～5mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振摇过夜培养。取1.5mL培养物于1.5mLEP管中，12000r/min离心1min倒扣于吸水纸上待液体流尽，加入100μL溶液I，彻底重悬；缓缓加入200μL新配制的溶液II，轻轻颠倒混匀3～5次，冰上放置不超过5min；加入150μL溶液III，温和颠倒混匀，冰上放置5min，12000r/min离心5min；取上清用等体积的饱和酚/氯仿、氯仿各抽提一次，取水相加入2倍体积的无水乙醇，室温放置10min，12000r/min离心5min；弃上清，沉淀用75％的乙醇洗涤一次；离心弃上清，无菌干燥后沉淀溶于30μl TE溶解，将初步鉴定为阳性的重组质粒命名为pMD-E3。
[0082] 1.11重组质粒的序列测定与分析
[0083] 将初步鉴定为阳性菌送生物公司测序，对所测序列进行分析，并与Toronto A26/61强毒株进行同源性比较。
[0084] 对扩增的目的基因进行了测序，其核苷酸序列与预测的各ORF及其编码的氨基酸序列见图2(SEQ ID NO.8)，各ORF在基因组中的相对位置见图3。
[0085] 目的片段全长4614bp，该片段包括4个完整的开放阅读框(ORF)，其中ORF1位于pVIII基因内部，编码224个氨基酸残基。在600bp处，即距E3区起始位置的上游340bp发现一TATA box，推测为E3区的上游启动子序列所在的位置。E3区位于pVIII基因和fiber基因之间，即图中897～2401bp，全长1504bp，正向有2个ORF，即图中ORF2和ORF3。ORF2编码118个氨基酸残基，与ORF1间有14bp重叠，ORF3编码364个氨基酸残基。ORF4是fiber蛋白基因的编码框内部，本研究所克隆的fiber不完整。将该序列与GenBank中Toronto A26/61强毒株比较，发现二者只有7个碱基不同，分别在1968bp，2064bp，2089bp，
2503bp，3162bp，3548bp，3702bp位置，核苷酸序列同源性高达99.81％。疫苗株与强毒TorontoA26/61 E3区仅有2个碱基不同，且均为同义突变，所编码的氨基酸不发生改变。
2503bp，3162bp，3548bp，3702bp位置，核苷酸序列同源性高达99.81％。疫苗株与强毒TorontoA26/61 E3区仅有2个碱基不同，且均为同义突变，所编码的氨基酸不发生改变。
[0086] 将扩增得到的E3区及其侧翼序列与Toronto A26/61强毒株进行了核苷酸序列的比较，发现二者的pVIII基因核苷酸同源性为100％，其余序列中共有7个碱基不同，其中5个碱基均分布在fiber基因编码框内。在E3区的虽有2个突变碱基，但这两个毒株E3区的氨基酸同源性为100％，这说明CAV-2E3区及其编码的蛋白可能与病毒毒力的强弱无关，本实验的结果为下一步构建E3缺失的CAV-2表达载体奠定了理论基础。
[0087] 实施例2 E3缺失重组犬2型腺病毒的构建及其生物学特性分析
[0088] 1 材料和方法
[0089] 1.1 病毒、载体及细胞
[0090] CAV-2疫苗株、感受态细胞DH5a的来源同实施例1；pUC18载体购自大连宝生物工程公司；质粒pEGFP-N1(物理图谱见图4)为Clontech公司产品，带有hCMV立即早期启动子、MCS、EGFP和SV40 polyA信号。
[0091] 1.2 主要试剂
[0092] DMEM购自GIBCO-BRL公司；胎牛血清购自天津灏洋生物公司；PrimeSTAR HS DNA Polymerase，dNTP，DNA Marker，T4 DNA连接酶，限制性内切酶EcoR I、Kpn I和Spe I等均购自大连宝生物工程公司；磷酸钙转染试剂盒(Calcium Phosphate Ttansfection Kit)购自Invitrogen公司；小量胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司；六孔板购自Nunc公司，蛋白酶K购于Sigma公司，低熔点琼脂糖购自Bio-rad公司。
[0093] 1.3 E3缺失转移载体的构建
[0094] 1.3.1 E3区的缺失
[0095] 根据实施例1中对E3区及其侧翼序列的核苷酸序列分析结果，分别选取24050～24953bp及26362～27238bp的序列作为转移载体的上/下游同源重组臂，设计两对引物，TS-U/TS-L用于扩增上游同源臂TX-U/TX-L用于扩增下游同源臂。在上游同源臂引物的两端分别引入EcoR I和KpnI、Spe I酶切位点，下游同源臂引物的两端分别引入Kpn I和HindIII酶切位点(序列中斜体部分)。
[0096] TS-U：5’TTT GAA TTC CAA CCG CCT TTT TCC AAC 3’(SEQ ID NO.2)[0097] TS-L：5’TTT GGT ACC ACT AGT CCA CCT GGT CCA TGC TCT C 3’(SEQID NO.3)[0098] TX-U：5’TTC GGT ACC ACC CTC AGC CTT CTA AT 3’(SEQ ID NO.4)[0099] TX-L：5’TTT TTG GAA AGA GGC TCG TTG T 3’(SEQ ID NO.5)
[0100] 以质粒pMD-E3为模板，PrimeSTAR HS DNA Polymerase PCR扩增上/下游同源重组臂基因。PCR反应参数为：98℃10s，68℃1min，30个循环。扩增后得到的下游同源臂目的片段经Kpn I和HindIII双酶切与同样处理的pUC18质粒做以下体系的连接：载体pUC180.5μL，目的基因(PCR产物)3.7μL，10×T DNA Ligase Buffer 0.5μL，T DNA Ligase
0.5μL。在保温瓶中16℃水浴，连接1小时，转化感受态细胞DH5a，挑取单个克隆菌，提取质粒鉴定正确后命名为pUC-X。上游同源臂目的片段与pUC-X质粒同时进行EcoRI和Kpn I双酶切，将二者连接(方法同上)后缺失了两同源重组臂之间的E3区序列，得到的质粒命名为的pUC-ΔE3。
0.5μL。在保温瓶中16℃水浴，连接1小时，转化感受态细胞DH5a，挑取单个克隆菌，提取质粒鉴定正确后命名为pUC-X。上游同源臂目的片段与pUC-X质粒同时进行EcoRI和Kpn I双酶切，将二者连接(方法同上)后缺失了两同源重组臂之间的E3区序列，得到的质粒命名为的pUC-ΔE3。
[0101] 1.3.2转移载体的构建
[0102] 根据pEGFP-N1载体的核苷酸序列设计1对引物：pE-U/pE-L
[0103] pE-U：5’TTT CCG CCA TGC ATT AGT TAT T3’(SEQ ID NO.6)
[0104] pE-L：5’TTT GCA GTG AAA AAA ATG CTT 3’(SEQ ID NO.7)
[0105] 在上、下游引物的两端同时引入了Spe I酶切位点(序列中划线部分)这两对引物可以扩增包括hCMV IE、MCS、EGFP、SV40早期转录PolyA终止信号等在内的1600bp的片段。反应参数为：95℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30个循环。将扩增得到的目片段与pUC-ΔE3质粒同时进行Spe I酶切后相连接，通过酶切鉴定筛选出连接方向正确的质粒命名为pUC-ΔE3-EGFP，完成了E3缺失转移载体的构建，构建过程见图5。
[0106] 试验结果：以TS-U/TS-L为引物，以pMD-E3质粒为模板，扩增了两个片段，与预期的上、下游同源臂大小一致(图6)，测序结果正确后将下游、上游同源臂先后克隆于PUC18载体，利用TS-U和TS-L中共有的酶切位点Kpn I将二者连接得到中间克隆载体PUC-ΔE3，以pE-U/pE-L为引物扩增质粒pEGFP-N1得到了约1600bp片段(图7)，与预期的包含有hCMV立即早期启动子、MCS、EGFP和SV40早期转录polyA信号的目的片段大小相符，将该片段插入到PUC-ΔE3的Spe I酶切位点中，构建的重组质粒中含有3个HindIII酶切位点，若插入的方向为正，酶切应得到约为2830bp、1880bp及1450bp的3个片段；反向则为2830bp、1750bp及1580bp的3个片段，筛选正向连接的质粒经测序正确后命名为PUC-ΔE3-EGFP，即为E3区缺失的重组转移载体。各中间产物及重组转移载体的酶切鉴定结果见图8，图9，图10。
[0107] 1.4中量法提取PUC-ΔE3-EGFP质粒并纯化
[0108] 按Promega公司Wziard PureFection Plasmid DNA PurificationSystem试剂盒说明书进行。收集25ml细菌培养物，10,000g室温离心10min，弃上清并用吸水纸吸尽残液。加入1.25ml Cell Resuspension Solution使细胞完全悬浮，然后再加入1.25ml Cell Lysis Solution，充分混匀后室温作用5min，加入1.75ml Neutralization Solution，立即颠倒6-8次混匀，10,000g室温离心20min；将上清用0.45pm滤器过滤入新的离心管中，加入事先彻底混匀Endotoxin Removal Resin 0.25ml，剧烈混匀后室温静止10min，期间间TM隔数秒混匀一次；将离心管放置在磁力棒上(Magnesil Magnetic Separation Unit)，轻轻摇动使树脂完全吸附在管壁上，静置30秒至溶液清晰后吸取上清至一新的离心管中；加入
1ml 5mol/L的Guanidine Thiocyanate，充分混匀后加入0.75ml MagnesilTMParamagnetic Particles于管中，振荡混匀后室温作用2-3min，将管置于磁力棒上使颗粒吸附，溶液清晰并静置30秒后，弃上清，将管从磁力棒上取下；加入1ml 4/10 Wash Solution振荡重悬沉淀的颗粒，重复上述步骤，吸附弃上清；加入2.5ml 80％的乙醇振荡悬浮颗粒，吸附弃上清并重复洗涤三次；沉淀室温干燥10min，用1.2ml灭菌去离子水重悬，剧烈振荡10秒后，室温静置1分钟，置于磁力棒上吸附后转移上清到新的离心管中，加入0.5倍体积的7.5mol/L的醋酸纳和2.5倍上述液体总体积的95％的乙醇，混匀后12000g室温离心15min，弃去上清，用70％乙醇洗涤沉淀，12000g室温离心5min，沉淀在无菌环境中自然干燥，加入200μl灭菌去离子水重悬DNA，在紫外分光光度计检测质粒浓度后-20℃保存备用。
1ml 5mol/L的Guanidine Thiocyanate，充分混匀后加入0.75ml MagnesilTMParamagnetic Particles于管中，振荡混匀后室温作用2-3min，将管置于磁力棒上使颗粒吸附，溶液清晰并静置30秒后，弃上清，将管从磁力棒上取下；加入1ml 4/10 Wash Solution振荡重悬沉淀的颗粒，重复上述步骤，吸附弃上清；加入2.5ml 80％的乙醇振荡悬浮颗粒，吸附弃上清并重复洗涤三次；沉淀室温干燥10min，用1.2ml灭菌去离子水重悬，剧烈振荡10秒后，室温静置1分钟，置于磁力棒上吸附后转移上清到新的离心管中，加入0.5倍体积的7.5mol/L的醋酸纳和2.5倍上述液体总体积的95％的乙醇，混匀后12000g室温离心15min，弃去上清，用70％乙醇洗涤沉淀，12000g室温离心5min，沉淀在无菌环境中自然干燥，加入200μl灭菌去离子水重悬DNA，在紫外分光光度计检测质粒浓度后-20℃保存备用。
[0109] 1.5CAV-2亲本病毒PFU的测定
[0110] 空斑滴定法(Nickin，1999)测定病毒滴度：将MDCK细胞传代于24孔细胞培养板，培养至细胞长成单层，吸去培养液，用PBS洗细胞两次；将试验一中收取的CAV-2病毒液用无血清的DMEM培养液作10倍比稀释，每孔接种200μl，每稀释度作4孔，37.℃吸附1h后吸出病毒液；将2％的低熔点琼脂糖融化后降至40℃左右，与事先在37℃预热的2×DMEM(含4％胎牛血清，0.02％中性红)等体积混和，缓慢注入24孔板中，厚度约为2mm平放至琼脂凝固，置于37℃培养，待蚀斑出现后计数，计算病毒液中的病毒含量。滴度pfu/ml＝plaque number/dilutionxvolume(ml)
[0111] 1.6重组质粒的转染
[0112] MDCK细胞经消化后接种于六孔板中，培养至长满80％时，给细胞换成新鲜的培5 6 7
养液，每孔2ml，分别以10、10 和10PFU的剂量感染亲本CAV-2，2h后钙转染试剂转染PUC-ΔE3-EGFP质粒每孔4μg，具体操作为：分别准备两个EP管，标为A、B，在A管内加入
7.2μl 2M Cacl和4μg质粒，加水补足60μl，混匀。B管加入60μl 2×HBS。逐滴将A管内的液体加入B管，滴加同时用枪头在B管从液面不断向底部吹气泡，直到液体完全混匀(液体内没有肉眼可见的颗粒，晶莹透亮为止)。将混合好的AB液室温放置30min后加入已感染CAV-2的细胞中，轻轻晃动以混匀，置于37℃CO2培养箱培养12h后将细胞内的液体吸出，加入10％DMSO(PBS溶解，pH 7.2)，准确作用2.5min，加入新鲜的DMEM培养液。每隔
24h在荧光显微镜下(Leica公司)观察绿色荧光的表达及病变情况。当90％的细胞出现CPE，收获细胞培养物反复冻融三次，超声裂解，离心取上清-20℃保存。
养液，每孔2ml，分别以10、10 和10PFU的剂量感染亲本CAV-2，2h后钙转染试剂转染PUC-ΔE3-EGFP质粒每孔4μg，具体操作为：分别准备两个EP管，标为A、B，在A管内加入
7.2μl 2M Cacl和4μg质粒，加水补足60μl，混匀。B管加入60μl 2×HBS。逐滴将A管内的液体加入B管，滴加同时用枪头在B管从液面不断向底部吹气泡，直到液体完全混匀(液体内没有肉眼可见的颗粒，晶莹透亮为止)。将混合好的AB液室温放置30min后加入已感染CAV-2的细胞中，轻轻晃动以混匀，置于37℃CO2培养箱培养12h后将细胞内的液体吸出，加入10％DMSO(PBS溶解，pH 7.2)，准确作用2.5min，加入新鲜的DMEM培养液。每隔
24h在荧光显微镜下(Leica公司)观察绿色荧光的表达及病变情况。当90％的细胞出现CPE，收获细胞培养物反复冻融三次，超声裂解，离心取上清-20℃保存。
[0113] 在转染时本发明采用的方法是CAV-2亲本病毒先感染DK细胞再转染重组质粒PUC-ΔE3-EGFP。这就需要用重组病毒进行多次纯化用以去除亲本CAV-2的污染。之所以采用这种方法是因为在本实验中很难像构建重组人腺病毒那样，用酶切过的病毒DNA和质粒DNA共转染获得重组病毒，其中原因首先是MDCK细胞不像293细胞那样具有较高的转染和重组效率，所用的CAV-2为致弱毒株，感染力及毒力均有减弱，其DNA的转染能力自然不高。
[0114] 1.7重组病毒的筛选及纯化
[0115] 将收获的病毒液用含2％犊牛血清的DMEM稀释后感染长满单层的MDCK细胞，每隔12h监测荧光。选择出现绿色荧光蛋白集中的位置用记号笔圈下，用细胞刮将圈外部分刮除，余下的细胞反复冻融后再次感染细胞，多次重复，直至在荧光显微镜下监测到被感染的大部分细胞中出现绿色荧光。待病变完全收取病毒液以无血清DMEM10倍比稀释后感染MDCK细胞，吸附1h后弃去细胞表面液体，加入2mL 2×DMEM(含有0.02％中性红染液和4％血清)和2％低熔点琼脂糖等体积混合凝胶，待出现明显的蚀斑时，在荧光显微镜下观察是否有绿色荧光出现。挑取有绿色荧光的蚀斑放入1mL无血清的DMEM培养液中，反复冻融3次后接种细胞进行新一轮的蚀斑纯化，直至所有病毒蚀斑在均呈现绿色荧光为止。将纯化到的重组病毒扩大培养，命名为rCAV-2ΔE3-EGFP。
[0116] 本发明用重组质粒转染CAV-2亲本病毒感染后的MDCK细胞病变后而用收获的病毒液再次感染细胞则发现视野中仅有极少量的荧光。这说明亲本病毒与PUC-ΔE3-EGFP质粒的在细胞内发生同源重组的效率并不高，我们所收获的病毒大多为亲本病毒，我们曾尝试直接通过蚀斑筛选重组病毒，而事实证明这是很难办到的，为了克服此难题，所采用的办法是用记号笔将在荧光显微镜下观察到绿色荧光聚集的位置各自圈在尽量小的范围内，将余下的细胞刮除。用收获的细胞培养物再次感染细胞，如此反复多次，直至被感染的大部分细胞在视野中均能呈现绿色荧光，则表示重组病毒已成为优势病毒，这是再用蚀斑筛选重组病毒就很容易了。为了检验外源基因的表达是否稳定，本发明对13代的重组CAV-2作蚀斑鉴定，结果仍为阳性，荧光显微镜下观察可见到EGFP的表达，证明EGFP在重组病毒中稳定表达，这对于重组病毒而言至关重要。若外源基因表达不稳定、在传代过程中丢失，将直接影响到重组病毒作为活载体疫苗的可行性。
[0117] pUC-ΔE3-EGFP经紫外分光光度计测定浓度为1.27μg/μL，按每2μg/mL的比例取纯化的重组质粒pUC-ΔE3-EGFP转染已被亲本CAV-2感染的MDCK细胞，在荧光显微镜下观察。转染24h后即可观察到瞬时表达的绿色荧光蛋白(图12)，72h后可看到明显的细胞病变，收取病变的细胞培养物，反复冻融3次后接种MDCK细胞，用含1％低熔点琼脂糖的DMEM培养细胞至出现明显的蚀斑时(见图13)，挑取在在荧光显微镜下呈现绿色荧光的蚀斑(见图14)进行下一轮的纯化，用经过连续6次蚀斑纯化的重组病毒接种MDCK细胞，24h后观察到几乎所有细胞均呈现绿色荧光(图15)，且所形成的蚀斑均为绿色。
[0118] 1.8重组病毒的PCR鉴定
[0119] 在缺失的E3区内部以及EGFP的内部分别设计一对引物：ΔE3-S/ΔE3-X；EGFP-S/EGFP-X。序列如下：
[0120] ΔE3-S 5’GTA TGC CCA AAC CTG CAC 3’
[0121] ΔE3-X 5’GCA TTG CAG TGT CAG GTA 3’
[0122] EGFP-S 5’CGA CGT AAA CGG CCA CAA GTT 3’
[0123] EGFP-X 5’ACT CCA GCA GGA CCA TGT GAT 3’
[0124] 用重组病毒rCAV-2ΔE3-EGFP感染细胞，病变完全后收取细胞培养物，SDS-蛋白酶K法提取重组病毒的核酸DNA，用上述两对引物做PCR鉴定。若不能扩出E3区缺失部分的基因，而EGFP的基因条带特异而明显，则表明已经纯化完全。
[0125] 将筛选到的表达EGFP阳性的蚀斑在MDCK细胞上扩增后，提取重组病毒的核酸DNA，用E3区内部的引物ΔE3-S/ΔE3-X及EGFP上的引物EGFP-S/EGFP-X作为鉴定引物，用野生型的CAV-2作为对照，结果如图15所示。用ΔE3-S/ΔE3-X为引物，扩增野生型的CAV-2的扩增的理论值应约为1300bp；以rCAV-2ΔE3-EGFP基因组为模板，用EGFP-S/EGFP-X PCR扩增片段大小理论值约为650bp。从图中可知ΔE3-S/ΔE3-X只能扩出野生型的CAV-2的片段，而EGFP-S/EGFP-X只能扩出rCAV-2ΔE3-EGFP的片段(图16)，且实际值与理论值相符，证明获得了纯化的单一克隆的rCAV-2ΔE3-EGFP。
[0126] 1.9重组病毒的生长特性及形态学的鉴定
[0127] 用经6代纯化后筛选到的重组病毒感染MDCK细胞，观察细胞所形成的病变。所收获的细胞培养物超生波破碎后，离心取上清，磷钨酸负染色，置电镜下观察病毒形态。重组病毒接种在MDCK细胞72h后，出现细胞肿胀变圆、葡萄串样等典型的CAV-2样病变(图17)。在电镜下可见腺病毒样病毒粒子(图18)。病毒粒子呈正二十面体结构，病毒表面由五邻粒和六邻粒构成的衣壳，还可见到由壳粒构成的正三角行结构(图中箭头所示)。
[0128] 以106PFU/mL的剂量分别将重组病毒rCAV-2ΔE3-EGFP及CAV-2亲本病毒接种于长满单层MDCK细胞，在接种后培养24h、48h、72h、96h、120h和144h收获病毒，空斑滴定法测定病毒滴度，绘制生长动力学曲线(图19)。从图18中可以看出，CAV-2和rCAV-2ΔE3-EGFP生长曲线走势相似，从24h到96h期间病毒滴度不断升高，且二者的滴度相近；自96h以后达到平稳期，rCAV-2ΔE3-EGFP的滴度比CAV-2略低；120h后病毒滴度有所下降。
[0129] 1.10重组病毒遗传稳定性检测
[0130] 将纯化的rCAV-2ΔE3-EGFP在MDCK细胞上连续传代13次，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达的情况。并用1.8中的方法对传代后的的rCAV-2ΔE3-EGFP进行PCR鉴定。
[0131] 用连续传13代的rCAV-2ΔE3-EGFP接种MDCK细胞，48h后在荧光显微镜下可见除部分病变脱落的细胞外几乎所有细胞均呈现绿色荧光。PCR鉴定结果与2.3的结论相同。
[0132] 将纯化后的重组病毒rCAV-2ΔE3-EGFP连续传15代，经测定每一代病毒的滴度相接近(见表1)。选取第5、10、15代重组病毒进行PCR鉴定，均只能扩增出特异性外源基因条带，而CAV-2对照只能扩增出缺失的E3区基因(图20)，证明外源基因在传代过程中未丢失且无野生型病毒的污染。接种病毒24h后观察荧光结果显示EGFP在第5、10、15代重组病毒中均获得了表达(图21)。证实本实验所获得的重组病毒rCAV-2ΔE3-EGFP能够稳定表达外源基因。
[0133] 表1 rCAV-2ΔE3-EGFP在MDCK细胞上传代后病毒滴度的变化
[0134]
[0135] 1.11重组病毒作为疫苗载体的安全性评估
[0136] 5只1月龄的幼犬隔离饲养于哈尔滨兽医研究所动物房，生长至4月龄时经血凝抑制试验检测犬腺病毒抗体为阴性。将5只犬随机分为3组：第一组2只接种rCAV-2ΔE3-EGFP(5×108PFU/mL)，肌注5mL/只；第二组两只接种同样剂量的CAV-2；第三组一只肌注5mL DMEM培养液。接种后每天观察犬的临床变化。3周后剖检犬，观察心、肝、脾、肾、肺、气管、腮腺、扁桃体、肩前淋巴结，颌下淋巴结等器官的病理变化。三组犬接种病毒后均无明显临床症状，3周后剖检做病理切片。接种CAV-2犬、接种rCAV-2ΔE3-EGFP犬与对照犬各组织器官病理变化的比较见表2及图21。分析实验结果，接种rCAV-2ΔE3-EGFP的犬组织无明显病变，仅个别组织出现淋巴细胞浸润，属正常免疫反应，说明E3区的缺失未使CAV-2的致病力增强。
[0137] 表2
[0138]肝 图21A(-) 图21B淋巴细胞浸润 图21C
肺 图21D支气管内有红细 图21E肺泡内有蛋白 图21F
胞和淋巴细胞浸润 析出并伴有淋巴细胞
浸润
肠 图21G小肠粘膜固有层 图21H(-) 图21I
淋巴细胞浸润
肺 图21D支气管内有红细 图21E肺泡内有蛋白 图21F
胞和淋巴细胞浸润 析出并伴有淋巴细胞
浸润
肠 图21G小肠粘膜固有层 图21H(-) 图21I
淋巴细胞浸润
[0139] 注：表中(-)表示无明显病理变化。
[0140] 本发明成功构建了E3区缺失的重组CAV-2转移载体并获得了纯化的含有EGFP报告基因的重组CAV-2毒株，对其克隆纯化方法进行了优化，经鉴定该重组病毒生物学特性稳定，为进一步开展CAV-2活载体疫苗研制及相关基础研究提供了技术平台。
[0141] 试验例1 犬瘟热病毒A株F和H蛋白在重组犬腺病毒中的表达
[0142] 腺病毒为载体的重组活疫苗，不仅刺激机体产生系统免疫而且还产生良好的局部粘膜免疫，可对抗母源抗体的干扰，且可通过多种途径传播，口服、点眼、滴鼻、气雾和注射均引起病毒感染，给疫苗应用提供了方便，特别适用于动物的群体免疫。因此选用腺病毒作载体进行活载体重组疫苗的研究是有实用意义的。CAV-2以犬为天然宿主，常用作弱毒疫苗用于犬传染性肝炎和犬传染性喉气管炎的预防，本研究拟将CDV中能够刺激机体产生中和抗体的两种主要的免疫原性蛋白F及H的编码基因插入表达载体pUC-ΔE3-EGFP中，用以构建表达CDV-F和CDV-H的重组CAV-2，为研制能够同时预防犬传染性肝炎、犬传染性喉气管炎和犬瘟热的重组活载体疫苗奠定基础。
[0143] 1材料及方法
[0144] 1.1病毒和细胞
[0145] 重组2型犬腺病毒rCAV-2ΔE3-EGFP由本发明实施例2所构建，犬瘟热病毒A株种毒由哈尔滨兽医研究所经济动物研究室提供，在鸡胚成纤维细胞上增殖培养；MDCK细胞由本实验室保存。
[0146] 1.2质粒
[0147] 表达载体pUC-ΔE3-EGFP由本发明实施例2所构建。
[0148] 1.3主要试剂
[0149] TRIzol Reagent购自Invitrogen公司DEPC，LA Taq、限制性内切酶Bgl II和Not I、IPTG、NC膜均购自TaKaRa公司；蛋白分子量标准购自Fermentas公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗犬IgG、FITC标记的兔抗犬IgG荧光抗体购自KPL公司，其它试剂同实施例2。
[0150] 1.4SPF鸡胚
[0151] 由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。
[0152] 1.5犬瘟热病毒的增殖
[0153] 取9～11日龄的SPF鸡胚，先后用碘酒棉和酒精棉消毒气室部位，无菌取鸡胚，弃去头、四肢和内脏，剪成约2mm大小的组织块；用Hank’s液洗涤组织块，去除污血后，以5mL/胚的比例加入0.25％胰酶溶液，放置在37℃水浴中消化15min；倒掉胰酶，用Hank’s液洗涤2～3次后加入适当的含10％胎牛血清的DMEM培养液，分散细胞，用6层纱布过滤，
6 7
制成10 ～10 个/ml的细胞悬液，分散于细胞培养瓶中，制成鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast，CEF)待细胞长成单层后，弃去培养基，用PBS洗涤细胞以去除残留血清。取A株CDV种毒1∶100倍稀释后取少量接种细胞，37℃吸附1h，加入DMEM维持液，继续培养至细胞病变完全，收获细胞培养物反复冻融3次后于-70℃保存备用。
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制成10 ～10 个/ml的细胞悬液，分散于细胞培养瓶中，制成鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast，CEF)待细胞长成单层后，弃去培养基，用PBS洗涤细胞以去除残留血清。取A株CDV种毒1∶100倍稀释后取少量接种细胞，37℃吸附1h，加入DMEM维持液，继续培养至细胞病变完全，收获细胞培养物反复冻融3次后于-70℃保存备用。
[0154] 1.6RT-PCR引物设计
[0155] 参照己发表的CDV F和H基因序列，分别设计了用于分段扩增F基因的两对引物F1U/F1L和F2U/F2L；及用于扩增H基因的引物HU/HL，由上海生物工程公司合成。合成后所有上游引物均采用DEPC处理的灭菌水溶解。
[0156] F1U：5’AGAAGGCAGATCATTATCGGAC 3’
[0157] F1L：5’CATCTCTGCCCAACTAATTCAC 3’
[0158] F2U：5’GAT GTG AAT TAG TTG GGC AGA GA 3’
[0159] F2L：5’TGT TGG ACT ACC TGA GCC CTA A 3’
[0160] HU：5’TAG GGC TCA GGT AGT CCA RCA AT3’
[0161] HL：5’GTA TAC GGC CTA AAT CTT CGA CA3’
[0162] 1.7病毒基因组RNA的提取
[0163] 参照TRIzol Reagent的说明书进行，具体步骤如下：取病毒悬液约200uL加入1mL的TRIzol裂解液，颠倒混匀室温放置5min，加入200uL氯仿盖紧EP管用力振荡15S，室温放置2～3min，4℃12000rpm离心15min，小心吸出上清加入等量的异丙醇混匀后于室温放置10min，4℃12000rpm离心15min，弃上清，沉淀用75％乙醇洗涤后真空干燥，用DEPC水重悬，紫外分光光度计测定RNA的浓度及纯度，立即反转录或-70℃保存。
[0164] 1.8反转录
[0165] 在DEPC处理的EP管里配置反应液，模板RNA3μL，Random Primer 1μL(25pmol/μL)混匀后置于70℃5min，于冰上依次加入以下组分：M-MLV×5Reaction Buffer 5μL，dNTP Mixture(10mmol/L)4μL，RibonucleaseInhibitor 1μL，M-MLV 1μL，加灭菌DEPC水定容至25μL，37℃作用1h，70℃10min后冰浴2min，所得的cDNA模板用于PCR扩增反应。
[0166] 1.9目的基因的PCR扩增
[0167] 取上述反转录产物为模板50μL反应体系依次加入TaKaRa LATaq(5u/μL)1μL，TM 2+10×LA pCR Buffer II(Mg Plus)10μL，上游引物(10mM)2μL、下游引物(10mM)2μL、dNTP(各2.5mM)8μL、模 板3μL。PCR反应 参数 为：95 ℃预变 性3min，94℃ 30S，
60℃(F1)/55℃(F2)/58℃(H)2min，30个循环，72℃延伸10min。取5μL PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定条带大小正确后将PCR产物送英杰生物公司测序。
60℃(F1)/55℃(F2)/58℃(H)2min，30个循环，72℃延伸10min。取5μL PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定条带大小正确后将PCR产物送英杰生物公司测序。
[0168] 1.10序列分析
[0169] 选 择 GenBank中 几 种 标 准 疫 苗 株 Onderstepoort(AF378705)、Lederle株(AF164967)、Convac(Z35493)及从 不同 国家 分离 到的具 有代 表性 的野 毒株 5408P(AY86316)、11103B(DQ494319)、012689(AY649446)、A75/17(AF164947)、GN(EF445054)、SC01(EF)、Yanaka(AB028914)、5VD(AY297454)、HM6(AB040768)、MS01(DQ922630)、ZD01(EF445051)、NM(EF445053)、982645(AY542312)、25259(AY964114)、002601(AY395984)等与A株的F、H基因进行了核苷酸及氨基酸序列的比对。
[0170] 1.11重组转移载体的构建
[0171] 通过对上述PCR产物基因测序结果的分析，设计2对引物rF-U/rF-L和rH-U/rH-L分别用于扩增包括完整阅读框的CDV-F和CDV-H。在两条上游引物的5’端均引入了BglII酶切位点，两条下游引物的5’端均引入了Not I酶切位点，引物序列(斜线部分为酶切位点)如下：
[0172] rF-U：5’ CCC CCC CAT GCA CAA GGA AAT 3’
[0173] rF-L：5’
[0174] rH-U：5’ CCC CGC AAT GCT CTC CTA CCA AGA C 3’
[0175] rH-L：5’
[0176] 提取A株CDV基因组RNA，分别以rF-U/rF-L、rH-U/rH-L为引物经RT-PCR扩增了CDV-H及CDV-F。两目的片段用Bgl II和Not I消化后，分别与经过同样处理的pUC-ΔE3-EGFP载体连接，用插入的外源基因替换了绿色荧光蛋白基因，鉴定连接正确的质粒分别命名为pUC-ΔE3-F。
[0177] 1.12重组病毒的筛选
[0178] MDCK细胞在六孔板中培养至单层，以每孔107PFU的剂量接种重组病毒rCAV-2ΔE3-EGFP，每孔200μL吸附1h后弃去感染液，磷酸钙转染法(具体操作同实施例2)分别转染纯化的重组质粒pUC-ΔE3-F、pUC-ΔE3-H。待细胞病变完全后收取病毒液继续接种MDCK细胞，在荧光显微镜下筛选无绿色荧光的蚀斑，经多次蚀斑纯化直至用筛选到的重组病毒感染细胞后在荧光显微镜下观察不到绿色荧光为止，将筛选到的重组病毒分别命名为rCAV-2ΔE3-F和rCAV-2ΔE3-H，扩大培养后-70℃保存。
[0179] 1.13重组病毒的PCR鉴定
[0180] SDS-蛋白酶K法(同实施例1)提取重组病毒rCAV-2ΔE3-F和rCAV-2ΔE3-H的核酸DNA，分别用rF-U/rF-L和rH-U/rH-L做PCR鉴定，验证F和H基因是否重组到rCAV-2ΔE3-EGFP的基因组中，用引物EGFP-S/EGFP-X做PCR鉴定检验重组病毒的纯化是否完全。
[0181] 1.14间接免疫荧光鉴定
[0182] 将重组病毒rCAV-2ΔE3-F和rCAV-2ΔE3-H感染后的MDCK细胞分别用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化；PBS洗涤，2000rpm离心5min，将吹打均匀的细胞滴在载玻片上，自然干燥；冷丙酮固定5-10min后，自然干燥；用PBS洗涤3次，每次5min；CDV单因子阳性血清用PBS稀释100倍，滴加在载玻片上，37℃作用45min；载玻片用PBS洗涤3次，每次5min，用去离子水洗涤一次，自然干燥；取FITC标记的兔抗犬IgG荧光抗体用的PBS稀释到工作浓度，滴加在载玻片上，37℃作用45min；用PBS洗涤3次，用去离子水脱盐后，自然干燥；滴加碱性甘油，加盖玻片，置于荧光显微镜下观察。
[0183] 1.15Western blot分析
[0184] 用重组病毒rCAV-2ΔE3-F和rCAV-2ΔE3-H分别感染MDCK细胞待细胞病变完全，刮取细胞作为检测样品。加入等体积的2XSDS电泳上样缓冲液置于沸水中煮沸10min。处理好的样品进行10％凝胶SDS-PAGE蛋白电泳，具体操作按《分子克隆实验指南》(科学出版社，第二版)进行。
[0185] 将6张滤纸和硝酸纤维素(NC)膜剪成与凝胶同样大小，在转移缓冲液中浸泡5min，按3张滤纸、NC膜、PAGE凝胶、3张滤纸的顺序依次叠放在一起，按NC膜侧在阳极、凝胶侧在阴极将其放入转移槽中稳流(40mA)转印2h。转印结束将NC模放入封口袋中，加入封闭液4℃封闭过夜。然后用PBST(0.05％Tween 20)洗涤三次，每次3～5min，加入用封闭液配制的1∶100倍稀释的CDV多克隆抗血清，37℃感作1h，弃去一抗，用PBST洗3次，每次10min。然后加入用PBST稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗犬IgG，37℃感作1h，再用PBST漂洗3次后显色，待出现明显的条带时去离子水终止显色反应。
[0186] 2结果
[0187] 2.1F和H基因的扩增结果
[0188] 提取的病毒基因组RNA经反转录后用特异性引物F1U/F1L和F2U/F2L分别扩增了约1200bp和1500bp的两个片段(图23)；HU/HL扩增后得到了约1900bp的片段，与预期大小一致(图24)。
[0189] 2.2F和H基因的核苷酸及推导的氨基酸序列分析
[0190] 对PCR产物的测序结果进行了分析，A株CDV的F基因编码框全长1989bp，共编码662个氨基酸残基，与其它毒株进行比较发现A株CDV的F基因与标准疫苗株Onderstepoort的核苷酸及氨基酸序列同源性最高，分别为97％和96.4％。与另外8株的核苷酸同源性在96.6％～91.6％之间，氨基酸同源性在94.9％～89.8％之间。H基因编码框全长1824bp，共编码607个氨基酸残基，与其它毒株进行了序列比较发现A株H基因与Lederle株Onderstepoort株序列同源性较高，核苷酸同源性分别为98.8％和96.6％；氨基酸同源性分别为97.5％和95.4％，与其余毒株的核苷酸及氨基酸同源性分别在90％和89％以上。
[0191] 2.3转移载体的构建
[0192] 将扩增得到的F、H基因片段用BglII和Not I消化后，分别与经过同样处理的pUC-ΔE3-EGFP载体连接，构建了重组质粒pUC-ΔE3-F和pUC-ΔE3-H。对重组质粒分别作Bgl II单酶切鉴定，Bgl II和Not I双酶切鉴定所得到条带均与理论上的大小相一致(图25，图26)。
[0193] 2.4重组病毒的筛选及PCR鉴定
[0194] 用纯化的重组质粒pUC-ΔE3-F、pUC-ΔE3-H分别转染rCAV-2ΔE3-EGFP感染的MDCK细胞，病变完全后收取病毒液继续接种MDCK细胞，在荧光显微镜下筛选无绿色荧光的蚀斑，经多次蚀斑纯化直至用筛选到的单一克隆株感染细胞后在荧光显微镜下观察不到绿色荧光并能够形成典型的CAV-2样细胞病变为止(图27)，将筛选到的两株单一克隆重组病毒分别命名为rCAV-2ΔE3-F和rCAV-2ΔE3-H。用引物rF-U/rF-L和rH-U/rH-L对所筛选到的两种单一克隆株进行了PCR扩增，结果为阳性，而引物EGFP-S/EGFP-X扩增的结果为阴性(图28)
[0195] 2.5间接免疫荧光检测
[0196] 间接免疫荧光结果(见图29)证实F及H基因在重组病毒中均获得了表达。
[0197] 2.6Western blot分析
[0198] 将重组病毒rCAV-2ΔE3-F和rCAV-2ΔE3-H分别接种MDCK细胞，待细胞病变达80％以上时，刮取病变细胞作为检测样品进行Western Blot，以CAV-2接种的MDCK细胞作对照。结果在rCAV-2ΔE3-F的细胞培养物中检测到大小约为43kDa和20kDa的蛋白，与F1、F2蛋白大小一致；在rCAV-2ΔE3-H的细胞培养物中检测到大小约为68kDa的蛋白，与H蛋白大小相一致；证明F及H蛋白在重组病毒中均获得了表达，并具有抗原反应原性(图
30，图31)
30，图31)
[0199] CDV病毒的结构蛋白主要有核衣蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、附着蛋白(H)，其中F、H为分布在囊膜表面的两种糖蛋白，囊膜糖蛋白为宿主免疫识别的主要靶抗原，是病毒的吸附和侵入宿主细胞过程中必不可少的。其中F蛋白是融合过程中所必需的，它所诱导的免疫反应能阻止病毒进一步侵染，并在病毒增殖的情况下对症状的发生具有一定的抑制作用。纯化的F蛋白免疫犬可免受致死量的CDV攻击(Blixenkron-Moller et al，1992)。H蛋白是CDV与细胞受体结合的蛋白，决定着病毒的细胞噬性，与F蛋白一起介导了病毒感染细胞合胞体的形成，H蛋白上分布着许多中和抗体表位，是产生中和抗体的主要抗原。具有中和作用的抗H蛋白抗体和抑制细胞融合的抗F抗体，在抗CDV感染的机制中发挥着重要作用。因此，在构建病毒的亚单位疫苗或重组基因工程疫苗方面，主要以这两个蛋白作为切入点。
[0200] 在实施例2中所构建的重组载体pUC-ΔE3-EGFP缺失了E3区1412bp的片断，从理论上讲可使外源基因的容量扩增至3000bp，但所插入的hCMV IE启动子、多克隆位点，绿色荧光蛋白基因、SV40早期转录PolyA信号等元件又占用了约1600bp的容量，而CDV-F和CDV-H基因片断大小分别为1998，1824bp，若将二者直接插入载体pUC-ΔE3-EGFP中则会超过CAV-2核衣壳的包装限度。对此本发明所采取的措施是，去除pUC-ΔE3-EGFP中的EGFP基因，即分别用CDV-F和CDV-H基因取代EGFP基因。为了方便筛选，本发明用筛选获得的遗传稳定表达绿色荧光蛋白的单一纯化重组病毒克隆rCAV-2ΔE3-EGFP作为亲本病毒感染MDCK细胞，使其基因组分别与重组质粒-rCAV-2ΔE3-F和rCAV-2ΔE3-H发生细胞内同源重组。通过筛选无绿色荧光的蚀斑来筛选重组病毒。
[0201] 本实验对筛选的重组病毒进行了Western-blot检测，在感染rCAV-2ΔE3-F的细胞培养物检测到了大小约为40kDa和23kDa的两个蛋白。在对rCAV-2ΔE3-H中重组H蛋白的检测中，得到了与预期大小相符的约67kDa的蛋白，但在其它的下方出现一条分子量略小于H蛋白的特异性条带，推测为病毒系统对重组蛋白加工、剪切的结果。本实验利用在实施例2中已验证的能够稳定表达外源蛋白的的E3区缺失的CAV-2载体构建了表达了A株CDV的F和H基因的重组病毒，经Western-blot检测所表达蛋白具有良好的免疫活性。
[0202] 序列表
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[0206]
[0207]
[0208]
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[0210]
[0211]
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[0213]
[0214]