单纯疱疹病毒载体和重组病毒及宿主细胞及其药物组合物转让专利
申请号 : CN200710120849.2
文献号 : CN101376893B
文献日 : 2011-07-13
发明人 : 李秉珅 , 李巍东 , 田超 , 李琦
申请人 : 李小鹏
摘要 :
本发明提供了一种单纯疱疹病毒载体和重组病毒及宿主细胞及其药物组合物。本发明提供的病毒载体对于黄色人种宿主细胞的特异性侵染率高，复制速度快，毒性低，因此可以直接用于侵染并溶解黄色人种的肿瘤细胞，也可以携带基因药物至黄色人种细胞内进行基因治疗。
权利要求 :
1.一种单纯疱疹病毒载体，所述单纯疱疹病毒载体是通过使单纯疱疹病毒缺失了编码感染细胞多肽34.5的基因、编码感染细胞多肽6的基因和编码感染细胞多肽47的基因中的一个或几个基因得到的，其中，所述单纯疱疹病毒的保藏编号为CGMCC No.1736。
2.一种重组病毒，所述重组病毒包括病毒载体和目的基因，其特征在于，所述病毒载体为权利要求1所述的单纯疱疹病毒载体。
3.一种感染有病毒的宿主细胞，其特征在于，所述病毒为权利要求1所述的单纯疱疹病毒载体和/或权利要求2所述的重组病毒。
说明书 :
单纯疱疹病毒载体和重组病毒及宿主细胞及其药物组合物
技术领域
[0001] 本发明是关于一种病毒载体、包括该病毒载体的重组病毒、包括所述病毒载体和/或所述重组病毒的宿主细胞，以及包括所述病毒载体和/或所述重组病毒的药物组合物。具体地说，本发明是关于一种单纯疱疹病毒载体、包括该病毒载体的重组病毒、包括所述病毒载体和/或所述重组病毒的宿主细胞，以及包括所述病毒载体和/或所述重组病毒的药物组合物。
背景技术
[0002] 单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)呈球形，完整的单纯疱疹病毒由核心、衣壳、被膜(Tegument)和囊膜组成。该病毒的核心含有双链DNA，缠绕成纤丝卷轴。衣壳呈二十面体对称，直径为100纳米左右，由162个壳微粒组成。衣壳外由厚薄不匀的被膜覆盖。病毒最外层为典型的脂质双层囊膜。包括囊膜的病毒直径为150-200纳米。单纯疱疹病毒包括I型单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus Type I，HSV-1)以及II型单纯疱疹病毒。HSV的基因组DNA通过共价连接的长节段(L)和短节段(S)组成，在每个节段的末端含有反向重复序列(invert terminal repeat，TR)和内部重复序列(internal repeat，IR)。病毒在侵入宿主细胞后，线状DNA就可以通过两端的TR连接形成环状，在宿主细胞核内的病毒基因组以级联反应的方式表达病毒蛋白，根据基因表达的时间顺序不同，将HSV基因分为立即早期基因(α)、早期基因(β)和晚期基因(γ)。立即早期基因(immediate earlyphase，IE)进入宿主细胞的能够迅速得到表达，该基因的表达产物为能够对病毒的复制进行调控的感染细胞多肽(infected cell polypeptides，ICP)。HSV进入宿主细胞后最先表达，例如编码感染细胞多肽α22、α27的立即早期基因促进单纯疱疹病毒在宿主细胞中的增殖。因此单纯疱疹病毒的立即早期基因编码的感染细胞多肽在宿主细胞中的表达丰度决定了病毒在宿主细胞中的增殖速度。此外，单纯疱疹病毒的编码感染细胞多肽34.5(infected cellpolypeptides，ICP34.5)的基因、编码感染细胞多肽6的基因和编码感染细胞多肽47的基因已分别被证实对人体正常细胞有害但不影
响单纯疱疹病毒在肿瘤细胞中的增殖，因此可以通过敲除所述三个基因中的一个或几个制备单纯疱疹病毒载体(参见“Mapping of herpes simplex virus-1 neurovirulence togamma 1 34.5，a gene nonessential for growth in culture”，J Chou等人，Science，Vol 250，Issue 4985，1262-1266，1990年9月；Treatment of Malignant GliomasUsing Ganciclovir-hypersensitive，Ribonucleotide Reductase-deficient HerpesSimplex Viral Mutant，Toshihiro Mineta等人，Cancer Research 54，3963-3966，1994年8月；以及CN 1283803C)。所述单纯疱疹病毒载体可以以空载体的形式感染肿瘤细胞，通过病毒载体的迅速增殖杀伤肿瘤细胞；也可以携带抗肿瘤外源基因(例如粒-巨噬细胞集落刺激因子)，通过病毒载体增殖和外源基因在肿瘤细胞中的表达，杀伤肿瘤细胞。
响单纯疱疹病毒在肿瘤细胞中的增殖，因此可以通过敲除所述三个基因中的一个或几个制备单纯疱疹病毒载体(参见“Mapping of herpes simplex virus-1 neurovirulence togamma 1 34.5，a gene nonessential for growth in culture”，J Chou等人，Science，Vol 250，Issue 4985，1262-1266，1990年9月；Treatment of Malignant GliomasUsing Ganciclovir-hypersensitive，Ribonucleotide Reductase-deficient HerpesSimplex Viral Mutant，Toshihiro Mineta等人，Cancer Research 54，3963-3966，1994年8月；以及CN 1283803C)。所述单纯疱疹病毒载体可以以空载体的形式感染肿瘤细胞，通过病毒载体的迅速增殖杀伤肿瘤细胞；也可以携带抗肿瘤外源基因(例如粒-巨噬细胞集落刺激因子)，通过病毒载体增殖和外源基因在肿瘤细胞中的表达，杀伤肿瘤细胞。
[0003] 由于单纯疱疹病毒能以人类细胞作为宿主细胞，并且能够感染的人类细胞类型广、发生意外增殖可以用抗疱疹药物阻止、裂解期和潜伏期都不整合宿主细胞基因组插入突变危险小，因此，单纯疱疹病毒已经用于肿瘤或神经系统退行性疾病的基因治疗。例如，I型单纯疱疹病毒F株HSV1716用于脑胶质瘤的治疗(参见“HSV1716 injection intothe brain adjacent to tumourfollowing surgical resection of high-grade glioma：
safety data and long-termsurvival”，S.Harrow等人，Gene Therapy，11，1648-1658，
2004)；I型单纯疱疹病毒17+株感染肿瘤细胞，通过该病毒的裂解性复制溶解肿瘤细胞而治疗癌症。然而，感染不同人种的I型单纯疱疹病毒基因组具有明显不同的限制性内切酶分解模式，即存在限制性片段长度多态性(restriction fragment lengthpolymorphism，RFLP)(参 见“Quantitative analysis of genomic polymorphismof herpes simplex virus type 1 strains from six countries：studies of molecularevolution and molecular epidemiology of the virus”，H.Sakaoka等人，Journal ofGeneral Virology，Vol 75，513-527，1994)，单纯疱疹病毒17+株从白色人种中分离，因此，将易于感染白色人种的I型单纯疱疹病毒17+株，敲除编码感染细胞多肽34.5的基因、编码感染细胞多肽6的基因和编码感染细胞多肽47的基因中的一个或几个后所得的载体，在用于对黄色人种进行基因治疗时，存在病毒感染率低、在宿主细胞中增殖速度慢的缺点。
safety data and long-termsurvival”，S.Harrow等人，Gene Therapy，11，1648-1658，
2004)；I型单纯疱疹病毒17+株感染肿瘤细胞，通过该病毒的裂解性复制溶解肿瘤细胞而治疗癌症。然而，感染不同人种的I型单纯疱疹病毒基因组具有明显不同的限制性内切酶分解模式，即存在限制性片段长度多态性(restriction fragment lengthpolymorphism，RFLP)(参 见“Quantitative analysis of genomic polymorphismof herpes simplex virus type 1 strains from six countries：studies of molecularevolution and molecular epidemiology of the virus”，H.Sakaoka等人，Journal ofGeneral Virology，Vol 75，513-527，1994)，单纯疱疹病毒17+株从白色人种中分离，因此，将易于感染白色人种的I型单纯疱疹病毒17+株，敲除编码感染细胞多肽34.5的基因、编码感染细胞多肽6的基因和编码感染细胞多肽47的基因中的一个或几个后所得的载体，在用于对黄色人种进行基因治疗时，存在病毒感染率低、在宿主细胞中增殖速度慢的缺点。
发明内容
[0004] 本发明的第一个目的是克服现有缺失编码感染细胞多肽34.5的基因、编码感染细胞多肽6的基因和编码感染细胞多肽47的基因中的一个或几个基因的单纯疱疹病毒载体用于黄色人种基因治疗时病毒感染率低、在宿主细胞中复制增殖速度慢的缺点，提供一种缺失编码感染细胞多肽34.5的基因、编码感染细胞多肽6的基因和编码感染细胞多肽47的基因中的一个或几个基因的单纯疱疹病毒载体，该病毒载体用于黄色人种基因治疗时，病毒感染率高、在宿主细胞中复制增殖速度快。
[0005] 本发明的第二个目的是提供包括上述病毒载体的重组病毒。
[0006] 本发明的第三个目的是提供包括上述病毒载体和/或上述重组病毒的宿主细胞。
[0007] 本发明的第四个目的是提供一种包括上述病毒载体和/或上述重组病毒的药物组合物。
[0008] 本发明的发明人针对易于感染白色人种的I型单纯疱疹病毒17+株敲除编码感染细胞多肽34.5的基因、编码感染细胞多肽6的基因和编码感染细胞多肽47的基因中的一个或几个后所得的载体，在用于对黄色人种进行基因治疗时，存在病毒感染率低、在宿主细胞中复制增殖速度慢的缺点，从成年中国人口角疱疹中分离出单纯疱疹病毒(分类命名为单纯疱疹病毒I型，拉丁文学名为Herpes Simplex Virus Type I，于2006年6月14日保藏至位于北京市海淀区中关村北一条13号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.1736)，并对该病毒进行了基因组全序列测定和分析，确定了该临床分离株与I型单纯疱疹病毒17+株在编码感染细胞多肽的立即早期基因方面存在的差异。而且本发明的发明人还敲除了单纯疱疹病毒编码感染细胞多肽34.5的基因、编码感染细胞多肽6的基因和编码感染细胞多肽47的基因中的一个或几个基因，得到毒性低、可以携带更多目的基因的单纯疱疹病毒载体。
[0009] 本发明提供了一种单纯疱疹病毒载体，所述病毒载体缺失编码感染细胞多肽34.5的基因、编码感染细胞多肽6的基因和编码感染细胞多肽47的基因中的一个或几个基因，侵入宿主细胞内表达感染细胞多肽，其中，所述感染细胞多肽包括一种具有促进该病毒载体增殖功能的氨基酸序列，所述氨基酸序列选自SEQ ID：NO.1所示的氨基酸序列、SEQ ID：NO.3所示的氨基酸序列，以及对所述SEQ ID：NO.1或SEQ ID：NO.3所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代、添加或缺失而得到的具有促进病毒载体增殖功能的氨基酸序列中的一种或几种。
[0010] 本发明还提供了一种单纯疱疹病毒载体，所述病毒载体缺失编码感染细胞多肽34.5的基因、编码感染细胞多肽6的基因和编码感染细胞多肽47的基因中的一个或几个基因，所述病毒具有编码感染细胞多肽的立即早期基因，其中，所述感染细胞多肽包括一种具有促进该病毒载体增殖功能的氨基酸序列，所述氨基酸序列选自SEQ ID：NO.1所示的氨基酸序列、SEQ ID：NO.3所示的氨基酸序列，以及对所述SEQ ID：NO.1或SEQ ID：NO.3所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代、添加或缺失而得到的具有促进病毒载体增殖功能的氨基酸序列中的一种或几种。
[0011] 本发明还提供了一种重组病毒，所述重组病毒包括病毒载体和目的基因，其中，所述病毒载体为本发明所述的单纯疱疹病毒载体。
[0012] 本发明还提供了一种感染有病毒的宿主细胞，其中，所述病毒为本发明提供的病毒载体和/或重组病毒。
[0013] 本发明还提供了一种药物组合物，其中，所述药物组合物包括本发明提供的病毒载体和/或重组病毒。
[0014] 本发明提供了一种分离自黄色人种且缺失编码感染细胞多肽34.5的基因、编码感染细胞多肽6的基因和编码感染细胞多肽47的基因中的一个或几个基因的单纯疱疹病毒载体，该病毒载体对于黄色人种宿主细胞的特异性侵染率高，复制速度快，毒性低，因此可以直接用于侵染并溶解黄色人种的肿瘤细胞，也可以作为病毒载体携带基因药物至黄色人种细胞内进行基因治疗。此外，与现有的分离自白色人种且敲除编码感染细胞多肽34.5的基因、编码感染细胞多肽6的基因和编码感染细胞多肽47的基因中的一个或几个基因得到的I型单纯疱疹病毒17+株载体相比，本发明病毒载体用于其他人种多发肿瘤细胞时，对肿瘤细胞的溶解能力更强。
[0015] 本发明涉及的单纯疱疹病毒的分类命名为单纯疱疹病毒I型，拉丁文学名为Herpes Simplex Virus Type I，于2006年6月14日保藏至位于北京市海淀区中关村北
一条13号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.1736。
一条13号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.1736。
附图说明
[0016] 图1为本发明涉及单纯疱疹病毒的电子显微镜照片(放大52000倍)；
[0017] 图2为正常人乳腺癌细胞系MCF-7培养96小时的生长情况光学显微镜照片(放大400倍)；
[0018] 图3为培养MCF-7细胞48小时后，按病毒活性颗粒/细胞数的比值(MOI)为0.1转染本发明病毒后再培养48小时的生长情况光学显微镜照片(放大400倍)；
[0019] 图4为本发明病毒载体对人结肠腺癌HT-29裸鼠移植瘤抑制作用的药效照片；
[0020] 图5为本发明病毒载体对结肠腺癌HT-29裸鼠移植瘤抑制作用的曲线；
[0021] 图6为表达由本发明病毒载体携带的绿色荧光蛋白基因的人鼻咽癌细胞。
具体实施方式
[0022] 本发明提供了一种单纯疱疹病毒载体，所述病毒载体缺失编码感染细胞多肽34.5的基因、编码感染细胞多肽6的基因和编码感染细胞多肽47的基因中的一个或几个基因，所述病毒载体侵入宿主细胞内表达感染细胞多肽，其中，所述感染细胞多肽包括一种具有促进病毒增殖功能的氨基酸序列，所述氨基酸序列选自SEQ ID：NO.1所示的氨基酸序列、SEQ ID：NO.3所示的氨基酸序列，以及对所述SEQ ID：NO.1或SEQ ID：NO.3所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代、添加或缺失而得到的具有促进病毒增殖功能的氨基酸序列中的一种或几种。
[0023] 所述立即早期基因(immediate early phase，IE)指病毒进入宿主细胞就立即利用宿主细胞表达(一般在1小时内)的基因，立即早期基因编码的感染细胞多肽在宿主细胞中的表达丰度决定了病毒在宿主细胞中的增殖速度。由于本发明的单纯疱疹病毒载体的立早基因表达产物感染细胞多肽，例如SEQ ID：NO.1所示的感染细胞多肽α22、SEQ ID：NO.3所示的α27，与野生型单纯疱疹病毒17+敲除编码感染细胞多肽34.5的基因、编码感染细胞多肽6的基因和编码感染细胞多肽47的基因中的一个或几个基因得到的病毒载体的相应感染细胞多肽相比，发生了变异，因此在宿主细胞尤其是黄色人种细胞中的表达丰度高，因而使病毒在的增殖速度明显加快。
[0024] 组成蛋白质的20种氨基酸残基，按照侧链极性可以分成四类：1、非极性的氨基酸：如丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro)；2、极性不带电荷的氨基酸：如甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和酪氨酸(Tyr)；3、带正电荷的氨基酸：如精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)；4、带负电荷的氨基酸：如天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(参见“生物化学”(第二版)上册，沈同、王镜岩，第
82-83页，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白质中如果发生同属一个类别的氨基酸残基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代Ile，所述残基在蛋白质结构域中所起的作用如提供正电荷或形成疏水囊袋结构的作用没有改变，因此对蛋白质的立体结构并不会产生影响，因此仍然可以实现蛋白质的功能。例如，本领域技术人员公知，Ala和Ser、Val和Ile、Asp和Glu、Ser和Thr、Ala和Gly、Ala和Thr、Ser和Asn、Ala和Val、Ser和Gly、Tyr和Phe、Ala和pro、Lys和Arg、Asp和Asn、Leu和Ile、Leu和Val、Ala和Glu以及Asp和Gly，两两之间相互取代，不会影响蛋白质的立体结构和功能。所述同属一个类别的氨基酸残基取代可以发生在上感染细胞多肽的任意一个氨基酸残基位置上。相反，不同类别的氨基酸残基发生取代，会使蛋白质的结构发生变化，功能出现差异。例如与单纯疱疹病毒17+敲除编码感染细胞多肽34.5的基因、编码感染细胞多肽6的基因和编码感染细胞多肽47的基因中的一个或几个基因得到的病毒载体比较，本发明单纯疱疹病毒载体因感染细胞多肽的碱基发生了不同类别的取代，如单纯疱疹病毒17+载体的感染细胞多肽α22的第34位氨基酸残基为丝氨酸，而本发明单纯疱疹病毒载体的感染细胞多肽α22的第34位氨基酸残基为丙氨酸，因此本发明的单纯疱疹病毒更易感染黄色人种。
82-83页，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白质中如果发生同属一个类别的氨基酸残基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代Ile，所述残基在蛋白质结构域中所起的作用如提供正电荷或形成疏水囊袋结构的作用没有改变，因此对蛋白质的立体结构并不会产生影响，因此仍然可以实现蛋白质的功能。例如，本领域技术人员公知，Ala和Ser、Val和Ile、Asp和Glu、Ser和Thr、Ala和Gly、Ala和Thr、Ser和Asn、Ala和Val、Ser和Gly、Tyr和Phe、Ala和pro、Lys和Arg、Asp和Asn、Leu和Ile、Leu和Val、Ala和Glu以及Asp和Gly，两两之间相互取代，不会影响蛋白质的立体结构和功能。所述同属一个类别的氨基酸残基取代可以发生在上感染细胞多肽的任意一个氨基酸残基位置上。相反，不同类别的氨基酸残基发生取代，会使蛋白质的结构发生变化，功能出现差异。例如与单纯疱疹病毒17+敲除编码感染细胞多肽34.5的基因、编码感染细胞多肽6的基因和编码感染细胞多肽47的基因中的一个或几个基因得到的病毒载体比较，本发明单纯疱疹病毒载体因感染细胞多肽的碱基发生了不同类别的取代，如单纯疱疹病毒17+载体的感染细胞多肽α22的第34位氨基酸残基为丝氨酸，而本发明单纯疱疹病毒载体的感染细胞多肽α22的第34位氨基酸残基为丙氨酸，因此本发明的单纯疱疹病毒更易感染黄色人种。
[0025] 对所述SEQ ID：NO.1所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代而得到的具有促进病毒载体增殖功能的氨基酸序列可以选自SEQ ID：NO.1中第34位为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸的氨基酸序列，SEQ ID：NO.1中第102位为丝氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或酪氨酸的氨基酸序列，SEQ ID：NO.1中第281位为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸的氨基酸序列，SEQ ID：NO.1中第351位为精氨酸或组氨酸的氨基酸序列和SEQ ID：NO.1中第360位为赖氨酸或组氨酸的氨基酸序列中的一种或几种。对所述SEQ ID：NO.3所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代而得到的具有促进病毒载体增殖功能的氨基酸序列可以选自SEQ ID：NO.3中第36位为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸的氨基酸序列，SEQ ID：NO.3中第178位为赖氨酸或精氨酸的氨基酸序列，SEQ ID：NO.3中第179位为赖氨酸或组氨酸的氨基酸序列，SEQ ID：NO.3中第180位为赖氨酸或组氨酸的氨基酸序列，SEQ ID：NO.3中第181位为丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或酪氨酸的氨基酸序列，SEQ ID：NO.3中第206位为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸序列，SEQ ID：NO.3中第383位为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸的氨基酸序列中的一种或几种。
[0026] 本发明所述氨基酸序列优选为SEQ ID：NO.1所示的氨基酸序列和/或SEQ ID：NO.3所示的氨基酸序列。更优选所述氨基酸序列为SEQ ID：NO.1所示的氨基酸序列和SEQ ID：NO.3所示的氨基酸序列。
[0027] 单纯疱疹病毒载体的囊膜表面含有病毒糖蛋白B(gB)、病毒糖蛋白C(gC)、病毒糖蛋白D(gD)、病毒糖蛋白G(gG)和病毒糖蛋白M(gM)；由于单纯疱疹病毒载体对宿主细胞的感染能力还与该病毒载体囊膜糖蛋白的立体结构有关，即囊膜糖蛋白的立体结构与宿主细胞的相应靶标(例如细胞表面受体)越吻合，则能够进入宿主细胞的病毒载体越多，更能促进病毒载体侵染宿主细胞。因此更优选所述病毒载体还包括一种具有促进病毒载体侵染宿主细胞功能的氨基酸序列，即一种立体结构与黄色人种细胞表面受体更为吻合的囊膜蛋白的氨基酸序列。所述氨基酸序列选自SEQ ID：NO.5所示的氨基酸序列、SEQ ID：NO.7所示的氨基酸序列、SEQ ID：NO.9所示的氨基酸序列、SEQ ID：NO.11所示的氨基酸序列、SEQ ID：NO.13所示的氨基酸序列，以及对所述SEQ ID：NO.5、SEQ ID：NO.7、SEQ ID：NO.9、SEQ ID：
NO.11或SEQ ID：NO.13所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代、添加或缺失而得到的具有促进病毒载体侵染宿主细胞功能的氨基酸序列中的一种或几种。
NO.11或SEQ ID：NO.13所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代、添加或缺失而得到的具有促进病毒载体侵染宿主细胞功能的氨基酸序列中的一种或几种。
[0028] 对所述SEQ ID：NO.5所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代而得到的具有促进病毒侵染宿主细胞功能的氨基酸序列可以选自SEQ ID：NO.5中第79位为丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸或甘氨酸的氨基酸序列。对所述SEQ ID：NO.7所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代而得到的具有促进病毒侵染宿主细胞功能的氨基酸序列可以为SEQ ID：NO.7中第201位为谷氨酸的氨基酸序列和/或SEQ ID：NO.7中第295位为赖氨酸或精氨酸的氨基酸序列。对所述SEQ ID：NO.9所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代而得到的具有促进病毒侵染宿主细胞功能的氨基酸序列可以为SEQ ID：
NO.9中第369位为赖氨酸或精氨酸的氨基酸序列。对所述SEQ ID：NO.11所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代而得到的具有促进病毒侵染宿主细胞功能的氨基酸序列可以选自SEQID：NO.11中第3位为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸序列，SEQ ID：NO.11中第86位为天冬氨酸的氨基酸序列，SEQ ID：NO.11中第116位为丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或酪氨酸的氨基酸序列，SEQ ID：
NO.11中第118位为天冬氨酸的氨基酸序列，SEQ ID：NO.11中第130位为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸序列，SEQ ID：NO.11中第151位为甘氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或酪氨酸的氨基酸序列，SEQ ID：NO.11中第153位为天冬氨酸的氨基酸序列，SEQ ID：NO.11中第162位为甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或酪氨酸的氨基酸序列，SEQ ID：NO.11中第164位为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸序列，SEQ ID：NO.11中第208位为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸序列和第236位为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸序列中的一种或几种。对所述SEQ ID：NO.13所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代而得到的具有促进病毒侵染宿主细胞功能的氨基酸序列可以为SEQ ID：NO.13中第440位为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸序列和/或SEQ ID：NO.13中第446位为甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺或酪氨酸的氨基酸序列。
NO.9中第369位为赖氨酸或精氨酸的氨基酸序列。对所述SEQ ID：NO.11所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代而得到的具有促进病毒侵染宿主细胞功能的氨基酸序列可以选自SEQID：NO.11中第3位为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸序列，SEQ ID：NO.11中第86位为天冬氨酸的氨基酸序列，SEQ ID：NO.11中第116位为丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或酪氨酸的氨基酸序列，SEQ ID：
NO.11中第118位为天冬氨酸的氨基酸序列，SEQ ID：NO.11中第130位为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸序列，SEQ ID：NO.11中第151位为甘氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或酪氨酸的氨基酸序列，SEQ ID：NO.11中第153位为天冬氨酸的氨基酸序列，SEQ ID：NO.11中第162位为甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或酪氨酸的氨基酸序列，SEQ ID：NO.11中第164位为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸序列，SEQ ID：NO.11中第208位为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸序列和第236位为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸序列中的一种或几种。对所述SEQ ID：NO.13所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代而得到的具有促进病毒侵染宿主细胞功能的氨基酸序列可以为SEQ ID：NO.13中第440位为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸序列和/或SEQ ID：NO.13中第446位为甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺或酪氨酸的氨基酸序列。
[0029] 进一步优选所述病毒载体还包括一种具有促进该病毒载体侵染宿主细胞功能的氨基酸序列，所述氨基酸序列选自SEQ ID：NO.5所示的氨基酸序列、SEQ ID：NO.7所示的氨基酸序列、SEQ ID：NO.9所示的氨基酸序列、SEQ ID：NO.11所示的氨基酸序列和SEQ ID：NO.13所示的氨基酸序列中的一种或几种。
[0030] 本发明还提供了一种单纯疱疹病毒载体，所述病毒载体缺失编码感染细胞多肽34.5的基因、编码感染细胞多肽6的基因和编码感染细胞多肽47的基因中的一个或几个基因，所述病毒载体具有编码感染细胞多肽的立即早期基因，其中，所述感染细胞多肽包括一种具有促进该病毒载体增殖功能的氨基酸序列，所述氨基酸序列选自SEQ ID：NO.1所示的氨基酸序列、SEQ ID：NO.3所示的氨基酸序列，以及对所述SEQ ID：NO.1或SEQ ID：NO.3所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代、添加或缺失而得到的具有促进病毒载体增殖功能的氨基酸序列中的一种或几种。
[0031] 本领域技术人员公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白质的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，以及由所述氨基酸序列得到的具有促进病毒载体增殖功能的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的核苷酸序列，通过生物学方法(如PCR方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，应用到重组技术以及基因治疗当中，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。相同道理，利用本文公开的DNA序列，也可以通过本领域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989)进行，通过修改本发明提供的核酸序列，得到与本发明所述感染细胞多肽功能一致的氨基酸序列。
[0032] 优选所述立即早期基因包括一种编码具有促进病毒载体增殖功能的氨基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自SEQ ID：NO.2所示的核苷酸序列、SEQ ID：NO.4所示的核苷酸序列，以及对所述SEQ ID：NO.2或SEQID：NO.4所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代而得到的编码蛋白不变的核苷酸序列中的一种或几种。其中，对所述SEQ ID：NO.2所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代而得到的编码蛋白不变的核苷酸序列可以选自SEQ ID：NO.2中第102位为腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或鸟嘌呤(G)的核苷酸序
列、SEQ ID：NO.2中第306位为A、T或胞嘧啶(C)的核苷酸序列、SEQ ID：NO.2中第570位为G的核苷酸序列、SEQ ID：NO.2中第612位为T、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.2中第652位为T的核苷酸序列、SEQ ID：NO.2中第654位为A、T或G的核苷酸序列、SEQ ID：
NO.2中第729位为A、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.2中第843位为A、T或G的核苷酸
序列、SEQ ID：NO.2中第1053位为G的核苷酸序列和SEQ ID：NO.2中第1080位为A、T或C的核苷酸序列中的一种或几种。对所述SEQ ID：NO.4所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代而得到的编码蛋白不变的核苷酸序列可以选自SEQ ID：NO.4中第108位为T、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.4中第465位为A、T或G的核苷酸序列、SEQ ID：NO.4中第519位为A、T或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.4中第534位为T的核苷酸序列、SEQ ID：
NO.4中第535位为A的核苷酸序列、SEQ ID：NO.4中第537位为A、T或C的核苷酸序列、
SEQ ID：NO.4中第540位为A、T或G的核苷酸序列、SEQ ID：NO.4中第588位为T、G或C
的核苷酸序列、SEQ ID：NO.4中第618位为A、T或C的核苷酸序列和SEQID：NO.4中第1149位为A、T或G的核苷酸序列的核苷酸序列中的一种或几种。
列、SEQ ID：NO.2中第306位为A、T或胞嘧啶(C)的核苷酸序列、SEQ ID：NO.2中第570位为G的核苷酸序列、SEQ ID：NO.2中第612位为T、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.2中第652位为T的核苷酸序列、SEQ ID：NO.2中第654位为A、T或G的核苷酸序列、SEQ ID：
NO.2中第729位为A、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.2中第843位为A、T或G的核苷酸
序列、SEQ ID：NO.2中第1053位为G的核苷酸序列和SEQ ID：NO.2中第1080位为A、T或C的核苷酸序列中的一种或几种。对所述SEQ ID：NO.4所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代而得到的编码蛋白不变的核苷酸序列可以选自SEQ ID：NO.4中第108位为T、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.4中第465位为A、T或G的核苷酸序列、SEQ ID：NO.4中第519位为A、T或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.4中第534位为T的核苷酸序列、SEQ ID：
NO.4中第535位为A的核苷酸序列、SEQ ID：NO.4中第537位为A、T或C的核苷酸序列、
SEQ ID：NO.4中第540位为A、T或G的核苷酸序列、SEQ ID：NO.4中第588位为T、G或C
的核苷酸序列、SEQ ID：NO.4中第618位为A、T或C的核苷酸序列和SEQID：NO.4中第1149位为A、T或G的核苷酸序列的核苷酸序列中的一种或几种。
[0033] 所述编码感染细胞多肽的立即早期基因中，所述感染细胞多肽更优选为SEQ ID：NO.1所示的氨基酸序列和/或SEQ ID：NO.3所示的氨基酸序列的感染细胞多肽。
[0034] 进一步优选所述核苷酸序列为SEQ ID：NO.2所示的核苷酸序列和/或SEQ ID：NO.4所示的核苷酸序列。更进一步优选所述核苷酸序列为SEQ ID：NO.2所示的核苷酸序列和SEQ ID：NO.4所示的核苷酸序列。
[0035] 更优选所述病毒载体还包括一种编码具有促进病毒侵染宿主细胞功能的氨基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自SEQ ID：NO.6所示的核苷酸序列、SEQ ID：NO.8所示的核苷酸序列、SEQ ID：NO.10所示的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12所示的核苷酸序列、SEQ ID：NO.14所示的核苷酸序列，以及对所述SEQ ID：NO.6、SEQ ID：NO.8、SEQ ID：NO.10、SEQID：NO.12或SEQ ID：NO.14所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代而得到的编码蛋白不变的核苷酸序列中的一种或几种。
[0036] 其中，对所述SEQ ID：NO.6所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代而得到的编码蛋白不变的核苷酸序列可以选自SEQ ID：NO.6中第144位为胞嘧啶(C)的核苷酸序列、SEQ ID：NO.6中第183位为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)的核苷酸序列、SEQ ID：NO.6中第186位为A、G或T的核苷酸序列、SEQ ID：NO.6中第210位为A的核苷酸序列、SEQ ID：NO.6中第219位为G的核苷酸序列、SEQ ID：NO.6中第237位为A、T或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.6中第865位为T的核苷酸序列、SEQ ID：NO.6中第867位为A、T或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.6中第1161位为A、T或G的核苷酸序列、SEQ ID：NO.6中第
1410位为T、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.6中第1513位为A的核苷酸序列、SEQ ID：
NO.6中第1515位为A、T或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.6中第2095位为T、G或C的核苷
酸序列、SEQ ID：NO.6中第2097位为T、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.6中第2196位为T的核苷酸序列、SEQ ID：NO.6中第2530位为T的核苷酸序列、SEQ ID：NO.6中第2532位为A、T或C的核苷酸序列和SEQ ID：NO.6中第2562位为A、T或C的核苷酸序列中的一种
或几种。对所述SEQ ID：NO.8所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代而得到的编码蛋白不变的核苷酸序列可以选自SEQ ID：NO.8中第120位为G、T或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.8中第177位为G的核苷酸序列、SEQ ID：NO.8中第267位为G的核苷酸序列、SEQ ID：NO.8中第597位为T的核苷酸序列、SEQ ID：NO.8中第865位为A的核苷酸序列、SEQ ID：NO.8中第867位为T、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.8中第1059位为A、T或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.8中第1149位为T、G或C的核苷酸序列和SEQ ID：NO.8中第1368位为T、G或C的核苷酸序列的核苷酸序列中的一种或几种。对所述SEQ ID：NO.10所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代而得到的编码蛋白不变的核苷酸序列可以选自SEQ ID：NO.10中第75位为A、T或G的核苷酸序列、SEQ ID：NO.10中第90位为A、T或C的核
苷酸序列、SEQ ID：NO.10中第822位为A、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.10中第870位为G的核苷酸序列、SEQ ID：NO.10中第948位为A、T或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.10中第963位为A或T的核苷酸序列、SEQ ID：NO.10中第1095位为T的核苷酸序列、SEQ ID：
NO.10中第1099位为A的核苷酸序列、SEQ ID：NO.10中第1101位为A、T或G的核苷酸序
列、SEQ ID：NO.10中第1105位为A的核苷酸序列和SEQ ID：NO.10中第1107位为A、T或C的核苷酸序列中的一种或几种。对所述SEQ ID：NO.12所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代而得到的编码蛋白不变的核苷酸序列可以选自SEQ ID：NO.12中第9位为A、T或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第108位为A的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第228位为A或T的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第258位为A的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第261位为A、T或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第270位为C的核苷酸序列、SEQ ID：
NO.12中第327位为A、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第336位为A、T或G的核苷
酸序列、SEQ ID：NO.12中第345位为A、T或G的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第348位为A、T或C的核苷酸序列、SEQID：NO.12中第351位为C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第354位为T的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第390位为A、T或G的核苷酸序列、SEQID：
NO.12中第396位为A、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第430位为A的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第432位为T、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第453位为C的核
苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第459位为A的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第472位为A的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第474位为T、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第486位为G的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第492位为A、T或G的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第501位为A、T或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第624位为A、G或C的核苷酸序列和SEQ ID：NO.12中第708位为A、T或G的核苷酸序列中的一种或几种。对所述SEQ ID：
NO.14所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代而得到的编码蛋白不变的核苷酸序列可以选自SEQ ID：NO.14中第27位为A、T或G的核苷酸序列、SEQ ID：NO.14中第136位
为T的核苷酸序列、SEQ ID：NO.14中第138位为A、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.14中第315位为A、T或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.14中第489位为G的核苷酸序列、SEQ ID：
NO.14中第609位为A、T或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.14中第618位为A、G或C的核苷
酸序列、SEQ ID：NO.14中第643位为A的核苷酸序列、SEQ ID：NO.14中第645位为T、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.14中第728位为T、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.14中第
762位为T或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.14中第784位为T的核苷酸序列、SEQ ID：NO.14中第786位为A、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.14中第954位为A、T或G的核苷酸序
列、SEQ ID：NO.14中第966位为A、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.14中第1320位为A、T或G的核苷酸序列、SEQ ID：NO.14中第1338位为T的核苷酸序列和SEQ ID：NO.14中第
1344位为A的核苷酸序列中的一种或几种。
1410位为T、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.6中第1513位为A的核苷酸序列、SEQ ID：
NO.6中第1515位为A、T或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.6中第2095位为T、G或C的核苷
酸序列、SEQ ID：NO.6中第2097位为T、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.6中第2196位为T的核苷酸序列、SEQ ID：NO.6中第2530位为T的核苷酸序列、SEQ ID：NO.6中第2532位为A、T或C的核苷酸序列和SEQ ID：NO.6中第2562位为A、T或C的核苷酸序列中的一种
或几种。对所述SEQ ID：NO.8所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代而得到的编码蛋白不变的核苷酸序列可以选自SEQ ID：NO.8中第120位为G、T或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.8中第177位为G的核苷酸序列、SEQ ID：NO.8中第267位为G的核苷酸序列、SEQ ID：NO.8中第597位为T的核苷酸序列、SEQ ID：NO.8中第865位为A的核苷酸序列、SEQ ID：NO.8中第867位为T、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.8中第1059位为A、T或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.8中第1149位为T、G或C的核苷酸序列和SEQ ID：NO.8中第1368位为T、G或C的核苷酸序列的核苷酸序列中的一种或几种。对所述SEQ ID：NO.10所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代而得到的编码蛋白不变的核苷酸序列可以选自SEQ ID：NO.10中第75位为A、T或G的核苷酸序列、SEQ ID：NO.10中第90位为A、T或C的核
苷酸序列、SEQ ID：NO.10中第822位为A、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.10中第870位为G的核苷酸序列、SEQ ID：NO.10中第948位为A、T或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.10中第963位为A或T的核苷酸序列、SEQ ID：NO.10中第1095位为T的核苷酸序列、SEQ ID：
NO.10中第1099位为A的核苷酸序列、SEQ ID：NO.10中第1101位为A、T或G的核苷酸序
列、SEQ ID：NO.10中第1105位为A的核苷酸序列和SEQ ID：NO.10中第1107位为A、T或C的核苷酸序列中的一种或几种。对所述SEQ ID：NO.12所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代而得到的编码蛋白不变的核苷酸序列可以选自SEQ ID：NO.12中第9位为A、T或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第108位为A的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第228位为A或T的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第258位为A的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第261位为A、T或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第270位为C的核苷酸序列、SEQ ID：
NO.12中第327位为A、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第336位为A、T或G的核苷
酸序列、SEQ ID：NO.12中第345位为A、T或G的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第348位为A、T或C的核苷酸序列、SEQID：NO.12中第351位为C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第354位为T的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第390位为A、T或G的核苷酸序列、SEQID：
NO.12中第396位为A、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第430位为A的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第432位为T、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第453位为C的核
苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第459位为A的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第472位为A的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第474位为T、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第486位为G的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第492位为A、T或G的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第501位为A、T或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12中第624位为A、G或C的核苷酸序列和SEQ ID：NO.12中第708位为A、T或G的核苷酸序列中的一种或几种。对所述SEQ ID：
NO.14所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代而得到的编码蛋白不变的核苷酸序列可以选自SEQ ID：NO.14中第27位为A、T或G的核苷酸序列、SEQ ID：NO.14中第136位
为T的核苷酸序列、SEQ ID：NO.14中第138位为A、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.14中第315位为A、T或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.14中第489位为G的核苷酸序列、SEQ ID：
NO.14中第609位为A、T或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.14中第618位为A、G或C的核苷
酸序列、SEQ ID：NO.14中第643位为A的核苷酸序列、SEQ ID：NO.14中第645位为T、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.14中第728位为T、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.14中第
762位为T或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.14中第784位为T的核苷酸序列、SEQ ID：NO.14中第786位为A、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.14中第954位为A、T或G的核苷酸序
列、SEQ ID：NO.14中第966位为A、G或C的核苷酸序列、SEQ ID：NO.14中第1320位为A、T或G的核苷酸序列、SEQ ID：NO.14中第1338位为T的核苷酸序列和SEQ ID：NO.14中第
1344位为A的核苷酸序列中的一种或几种。
[0037] 进一步优选所述病毒载体还包括一种编码具有促进病毒载体侵染宿主细胞功能的氨基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自SEQ ID：NO.6所示的核苷酸序列、SEQ ID：NO.8所示的核苷酸序列、SEQ ID：NO.10所示的核苷酸序列、SEQ ID：NO.12所示的核苷酸序列和SEQ ID：NO.14所示的核苷酸序列中的一种或几种。
[0038] 用于制备本发明所述病毒载体的单纯疱疹病毒可以为核苷酸序列与NCBI中ID：NC_001806的I型单纯疱疹病毒17+的核苷酸序列具有99.5％的同源性的单纯疱疹病毒，二者的差别如表1所示。表1中的“变异位置”为ID：NC_001806的I型单纯疱疹病毒17+的全序列核苷酸的碱基编号。
[0039] 表1
[0040]变异 2351 2352-2353 2538 5730 6067 6385 7412 7604 9663 9980 10085
位置
17+ G CT C G G C C C C T G
CL-1 A TG T A 缺失 缺失 A G T C 缺失
位置
17+ G CT C G G C C C C T G
CL-1 A TG T A 缺失 缺失 A G T C 缺失
[0041] 续表1
[0042]591
11 T C
2
4111 A G
32
111 G T
1680
1 G T
32
701 G A
6560
1 C T
80
501 T C
13
401 A C
间
之
0
1101
和
9 G
0101 - 加添
异变 置位 +71 1-LC
11 T C
2
4111 A G
32
111 G T
1680
1 G T
32
701 G A
6560
1 C T
80
501 T C
13
401 A C
间
之
0
1101
和
9 G
0101 - 加添
异变 置位 +71 1-LC
[0043] 续表1
[0044]5603
1 C A
503
21 A G
86
121 G T
2
5911 A G
5491
1 C T
287
11 T G
5
7711-477 GA加
11 -- 添
5
8611
-486 失
11 CG 缺
1
8611
1-08
6111 CC TA
异变 置位 +71 1-LC
1 C A
503
21 A G
86
121 G T
2
5911 A G
5491
1 C T
287
11 T G
5
7711-477 GA加
11 -- 添
5
8611
-486 失
11 CG 缺
1
8611
1-08
6111 CC TA
异变 置位 +71 1-LC
[0045] 续表1
[0046]49
061 T C
809
51 T C
3785
1 G A
9
2251 C G
9
0251 G C
4
3941 C T
02
541 G A
59
931 C T
78
731 A C
3
5331 G A
1333
1 T C
异 置 + 1-
变 位 71 LC
061 T C
809
51 T C
3785
1 G A
9
2251 C G
9
0251 G C
4
3941 C T
02
541 G A
59
931 C T
78
731 A C
3
5331 G A
1333
1 T C
异 置 + 1-
变 位 71 LC
[0047] 续表1
[0048]73
771 C T
766
71 C A
0457
1 C A
2
4471 T C
47
171 T C
50
171 A G
89
071 A G
496
61 T C
244
61 A C
812
61 G T
8
4161 A G
异变 置位 +71 1-LC
771 C T
766
71 C A
0457
1 C A
2
4471 T C
47
171 T C
50
171 A G
89
071 A G
496
61 T C
244
61 A C
812
61 G T
8
4161 A G
异变 置位 +71 1-LC
[0049] 续表1
[0050]84
181 T A
541 失
81 G 缺
631
81 A G
8118
1 C G
4118
1 A G
9
0181 T G
92
971 G T
61
971 T G
748
71 A G
4187
1 T G
577
71 T C
1
异变 置位 -LC +71
181 T A
541 失
81 G 缺
631
81 A G
8118
1 C G
4118
1 A G
9
0181 T G
92
971 G T
61
971 T G
748
71 A G
4187
1 T G
577
71 T C
1
异变 置位 -LC +71
[0051] 续表1
[0052]变异
位置 18284 18458 18515 18580 18646 18722 18850 18852 19081 19253
CL-1 T A A C C A G C C A
17+ G G G A A G C G T G
位置 18284 18458 18515 18580 18646 18722 18850 18852 19081 19253
CL-1 T A A C C A G C C A
17+ G G G A A G C G T G
[0053] 续表1
[0054]变异 20574和
位置 20575之间 20856 20967 21093 21237 21345 21525 22011 22014 22422
CL-1 - T A A C A C G C G
17+ G C G G T G T A A C
位置 20575之间 20856 20967 21093 21237 21345 21525 22011 22014 22422
CL-1 - T A A C A C G C G
17+ G C G G T G T A A C
[0055] 续表1
[0056]变异 22452 22651 22905 23232 23343 23519 23694 23813 23823 23850 23933
位置
CL-1 T G C C T C A C T A A
17+ C A T T C T G T C C T
位置
CL-1 T G C C T C A C T A A
17+ C A T T C T G T C C T
[0057] 续表1
[0058]间
和 之
167 267
42 42 - A
6274
2 A C
0
2742
-917
42 TT CC
9
4542 G T
145
42 A G
4
2542 C A
171
42 T C
9
5142 C T
989
32 C A
7693
2 A C
异 置 1-L +7
变 位 C 1
和 之
167 267
42 42 - A
6274
2 A C
0
2742
-917
42 TT CC
9
4542 G T
145
42 A G
4
2542 C A
171
42 T C
9
5142 C T
989
32 C A
7693
2 A C
异 置 1-L +7
变 位 C 1
[0059] 续表1
[0060]65
272 G A
517
62 C T
943
62 T G
6136
2 G A
9406
2 T C
6
1152 C T
19
942 A G
239
42 A C
59842 C T
4
6842 A G
09
742 C T
异变 置位 1-LC +71
272 G A
517
62 C T
943
62 T G
6136
2 G A
9406
2 T C
6
1152 C T
19
942 A G
239
42 A C
59842 C T
4
6842 A G
09
742 C T
异变 置位 1-LC +71
[0061] 续表1
[0062]变异 27343 27346 27811 27911 28015 28132 28217 28336 28387 28401 28938
位置
CL-1 A A A G G A T C T T A
17+ G C G A A G C A G C C
位置
CL-1 A A A G G A T C T T A
17+ G C G A A G C A G C C
[0063] 续表1
[0064]27
213 T G
991
13 G A
888 失
03 T 缺
6580
3 G T
8230
3 A G
4
2892 A G
12
592 T C
64
492 C T
763
92 A C
3029
2 G T
521
92 A C
1
异变 置位 -LC +71
213 T G
991
13 G A
888 失
03 T 缺
6580
3 G T
8230
3 A G
4
2892 A G
12
592 T C
64
492 C T
763
92 A C
3029
2 G T
521
92 A C
1
异变 置位 -LC +71
[0065] 续表1
[0066]变异
位置 31315 31397 31942 31994 32147 32460 32477 32508 32534 32554 32624
CL-1 T A G A G C T A T A G
17+ G C A C T A C G G G T
位置 31315 31397 31942 31994 32147 32460 32477 32508 32534 32554 32624
CL-1 T A G A G C T A T A G
17+ G C A C T A C G G G T
[0067] 续表1
[0068]变异 32663 32666 32738 33145 33230 33437和 33453 33469 33634 33816
位置 33438之间
CL-1 A G C T A - A A C C
17+ C T T C C C C 缺失 T A
位置 33438之间
CL-1 A G C T A - A A C C
17+ C T T C C C C 缺失 T A
[0069] 续表1
[0070]变异 33865 33999 34215 34296 34416 34449 34596 34650 34683 34725 34797
位置
CL-1 C A T A C G C G G C C
17+ A C C G A C T A T T T
位置
CL-1 C A T A C G C G G C C
17+ A C C G A C T A T T T
[0071] 续表1
[0072]变异 34811 34863 34880和 35068和
位置 34881之间 34916 35018 35047 35076 35238 35267
35069之间
CL-1 A C -- A G G - A G C
17+ C T GG G A T C C A T
位置 34881之间 34916 35018 35047 35076 35238 35267
35069之间
CL-1 A C -- A G G - A G C
17+ C T GG G A T C C A T
[0073] 续表1
[0074]变异 35331 35463 36121 36129 36222 36228 36253 36266 36336 36494 36613
位置
CL-1 G G A A T C A C G G T
17+ T A G G G A G T 缺失 A C
位置
CL-1 G G A A T C A C G G T
17+ T A G G G A G T 缺失 A C
[0075] 续表1
[0076]96
004 T C
276
83 T G
615
83 T G
093
83 T C
21
383 G A
13
283 T C
52
283 C T
141
83 G A
0827
3 A G
6
3273 C G
5
1173 T G
异变 置位 1-LC +71
004 T C
276
83 T G
615
83 T G
093
83 T C
21
383 G A
13
283 T C
52
283 C T
141
83 G A
0827
3 A G
6
3273 C G
5
1173 T G
异变 置位 1-LC +71
[0077] 续表1
[0078]8
7924 A C
7762
4 G A
9422
4 G C
4502
4 C T
5881
4 G A
2861
4 A G
5
2414 A G
1041
4 T C
76
904 T G
249
04 T C
919
04 A G
1
异变 置位 -LC +71
7924 A C
7762
4 G A
9422
4 G C
4502
4 C T
5881
4 G A
2861
4 A G
5
2414 A G
1041
4 T C
76
904 T G
249
04 T C
919
04 A G
1
异变 置位 -LC +71
[0079] 续表1
[0080]变异 43402 43678 43697 43705 43744 43744和 43752 43857 44289 44478
位置 43745之间
CL-1 A C G C A - A C C G
17+ G A A T G GG G A T A
位置 43745之间
CL-1 A C G C A - A C C G
17+ G A A T G GG G A T A
[0081] 续表1
[0082]变异
位置 44781 45043 45123 46023 46049 46649 46828 46864 47004 47080 47235
CL-1 C A G A A C G G T G A
17+ A G A G G T A A C A G
位置 44781 45043 45123 46023 46049 46649 46828 46864 47004 47080 47235
CL-1 C A G A A C G G T G A
17+ A G A G G T A A C A G
[0083] 续表1
[0084]变异 47251 47526 47626 47729 47738 47904 48303 48304 48402 48406 48445
位置
CL-1 T G A C A G G A A C G
17+ C A G T G A T G C T A
位置
CL-1 T G A C A G G A A C G
17+ C A G T G A T G C T A
[0085] 续表1
[0086]89
594 T G
555
94 T C
22594 A C
75
494 T G
444
94 C A
4149
4 G T
0
7984 G A
5
8784 G T
间
和 之
917 027
84 84 - C
6
0784 T C
1
0784 T G
异变 置位 1-LC +71
594 T G
555
94 T C
22594 A C
75
494 T G
444
94 C A
4149
4 G T
0
7984 G A
5
8784 G T
间
和 之
917 027
84 84 - C
6
0784 T C
1
0784 T G
异变 置位 1-LC +71
[0087] 续表1
[0088]22
825-
1252 T 失
5 T 缺
815
25 A G
62
325 G A
1
8225 A G
7931
5 A C
47 TTTT
705- TTTT
2670 TTTT 失
5 T 缺
885
05 G A
35
305 C T
9189
4 C T
异变 置位 1-LC +71
825-
1252 T 失
5 T 缺
815
25 A G
62
325 G A
1
8225 A G
7931
5 A C
47 TTTT
705- TTTT
2670 TTTT 失
5 T 缺
885
05 G A
35
305 C T
9189
4 C T
异变 置位 1-LC +71
[0089] 续表1
[0090]01
035-
9003 A 失
5 C 缺
589
25 T C
7792
5-67
925 TA 失缺
0
6925 G A
519
25 A G
间
和 之
798 898
25 25 -- GG
988
25 T G
07
825 T C
3382
5 G C
异变 置位 1-LC +71
035-
9003 A 失
5 C 缺
589
25 T C
7792
5-67
925 TA 失缺
0
6925 G A
519
25 A G
间
和 之
798 898
25 25 -- GG
988
25 T G
07
825 T C
3382
5 G C
异变 置位 1-LC +71
[0091] 续表1
[0092]79
345 T G
492
45 G T
01735 T C
11
635 G A
772
35 T G
5423
5 C A
1
9035 G A
76
035 A G
640
35 G A
43
035-
3303 A 失
5 A 缺
9203
5 A C
异 置 1-L +7
变 位 C 1
345 T G
492
45 G T
01735 T C
11
635 G A
772
35 T G
5423
5 C A
1
9035 G A
76
035 A G
640
35 G A
43
035-
3303 A 失
5 A 缺
9203
5 A C
异 置 1-L +7
变 位 C 1
[0093] 续表1
[0094]变异 54646 54942 55571 55589 55598 55623 55626 55663 55895 56027 56684
位置
CL-1 G G G T C C G A G T T
17+ A A T C T G C G T C C
位置
CL-1 G G G T C C G A G T T
17+ A A T C T G C G T C C
[0095] 续表1
[0096]变异 57074 58332 58952 59105 59279 59324 59528 60005 60023 60071 60389
位置
CL-1 A T C T C G A G A T T
17+ G C T C A A G A G C C
位置
CL-1 A T C T C G A G A T T
17+ G C T C A A G A G C C
[0097] 续表1
[0098]变异
位置 60396 60428 60497 60563 60569 60642 60806 60890 60999 61023 61061
CL-1 A A G C G C T A T C G
17+ G G T T A G C G G A A
位置 60396 60428 60497 60563 60569 60642 60806 60890 60999 61023 61061
CL-1 A A G C G C T A T C G
17+ G G T T A G C G G A A
[0099] 续表1
[0100]2702
6-17
026 CC TT
949
16 C T
63916 C A
5
0816 T G
12
716 G A
5741
6 A G
4
9316 A G
88
316 A G
502
16 A G
5711
6 A G
0511
6 G C
异 置 1-L +7
变 位 C 1
6-17
026 CC TT
949
16 C T
63916 C A
5
0816 T G
12
716 G A
5741
6 A G
4
9316 A G
88
316 A G
502
16 A G
5711
6 A G
0511
6 G C
异 置 1-L +7
变 位 C 1
[0101] 续表1
[0102]间
和 之
3522 4522
6 6 - C
间
和 之
8 9
3226 3226 -- CC
0
2226 A C
191
26 G T
78
126 A 失缺
4
7126 A C
76
126-
3612 GGGG 失
6 G 缺
621
26 G A
8802
6 A G
异变 置位 1-LC +71
和 之
3522 4522
6 6 - C
间
和 之
8 9
3226 3226 -- CC
0
2226 A C
191
26 G T
78
126 A 失缺
4
7126 A C
76
126-
3612 GGGG 失
6 G 缺
621
26 G A
8802
6 A G
异变 置位 1-LC +71
[0103] 续表1
[0104]变异 62271 62276 62329 62342 62759 62784 62786 62788 62793 63273 63459
位置
CL-1 A G C A G C C C C T T
17+ G 缺失 T G T A A T 缺失 C C
位置
CL-1 A G C A G C C C C T T
17+ G 缺失 T G T A A T 缺失 C C
[0105] 续表1
[0106]变异
位置 63654 63811 63812 64897 65493 65536 65537 65772 65808 65835 66445
CL-1 C C G C A A C A A A G
17+ T G C A C G T C G C A
位置 63654 63811 63812 64897 65493 65536 65537 65772 65808 65835 66445
CL-1 C C G C A A C A A A G
17+ T G C A C G T C G C A
[0107] 续表1
[0108]变异 73198 73761 80715 80827 80839 80857 80890 80942 81165 81216 81408
位置
CL-1 G G G T A T G C T A A
17+ T A T C G C A A C G G
位置
CL-1 G G G T A T G C T A A
17+ T A T C G C A A C G G
[0109] 续表1
[0110]变异 81417 81716 81834 81870 82065 82101 82215 82575 82694 82695 82766
位置
CL-1 A T G A A G A C G A C
17+ G C T G G A G T A C T
位置
CL-1 A T G A A G A C G A C
17+ G C T G G A G T A C T
[0111] 续表1
[0112]变异 84505和
位置 83172 83175 83643 83856 83857 84535 84611 84629 84685
84506之间
CL-1 C T C T G ---- T C G T
17+ G C A G T CTCCC G A A G
位置 83172 83175 83643 83856 83857 84535 84611 84629 84685
84506之间
CL-1 C T C T G ---- T C G T
17+ G C A G T CTCCC G A A G
[0113] 续表1
[0114]9646
8 C A
间
和 之
4 5
3368 3368 - C
652
68 T C
4416
8 C T
8
1068 A G
24
958 A C
298
58 C T
90458 G A
04
358 T C
190
58 C A
029
48 C T
异变 置位 1-LC +71
8 C A
间
和 之
4 5
3368 3368 - C
652
68 T C
4416
8 C T
8
1068 A G
24
958 A C
298
58 C T
90458 G A
04
358 T C
190
58 C A
029
48 C T
异变 置位 1-LC +71
[0115] 续表1
[0116]变异
位置 86573 86663 86703 86817 86883 86884 86943 86997 87060 87353 87538
CL-1 G G A T A G C C C T T
17+ A A C G C A T A G C G
位置 86573 86663 86703 86817 86883 86884 86943 86997 87060 87353 87538
CL-1 G G A T A G C C C T T
17+ A A C G C A T A G C G
[0117] 续表1
[0118]变异
位置 87548 87705 87732 87816 87975 88146 88881 89852 89923 89930 89980
CL-1 A A T C C A T C G C A
17+ C G C T T G C T T T T
位置 87548 87705 87732 87816 87975 88146 88881 89852 89923 89930 89980
CL-1 A A T C C A T C G C A
17+ C G C T T G C T T T T
[0119] 续表1
[0120]变异
位置 89986 89997 90353 90392 90432 90455 90479 90626 90961 91107 91179
CL-1 G C T C C T C T G A T
17+ A A C T T C T C T C C
位置 89986 89997 90353 90392 90432 90455 90479 90626 90961 91107 91179
CL-1 G C T C C T C T G A T
17+ A A C T T C T C T C C
[0121] 续表1
[0122]变异 91244 91495 91498 92657 92964 93140 93141 93783 94133 94158 94253
位置
CL-1 G C C G A C A A T A C
17+ A G T A G G C C C G T
位置
CL-1 G C C G A C A A T A C
17+ A G T A G G C C C G T
[0123] 续表1
[0124]09
159 T C
177 失
49 C 缺
467
49 C T
9074 失
9 T 缺
3964
9 G A
6
3649 G 失缺
50
649 A G
633
49 T G
6924
9 A C
7
5249 C T
5524
9 T C
异 置 1-L +7
变 位 C 1
159 T C
177 失
49 C 缺
467
49 C T
9074 失
9 T 缺
3964
9 G A
6
3649 G 失缺
50
649 A G
633
49 T G
6924
9 A C
7
5249 C T
5524
9 T C
异 置 1-L +7
变 位 C 1
[0125] 续表1
[0126]31
559 A T
384
59 A G
374
59 G C
9545
9 T C
8545
9 G A
1
5459 C T
72
459 G T
814
59 C T
5635
9 T C
5
2359 T C
6915
9 G A
异 置 1-L +7
变 位 C 1
559 A T
384
59 A G
374
59 G C
9545
9 T C
8545
9 G A
1
5459 C T
72
459 G T
814
59 C T
5635
9 T C
5
2359 T C
6915
9 G A
异 置 1-L +7
变 位 C 1
[0127] 续表1
[0128]变异 95514 95646 96020 96178和 96190 96261 96264 96444 96501 96589
位置 96179之间
CL-1 C C C -- C T G A A C
17+ T T T GC T 缺失 缺失 G G 缺失
位置 96179之间
CL-1 C C C -- C T G A A C
17+ T T T GC T 缺失 缺失 G G 缺失
[0129] 续表1
[0130]变异 96919 97191 97381 97471-97473 97690 97865 97893 97903 97910和
位置 97911之间
CL-1 G A C GCA G G G T -
17+ A C T CAT A A T G C
位置 97911之间
CL-1 G A C GCA G G G T -
17+ A C T CAT A A T G C
[0131] 续表1
[0132]变异 97984 98639 99122 99218和 99347 99427 99460 99511 99522-99524
位置 99219之间
CL-1 C C G --- A C C G GGC
17+ A T C TCG C T T T 缺失
位置 99219之间
CL-1 C C G --- A C C G GGC
17+ A T C TCG C T T T 缺失
[0133] 续表1
[0134]222
101 A G
006
001 C A
7120
01 T C
2999
9 C G
1
4999 A G
53
799 C T
64
699 C T
246
99 A G
0469
9 G T
0559
9 T G
异 置 1-L +7
变 位 C 1
101 A G
006
001 C A
7120
01 T C
2999
9 C G
1
4999 A G
53
799 C T
64
699 C T
246
99 A G
0469
9 G T
0559
9 T G
异 置 1-L +7
变 位 C 1
[0135] 续表1
[0136]022
301 A G
118
201 C T
6462
01 T G
0
9220
1 T C
0
1220
1 T C
59
1201 C A
771
201 A C
450
201 A G
8321
01 C A
异 置 1- +
变 位 LC 71
301 A G
118
201 C T
6462
01 T G
0
9220
1 T C
0
1220
1 T C
59
1201 C A
771
201 A C
450
201 A G
8321
01 C A
异 置 1- +
变 位 LC 71
[0137] 续表1
[0138]028
401 A G
677
401 G T
4274
01 C T
3
8640
1 C A
8
1440
1 G A
23
7301 A C
275
301 G T
235
301 T 失缺
间
和 之
372 472
301 301 - A
1
异变 置位 -LC +71
401 A G
677
401 G T
4274
01 C T
3
8640
1 C A
8
1440
1 G A
23
7301 A C
275
301 G T
235
301 T 失缺
间
和 之
372 472
301 301 - A
1
异变 置位 -LC +71
[0139] 续表1
[0140]变异 104832 104938 104989 105057 105194 105203 105293 105411 105502 106256
位置
CL-1 A C A C A T C A T G
17+ G T G T 缺失 C A C 缺失 T
位置
CL-1 A C A C A T C A T G
17+ G T G T 缺失 C A C 缺失 T
[0141] 续表1
[0142]042
701 A C
015
701 C A
6827
01 A C
8
7270
1 T G
35
2701 T C
181
701 C T
520
701 C G
7296
01 T C
9
5860
1 C T
36
2601 C A
异 置 1-L +7
变 位 C 1
701 A C
015
701 C A
6827
01 A C
8
7270
1 T G
35
2701 T C
181
701 C T
520
701 C G
7296
01 T C
9
5860
1 C T
36
2601 C A
异 置 1-L +7
变 位 C 1
[0143] 续表1
[0144]905
801 G C
994
801 G T
4628
01 G A
2
1280
1 C A
78
1801 T G
251
801 G T
641
801 T C
6218
01 C T
8
8970
1 T C
45
5701 C A
异 置 1-L +7
变 位 C 1
801 G C
994
801 G T
4628
01 G A
2
1280
1 C A
78
1801 T G
251
801 G T
641
801 T C
6218
01 C T
8
8970
1 T C
45
5701 C A
异 置 1-L +7
变 位 C 1
[0145] 续表1
[0146]365
011 C T
425
011 T C
8210
11 T C
7
2990
1 C T
80
9901 A G
507
901 G T
596
901 C T
9098
01 A G
4
5780
1 G A
78
5801 G A
异 置 1-L +7
变 位 C 1
011 C T
425
011 T C
8210
11 T C
7
2990
1 C T
80
9901 A G
507
901 G T
596
901 C T
9098
01 A G
4
5780
1 G A
78
5801 G A
异 置 1-L +7
变 位 C 1
[0147] 续表1
[0148]932
311 G T
522
311 A G
8792
11 A C
7
3211 失
1 G 缺
4
4801
1-24
8011 AAA GGG
1160
11 G A
60
6011 A C
4060
11 A G
99
5011 A G
异变 置位 1-LC +71
311 G T
522
311 A G
8792
11 A C
7
3211 失
1 G 缺
4
4801
1-24
8011 AAA GGG
1160
11 G A
60
6011 A C
4060
11 A G
99
5011 A G
异变 置位 1-LC +71
[0149] 续表1
[0150]482
411 C G
282
411 A C
8624
11 G T
4
1241
1 C T
6
5831
1 C A
47
4311 T C
344
311 T G
823
311 T C
间
和 之
672 772
311 311 - G
1
异变 置位 -LC +71
411 C G
282
411 A C
8624
11 G T
4
1241
1 C T
6
5831
1 C A
47
4311 T C
344
311 T G
823
311 T C
间
和 之
672 772
311 311 - G
1
异变 置位 -LC +71
[0151] 续表1
[0152]922
331 A C
369
231 A G
957
231 G T
7798
11 G T
3
9451
1 A G
6
9841
1 G A
66
3411 C A
733
411 A C
9824
11 C G
8824
11 G C
异 置 1- +
变 位 LC 71
331 A C
369
231 A G
957
231 G T
7798
11 G T
3
9451
1 A G
6
9841
1 G A
66
3411 C A
733
411 A C
9824
11 C G
8824
11 G C
异 置 1- +
变 位 LC 71
[0153] 续表1
[0154]359
331 A C
349
331 T C
9373
31 G A
1
1733
1 A G
1
0533
1 G A
间
和 之
0 1
1433 1433
1 1 - C
783
331 C T
2
1333 失
1 T 缺
172
331 A 失缺
1
异变 置位 -LC +71
331 A C
349
331 T C
9373
31 G A
1
1733
1 A G
1
0533
1 G A
间
和 之
0 1
1433 1433
1 1 - C
783
331 C T
2
1333 失
1 T 缺
172
331 A 失缺
1
异变 置位 -LC +71
[0155] 续表1
[0156]852
531 T 失缺
232
531 A G
5515
31 A G
2
3153
1 T G
8
1443
1 T C
114
431 T G
7
7043
1 C -
270
431 C A
间
和 之
1 2
4043 4043
1 1 - G
异 置 1-L +7
变 位 C 1
531 T 失缺
232
531 A G
5515
31 A G
2
3153
1 T G
8
1443
1 T C
114
431 T G
7
7043
1 C -
270
431 C A
间
和 之
1 2
4043 4043
1 1 - G
异 置 1-L +7
变 位 C 1
[0157] 续表1
[0158]396
631 G T
123
631 C G
6606
31 G A
8
5953
1 C G
8
6853
1 C T
29
3531 C A
3835
31 A C
70
3531 A G
间
和 之
9 0
7253 8253
1 1 - G
异变 置位 1-LC +71
631 G T
123
631 C G
6606
31 G A
8
5953
1 C G
8
6853
1 C T
29
3531 C A
3835
31 A C
70
3531 A G
间
和 之
9 0
7253 8253
1 1 - G
异变 置位 1-LC +71
[0159] 续表1
[0160]5907
31 G T
88
0731 T C
13
0731 T C
02
0731
-810
731 GGA 失缺
9
8963
1 C T
968
631 G A
9676
31 C A
63
7631 C T
5076 失
31 C 缺
异 置 1- +
变 位 LC 71
31 G T
88
0731 T C
13
0731 T C
02
0731
-810
731 GGA 失缺
9
8963
1 C T
968
631 G A
9676
31 C A
63
7631 C T
5076 失
31 C 缺
异 置 1- +
变 位 LC 71
[0161] 续表1
[0162]532
731 A C
912
731 A G
3127
31 G T
3
9173
1 A C
65
1731 G A
941
731 C T
411
731 A T
2117
31 T C
8
0173
1 G A
60
1731 C T
异 置 1-L +7
变 位 C 1
731 A C
912
731 A G
3127
31 G T
3
9173
1 A C
65
1731 G A
941
731 C T
411
731 A T
2117
31 T C
8
0173
1 G A
60
1731 C T
异 置 1-L +7
变 位 C 1
[0163] 续表1
[0164]变异 137246 137251 137262 137384 137467 137495和 137498 137512 137516
位置 137496之间
CL-1 A C G T C - T C T
17+ G A A G T G G T G
位置 137496之间
CL-1 A C G T C - T C T
17+ G A A G T G G T G
[0165] 续表1
[0166]259
731 G A
528
731 T G
3677
31 T C
4
6673
1 G A
01
6731 G 失缺
506
731 T C
685
731 G A
8557
31 G A
2
4573
1 G T
93
5731 C T
异 置 1-L +7
变 位 C 1
731 G A
528
731 T G
3677
31 T C
4
6673
1 G A
01
6731 G 失缺
506
731 T C
685
731 G A
8557
31 G A
2
4573
1 G T
93
5731 C T
异 置 1-L +7
变 位 C 1
[0167] 续表1
[0168]64
5931
-545
931 GG AA
935
931 G A
3
3593
1 A G
204
931 C A
7
8393
1 G A
903
931 A G
1629
31 T G
82
5831 C T
2158
31 G A
异 置 1- +
变 位 LC 71
5931
-545
931 GG AA
935
931 G A
3
3593
1 A G
204
931 C A
7
8393
1 G A
903
931 A G
1629
31 T G
82
5831 C T
2158
31 G A
异 置 1- +
变 位 LC 71
[0169] 续表1
[0170]4120
41 G A
70
2041 G A
571
041 G C
2
7004
1 G A
120
041 T G
间
和 之
387 487
931 931 - T
3
8793
1 C T
717
931 C T
间
和 之
436 536
931 931 - C
1
异变 置位 -LC +71
41 G A
70
2041 G A
571
041 G C
2
7004
1 G A
120
041 T G
间
和 之
387 487
931 931 - T
3
8793
1 C T
717
931 C T
间
和 之
436 536
931 931 - C
1
异变 置位 -LC +71
[0171] 续表1
[0172]764
041 T C
564
041 C T
4640
41 G A
3
4404
1 G A
02
4041 C A
833
041 C T
803
041 A G
5620
41 A G
9
5204
1 G T
02
2041 T G
异 置 1-L +7
变 位 C 1
041 T C
564
041 C T
4640
41 G A
3
4404
1 G A
02
4041 C A
833
041 C T
803
041 A G
5620
41 A G
9
5204
1 G T
02
2041 T G
异 置 1-L +7
变 位 C 1
[0173] 续表1
[0174]749
041 T C
429
041 T C
4090
41 G T
8
4704
1 A G
42
7041 C T
256
041 T C
445
041 C T
9250
41 C T
2
7404
1 C T
07
4041 A G
异 置 1-L +7
变 位 C 1
041 T C
429
041 T C
4090
41 G T
8
4704
1 A G
42
7041 C T
256
041 T C
445
041 C T
9250
41 C T
2
7404
1 C T
07
4041 A G
异 置 1-L +7
变 位 C 1
[0175] 续表1
[0176]0061
41 C G
4
9114
1 A C
391
141 G C
0901
41-7
8014 CCC 失
1 C 缺
180
141-
970141 CCT 失缺
1
2014
1 A C
799
041 G A
8
7904
1 G T
异变 置位 1-LC +71
41 C G
4
9114
1 A C
391
141 G C
0901
41-7
8014 CCC 失
1 C 缺
180
141-
970141 CCT 失缺
1
2014
1 A C
799
041 G A
8
7904
1 G T
异变 置位 1-LC +71
[0177] 续表1
[0178]285
341 C T
015
341 G T
2543 失
41 T 缺
8
9234
1 T A
98
1341 T C
450
341 A G
465
241 G A
9512
41 T C
7
4124
1 A C
73
0241 G T
异 置 1-L +7
变 位 C 1
341 C T
015
341 G T
2543 失
41 T 缺
8
9234
1 T A
98
1341 T C
450
341 A G
465
241 G A
9512
41 T C
7
4124
1 A C
73
0241 G T
异 置 1-L +7
变 位 C 1
[0179] 续表1
[0180]CCCT
GCCA
230 CCCG
441- GGTA
1104 GAGG 失
41 GT 缺
9
0044
1 C G
50
0441 T A
99
9341 C 失缺
929
341 C T
4563
41-3
5634 T 失
1 C 缺
异 置 1- +
变 位 LC 71
GCCA
230 CCCG
441- GGTA
1104 GAGG 失
41 GT 缺
9
0044
1 C G
50
0441 T A
99
9341 C 失缺
929
341 C T
4563
41-3
5634 T 失
1 C 缺
异 置 1- +
变 位 LC 71
[0181] 续表1
[0182]变异 144047 144085 144184 144276 144278 152311之后
位置
CL-1 G G G A A ---
17+ 缺失 A A G T GGC
位置
CL-1 G G G A A ---
17+ 缺失 A A G T GGC
[0183] 本发明单纯疱疹病毒载体不仅在侵染黄色人种宿主细胞的能力方面增强，而且用于其他人种多发肿瘤细胞时，对肿瘤细胞的溶解能力更强。
[0184] 本发明还提供了一种重组病毒，所述重组病毒包括病毒载体和目的基因，其中，所述病毒载体为本发明的单纯疱疹病毒载体。本发明的单纯疱疹病毒载体不仅可以单独作用裂解杀伤肿瘤细胞，而且还可以通过传递目的基因和/或裂解杀伤肿瘤细胞。本发明的单纯疱疹病毒载体可以携带0.1-50kb的目的基因，优选携带10-40kb的目的基因。所述目的基因可以为抗肿瘤活性的基因，例如编码前体药物激活蛋白的基因、编码肿瘤抑制蛋白的基因、编码细胞凋亡因子(pro-apoptotic factors)前体的基因和编码免疫刺激蛋白的基因中的一种或几种。所述免疫刺激蛋白可以为自身具有细胞毒性的蛋白、能够刺激/增强抗肿瘤免疫应答的蛋白。当然本发明的病毒载体也可以用来将一种或几种目的基因传递至需要其表达的细胞内，该细胞可以是非肿瘤细胞例如神经细胞，所述一种或几种目的基因可以为编码改变对疼痛刺激应答或缓解慢性疼痛的多肽的基因，所述多肽例如能够隔绝例如神经生长因子、其它疼痛调节神经营养因子、神经营养因子样分子的蛋白，物质P以及其它神经肽。所述一种或几种目的基因也可以为编码能够刺激变性性疾病中损伤神经再生长或防止神经进一步变性的多肽的基因。
[0185] 所述目的基因还可以包括调控序列，例如所述一种或几种目的基因表达的启动子、终止子和增强子。所述目的基因也可以包括标记基因(例如，编码β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白或其它荧光蛋白的基因)或其产物调节其它基因表达的基因。
[0186] 所述目的基因除可以是DNA外，还可以是mRNA、tRNA或rRNA，还可以包括通常与转录序列相关的相关转录调控序列，例如转录终止信号、聚腺苷酸化位点和下游增强子元件。
[0187] 本发明还提供了一种感染有病毒的宿主细胞，其中，所述病毒为本发明的单纯疱疹病毒载体和/或重组病毒。单纯疱疹病毒载体可以定义为缺失编码感染细胞多肽34.5的基因、编码感染细胞多肽6的基因和编码感染细胞多肽47的基因中的一个或几个基因的单纯疱疹病毒，与正常单纯疱疹病毒一样，也需要在宿主细胞内完成其生活史，因此所述病毒载体和重组病毒的传代增殖以及活化需要在宿主细胞中进行。而在体外感染有本发明单纯疱疹病毒载体和/或重组病毒的宿主细胞，也可以作为基因治疗的药物导入体内。所述宿主细胞可以是各种能够培养本发明病毒载体和/或重组病毒的宿主细胞，例如非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、原代兔肾细胞、鸡胚细胞、羊膜细胞、人宫颈癌细胞(Hela细胞)以及人胚肺二倍体成纤维细胞(WI-38细胞)。
[0188] 本发明还提供了一种药物组合物，其中，所述药物组合物包括本发明的单纯疱疹病毒载体和/或重组病毒。本发明的单纯疱疹病毒载体可以单独使用裂解杀伤肿瘤细胞；还可以携带目的基因制备重组病毒，所述重组病毒单独使用通过传递目的基因和/或裂解杀伤肿瘤细胞。本发明的单纯疱疹病毒载体和本发明的重组病毒也可以同时使用。本发明的单纯疱疹病毒载体、本发明的重组病毒以及它们的混合物都还可以包括药物可接受的载体或赋形剂，以药物组合物的形式使用。
[0189] 所述药物可接受的载体或赋形剂指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、包囊材料或其他制剂辅料，例如，包括但不限于盐水、缓冲盐液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其混合物。所述药物组合物适于胃肠外、舌下、脑池内、阴道内、直肠内、颊内、肿瘤内或表皮给药。
[0190] 胃肠外给药包括静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下、关节内注射和输注。适于胃肠外给药的药物组合物包括无菌水溶液或非水溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于在临使用前在无菌可注射溶液或分散液中配制的粉末。适宜的水性或非水性载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、甘油、内二醇、聚乙二醇、羧甲基纤维素、植物油和可注射的有机酯如油酸乙酯。这些组合物还可以含有防腐剂、润湿剂、乳化剂、保护剂和分散剂佐剂，例如肌醇、山梨醇和蔗糖。优选加入等渗剂如糖类、氯化钠、氯化钾。
[0191] 表皮给药包括在皮肤、黏膜上以及在肺和眼表面给药。这样的药物组合物包括粉剂、软膏、滴剂、透皮贴剂、离子电渗疗法装置以及吸入剂等。直肠或阴道给药的组合物优选为栓剂，它可以通过将本发明的载体与适宜的非刺激性赋形剂或载体如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合制备，所述赋形剂或载体在室温为固态，在体温下为液态，因此在直肠或阴道腔内熔化并释放出活性化合物。
[0192] 优选所述药物组合物为注射液，所述注射液包括药学上可接受的载体和本发明提2 10
供的单纯疱疹病毒载体和/或重组病毒，每毫升所述注射液中含有10-10 空斑形成数的所述病毒载体和/或重组病毒。所述药学上可接受的载体可以为pH值为4.0-9.0的磷酸
缓冲液。所述注射液还含有保护剂和/或渗透压调节剂；以所述注射液为基准，所述保护剂的含量为0.01-30重量％，所述保护剂选自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一种或几种；所述渗透压调节剂的含量使所述注射液的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克，所述渗透压调节剂为
3 10
氯化钠和/或氯化钾。使用所述注射液进行时，给予的病毒量范围为10-10 空斑形成数
5 8 6 8
(pfu)、优选10-10pfu、更优选10-10pfu。当注射本发明所述药用组合物时，注射用量可以为本领域常用的剂量，至多500微升、一般1-200微升、优选1-10微升；但是根据所述肿瘤和接种部位，也可以使用至多10毫升的剂量。因为本领域技术人员能够容易地确定最佳给药途径和剂量，所以所述给药途径和剂量仅作为参考。所述剂量可以根据各种参数、尤其根据待治疗患者的年龄、体重和病症、疾病或病症的严重程度以及给药途径来确定。此外，对于癌症患者优选的给药途径是直接注射到肿瘤内。本发明所述药物组合物注射液也可以系统给药，也可以将本发明的药物组合物注射液注射到为肿瘤供血的血管内给药。最优选给药途径取决于所述肿瘤的位置和大小。
供的单纯疱疹病毒载体和/或重组病毒，每毫升所述注射液中含有10-10 空斑形成数的所述病毒载体和/或重组病毒。所述药学上可接受的载体可以为pH值为4.0-9.0的磷酸
缓冲液。所述注射液还含有保护剂和/或渗透压调节剂；以所述注射液为基准，所述保护剂的含量为0.01-30重量％，所述保护剂选自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一种或几种；所述渗透压调节剂的含量使所述注射液的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克，所述渗透压调节剂为
3 10
氯化钠和/或氯化钾。使用所述注射液进行时，给予的病毒量范围为10-10 空斑形成数
5 8 6 8
(pfu)、优选10-10pfu、更优选10-10pfu。当注射本发明所述药用组合物时，注射用量可以为本领域常用的剂量，至多500微升、一般1-200微升、优选1-10微升；但是根据所述肿瘤和接种部位，也可以使用至多10毫升的剂量。因为本领域技术人员能够容易地确定最佳给药途径和剂量，所以所述给药途径和剂量仅作为参考。所述剂量可以根据各种参数、尤其根据待治疗患者的年龄、体重和病症、疾病或病症的严重程度以及给药途径来确定。此外，对于癌症患者优选的给药途径是直接注射到肿瘤内。本发明所述药物组合物注射液也可以系统给药，也可以将本发明的药物组合物注射液注射到为肿瘤供血的血管内给药。最优选给药途径取决于所述肿瘤的位置和大小。
[0193] 下面结合实施例进一步说明本发明，除非特别说明本发明所用到的试剂、培养基均为市售商品。
[0194] 实施例1
[0195] 本实施例说明本发明单纯疱疹病毒的所述病毒载体的分离制备。
[0196] (1)病毒的采集
[0197] 成年中国男性，37岁，汉族，多次口角疱疹反复发作病史，无其他疾病，呈典型I型单纯疱疹病毒复发感染临床表现——口角周围出现疱疹样水泡两天后取样。
[0198] 取15毫升的无菌离心管，盛有3毫升无菌的含100微克/毫升卡那霉素的磷酸盐缓冲液(PBS)，所述缓冲液中含有9克/升的NaCl、0.21克/升的KH2PO4以及0.97克/升的Na2HPO4.12H2O；用无菌棉签挤压疱疹样水疱至淡黄色分泌物流出，然后用棉签蘸取该分泌物，将所得棉签带有分泌物的一端在上述PBS缓冲液中涮洗10秒钟。取出棉签，用灭菌微量加样器将所得含有分泌物的缓冲液吹吸均匀。
[0199] (2)病毒的接种、培养和纯化
[0200] 用含10％胎牛血清的DMEM培养基，在六孔细胞培养板上以5×105个细胞/孔的密度接种非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)(美国ATCC)，37℃下在5％CO2培养箱中培养24小
时，至每孔Vero细胞长满80％。然后在无菌环境下，向上述六孔细胞培养板的每孔中加入
200微升的(1)得到含有分泌物的PBS缓冲液(采样后1小时完成接种)。继续在5％CO2
培养箱中37℃下培养24小时后，在无菌环境下，在光学显微镜下以100倍的放大倍数观察Vero细胞，发现病毒噬斑；用灭菌微量加样器吸取单个的病毒噬斑10微升，将10微升吸取的液体混入100微升的DMEM培养基中，并用微量加样器将所得含有病毒的DMEM培养基吹吸均匀。
时，至每孔Vero细胞长满80％。然后在无菌环境下，向上述六孔细胞培养板的每孔中加入
200微升的(1)得到含有分泌物的PBS缓冲液(采样后1小时完成接种)。继续在5％CO2
培养箱中37℃下培养24小时后，在无菌环境下，在光学显微镜下以100倍的放大倍数观察Vero细胞，发现病毒噬斑；用灭菌微量加样器吸取单个的病毒噬斑10微升，将10微升吸取的液体混入100微升的DMEM培养基中，并用微量加样器将所得含有病毒的DMEM培养基吹吸均匀。
[0201] 在无菌环境下，向另外一个长满80％Vero细胞的六孔细胞培养板的每孔中加入上述得到含有纯化病毒的DMEM培养基，感染该Vero细胞。在5％CO2培养箱中37℃下培养获得纯化的本发明单纯疱疹病毒。
[0202] (3)病毒的生物学特性分析
[0203] 如图1所示，52000倍电镜下观察到(2)纯化的病毒具有典型的单纯疱疹病毒形态：衣壳呈二十面体对称，直径为100纳米左右。衣壳外由厚薄不匀的被膜覆盖。病毒最外层为典型的脂质双层囊膜，包括囊膜的病毒直径为150至200纳米。
[0204] 此外发明人委托杭州华大基因公司还对(2)纯化的病毒进行了全基因组测序，测序结果如上述表1所示，所得病毒与NCBI中编号为ID：NC_001806的I型单纯疱疹病毒17+的序列同源性为99.5％。本发明的发明人对得到的全基因组序列进行了分析，得到如SEQ ID：NO.2以及SEQ ID：NO.4所示的编码感染细胞多肽的立即早期基因的核苷酸序列，并由所述核苷酸序列得到如SEQ ID：NO.1(感染细胞多肽α22)以及SEQ ID：NO.3(感染细胞多肽α27)。通过与ID：NC_001806的相应基因比对，发现(2)得到的纯化病毒的立即早期基因存在变异。此外还得到了如SEQ ID：NO.6、SEQ ID：NO.8、SEQ ID：NO.10、SEQ ID：NO.12，以及SEQ ID：NO.14所示的编码囊膜蛋白的基因核苷酸序列，并由所述核苷酸序列得到如SEQ ID：NO.5(病毒糖蛋白B)、SEQ ID：NO.7(病毒糖蛋白C)、SEQ ID：NO.9(病毒糖蛋白D)、SEQ ID：NO.11(病毒糖蛋白G)，以及SEQ ID：NO.13(病毒糖蛋白M)所示的囊膜蛋白的氨基酸序列。通过与ID：NC_001806的相应基因比对，发现(2)得到的纯化病毒的编码囊膜蛋白的基因也存在变异。
[0205] (4)编码感染细胞多肽34.5的基因、编码感染细胞多肽6的基因和编码感染细胞多肽47的基因中的敲除。
[0206] 按照CN 1283803C记载的方法，分别敲除编码感染细胞多肽34.5的基因、编码感染细胞多肽6的基因和编码感染细胞多肽47的基因中的一个或几个基因，得到如表2所示的一组单纯疱疹病毒载体。
[0207] 表2
[0208]病毒载
1 2 3 4 5 6 7
体编号
缺失 ICP34.5 ICP34.5 ICP6和 ICP34.5、ICP6
ICP34.5 ICP6 ICP47
基因 和ICP6 和ICP47 ICP47 和ICP47
1 2 3 4 5 6 7
体编号
缺失 ICP34.5 ICP34.5 ICP6和 ICP34.5、ICP6
ICP34.5 ICP6 ICP47
基因 和ICP6 和ICP47 ICP47 和ICP47
[0209] 实施例2
[0210] 本实施例说明本发明的单纯疱疹病毒载体对黄色人种多发的人鼻咽癌细胞(CNE-1)的溶解能力。
[0211] (1)单纯疱疹病毒载体滴度的测定
[0212] 用含10％胎牛血清的DMEM培养基，在7个六孔细胞培养板上以5×105个细胞/孔的密度接种非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)(美国ATCC)，37℃下在5％CO2培养箱中培养
24小时，至每孔Vero细胞长满80％备用。
24小时，至每孔Vero细胞长满80％备用。
[0213] 无菌条件下，收集分别实施例1表2所示7种培养有本发明单纯疱疹病毒载体的2
Vero细胞培养物的上清培养液，用不含血清的DMEM培养基分别梯度稀释成1×10 倍液、
3 4 5 6 7
1×10 倍液、1×10 倍液、1×10 倍液、1×10 倍液以及1×10 倍液，每种稀释液各100微
升。
Vero细胞培养物的上清培养液，用不含血清的DMEM培养基分别梯度稀释成1×10 倍液、
3 4 5 6 7
1×10 倍液、1×10 倍液、1×10 倍液、1×10 倍液以及1×10 倍液，每种稀释液各100微
升。
[0214] 无菌条件下，弃去上述六孔细胞培养板上培养好的Vero细胞培养物中含10％胎牛血清的DMEM培养基，然后每孔加入上述稀释用的不含血清的DMEM培养基1毫升，接着将上述制得的六种浓度的病毒稀释液分别加入6个孔中，每孔100微升。每种病毒载体加在一个六孔细胞培养板上，共得到7个加有病毒载体的六孔细胞培养板。转染有病毒载体的Vero细胞六孔培养板置于5％CO2培养箱中37℃下培养1小时，无菌条件下弃去孔中的培养基，每孔中加入2毫升羧甲基纤维素培养基(将羧甲基纤维素粉末与PBS溶液按照重量体积比2∶125混合后，在4℃冰箱保存12小时，溶解完全后121.3℃灭菌30分钟，无菌条件下，将所得无菌1.6重量体积％的羧甲基纤维素PBS溶液与含10％FBS的DMEM按体积1∶2混合制得)。置于5％CO2培养箱中37℃下培养48小时后，弃去培养液，用PBS溶液
将细胞润洗2次，弃去PBS溶液，加入2毫升含有0.1体积％的戊二醛(美国Sigma)的PBS
溶液，25℃下放置10分钟。再次将细胞用PBS溶液润洗两次，弃去PBS溶液，加入1毫升0.1重量体积％的结晶紫溶液(用20体积％乙醇作为溶剂配制)，25℃下放置10分钟。用纯净水润洗细胞两次，用吸水纸擦干六孔板背面的水，将六孔板置于100倍光学显微镜下观察，计数空斑。计算得出如表3所示每毫升病毒载体原液形成的空斑数，即病毒原液的滴度，单位为空斑形成单位/毫升(pfu/ml)。
将细胞润洗2次，弃去PBS溶液，加入2毫升含有0.1体积％的戊二醛(美国Sigma)的PBS
溶液，25℃下放置10分钟。再次将细胞用PBS溶液润洗两次，弃去PBS溶液，加入1毫升0.1重量体积％的结晶紫溶液(用20体积％乙醇作为溶剂配制)，25℃下放置10分钟。用纯净水润洗细胞两次，用吸水纸擦干六孔板背面的水，将六孔板置于100倍光学显微镜下观察，计数空斑。计算得出如表3所示每毫升病毒载体原液形成的空斑数，即病毒原液的滴度，单位为空斑形成单位/毫升(pfu/ml)。
[0215] 表3
[0216]病毒载体编号 1 2 3 4 5 6 7
滴度(pfu/ml) 5×107 5×107 7×107 3×107 5×107 5×107 4×107
滴度(pfu/ml) 5×107 5×107 7×107 3×107 5×107 5×107 4×107
[0217] (2)人鼻咽癌细胞的培养
[0218] 37℃下在5％CO2培养箱中用6毫升含10％胎牛血清的DMEM培养基，培养接种在25平方厘米的培养瓶中的CNE-1细胞(购自中科院上海细胞研究所)48小时，用放大100
倍的倒置显微镜CNE-1细胞处于对数生长期。无菌条件下，加入0.25％的胰蛋白酶1毫升，在37℃下消化所述处于对数生长期的CNE-1细胞5分钟。用倒置显微镜观察CNE-1细胞在
4
培养基溶液中游离后，加入新鲜培养基稀释成1×10 个/毫升的细胞悬液，微量进样器吹打均匀后加入96孔板中，每孔加100微升细胞悬液，在37℃、5％CO2培养箱中继续培养24小时。
倍的倒置显微镜CNE-1细胞处于对数生长期。无菌条件下，加入0.25％的胰蛋白酶1毫升，在37℃下消化所述处于对数生长期的CNE-1细胞5分钟。用倒置显微镜观察CNE-1细胞在
4
培养基溶液中游离后，加入新鲜培养基稀释成1×10 个/毫升的细胞悬液，微量进样器吹打均匀后加入96孔板中，每孔加100微升细胞悬液，在37℃、5％CO2培养箱中继续培养24小时。
[0219] (3)病毒载体的转染以及人鼻咽癌细胞存活率的测定
[0220] 用已知滴度的步骤(1)的单纯疱疹病毒载体原液，按照步骤(1)的方法以感染复数(multiplicity of infection，MOI)为0.1转染上述培养的CNE-1细胞。其中对照孔加入与病毒原液等体积的含1％小牛血清DMEM培养基。对照孔CNE-1细胞和被转染的CNE-1细胞都在37℃下5％CO2培养箱中培养，并分别在转染后24小时、48小时和72小时用MTT法(具体方法记载在“测定细胞存活和增殖的MTT方法的建立”，郑永唐等人，免疫学杂志，1992年，第8卷，第4期，第266-269页)测定细胞存活率。用DG-3022型酶联免疫仪(华
东电子管厂制造)在570纳米下测定OD值，细胞存活率由下式计算：
东电子管厂制造)在570纳米下测定OD值，细胞存活率由下式计算：
[0221] 细胞存活率＝(转染孔光吸收值/对照孔光吸收值)×100％。
[0222] 细胞存活率的测试结果见表5。
[0223] 对比例1
[0224] 本对比例说明现有技术的单纯疱疹病毒载体对黄色人种多发的人鼻咽癌细胞(CNE-1)的溶解能力。
[0225] 按照实施例1的方法，以单纯疱疹病毒17+制备7种单纯疱疹病毒载体，缺失基因情况如表4所示。
[0226] 表4
[0227]病毒载
A B C D E F G
体编号
缺失 ICP34.5 ICP34.5 ICP6和 ICP34.5、ICP6
ICP34.5 ICP6 ICP47
基因 和ICP6 和ICP47 ICP47 和ICP47
A B C D E F G
体编号
缺失 ICP34.5 ICP34.5 ICP6和 ICP34.5、ICP6
ICP34.5 ICP6 ICP47
基因 和ICP6 和ICP47 ICP47 和ICP47
[0228] 按照实施例2的方法，以相同病毒载体滴度的单纯疱疹病毒17+转染黄色人种多发的人鼻咽癌细胞(CNE-1)(购自中科院上海细胞研究所)，在同样的条件下培养转染的CNE-1细胞，并按照实施例2的方法测定CNE-1细胞的存活率，测定结果见表5。
[0229] 表5
[0230]
[0231] 从表5可以看出，转染本发明单纯疱疹病毒载体的CNE-1细胞的存活率大大低于转染现有技术单纯疱疹病毒17+载体的CNE-1细胞的存活率，而CNE-1细胞为典型的黄色人种多发人鼻咽癌的肿瘤细胞，说明本发明的病毒载体，相对于现有技术的单纯疱疹病毒17+载体而言，特异性对黄色人种的肿瘤细胞的溶解能力更强。
[0232] 实施例3
[0233] 本实施例说明本发明的单纯疱疹病毒载体对一般肿瘤细胞的溶解能力。
[0234] 按照实施例2的方法，用本发明的单纯疱疹病毒载体分别在两种不同的感染复数(MOI＝0.1和MOI＝1)下转染人乳腺癌细胞MCF-7、人结肠癌细胞HT-29和人肺腺癌细胞A549(购自军事医学科学院第二研究所)，并测试转染后不同时间点肿瘤细胞的存活数，结果如表6所示。
[0235] 对比例2
[0236] 本对比例说明现有技术的单纯疱疹病毒17+载体对一般肿瘤细胞的溶解能力。
[0237] 按照实施例2的方法，用单纯疱疹病毒17+载体分别在两种不同的感染复数(MOI＝0.1和MOI＝1)下转染人乳腺癌细胞系MCF-7、人结肠癌细胞系HT-29和人肺腺癌细胞系A549，并测试转染后不同时间点肿瘤细胞的存活数，结果如表6和表7所示。
[0238] 表6
[0239]
[0240] 表7
[0241]
[0242] 从表6和表7可以看出，无论在低感染复数(MOI＝0.1)还是高感染复数(MOI＝1)的情况下，转染本发明单纯疱疹病毒载体24小时的三种肿瘤细胞系的存活率都大大低于转染现有技术单纯疱疹病毒17+载体的三种肿瘤细胞系的存活率，说明本发明的病毒载体对一般肿瘤细胞的溶解能力也好于现有技术的单纯疱疹病毒17+载体。此外，图2展示了正常人乳腺癌细胞系MCF-7培养96小时的生长情况光学显微镜照片(放大400倍)，从
图2可以看出，正常人乳腺癌细胞系MCF-7培养96小时后，细胞结构完整，密集生长排列；
图3展示了培养MCF-7细胞48小时后，按病毒活性颗粒/细胞数的比值(MOI)为0.1转染
本发明病毒载体后再培养48小时的生长情况光学显微镜照片(放大400倍)，从图3可以
看出，多数细胞结构遭到破坏，细胞数目大大减少。从两张照片对比可以看出，本发明的单纯疱疹病毒载体对一般肿瘤细胞都具有更强的溶解能力。
图2可以看出，正常人乳腺癌细胞系MCF-7培养96小时后，细胞结构完整，密集生长排列；
图3展示了培养MCF-7细胞48小时后，按病毒活性颗粒/细胞数的比值(MOI)为0.1转染
本发明病毒载体后再培养48小时的生长情况光学显微镜照片(放大400倍)，从图3可以
看出，多数细胞结构遭到破坏，细胞数目大大减少。从两张照片对比可以看出，本发明的单纯疱疹病毒载体对一般肿瘤细胞都具有更强的溶解能力。
[0243] 实施例4
[0244] 本实施例说明本发明提供的重组病毒及其制备方法。
[0245] 按照CN 1283803C记载的方法，向实施例1中得到的病毒载体7中，分别在编码感染细胞多肽34.5(infected cell polypeptides，ICP34.5)的基因位置上插入由hCMV的IE启动子引导的人类GM-CSF基因、编码感染细胞多肽6的基因位置上插入由MMLV启动子引导的编码绿色荧光蛋白的基因和编码感染细胞多肽47的基因的基因位置上插入由RSV启动子引导的编码红色荧光蛋白的基因。所述基因的序列可以在NCBI数据库中查到，用得到的重组病毒按照实施例2的方法，以感染复数为0.1转染人鼻咽癌细胞。转染后24小时可以在100倍光学显微镜下观察到如图6所示的，表达绿色荧光蛋白的人鼻咽癌细胞。
[0246] 收集转染后24小时、48小时和72小时的六孔细胞培养板中的上清液，用型号为DG-3022的酶联免疫仪(华东电子管厂制造)在450纳米下，按照ELISA试剂盒说明书(BD OptEIA set human GM-CSF，Catalog No：555126、绿色荧光蛋白试剂盒和红色荧光蛋白试剂盒)，分别测定人GM-CSF、绿色荧光蛋白以及红色荧光蛋白在人鼻咽癌细胞中的表达量，结果如表8所示。
[0247] 对比例3
[0248] 按照实施例4所述的方法，不同的是用对比例2得到单纯疱疹病毒17+载体G制备重组病毒，收集转染后24小时、48小时和72小时的六孔细胞培养板中的上清液，用型号为DG-3022的酶联免疫仪(华东电子管厂制造)在450纳米下，按照ELISA试剂盒说明书
(BD OptEIA set human GM-CSF，Catalog No：555126、绿色荧光蛋白试剂盒和红色荧光蛋白试剂盒)，分别测定人GM-CSF、绿色荧光蛋白(GFP)以及红色荧光蛋白(RFP)在人鼻咽癌细胞中的表达量，结果如表8所示。
(BD OptEIA set human GM-CSF，Catalog No：555126、绿色荧光蛋白试剂盒和红色荧光蛋白试剂盒)，分别测定人GM-CSF、绿色荧光蛋白(GFP)以及红色荧光蛋白(RFP)在人鼻咽癌细胞中的表达量，结果如表8所示。
[0249] 表8
[0250]
[0251] 从表8可以看出，转染本发明重组单纯疱疹病毒24小时的黄色人种肿瘤细胞中目的基因的表达量，都大大高于转染现有技术重组单纯疱疹病毒17+的表达量，说明本发明的重组病毒感染黄色人种肿瘤细胞的能力更强。
[0252] 实施例5
[0253] 本实施例说明含有本发明病毒载体的药物组合物及其制备方法。
[0254] (1)注射液的配制
[0255] 将按照表9所示的剂量分别配制一组磷酸盐缓冲液，121℃下灭菌60分钟。在无菌条件下，以0.45微米的微孔滤膜过滤实施例2的步骤(1)已知滴度的单纯疱疹病毒载体7原液，或者以0.45微米的微孔滤膜过滤按照实施例4所述的方法在单纯疱疹病毒载体7编码ICP34.5的基因位置上插入由hCMV的IE启动子引导的人类GM-CSF基因的重组细胞
原液(重组细胞原液的滴度按照实施例2的方法测定)去除细胞碎片，收集滤液至无菌离心管中，8000转/分离心1小时，弃去上清，按照表9所示的病毒滴度，将所得病毒载体或重组病毒沉淀分散在上述高温灭菌后的磷酸缓冲液中，即得两组(分别包括病毒载体和重组病毒)本发明注射液。
原液(重组细胞原液的滴度按照实施例2的方法测定)去除细胞碎片，收集滤液至无菌离心管中，8000转/分离心1小时，弃去上清，按照表9所示的病毒滴度，将所得病毒载体或重组病毒沉淀分散在上述高温灭菌后的磷酸缓冲液中，即得两组(分别包括病毒载体和重组病毒)本发明注射液。
[0256] 表9
[0257]药品 配方1 配方2 配方3 配方4 配方5 配方6 配方7
磷酸缓冲液(重量％) 99 95 90 85 80 75 70
肌醇(重量％) 1 0 0 10 15 0 10
山梨醇(重量％) 0 5 0 5 0 15 15
蔗糖(重量％) 0 0 10 0 5 10 5
渗透压调节剂及其浓 氯化钠 氯化钾 氯化钠 氯化钾 氯化钠 氯化钾 氯化钠
度(摩尔/升) 0.9 0.5 0.9 0.5 0.9 0.5 0.9
渗透压 200 300 400 450 500 600 700
(毫渗摩尔/千克)
病毒滴度 104 105 106 107 108 109 1010
(pfu/ml)
磷酸缓冲液(重量％) 99 95 90 85 80 75 70
肌醇(重量％) 1 0 0 10 15 0 10
山梨醇(重量％) 0 5 0 5 0 15 15
蔗糖(重量％) 0 0 10 0 5 10 5
渗透压调节剂及其浓 氯化钠 氯化钾 氯化钠 氯化钾 氯化钠 氯化钾 氯化钠
度(摩尔/升) 0.9 0.5 0.9 0.5 0.9 0.5 0.9
渗透压 200 300 400 450 500 600 700
(毫渗摩尔/千克)
病毒滴度 104 105 106 107 108 109 1010
(pfu/ml)
[0258] 本实施例中，阴性对照药物为不含病毒的灭菌磷酸缓冲液；阳性对照药物为注射用环磷酰胺(CTX)，批号：050202，规格200毫克/支，上海华联制药有限公司生产。
[0259] (2)细胞水平药效学实验
[0260] 按照实施例2的方法，以感染复数MOI＝1的病毒注射液感染黄色人种多发的人鼻咽癌细胞(CNE-1)。结果如表10所示。
[0261] 表10
[0262]
[0263] 从表10可以看出，本发明的注射液对黄色人种多发的CNE-1细胞具有显著的杀伤作用，阳性对照药能在24小时内杀死肿瘤细胞，但是阳性对照药对正常细胞的毒性也很大。此外，从表10还可以看出，重组病毒对肿瘤的杀伤能力强于病毒载体对肿瘤细胞的杀伤能力，进而说明含有本发明重组病毒的药物组合物不仅具有溶瘤作用，并且可以在被重组病毒转染的细胞内表达目的基因。
[0264] (3)人结肠腺癌HT-29裸鼠移植瘤生长的抑制作用药效学实验
[0265] 人结肠腺癌HT-29裸鼠移植瘤购自中国医学科学院药物研究所，Balb/c裸鼠，4-6周龄，16-20克，雌性，购自中国医学科学院实验动物中心。
[0266] 传代荷瘤鼠皮下肿瘤生长至直径约2-3厘米时，无菌条件下取出瘤块，按照每克肿瘤组织3-4毫升生理盐水的比例，制成肿瘤细胞匀浆，给予每只小鼠右前肢腋部皮下接种0.2毫升；或者将瘤块切割成1立方厘米的小瘤块，用套管针接种到裸鼠右侧腋部皮下。
[0267] 待各组动物接种的肿瘤生长到动物体表能观察到约0.6厘米×0.6厘米的肿块时，随机分16组(本发明配方14组、阳性对照组、阴性对照组)，每组7只开始用步骤(1)的本发明病毒载体或重组病毒注射液以及阳性对照药物、阴性对照药物肿瘤瘤体内局部注射给药。于第1天、第4天和第7天瘤内注射，注射容积为100微升。本发明步骤(1)病毒
7
载体或重组病毒的给药剂量为2.5×10pfu/kg，阳性对照药为环磷酰胺，阳性对照药的给药剂量为100mg/kg，阴性对照药为与本发明病毒注射液等体积的磷酸缓冲液。最后一次给药后，每周称体重，测定动物体表能观察到的肿瘤体积，继续观察2周左右，肿瘤体积变化曲线见图5(本发明病毒载体7+配方2)，然后颈部脱臼处死动物，剥离取出瘤块称重，可得出肿瘤抑制率＝100％×本发明病毒注射液组或阳性对照药组平均瘤块重量/阴性对照药平均瘤块重量，结果见表11。图4为阴性对照药(第一行)、阳性对照药(第二行)、本发明病毒载体7配方2注射液(第三行)以及本发明重组病毒配方2注射液(第四行)所取出
的瘤块照片，空白位置的小鼠死亡。
7
载体或重组病毒的给药剂量为2.5×10pfu/kg，阳性对照药为环磷酰胺，阳性对照药的给药剂量为100mg/kg，阴性对照药为与本发明病毒注射液等体积的磷酸缓冲液。最后一次给药后，每周称体重，测定动物体表能观察到的肿瘤体积，继续观察2周左右，肿瘤体积变化曲线见图5(本发明病毒载体7+配方2)，然后颈部脱臼处死动物，剥离取出瘤块称重，可得出肿瘤抑制率＝100％×本发明病毒注射液组或阳性对照药组平均瘤块重量/阴性对照药平均瘤块重量，结果见表11。图4为阴性对照药(第一行)、阳性对照药(第二行)、本发明病毒载体7配方2注射液(第三行)以及本发明重组病毒配方2注射液(第四行)所取出
的瘤块照片，空白位置的小鼠死亡。
[0268] 表11
[0269]
[0270] 从表11和图4、图5可以看出，本发明病毒载体和重组病毒对人结肠腺癌HT-29裸鼠移植瘤生长有明显的抑制作用，本发明组的抑制率范围为28.0％-77.0％，虽然阳性对照药的抑制率对肿瘤的抑制作用也很明显，但是阳性对照药的死亡率很高，因而本发明的病毒载体或重组病毒的注射液更安全。此外，从表11还可以看出，含有重组病毒的注射液表达了抗肿瘤的GM-CSF，因此其对肿瘤的杀伤能力强于含有病毒载体的注射液。
[0271] SEQUENCE LISTING
[0272]
[0273]
[0274]
[0275]
[0276]
[0277]
[0278]
[0279]
[0280]
[0281]
[0282]
[0283]
[0284]
[0285]
[0286]
[0287]
[0288]
[0289]
[0290]