一种筛选激活潜伏感染HIV-1化合物的T淋巴细胞及其制备方法

摘要

本发明属于基因工程和细胞工程领域，涉及一种用于筛选再次激活潜伏感染HIV-1化合物的人T淋巴细胞系模型及其制备方法。本发明提供了一种筛选激活潜伏感染HIV-1药物的T淋巴细胞，该细胞是被携带报告基因的HIV慢病毒感染同时又不表达Jurkat稳定株。本发明所述细胞的保藏号为CCTCC？NO.C200821。本发明提供了上述细胞的制备方法，即将携带EGFP报告基因的HIV-1的慢病毒感染人T淋巴细胞系Jurkat，通过细胞分选和HIV整合检测，获得具有HIV整合但未表达EGFP的克隆。本发明为病毒储藏库控制药物进行筛选的细胞模型。

权利要求

1.一种筛选激活潜伏感染HIV-1药物的T淋巴细胞，其特征在于，该细胞是被携带报告基因的HIV慢病毒感染同时又不表达该报告基因的Jurkat稳定株；所述的HIV慢病毒的制备方法包括以下步骤：(1)FUGW载体经PacI+BamhI酶切，回收7KB片段并用T4连接酶连接而获得泛素调控区缺失的FGW质粒；(2)FGW质粒、包膜质粒VSVG和包装结构质粒CMVΔ8.9质粒混合，转染人293T细胞，48小时后，收集上清，经超速离心获得FGW病毒，其滴度在10E5-10E8，-80度储存。

2.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，该细胞是保藏号为CCTCCNO.C200821的细胞。

3.一种权利要求1所述细胞的制备方法，其特征在于，将携带EGFP报告基因的HIV-1的慢病毒感染人T淋巴细胞系Jurkat，通过细胞分选和HIV整合检测，获得具有HIV整合但未表达EGFP的克隆。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，进一步利用TNF-a进行不同浓度的诱导激活，分析荧光强度和荧光阳性的细胞数目，最后筛选并获得可诱导性的EGFP表达克隆。

5.一种权利要求1所述细胞的应用，其特征在于，将化合物加入权利要求1所述细胞，能使细胞出现绿色荧光的化合物即为候选激活潜伏感染HIV-1药物。

说明书

一种筛选激活潜伏感染HIV-1化合物的T淋巴细胞及其制

备方法

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程和细胞工程领域，涉及一种用于筛选再次激活潜伏感染HIV-1化合物的人T淋巴细胞系模型及其制备方法。

背景技术

[0002] 获得性免疫缺陷综合征(AIDS)是由HIV感染引起的一种严重危害人们生命健康的传染性疾病。据WHO统计全球艾滋病患者已超过4000万，每年新增患者500万，而每年死亡约为300万。目前，艾滋病临床治疗方法主要是高效抗逆传录病毒疗法(Highly active antiretroviral therapy，HAART)，由于它能有效减少病毒载量(virus load)和保护免疫功能，从而相应地延长了HIV感染者的存活时间。然而，该疗法只能抑制病毒复制，不能彻底清除HIV的感染，大多数病人在中断HAART后会出现病毒反弹，其主要原因是HIV会整合在静止型记忆细胞CD4阳性T细胞的基因组中。这些细胞半衰期较长，据估计，机体要清除这些病毒储存库的细胞需要40-60年。最近，免疫刺激治疗的策略可通过对感染细胞的再次激活，从而促进细胞死亡以此加速病毒库的清除，因而，该策略为病毒储存库的控制开辟了新的思路。尽管对病毒储藏库的消除已有几个方案，但在临床上仍未获得满意的效果，因此，研发新型激活潜伏感染细胞药物已是迫在眉睫，而建立相应药物筛选模型是一个关键环节。

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供一种用于筛选再次激活潜伏感染HIV-1化合物的人T淋巴细胞。

[0004] 本发明的另一个目的是提供上述细胞的制备方法。

[0005] 本发明的再一个目的是提供上述细胞的应用。

[0006] HIV分为HIV-1和HIV-2两个型。目前广泛流行于全球的毒株是HIV-1型。HIV-2毒株虽然发现于西非地区，随着时间的推移，该毒株在欧洲、美国和南美、亚洲一些感染者中也被检测到，尤其亚洲印度的HIV-2感染者数量正在迅速增加，我国在新疆、上海等地区也已陆续发现。当然不论从全球乃至我国，HIV-1是当前主要的艾滋病流行毒株。若要获得有效安全的再次激活潜伏感染HIV-1化合物，就必须大规模在于HIV-1潜伏的细胞模型上进行筛选。由于HIV-1潜伏的静止型记忆CD4细胞数量较少，且其形态上与正常CD4细胞一样，分离纯化和鉴定病毒储存库的细胞较难，因而，以患者HIV-1潜伏的感染细胞为药物筛选模型较困难。为此，本发明将携带EGFP报告基因的HIV-1的慢病毒感染人淋巴细胞系，模拟HIV-1感染正常人T淋巴细胞的状况，通过细胞分选，获得不表达的细胞并进行克隆扩增，对这些克隆进行HIV整合检测，然后，获得具有HIV整合但未表达EGFP的克隆。为了验证该细胞模型的可用性，我们利用TNF-α进行诱导，最后获得诱导性的EGFP表达克隆，该基因修饰细胞系即为潜伏感染HIV-1的人T淋巴细胞模型，该模型将为HIV-1潜伏的机制研究，尤其是为病毒储藏库控制药物的筛选奠定基础。

[0007] 本发明提供了一种筛选激活潜伏感染HIV-1药物的T淋巴细胞，该细胞是被携带报告基因的HIV慢病毒感染同时又不表达Jurkat稳定株。

[0008] 本发明所述Jurkat稳定株已经提交中国典型培养物保藏中心(中国武汉.武汉大学)保藏，保藏号为CCTCC NO.C200821，名称为Jurkat-LTRGT细胞系，保藏日期为2008年5月19日。

[0009] 本发明提供了一种基于HIV-1慢病毒包装载体系统，由FGW质粒、CMVΔ8.9和包膜质粒VSVG组成(其结构示意图分别如图1、2和3所示)组成..

[0010] 本发明的FGW质粒是在FUGW慢病毒载体基础上，经过基因缺失泛素调控区改建而成。FUGW，CMVΔ8.9和包膜质粒VSVG来源于美国Carlos Lois博士惠赠。FUGW来源于文章：Lois C，et al.Germline transmission and tissue-specificexpression of transgenes delivered by lentiviral vectors.Science，2002，295：868-72。FGW质粒是由FUGW衍生的、已除去HIV-1有害基因后的HIV长末端重复序列(LTR)及FLAP作为骨架，表达仅由LTR调控的绿色荧光蛋白基因(EGFP)； pCMV.Δ8.9为包装结构质粒，主要起病毒包装功能，表达酶蛋白形成病毒衣壳结构及整合酶(IN)；VSVG为包膜质粒。

[0011] 本发明所述的药物可以是人工合成，也可以是从植物中提取。 [0012] 另一方面，本发明提供了上述细胞的制备方法，即将携带EGFP报告基因的HIV-1的慢病毒感染人T淋巴细胞系Jurkat，通过细胞分选和HIV整合检测，获得具有HIV整合但未表达EGFP的克隆。

[0013] 本发明中，可以进一步利用TNF-a进行不同浓度的诱导激活，分析荧光强度和荧光阳性的细胞数目，最后筛选并获得可诱导性的EGFP表达克隆。

[0014] 本发明还提供了慢病毒的制备方法，该方法包括以下步骤：

[0015] 该制备方法包括以下步骤：

[0016] (1)FUGW载体经PacI+BamhI酶切，回收7KB片段并T4连接酶连接而获得泛素调控区缺失的FGW质粒；

[0017] (2)FGW质粒、包膜质粒VSVG和包装结构质粒CMVΔ8.9质粒混合，转染人293T细胞，48小时后，收集上清，经超速离心获得FGW病毒，其滴度应在10E5-10E8，-80度储存。 [0018] 本发明的制备方法中，(2)中采用混合质量比为5∶4∶3-4∶3∶2。质粒FGW，pCMV.Δ8.9，及VSVG三部分共转染时，三者质量比可以为2∶1.5∶1；如三质粒共转染100CM培养皿，FGW，pCMV.Δ8.9及VSVG所需量可以是10ug，7.5ug和5ug。共转染方法可以通过脂质体，磷酸钙，PEI等。

[0019] (3)将(2)获得FGW病毒感染人T淋巴细胞Jurkat，感染72小时后经流式细胞仪进行细胞分选，收集未荧光表达的细胞并在96孔板上进行单个细胞克隆扩增。抽提每个细胞克隆基因组DNA，进行病毒整合检测。

[0020] (4)病毒整合检测所用引物如下：EGFP(4021)-F，5-TAGCAATACAGCAGCTACCAATGCTGATTG-3；EGFP(4371)-R，5-GTGTTCTCTCCTTCATTGGCTTCTTCTACC-3.PCR反应条件为，95度1分；95度30秒，58度40秒，72度45秒；30个循环.延伸10分.PCR产物在1.5凝胶上电泳，目的带应在350BP处的单一条 带.

[0021] (5)将(4)整合阳性的细胞克隆进行扩增，一部分细胞冻存，一部分细胞用TNF-进行不同浓度的诱导激活(0ng/mL，0.3ng/mL，0.6ng/mL，1.2ng/mL，2.4ng/mL，4.8ng/mL9.6ng/mL，)，分析荧光强度和荧光阳性的细胞数目，最后筛选并获得可诱导性的EGFP表达克隆为病毒储藏库控制药物进行筛选的细胞模型.

[0022] (6)FGW病毒感染靶细胞除人T淋巴细胞Jurkat外，可以是人单核巨嗜细胞，星型胶质细胞.

[0023] 本发明还提供了上述细胞的应用，即将化合物加入上述用于筛选再次激活潜伏感染HIV-1化合物的人T淋巴细胞系模型细胞，能使细胞出现绿色荧光的化合物即为候选激活潜伏感染HIV-1药物。

[0024] 本发明将携带EGFP报告基因的HIV-1的慢病毒感染人T淋巴细胞系Jurkat，模拟HIV-1感染正常人T淋巴细胞的状况，通过细胞分选和HIV整合检测，获得具有HIV整合但未表达EGFP的克隆。然后，利用TNF-a进行不同浓度的诱导激活，分析荧光强度和荧光阳性的细胞数目，最后筛选并获得可诱导性的EGFP表达克隆。本发明的目的是提供一种为HIV-1潜伏机制的研究，尤其是为病毒储藏库控制药物进行筛选的细胞模型。 附图说明

[0025] 图1.FGW载体结构示意图。

[0026] 图2.VSVG载体结构示意图

[0027] 图3.pCMV.Δ8.9结构示意图。

[0028] 图4.TNF-α诱导激活后荧光显微镜下观察细胞荧光的结果示意图。 [0029] 图5.TNF-α诱导激活后细胞绿色荧光强度的结果示意图。

[0030] 图6.不同浓度的TNF-α诱导激活后绿色荧光细胞数的结果示意图。 具体实施方式

[0031] 实施例1 慢病毒载体制备方法

[0032] 慢病毒载体FUGW用PacI+BamhI酶切，回收8691BP片段，T4连接酶连接，转化细菌克隆抽提DNA序列分析，最后获得泛素调控区缺失的FGW质粒。

[0033] 实施例2 慢病毒载体制备

[0034] 将FGW载体，与包装结构质粒CMVΔ8.9和包膜质粒(VSVG)以2∶1∶1质量比例混合。利用脂质体LipofectamineTM在293T细胞上进行转染，24～48h后在荧光显微镜下观察，出现大量荧光后收集病毒上清，收集的病毒上清浓缩后分装备用或立即使用.重组慢病毒活性测定时，将浓缩后的病毒贮存液作不同比例稀释，感染细胞48h后在荧光显微镜下进行荧光计数，确定滴度。FGW载体作为对照。结果显示，位点特异整合性慢病毒滴-7度为6.8X10 TU/ML.

[0035] 实施例3慢病毒系统感染细胞分析

[0036] 将上述1ul慢病毒系统FGW-(被质粒CMVΔ8.9包装)感染6孔板上Jurkat细胞系。72h后在荧光显微镜下进行观察，结果显示，Jurkat系细胞可见绿色荧光；感染效率为82.1％。收集未荧光表达的细胞并在96孔板上进行单个细胞克隆扩增。 [0037] 实施例4 FGW慢病毒感染细胞后整合分析

[0038] 抽提上述被感染细胞基因组DNA，用PCR和序列分析方法鉴定是否病毒基因组整合：EGFP(4021)-F，5-TAGCAATACAGCAGCTACCAATGCTGATTG-3；EGFP(4371)-R，5-GTGTTCTCTCCTTCATTGGCTTCTTCTACC-3.PCR反应条件为，95度1分；95度30秒，58度40秒，72度45秒；30个循环.延伸10分.PCR产物在1.5凝胶上电泳。结果显示，FGW-慢病毒感染Jurkat细胞，岁未见荧光表达，但能扩增出350bp的目的条带.

[0039] 实施例5. 不同浓度的TNF-α诱导Jurkat细胞报告基因激活

[0040] 为了验证整合阳性的细胞克隆是否能被免疫抑制剂激活，细胞在24孔板上用TNF-α进行不同浓度的诱导激活(0ng/mL，0.3ng/mL，0.6ng/mL，1.2ng/mL， 2.4ng/mL，4.8ng/mL，9.6ng/mL)，24小时后，用流式细胞仪分析荧光强度和荧光阳性的细胞数目，结果显示，随着TNF-α浓度升高，Jurkat细胞表达荧光强度也增高，在2.4ng/mLTNF-α浓度时荧光阳性的细胞数目达最大，以后处于平台期。

[0041] 实施例6 IL-7诱导Jurkat细胞报告基因激活

[0042] 为了验证整合阳性的细胞克隆是否能被免疫抑制剂激活，细胞在24孔板上用IL-7进行不同浓度的诱导激活(0ng/mL，0.3ng/mL，0.6ng/mL，1.2ng/mL，2.4ng/mL，4.8ng/mL，9.6ng/mL)，24小时后，用流式细胞仪分析荧光强度和荧光阳性的细胞数目，结果显示，随着IL-7浓度升高，Jurkat细胞表达荧光强度也增高，在大于等于2.ng/mL IL-7浓度时荧光阳性的细胞数目趋于稳定。

[0043] 序列表

[0044] <110>复旦大学

[0045] <120>一种筛选激活潜伏感染HIV-1化合物的T淋巴细胞及其制备方法 [0046] <130>31

[0047] <160>3

[0048] <170>PatentIn version 3.1

[0049] <210>1

[0050] <211>30

[0051] <212>DNA

[0052] <213>Artificial

[0053] <400>1

[0054] tagcaataca gcagctacca atgctgattg 30 [0055] <210>2

[0056] <211>30

[0057] <212>DNA

[0058] <213>Artificial

[0059] <400>2

[0060] gtgttctctc cttcattggc ttcttctacc 30 [0061] <210>3

[0062] <211>8691

[0063] <212>DNA

[0064] <213>Artificial

[0065] <220>

[0066] <221>cmv promoter

[0067] <222>(1)..(817)

[0068] <223>

[0069] <220>

[0070] <221>LTR

[0071] <222>(818)..(1117)

[0072] <223>

[0073] <220>

[0074] <221>RRE

[0075] <222>(1118)..(1895)

[0076] <223>

[0077] <220>

[0078] <221>FLP

[0079] <222>(1896)..(2600)

[0080] <223>

[0081] <220>

[0082] <221>EGFP

[0083] <222>(2601)..(3434)

[0084] <223>

[0085] <220>

[0086] <221>WHV

[0087] <222>(3435)..(4002)

[0088] <223>

[0089] <220>

[0090] <221>LTR

[0091] <222>(4003)..(4831)

[0092] <223>

[0093] <400>3

[0094] gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 60 [0095] atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt 120 [0096] gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc 180 [0097] tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat acgcgttgac 240 [0098] attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat 300 [0099] atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg 360 [0100] acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 420 [0101] tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 480 [0102] tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 540 [0103] attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 600 [0104] tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt 660 [0105] ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc 720 [0106] accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg 780 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