甲基莲心碱及其类似物的新用途

摘要

本发明公开了甲基莲心碱及其类似物的新用途。该用途是式(I)所示的甲基莲心碱及其类似物或它们药物学上可接受的盐在制备抑制真核生物肿瘤细胞增殖的药物中的应用和在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。式(I)所示的甲基莲心碱及其类似物或它们药学上可接受的盐可与G-四链体DNA结合，增加G-四链体的稳定性，从而竞争性抑制端粒酶与端粒的结合，抑制端粒酶的活性，减弱细胞的增殖能力，抑制端粒延伸，促进细胞凋亡。将式(I)所示的甲基莲心碱及其类似物或它们药学上可接受的盐用于制备预防和/或治疗癌症的药物，具有重大的意义。式(I)

权利要求

1.式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备抑制真核生物肿瘤细胞增殖的药物中的应用；

式(I)

其中，式(I)中R1、R2、R3均为氢；与R1相连的碳为R构型，与R2相连的碳为S构型；

所述真核生物为哺乳动物；

所述肿瘤细胞为癌细胞；所述癌细胞为白血病细胞、胃癌细胞、肝癌细胞或鼻咽癌细胞。

2.权利要求1所述的式(I)化合物或其药物学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用；

所述肿瘤为癌；所述癌为白血病、胃癌、肝癌或鼻咽癌。

说明书

甲基莲心碱及其类似物的新用途

技术领域

[0001] 本发明涉及甲基莲心碱及其类似物的新用途。

背景技术

[0002] 端粒是指真核生物线性染色体末端的非编码DNA区域，其功能为：在重组过程中协助染色体排列；稳定染色体末端结构，防止染色体间末端连接；可补偿滞后链5’末端在消除RNA引物后造成的空缺。端粒DNA序列在体外能形成四链体结构(Wang，Y.and Patel，D.J.，Structure，2，1141-1156(1994).)。

[0003] 组织培养的细胞证明，端粒在决定细胞的寿命中起着重要作用，经过多代培养的老化细胞端粒变短，染色体也变得不稳定。细胞分裂的时候，因为3’末端在复制过程中是滞后链，DNA聚合酶不能复制染色体3’链的最末端，这种“末端复制问题”导致细胞每倍增一次端粒就缩短约30-200个碱基，大约经过60-70次复制后，端粒达到一个临界长度，此时细胞就进入非分裂状态，叫做衰老期，这将导致细胞凋亡直至死亡(Harley，C.B.，et al.，Nature，345，458-460(1990).)。

[0004] 端粒酶，是基本的核蛋白逆转录酶，可将端粒DNA加至真核细胞染色体末端。端粒酶在不同物种细胞中对于保持染色体稳定性和细胞活性有重要作用，能延长缩短的端粒，从而增强体外细胞的增殖能力。端粒酶在正常人体组织中活性被抑制，在肿瘤中被重新激活，可能参与恶性转化。端粒酶在保持端粒稳定、基因组完整、细胞长期的活性和潜在的继续增殖能力等方面有重要作用。Kim等发现，在85-90％的癌细胞中，一种逆转录酶-端粒酶被激活(Kim，N.W.，et al.，Science，266，2011-2015(1994).)，这提供了一种用于治疗癌症的特异的靶。

[0005] 端粒序列随生物体的不同而不同。在人类和其他脊椎动物中，端粒含有TTAGGG的重复序列。在人体中，端粒酶将TTAGGG重复序列加入到端粒末端，以平衡细胞分裂所带来的端粒缩短，结果端粒的长度被保持住，使得癌细胞永生化。人类端粒具有一段5-15kb的双链区域，一条链富含嘌呤(A链)，一条链富含嘧啶(B链)。在3’末端，A链存在一个200个碱基长度的单链突出，该单链可作为端粒酶的引物。Zahler等发现，G-四链体的形成能阻止端粒酶与端粒的结合，从而抑制端粒酶的活性(Zahler，A.M.，et al.，Nature，
350718-720(1991).)。G-四链体DNA是由含有一连串连续鸟嘌呤残基的DNA形成的一种四链DNA结构(Cech，T.R.，Nature，332，777-778(1988).)。因此，关于稳定端粒G-四链体DNA的小分子的研究是目前抗癌药物设计的一个热点领域。

[0006] 甲基莲心碱(neferine，Nef)是从睡莲科植物莲Nelumbo nucifera Gaertn成熟种子的绿色胚芽中提取出的一种生物碱(分子式C38H44N2O6)。近年来发现甲基莲心碱具有抗心律失常、降血压、保护心肌缺血-再灌注损伤、抗血小板聚集等广泛的心血管等药理作用。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供甲基莲心碱及其类似物的新用途。

[0008] 本发明所提供的甲基莲心碱及其类似物的用途为：式(I)所示的化合物或其药物学上可接受的盐在制备抑制真核生物肿瘤细胞增殖药物中的应用；

[0009] 式(I)中R1、R2、R3均为下述四种基团中的任意一种：氢，取代酰基，直链或支链烷基，其中烷基可以被选自O，N，S的杂原子间断；与R1相连的碳为R构型，与R2相连的碳为S构型。

[0010]

[0011] 式(I)

[0012] 所述真核生物为哺乳动物。

[0013] 所述肿瘤细胞为癌细胞；所述癌细胞具体可为乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、脑癌细胞、卵巢癌细胞、子宫癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞、白血病细胞、头颈癌细胞、胃癌细胞、鼻咽癌细胞、结肠癌细胞、视网膜癌细胞、膀胱癌细胞、肛门癌细胞或直肠癌细胞；优选为白血病细胞、胃癌细胞、肝癌细胞或鼻咽癌细胞。

[0014] 本发明还保护一种抑制真核生物肿瘤细胞增殖的药物，它的有效成分为式(I)所示的甲基莲心碱及其类似物或它们药物学上可接受的盐。

[0015] 所述真核生物为哺乳动物。

[0016] 所述肿瘤细胞为癌细胞；所述癌细胞具体可为乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、脑癌细胞、卵巢癌细胞、子宫癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞、白血病细胞、头颈癌细胞、胃癌细胞、鼻咽癌细胞、结肠癌细胞、视网膜癌细胞、膀胱癌细胞、肛门癌细胞或直肠癌细胞；优选为白血病细胞、胃癌细胞、肝癌细胞或鼻咽癌细胞。

[0017] 本发明提供的甲基莲心碱及其类似物的新用途还为：式(I)所示的化合物或其药物学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。

[0018] 所述肿瘤可为癌，如乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、脑癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、皮肤癌、白血病、头颈癌、胃癌、鼻咽癌、结肠癌、视网膜癌、膀胱癌、肛门癌或直肠癌；特别适合于制备预防和/或治疗人白血病、人胃癌、人肝癌和人鼻咽癌的药物。

[0019] 有效成分为式(I)所示的甲基莲心碱及其类似物或它们药学上可接受的盐的预防和/或治疗肿瘤的药物，也属于本发明的保护范围。

[0020] 所述预防和/或治疗肿瘤药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

[0021] 以甲基莲心碱及其类似物或它们药学上可接受的盐为活性成分的抗肿瘤药物，需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

[0022] 用甲基莲心碱及其类似物或它们药学上可接受的盐制备的预防和/或治疗肿瘤药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

[0023] 试验证明，式(I)所示的甲基莲心碱及其类似物或它们药学上可接受的盐可与G-四链体DNA(简称为Telo7)结合，增加G-四链体的稳定性，从而竞争性抑制端粒酶与端粒的结合，抑制端粒酶的活性，抑制端粒延伸，减弱细胞的增殖能力，促进细胞凋亡。

[0024] 甲基莲心碱体外抗癌细胞增殖实验结果表明，甲基莲心碱对于人白血病细胞系HL-60、人胃癌细胞系BGC-823、人肝癌细胞系Bel-7402以及人鼻咽癌细胞系KB均有比较好的抑制效果，其中，当甲基莲心碱的药物浓度为50μM对于HL-60、BGC-823的抑制率超过了90％。

附图说明

[0025] 图1为甲基莲心碱与Telo7的荧光滴定图，图中的曲线从上到下，Telo7与甲基莲心碱的摩尔比分别为0:1、0.05:1、0.1:1、0.25:1、0.5:1、1:1、2:1、4:1。

[0026] 图2为Telo7单独存在时的熔点曲线图以及加入了甲基莲心碱的Telo7的熔点曲线图；其中1为单独Telo7的熔点曲线图，2为甲基莲心碱与Telo7混合的熔点曲线图。

具体实施方式

[0027] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0028] 实施例1、甲基莲心碱对G-四链体热稳定性的影响

[0029] (1)甲基莲心碱与G-四链体的结合

[0030] 在K+离子存在的条件下，溶液中的[d(TTAGGGT)]序列以平行结构四链体状态[d(TTAGGGT)]4存在。当Telo7(G-四链体DNA)与甲基莲心碱(式(I)中R1、R2、R3均为氢)相接触时，甲基莲心碱即与Telo7结合。荧光光谱中，可以观察到，Telo7(G-四链体DNA)的加入使得甲基莲心碱的荧光信号发生淬灭，即Telo7与甲基莲心碱的结合使其发生荧光淬灭。因而能够证明Telo7与甲基莲心碱的结合。

[0031] 具体方法如下：

[0032] 1、配制缓冲液

[0033] 缓冲液为水溶液，含有以下终浓度的各种物质：17.2mM K+(K2HPO4/KH2PO4)；pH7.4。

[0034] 2、将400OD[d(TTAGGGT)]所示的单链Telo7(北京擎科生物技术有限公司)溶解在缓冲液中，得到浓度为200uM的Telo7母液。

[0035] 3、将3.0mg甲基莲心碱(中国药品生物制品检定所)溶解在缓冲液中，得到浓度为10mM的甲基莲心碱母液。

[0036] 4、制备一系列不同的摩尔比的Telo7与甲基莲心碱的混合溶液，混合溶液中甲基莲心碱的浓度为20uM不变，Telo7与甲基莲心碱的摩尔比分别为0:1、0.05:1、0.1:1、0.25:1、0.5:1、1:1、2:1、4:1。

[0037] 5、将上述混合溶液25℃孵育12h，荧光测定，观察甲基莲心碱荧光强度的变化。

[0038] 由图1可见，在甲基莲心碱的溶液中加入Telo7后，Telo7使甲基莲心碱的荧光强度减弱，发生了荧光淬灭，因此确定Telo7四链体与甲基莲心碱发生了结合。

[0039] (2)与甲基莲心碱结合后Telo7的热稳定性

[0040] Telo7四链体的熔点是指G4结构分解50％时的温度。DNA的熔点(Tm)反应了它的热稳定性，熔点越高说明该G4结构越稳定，反之，熔点越低说明该G4结构越不稳定。G4结构越稳定表明对肿瘤细胞增殖的影响越大，抗肿瘤增殖效果越明显。

[0041] 通过圆二色谱(CD)变温实验测定甲基莲心碱与Telo7的混合溶液(摩尔比为10:1)中Telo7的熔点，以浓度为200uM的Telo7溶液作为对照。采用的仪器为Jasco815圆二色谱仪，实验中采用的CD吸收池光程为1cm。在进行实验前用高纯N2除氧5分钟，且实验中一直用高纯N2作为保护气以保证没有臭氧出现，实验数据采集前，用缓冲液进行基线校对。在近紫外区220nm-320nm采集CD光谱，扫描速度为500nm/min，集次数为3次。在变温实验中采用JascoPTC-423S控温仪，温速度为2℃/min，通过监控262nm CD信号来进行Telo7熔点的测定，结果如图2所示。试验重复3次，数据采用平均值±标准差。

[0042] 结果表明，对照中，Telo7的熔点为43±1℃；甲基莲心碱与Telo7的混合溶液中，Telo7的熔点为57±1℃，提高Telo7的熔点达14℃。变温结果证实了甲基莲心碱的存在可以显著的提高Telo7的稳定性。

[0043] 实施例2、甲基莲心碱对人白血病细胞增殖能力的影响

[0044] 试验采用MTT法。

[0045] MTT法的基本原理为：四甲基偶氮唑盐[MTT，3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide](购自北京化学试剂公司)是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的formazon，而死细胞则无此功能。用DMSO溶解formazon后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。按照公式可计算肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(OD对照-OD实验)/OD对照×100％，进而计算得到半数抑制浓度(IC50)。

[0046] 1)甲基莲心碱对癌细胞增殖能力的影响

[0047] 具体操作步骤如下：

[0048] 1)选用对数生长期的贴壁人白血病细胞HL-60，用0.25％胰酶消化后，用含10％小牛血清的RPMI1640培养液配制成5000个/ml的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔接种100μl，37℃，5％CO2培养24h。

[0049] 2)按3个质量浓度梯度设甲基莲心碱组，第1-3行的第1-3列孔按浓度从低到高依次加入甲基莲心碱100μl，使每孔中甲基莲心碱终浓度依次为12.5μM、25μM、50μM；第1-3行第4列孔为对照1组，加入200μl RPMI1640培养液。第1-3行第5列孔为空白组，每孔未接种细胞，只加入200ul RPMI1640培养液。37℃，5％CO2培养72h。

[0050] 3)弃上清液，每孔加入100μl新鲜配制的0.5mg/ml MTT的无血清培养液，37℃继续培养4h。小心弃上清，并加入100μl DMSO溶解MTT formazon沉淀，用微型超声振荡器混匀，用BIORAD550型酶标仪于490nm波长下测定96孔板每一孔的光密度值。按照下述公式计算肿瘤细胞生长抑制率，肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(OD对照-OD实验)/OD对照×100％(其中OD对照、OD实验为已经扣除OD空白的实验数值)。实验结果如表1所示。

[0051] 实施例3、甲基莲心碱对人胃癌细胞、人肝癌细胞以及人鼻咽癌细胞增殖能力的影响

[0052] 试验采用SRB法。

[0053] SRB法的基本原理为：SRB是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于水。SRB可与细胞蛋白的碱性氨基结合而显色，在490nm-520nm波长处其OD值与活细胞数呈良好的线性关系。故可用作细胞数的定量。

[0054] 具体操作步骤如下：

[0055] 1)分别将人胃癌细胞系BGC-823、人肝癌细胞系Bel-7402、人鼻咽癌细胞系KB细胞接种于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中。细胞培养用50ml培养瓶，置于37℃、5％CO2培养箱在全湿条件下培养。将增殖良好并处于对数生长期的上述三种细胞分别用含10％小牛血清的RPMI1640培养液配制成5000个/ml的细胞悬液，接种于96孔板内，100uL/孔。预培养24小时。

[0056] 2)按3个质量浓度梯度设甲基莲心碱组，第1-3行的第1-3列孔按浓度从低[0057] 到高依次加入甲基莲心碱100μl，使每孔中甲基莲心碱终浓度依次为12.5μM、25μM、

[0058] 50μM；第1-3行第4列孔为对照2组，加入200μl RPMI1640培养液。第1-3行第5列孔为空白组，每孔未接种细胞，只加入200ul RPMI 1640培养液。37℃，5％CO2培养72h。

[0059] 3)参 照Skehan’s法 (Skehan P，et al.J ofNat Cancer Ins，1990，82(13)：1107～1112)每孔加入0.4％SRB100uL，用BIORAD550型酶标仪于509nm波长下测定96孔板每一孔的光密度值。按照下述公式计算肿瘤细胞生长抑制率，肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(OD对照-OD实验)/OD对照×100％(其中OD对照、OD实验为已经扣除OD空白的实验数值)。实验结果如表1所示。

[0060] 表1甲基莲心碱抑制肿瘤细胞增殖的试验结果

[0061]