一种肺癌DNA质粒疫苗及其制备方法

摘要

本发明公开了一种肺癌DNA质粒疫苗，包括质粒载体，质粒载体中含有肺癌抗原MAGE-3和NY-ESO-1的四表位的融合基因MAGE-NY-ESO，融合基因MAGE-NY-ESO具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；本发明还公开了该DNA质粒疫苗的制备方法；以含有目标抗原编码序列的DNA质粒作为新一代治疗性疫苗，该疫苗在体内诱导产生特异性针对相关编码抗原的免疫反应，并有效抑制肺癌发展和转移。因此本发明是一种制备简单、成本低廉且安全可靠、治疗肺癌有效的DNA质粒疫苗。

权利要求

1.一种肺癌DNA质粒疫苗的制备方法，其特征在于包括下述步骤：

1)根据特异性CTL识别的肺癌抗原MAGE-3的表位EVDPIGHLY和FLWGPRALY以及NY-ESO-1的表位SLLMWITQC和QLSLLMWIT，设计合成含有上述四个表位的融合基因MAGE-NY-ESO，并以柔性四肽GPGP连接各表位，融合基因MAGE-NY-ESO的大小为144bp；

2)以pNGVL4a质粒为载体，将上述融合基因亚克隆入CMV启动子下游，得到pNGVL-MAGE-NY-ESO质粒；

3)将PCR获得的大小为432bp的GM-CSF基因片段插入到上述pNGVL-MAGE-NY-ESO质粒的另一个CMV启动子下，得到pNGVL-GM-CSF-MAGE-NY-ESO质粒；

4)将上述pNGVL-GM-CSF-MAGE-NY-ESO质粒转入到感受态细胞E.coli TG1中，在37℃温度条件下的LB培养基中培养扩增，经过筛选和质粒抽提试剂盒抽提获得能治疗肺癌的DNA质粒疫苗pNGVL-GM-CSF-MAGE-NY-ESO。

2.如权利要求1所述的一种肺癌DNA质粒疫苗的制备方法，其特征在于将上述DNA质粒疫苗溶于磷酸盐缓冲液中，并以阳离子脂质体DOSPER为免疫佐剂，制备得到含有阳离子脂质体的DNA质粒疫苗，其中所述DNA质粒疫苗与阳离子脂质体的质量比为10∶1。

3.如权利要求1所述的制备方法得到的肺癌DNA质粒疫苗，包括质粒载体，其特征在于所述质粒载体中含有肺癌抗原MAGE-3和NY-ESO-1的四表位的融合基因MAGE-NY-ESO，所述融合基因MAGE-NY-ESO为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述质粒载体为pNGVL4a，所述质粒载体中还含有GM-CSF对应的全部基因序列，所述GM-CSF编码的氨基酸序列为Genebank no.AAA52578。

4.如权利要求3所述的肺癌DNA质粒疫苗，其特征在于所述融合基因MAGE-NY-ESO表达的蛋白质为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

说明书

一种肺癌DNA质粒疫苗及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及DNA疫苗，具体涉及一种肺癌DNA质粒疫苗及其制备方法。

背景技术

[0002] 肺癌是当前世界各地最常见的恶性肿瘤之一，近数十年肺癌的发病率和死亡率显著增高，且上升趋势位列各种恶性肿瘤首位。肺癌的治疗效果在过去十年中没有显著的提高，其主要原因是肺癌生物学特性十分复杂，恶性程度高，大部分患者在确诊时已属晚期。癌症治疗理想的方法应能特异地清除癌变组织，而不破坏正常的组织。目前癌症的三大常规疗法为手术、化疗和放疗，它们治疗癌症的特异性不足，常常对正常组织和器官造成损伤。疫苗的免疫治疗可以产生针对癌症的特异性反应，甚至能清除残余的肿瘤病灶，并产生免疫记忆，它与三大常规疗法有明显的互补性。

[0003] 疫苗通常用来预防致病微生物的侵害，癌症疫苗则主要是治疗性疫苗，是主动免疫治疗的一种方式。随着癌症DNA疫苗对癌症防治效果的逐渐显现，已逐步引起人们的重视。治疗性癌症DNA疫苗是近年来兴起的一种癌症防治方法，目的基因包括：可编码肿瘤相关抗原、肿瘤癌胚抗原、细胞因子和共刺激分子等的各种基因。大量研究表明，通过肌肉注射编码抗原的质粒DNA，能诱导抗体产生、T细胞增殖、淋巴因子的释放及细胞毒T细胞的活化。

[0004] 肿瘤DNA疫苗是继细胞疫苗、重组蛋白疫苗后的第三代肿瘤疫苗，其具有制备容易、生产成本低廉、储存和运输方便、使用方法简单等常规疫苗无法比拟的优点。DNA疫苗的另一优势是可将多个抗原表位基因克隆在同一表达载体，制备多表位DNA疫苗(多价疫苗)，诱导产生针对多种不同抗原表位的抗肿瘤免疫。与病毒载体相比，质粒载体既不会引起抗质粒的免疫反应，也没有潜在的致病危险性。DNA质粒可长期存在于接种部位的组织细胞内，模拟自然感染过程，长期表达抗原蛋白(但不存在减毒活疫苗的毒力回复等危险)，持续刺激免疫系统，能够诱导产生强大而持久的免疫应答。近几年基因疫苗被运用在癌症的防治研究上，取得了较大的进展，部分针对恶性黑素瘤、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌等基因疫苗已经进入临床试验阶段。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种制备简单、成本低廉且安全可靠、治疗肺癌有效的DNA质粒疫苗。本发明还提供了该DNA质粒疫苗的制备方法。

[0006] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种肺癌DNA质粒疫苗，包括质粒载体，所述质粒载体中含有肺癌抗原MAGE-3和NY-ESO-1的四表位的融合基因MAGE-NY-ESO，所述融合基因MAGE-NY-ESO具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。抗原MAGE-3的两表位编码的氨基酸序列为EVDPIGHLY和FLWGPRALY，抗原NY-ESO-1的两表位编码氨基酸序列为SLLMWITQC和QLSLLMWIT。

[0007] 所述质粒载体中还含有GM-CSF(Genebank no.AAA52578)对应的全部基因序列。细胞因子GM-CSF编码氨基酸序列与Genebank no.AAA52578一致。所述质粒载体为pNGVL4a(http://www.med.umich.edu/vcore/Plasmids/Vector％20Core％20Plasmid％20List.htm)；也可以用其它真核质粒载体，如pcDNA3.1等。

[0008] 所述融合基因MAGE-NY-ESO表达的蛋白质具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

[0009] 一种所述的肺癌DNA质粒疫苗的制备方法，包括下述步骤：

[0010] 1)根据特异性CTL识别的肺癌抗原MAGE-3的表位EVDPIGHLY和FLWGPRALY以及NY-ESO-1的表位SLLMWITQC和QLSLLMWIT，设计合成含有上述四个表位的融合基因MAGE-NY-ESO，并以柔性四肽(GPGP)连接各表位，融合基因MAGE-NY-ESO的大小为144bp；

[0011] 2)以pNGVL4a质粒为载体，将上述融合基因亚克隆入CMV启动子下游，得到pNGVL-MAGE-NY-ESO质粒；

[0012] 3)将PCR获得的大小为432bp的GM-CSF基因片段插入到上述pNGVL-MAGE-NY-ESO质粒的另一个CMV启动子下，得到pNGVL-GM-CSF-MAGE-NY-ESO质粒；

[0013] 4)将上述pNGVL-GM-CSF-MAGE-NY-ESO质粒转入到感受态细胞E.coli TG1中，在37℃温度条件下的LB培养基中培养扩增，经过筛选和质粒抽提试剂盒抽提获得能治疗肺癌的DNA质粒疫苗pNGVL-GM-CSF-MAGE-NY-ESO。

[0014] 如果只是制备只含融合基因MAGE-NY-ESO的肺癌DNA质粒疫苗，那么在上述制备方法中就省去步骤3)，即不需要插入GM-CSF基因片段，直接将步骤2)的pNGVL-MAGE-NY-ESO质粒转入到感受态细胞E.coli TG1中，培养扩增、筛选和质粒抽提，得到的是治疗肺癌的DNA质粒疫苗pNGVL-MAGE-NY-ESO。

[0015] 将上述DNA质粒疫苗溶于磷酸盐缓冲液中，并以阳离子脂质体DOSPER为免疫佐剂，制备得到含有阳离子脂质体的DNA质粒疫苗，其中所述DNA质粒疫苗与阳离子脂质体的质量比为10∶1。

[0016] 与现有技术相比，本发明的优点在于质粒载体中含有肺癌抗原MAGE-3和NY-ESO-1的四表位的融合基因MAGE-NY-ESO，融合基因MAGE-NY-ESO具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；以含有目标抗原编码序列MAGE-NY-ESO的DNA质粒作为新一代治疗性疫苗，该疫苗在体内诱导产生特异性针对相关编码抗原的免疫反应，并有效抑制肺癌发展和转移；DNA质粒可长期存在于接种部位的组织细胞内，模拟自然感染过程，长期表达抗原蛋白，持续刺激免疫系统，能够诱导产生强大而持久的免疫应答。质粒载体与病毒载体相比既不会引起抗质粒的免疫反应，也没有潜在的致病危险性。本发明的肺癌DNA质粒疫苗制备简单、成本低廉且安全可靠。融合基因MAGE-NY-ESO与基因GM-CSF构建得到的DNA质粒疫苗pNGVL-GM-CSF-MAGE-NY-ESO，该疫苗经免疫肺癌模型鼠后，能大量表达GM-CSF及刺激产生IL-4、IL-6和IFN-γ等细胞因子的分泌表达，同时显著抑制肺泡细胞的炎症，结果表明对肺癌有很好的治疗效果。

附图说明

[0017] 图1为融合基因结构示意图：KanR和AMP分布表示卡那霉素和氨苄青霉素抗性基因，CMV示CMV启动子，GM-CSF示粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因，MAGE-3示肺癌抗原MAGE-3的表位EVDPIGHLY和FLWGPRALY对应基因序列，NY-ESO-1示肺癌抗原NY-ESO-1的表位SLLMWITQC和QLSLLMWIT对应基因序列，Ori示复制起始点；

[0018] 图2为GM-CSF的PCR产物的琼脂糖电泳图：第1泳道示DNA分子量标准，从上至下分别为2000、1000、750、500、250、100bp大小，第2泳道为阴性对照组PCR结果，第3泳道为实验组PCR结果，箭头所指即为大小约为432bp目的基因所在位置；

[0019] 图3为四表位融合基因MAGE-NY-ESO的PCR产物的琼脂糖电泳图：第1泳道示DNA分子量标准，从上至下分别为2000、1000、750、500、250、100bp大小，第2和第3泳道均为实验组PCR鉴定结果，箭头所指即为大小约为144bp目的基因所在位置。

具体实施方式

[0020] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

[0021] 实施例1

[0022] 肺癌DNA质粒疫苗的构建与纯化：根据特异性CTL识别的肺癌抗原MAGE-3的表位EVDPIGHLY和FLWGPRALY以及NY-ESO-1的表位SLLMWITQC和QLSLLMWIT，设计合成含有以上四个表位的融合基因，并以柔性四肽(GPGP)连接各表位(大小约为144bp，结果见图3)，并将其亚克隆入pNGVL4a质粒的CMV启动子下，得到pNGVL-MAGE-NY-ESO质粒，同时将反转录PCR获得的大小约为432bp的GM-CSF基因片段插入到上述质粒的另一个CMV启动子下，构建得到如图1结构所示pNGVL-GM-CSF-MAGE-NY-ESO质粒；其中GM-CSF基因片段通过常规方法获得：首先分离人外周血白细胞，提取总RNA，然后根据已知序列(Genebank no.AAA52578)设计引物，通过反转录PCR扩增获得，结果如图2所示。

[0023] 将上述pNGVL-GM-CSF-MAGE-NY-ESO质粒经测序鉴定正确后转化至大肠杆菌E.coli TG1中，在37℃温度条件下培养扩增，然后大规模制备质粒，用Qiagen试剂盒筛选、纯化、抽提获得符合转染和注射要求的不含外毒素的高纯度肺癌DNA质粒疫苗pNGVL-GM-CSF-MAGE-NY-ESO。

[0024] 本实施例中如果不插入GM-CSF基因片段，对pNGVL-MAGE-NY-ESO质粒培养扩增、筛选抽提得到的是含有肺癌抗原MAGE-3和NY-ESO-1的四表位的融合基因MAGE-NY-ESO的肺癌DNA质粒疫苗pNGVL-MAGE-NY-ESO。

[0025] 实施例2

[0026] 肺癌DNA质粒疫苗注射液及其哺乳动物细胞中的表达分析：将实施例1获得的高纯度肺癌DNA质粒疫苗pNGVL-GM-CSF-MAGE-NY-ESO与阳离子脂质体DOSPER(购自Roche公司)，按DNA质粒疫苗与阳离子脂质体的质量比为10∶1溶于磷酸盐缓冲液中，配制得到DNA质粒疫苗注射液，DNA质粒疫苗注射液中高度纯化的质粒被阳离子脂质体包裹。

[0027] 将DNA质粒疫苗注射液转染至哺乳动物cos-7细胞，在含10％胎牛血清的DMEM培养基中37度下继续培养。收获不同时段的培养细胞后用流式细胞仪(BD公司)分析GM-CSF及其刺激产生的IL-4、IL-6和IFN-γ等细胞因子的表达情况，确定该质粒刺激产生免疫应6
答的能力。计算结果表明，细胞因子GM-CSF表达量达1200ng/10 细胞，而刺激产生的IL-4、
6
IL-6和IFN-γ分别达到850、700、950ng/10 细胞。

[0028] 实施例3

[0029] 肺癌模型鼠建立：根据文献报道通过二乙基亚硝胺(DEN)诱发BALB/c小鼠肺癌：小白鼠每周皮下注射1％DEN水溶液一次，每次剂量56mg/kg，DEN总剂量达到1176mg，观察时间为半年左右时，通过免疫组化方式鉴定肺癌的发生率，一般发癌率可达94％。

[0030] 实施例4

[0031] 质粒免疫动物模型：将实施例2的DNA质粒疫苗注射液注射入实施例3的免疫模型鼠四头肌，分高中低剂量组(分别为100μg，50μg和10μg三组)分别免疫，同时设置不含质粒的空白对照组，在0、7、14天共免疫三次。

[0032] 实施例5

[0033] 抗原特异性免疫应答能力分析：在实施例4的末次注射免疫后的不同时段(15、30、60天)分别取小鼠血清样本和脾脏组织，血清中IgG抗体产生情况通过ELISA方法分析，脾脏细胞经培养后通过流式细胞术分析IL-4、IFN-γ等细胞因子的表达情况。得到表
1的结果，从表1可以看出末次免疫30天后50μg剂量组的细胞因子IL-4和IFN-γ的表
6
达量最高，分别达到900和1100ng/10 细胞。

[0034] 实施例6

[0035] 抑制肺癌效果评价：取实施例4不同剂量组的小鼠肺组织经10％多聚甲醛固定，进行苏木素-伊红(HE)染色后显微镜观察肺泡细胞浸润情况，评价不同组别的治疗效果。病理组织切片表明，注射100μg、50μg和10μg等不同剂量质粒DNA的抑制肺泡浸润效果不同，抑制率分别达55％、68％和27％。结果表面50μg剂量组的小鼠肺癌抑制效果较好。

[0036] 从实施例5和实施例6中就可以看出含GM-CSF-MAGE-NY-ESO基因的肺癌DNA质粒疫苗能刺激产生IL-4、IL-6和IFN-γ等细胞因子和抑制小鼠的肺癌。

[0037] 同样含融合基因MAGE-NY-ESO的肺癌DNA质粒疫苗也能刺激产生IL-4、IL-6和IFN-γ等细胞因子和抑制小鼠的肺癌，在此就不一一列举。

[0038] 表1：不同剂量的DNA质粒疫苗刺激产生IL-4和IFN-γ的能力分析[0039]

[0040] 序列表

[0041] <110>宁波大学

[0042] <120>一种肺癌DNA质粒疫苗及其制备方法

[0043] <160>2

[0044] <170>PatentIn version 3.1

[0045] <210>1

[0046] <211>144

[0047] <212>DNA

[0048] <213>Artificial

[0049] <220>

[0050] <400>1

[0051] gaa gtt gat ccc att ggt cat ttg tac ggt ccc ggt ccc ttt cta tgg 48[0052] Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr Gly Pro Gly Pro Phe Leu Trp[0053] 1 5 10 15[0054] ggt ccc aga gca ttg tat ggt ccc ggt ccc tct tta cta atg tgg att 96[0055] Gly Pro Arg Ala Leu Tyr Gly Pro Gly Pro Ser Leu Leu Met Trp Ile[0056] 20 25 30

[0057] aca caa tgt ggt ccc ggt ccc caa ttg tct cta ctt atg tgg ata acc 144[0058] Thr Gln Cys Gly Pro Gly Pro Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr[0059] 35 40 45

[0060] <211>48

[0061] <212>PRT

[0062] <213>Artificial

[0063] <400>2

[0064] Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr Gly Pro Gly Pro Phe Leu Trp[0065] 1 5 10 15[0066] Gly Pro Arg Ala Leu Tyr Gly Pro Gly Pro Ser Leu Leu Met Trp Ile[0067] 20 25 30

[0068] Thr Gln Cys Gly Pro Gly Pro Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr[0069] 35 40 45