新片螺素类生物碱及其制备方法和抗艾滋病病毒用途

摘要

本发明公开了一种新颖结构的片螺素类生物碱及其制备方法和用途。本发明的生物碱是从中国南海海绵Iotrochota baculifera中经提取，分离，和纯化片螺素类生物碱。此外，本发明所提供的化合物可应用于抗艾滋病(HIV)病毒。式I

权利要求

1.一种式I化合物，或者其药学上可接受酸或碱的盐：其中i).取代基Rq和Rs一起成键时，式I化合物选自下列式VIII、式IX、式XI或式XII化合物：这里，式VIII化合物，其中R5为-OSO3H，而R4、R8和R9分别为羟基；

或，R4为-OSO3H，而R5、R8和R9分别为羟基；

或，R4和R8分别为-OSO3H，而R5和R9分别为羟基；

或，R5和R9分别为-SO3H，而R4和R8分别为羟基；

或，R4和R5分别为-OSO3H，而R8和R9分别为羟基；

或，R5和R8分别为-OSO3H，而R4和R9分别为羟基；

或，R4、R5和R8分别为-OSO3H，而R9为羟基；

或，R4、R5和R9分别为-OSO3H，而R8为羟基；

这里，式IX化合物，其中R4、R5、R8和R9分别为羟基；

或，R5为-OSO3H，而R4、R8和R9分别为羟基；

这里，式XI化合物，其中R1、R4、R5和R12分别为羟基；

或，R12是-OSO3H，R1、R4和R5分别为羟基；

或，R1是-OSO3H，R4、R5和R12分别为羟基；

这里，式XII化合物，其中R4、R5和R12分别为羟基，C6-C7轴为M-构型；

或，R4、R5和R12分别为羟基，C6-C7轴为P-构型；

或者，ii).取代基Rq和Rs没有一起成键时，而且，Rn与Rp、Rt与Rx各自地分别形成单键；式I化合物选自式XIII化合物：这里，式XIII化合物，其中R13、R15和R16分别地为羟基，R14为-OSO3H。

2.一种制备权利要求1所述式I化合物的方法，包括用C1-C6的醇或含水的C1-C6的醇提取海绵I.baculifera，得粗浸膏，然后从粗浸膏中分离纯化而得到。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述C1-C6的醇选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇或正丁醇。

4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述含水的C1-C6的醇为20～97％体积比。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述含水的C1-C6的醇为75～95％体积比。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述含水的C1-C6的醇为80～90％体积比的含水乙醇。

7.一种包含权利要求1所述式I化合物或者其药学上可接受酸或碱的盐的药物组合物。

8.根据权利要求7所述的药物组合物在制备抗HIV药物中的用途。

9.权利要求1所述式I化合物或者其药学上可接受酸或碱的盐在制备治疗HIV感染疾病的药物中的应用。

说明书

新片螺素类生物碱及其制备方法和抗艾滋病病毒用途

技术领域

[0001] 本发明涉及天然药物化学，更具体地说，涉及一种新purpurone类生物碱及其制备方法和作为抗HIV剂的用途。

背景技术

[0002] 片螺素purpurone类化合物已有一些文献报道，如文献[George W.Chan，et al.，Purpurone，an Inhibitor of ATP-Citrate Lyase：A Novel Alkaloidfrom the Marine Sponge Iotrochota sp.J.Org.Chem.1993，58，2544-2546.]和文献[Kang，H.；et al.，Ningalins A-D：Novel Aromatic Alkaloids from aWestern Australian Ascidian of the Genus Didemnum.J.Org.Chem.1997，62，3254-3262.]曾分别报道了purpurone类生物碱的提取分离及结构鉴定，但尚未见该类化合物结构中含有OSO3H基团，且具有抗HIV活性的报道。

[0003] 海绵I.baculifera是一种热带海绵，属于Demospongiae纲，Paecilosclerida目，Tedaniidae科。广泛分布于暗礁，深海及浅海湾的隐秘地带。表面形态呈多枝的灌木状，比较厚实，表面不平滑，颜色从紫黑色到黑色，偶有绿色。当被挤压时，会有黑色分泌物流出。未见从该海绵中分离得到purpurone类生物碱的文献报道。

发明内容

[0004] 本发明人首次发现海绵I.baculifera的低级醇提取物中含有下述通式I所示的purpurone类生物碱。

[0005] 本发明的一个目的是提供一类新的且具有抗HIV活性的化合物。

[0006] 本发明的另一个目的是提供了上述化合物的制备方法。

[0007] 本发明的另一个目的是提供包含上述化合物的药物组合物。

[0008] 本发明的另一个目的是提供上述化合物作为抗HIV病毒剂的用途。本发明的purpurone类生物碱化合物对HIV病毒gp41和vif蛋白具有很好的亲和力，具有抗HIV活性。

[0009] 具体地说，本发明提供了下列式I化合物，或者其药学上可接受酸或碱的盐，或者溶剂化物：

[0010]

[0011] 式I

[0012] 其中i).当取代基Rq和Rs一起成键时，

[0013] 取代基Rz选自-(CH2)k-Ra，这里，k为1至4的正整数，优选地，k＝1或2；Ra选自羧基或-phR1，所述的-ph为苯基，R1为该苯基的取代基，优选地为该苯基的4位的取代基，而且，R1选自羟基或-OR2，这里R2选自C1-C4烷基、C1-C4酰基或-SO3H，优选地，R2选自甲基或乙酰基；并且，

[0014] Rp与式II中Ru一起形成单键；Rm、Rn与式II中的Rv、Rw一起形成双键；并且，[0015] Rt与式III中Ru′一起形成单键，Rx、Ry与式III中的Rv′、Rw′一起形成双键；或者，Rx、Ry一起形成羰基，Rt选自式IV残基；

[0016]

[0017] 式IV

[0018] 这里，R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12各自独立地选自羟基或-OR2，其中R2选自C1-C4烷基、C1-C4酰基或-SO3H，优选地，R2选自甲基或乙酰基；

[0019] 并且规定，当Rp与式II中Ru一起形成单键；Rm、Rn与式II中的Rv、Rw一起形成双键；并且，Rt与式III中Ru′一起形成单键，Rx、Ry与式III中的Rv′、Rw′一起形成双键；Ra为-phR1，所述的-ph为苯基，R1为该苯基的4位取代基，而且，R1选自羟基或-OR2，这里R2选自C1-C4烷基、C1-C4酰基或-SO3H时，R1、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12其中至少一个为-OSO3H；或者，

[0020] ii).当取代基Rq和Rs没有一起成键时，Rn与Rp、Rt与Rx各自地分别形成单键；

[0021] Rz为氢；

[0022] Rq与式V中Ru″一起形成单键；Rm与式V中的Rv″一起形成双键；

[0023]

[0024] 式V

[0025] Rs与式VI中Ru″′一起形成单键；Ry与式VI中的Rv″′一起形成单键；

[0026]

[0027] 式VI

[0028] 这里，R13、R14、R15和R16各自独立地选自羟基或-OR2，其中，R2选自C1-C4烷基、C1-C4酰基或-SO3H，优选地，R2选自甲基或乙酰基；

[0029] 并且规定，R13、R14、R15和R16其中至少一个为-OSO3H。

[0030] 优选地，本发明的式I化合物选自式VII化合物：

[0031]

[0032] 式VII

[0033] 其中，Rz选自-(CH2)k-Ra，这里，k为1至4的正整数，优选地，k＝1或2；Ra选自羧基或-phR1，所述的-ph为苯基，R1为该苯基的取代基，优选地为该苯基的4位的取代基，而且，R1选自羟基或-OR2，这里R2选自C1-C4烷基、C1-C4酰基或-SO3H，优选地，R2选自甲基或乙酰基；

[0034] R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10各自独立地选自羟基或-OR2，其中R2选自C1-C4烷基、C1-C4酰基或-SO3H，优选地，R2选自甲基或乙酰基；

[0035] 并且规定，当Ra为-phR1，所述的-ph为苯基，R1为该苯基的4位取代基，而且，R1选自羟基或-OR2，这里R2选自C1-C4烷基、C1-C4酰基或-SO3H时，R1、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10其中至少一个为-OSO3H。

[0036] 更优选地，本发明的式VII化合物，Rz选自-(CH2)k-Ra，其中k为1，Ra为-COOH，即Rz为-CH2COOH，其他的取代基如上述的定义。

[0037] 更优选地，本发明的式VII化合物，Rz选自-(CH2)k-Ra，这里，k为2；Ra为-phR1，所述的-ph为苯基，R1为该苯基4位的取代基，而且，R1选自羟基或-OR2，这里R2选自C1-C4烷基、C1-C4酰基或-SO3H，优选地，R2选自甲基或乙酰基；其余的取代基如上述所定义的。

[0038] 进一步优选地，本发明的式VII化合物选自下列式VIII或式IX化合物：

[0039]

[0040] 式VIII式IX

[0041] 这里，R4、R5、R8和R9各自独立地选自羟基或-OR2，其中R2选自C1-C4烷基、C1-C4酰基或-SO3H，优选地，R2选自甲基或乙酰基；

[0042] 并且规定，当式VII化合物选自式VIII化合物时，R4、R5、R8和R9其中至少一个为-OSO3H。

[0043] 最优选地，本发明的式VIII化合物，其中R5为-SO3H，而R4、R8和R9分别为羟基(化合物1)；

[0044] 或者，R4为-SO3H，而R5、R8和R9分别为羟基(化合物2)；

[0045] 或者，R4和R8分别为-SO3H，而R5和R9分别为羟基(化合物3)；

[0046] 或者，R5和R9分别为-SO3H，而R4和R8分别为羟基(化合物4)；

[0047] 或者，R4和R5分别为-SO3H，而R8和R9分别为羟基(化合物5)；

[0048] 或者，R5和R8分别为-SO3H，而R4和R9分别为羟基(化合物6)；

[0049] 或者，R4、R5和R8分别为-SO3H，而R9为羟基(化合物7)；

[0050] 或者，R4、R5和R9分别为-SO3H，而R8为羟基(化合物8)。

[0051] 最优选地，本发明的式IX化合物，其中R4、R5、R8和R9分别为羟基(化合物12)；

[0052] 或者，其中R5为-SO3H，而R4、R8和R9分别为羟基(化合物13)。

[0053] 优选地，本发明的式I化合物选自式X化合物：

[0054]

[0055] 其中，Rz选自-(CH2)k-Ra，这里，k为1至4的正整数，优选地，k＝1或2；Ra选自羧基或-phR1，所述的-ph为苯基，R1为该苯基的取代基，优选地为该苯基的4位的取代基，而且，R1选自羟基或-OR2，这里R2选自C1-C4烷基、C1-C4酰基或-SO3H，优选地，R2选自甲基或乙酰基；

[0056] R3、R4、R5、R6、R11和R12各自独立地选自羟基或-OR2，其中R2选自C1-C4烷基、C1-C4酰基或-SO3H，优选地，R2选自甲基或乙酰基。

[0057] 更优选地，本发明的式X化合物，Rz选自-(CH2)k-Ra，其中k为1，Ra为-COOH，即Rz为-CH2COOH，其他的取代基如上述的定义。

[0058] 更优选地，本发明的式X化合物，Rz选自-(CH2)k-Ra，其中k为2；Ra为-phR1，所述的-ph为苯基，R1为该苯基4位的取代基，而且，R1选自羟基或-OR2，这里R2选自C1-C4烷基、C1-C4酰基或-SO3H，优选地，R2选自甲基或乙酰基；其余的取代基如上述所定义的。

[0059] 更优选地，本发明的式X化合物选自下列式XI或式XII化合物：

[0060]

[0061] 这里，R1、R4、R5和R12各自独立地选自羟基或-OR2，其中R2选自C1-C4烷基、C1-C4酰基或-SO3H，优选地，R2选自甲基或乙酰基；

[0062] 最优选地，本发明的式XI化合物，其中R1、R4、R5和R12分别为羟基(化合物9)；

[0063] 或者，R12是-SO3H，R1、R4和R5分别为羟基(化合物10)；

[0064] 或者，R1是-SO3H，R4、R5和R12分别为羟基(化合物11)。

[0065] 最优选地，本发明的式XII化合物，其中R4、R5和R12分别为羟基，C6-C7轴为M-构型(化合物14)；

[0066] 或者，其中R4、R5和R12分别为羟基，C6-C7轴为P-构型(化合物15)。

[0067] 优选地，本发明的式I化合物选自式XIII化合物：

[0068]

[0069] 式XIII

[0070] 其中，R13、R14、R15和R16各自独立地选自羟基或-OR2，其中R2选自C1-C4烷基、C1-C4酰基或-SO3H，优选地，R2选自甲基或乙酰基；并且规定，R13、R14、R15和R16其中至少一个为-OSO3H。

[0071] 最优选地，本发明的式XIII化合物，其中R13、R15和R16分别地为羟基，R14为-OSO3H(化合物16)。

[0072] 这里，在本发明的化合物中，所述药学上可接受的酸选自无机酸或有机酸，所述的无机酸可选自氢卤酸(包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸等)、硫酸、磷酸等；所述的有机酸选自马来酸、富马酸、苹果酸、枸橼酸、琥珀酸、甲磺酸、苯磺酸等。所述的碱选自无机碱或有机碱，所述的无机碱选自碱金属或碱土金属的氢氧化物，或碳酸盐或碳酸氢盐，所述碱金属包括钠、钾、锂等，所述的碱土金属包括钙、镁、铝等，非限定性实例包括：氢氧化钠，氢氧化钾，碳酸钠，碳酸氢钠等；所述有机碱包括但不限于三乙胺、二异丙基乙胺、哌啶、哌嗪等。

[0073] 这里，在本发明的化合物中，所述的溶剂化物包括但不限于水合物、低级醇(例如，甲醇、乙醇等)化物、多元醇(乙二醇、甘油)化物、或二甲基甲酰胺化物、或二甲基亚砜化物。

[0074] 另一方面，本发明提供了上述本发明化合物的制备方法，包括用低级醇或含水的低级醇提取海绵I.baculifera，得粗浸膏，然后从粗浸膏中分离纯化而得到。

[0075] 所述低级醇为C1-C6的醇，优选地，为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇；所述含水的低级醇是20～97％(体积比)，优选地，75～95％(体积比)，更优选地，80～90％(体积比)，最优选地，为80～90％(体积比)的含水乙醇；所述分离纯化包括利用本领域技术人员熟知的天然产物分离纯化的常规方法，如液液萃取、柱层析及薄层层析等。其中柱层析和薄层层析精制可反复进行多次。

[0076] 此外，本发明所提供的上述本发明化合物的制备方法进一步地包括C1-C4烷酰化或醚化反应。对于本领域的技术人员，所述的C1-C4烷酰化或醚化反应是常规的，例如乙酰化，向本发明化合物的吡啶溶液中加入乙酸酐，室温反应数小时即得；甲醚化，例如向本发明化合物的甲醇溶液加入重氮甲烷的乙醚溶液，室温反应数小时即得。

[0077] 本发明提供了一种包含上述本发明化合物的药物组合物。在该药物组合物中，本发明化合物的含量为0.001-99.99重量％。每日的用量为0.1-100mg/Kg体重，每日的用药次数为1-4次。根据需要，本发明的药物组合物可制成口服制剂、非胃肠制剂、局部用制剂，例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、软膏、乳膏、注射剂等。

[0078] 经实验证实，本发明发现的式I化合物对HIV病毒gp41和vif蛋白具有很好的亲和力，因此可用作抗HIV剂。

[0079] 本发明的purpurone类化合物可通过加入药物或试剂可接受的辅料或溶剂制成抗HIV剂，来用于HIV的治疗或生命科学研究。在生命科学研究中作为抑制HIV病毒gp41和vif蛋白酶的低分子生物探针加以利用时，本发明的化合物可溶于甲醇、含水甲醇或水中使用，也可以用二甲基亚砜或水溶液溶解使用。

附图说明

[0080] 将基因重组的gp41、Vif及APOBEC3G蛋白分别偶联至BIAcore检测仪的芯片上，分别加入一定浓度的各样品溶液，仪器即检测出各样品与gp41、Vif及APOBEC3G蛋白的结合作用。

[0081] 图1.BIAcore检测F-3(化合物8)与Vif相互作用

[0082] 图2.BIAcore检测F-6-3(化合物13)与Vif相互作用

[0083] 图3.BIAcore检测F-8-5(化合物9)与Vif相互作用

[0084] 图4.BIAcore检测F-12-1(化合物14)与Vif相互作用

[0085] 图5.BIAcore检测F-17-3(化合物10)与GP41相互作用

[0086] 图6.BIAcore检测F-12-1(化合物14)与GP41相互作用

具体实施方式

[0087] 实施例1式VIII中化合物1-8的分离精制

[0088]

[0089] 式VIII

[0090] 式中，阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位。大写英文字母是化学结构中环的编号

[0091] 取海绵Iotrochota baculifera样品(600克)匀浆，用25升90％(体积比)乙醇动态搅拌提取3次，每次2小时。提取液合并，浓缩，无水甲醇除盐，得总提物40克。将乙醇提取物悬浮于水中，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，得乙酸乙酯萃取物5.0克，正丁醇萃取物3.0克。

[0092] 取正丁醇萃取物5克，用适量氯仿-甲醇混合溶剂溶解后加10克200-300目硅胶G(青岛海洋化工集团公司产品)拌样，上到装填有50克青岛海洋化工集团公司产薄层层析用硅胶G的玻璃减压柱上，以氯仿-甲醇(10:1，5:1，2:1(体积比))梯度洗脱，洗脱溶剂的极性通过提高氯仿中甲醇的用量来梯度递增，每个洗脱流份分别接收200毫升，根据薄层层析检测合并流份，得到3个组分(组分III，组分V和组分VII)。将组分VII(0.8克，氯仿-甲醇2:1-0:1(体积比)洗脱物)经反相RP-18柱层析(5.0×31厘米)以35-50％(体积比)甲醇-水系统分段，洗脱溶剂的极性通过提高甲醇中水的用量来梯度递增，按色带分成4个组分，即组分3(50毫克)、组分4(144毫克)、组分10(50毫克)和组分12(76毫克)。

[0093] 组分12(76毫克)经反相RP-18柱层析(4.0×31厘米)以50％(体积比)甲醇-水洗脱，按色带得到组分12-3(37毫克)，经制备硅胶薄层层析，以正丁醇-乙酸-水(4:1:1)(体积比)和氯仿-甲醇-乙酸-水(4:1:1:0.5)(体积比)的1:1(体积比)混合
液为展开剂，刮取红色色带，用甲醇-水(90:10)(体积比)洗脱并将获得的化合物1和化合物2的粗品分别通过ODS滴管小柱(甲醇洗脱)精制，分别得化合物1纯品9.6毫克和化合物2纯品9.8毫克。

[0094] 组分4(144毫克)经反相RP-18(4.0×31厘米)柱层析，以15％(体积比)甲醇-水洗脱，按色带分成3个组分，即组分4-2(17毫克)、组分4-4(30毫克)和组分iv(44毫克)。组分4-2经反相RP-18(2.0×20厘米)柱层析精制，以25％(体积比？)甲醇-水洗脱，得到化合物7纯品13毫克。组分4-4经sephadex LH-20(1.5×50厘米)柱层析精制，以60％甲醇-水洗脱，得到化合物3纯品6毫克。组分iv经反相RP-18(2.0×20厘米)柱层析精制，以35％(体积比)甲醇-水洗脱，得到化合物5和化合物6的混合物30毫克。

[0095] 组分3(50毫克)经反相RP-18(2.0×20厘米)柱层析精制，以15％(体积比)甲醇-水洗脱，得到化合物8纯品7.4毫克。

[0096] 组分10(50毫克)经反相RP-18(2.5×30厘米)柱层析，以30％(体积比)甲醇-水洗脱，得含化合物4粗品15毫克，后经sephedax LH-20(1.5×50厘米)柱层析精制，以50％(体积比)甲醇-水洗脱，得到化合物4纯品8毫克。

[0097] 化合物1深红色粉末。无光学活性。UV(MeOH)λmax262，276，327，508nm；IR(KBr)-1λmax3700-3000，1670，1560，1514，1443，1385，1294，1165，1115，1023cm ；HRESIMS m/- 1 13
z776.1062[M-H]-(C40H27NO14S，calc.776.1079)；ESIMS m/z776.2[M-H] ；H及 C NMR谱数据见表1和表2。

[0098] 化合物2深红色粉末。无光学活性。UV(MeOH)λmax262，276，327，508nm；IR(KBr)-1λmax3700-3000，1675，1564，1513，1446，1384，1293，1165，1117，1047cm ；HRESIMS m/- - 1 13
z776.1076[M-H](C40H27NO14S，calc.776.1079)；ESIMS m/z776.2[M-H] ；H和 C NMR谱数据见表1和表2。

[0099] 化合物3深红色粉末。无光学活性。UV(MeOH)λmax262，276，327，508nm；IR(KBr)-1λmax3700-3000，1731，1683，1627，1511，1442，1297，1207，1137，1049，1024cm ；HRESIMS - -
m/z856.0620[M-H](C40H27NO17S2，calc.856.0648)，m/z776.1074[M-HSO3](C40H27NO14S，
1 13
cal.776.1080)；H和 CNMR谱数据见表1和表2。

[0100] 化合物4深红色粉末。无光学活性。UV(MeOH)λmax262，276，327，508nm；IR(KBr)λmax3700-3000，1731，1591，1559，1515，1438，1408，1288，1243，1167，-1 -
1116，1040cm ；HRESIMS m/z856.0646[M-H] (C40H27NO17S2，calc.856.0648)，m/- 1 13
z776.1080[M-HSO3](C40H27NO14S，cal.776.1080)；H和 C NMR谱数据见表1和表2。

[0101] 化合物5和化合物6深红色粉末。无光学活性。UV(MeOH)λmax262，276，327，-1508nm；IR(KBr)λmax3700-3000，1673，1563，1513，1442，1401，1294，1116，1043cm ；HRESIMS - -
m/z856.0668[M-H](C40H27NO17S2，calc.856.0647)，m/z776.1044[M-HSO3](C40H27NO14S，
1 13
calc.776.1080)；H和 C NMR谱数据见表1和表2。

[0102] 化合物7深红色粉末。无光学活性。UV(MeOH)λmax262，276，327，508nm；IR(KBr)-1 -λmax3700-3000，1628，1440，1265，1025cm ；HRESIMSm/z936.0182[M-H](C40H27NO20S3，-
calc.936.0216)，m/z856.0653[M-HSO3](C40H27NO17S2，calc.856.0648)，m/z776.1072[M-2(S- 1 13
O3)-H](C40H27NO14S，calc.776.1080)；H和 C NMR谱数据见表1和表2。

[0103] 化合物8深红色粉末。无光学活性。UV(MeOH)λmax262，276，327，508nm；-1
IR(KBr)λmax3700-3000，1673，1594，1562，1514，1437，1293，1117，1046cm ；HRESIMS m/- -
z936.0254[M-H](C40H27NO20S3，calc.936.0216)，m/z856.0618[M-HSO3](C40H27NO17S2，- 1 13
calc.856.0648)，m/z776.1046[M-2(SO3)-H](C40H27NO14S，calc.776.1080)；H和 C NMR谱数据见表1和表2。

[0104]

[0105]

[0106]

[0107]

[0108] 实施例2式IX、XI-XIII中化合物9-16的分离精制

[0109]

[0110] 式xI，

[0111] 式中，阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位。大写英文字母是化学结构中环的编号

[0112]

[0113] 式IX

[0114] 式中，阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位。大写英文字母是化学结构中环的编号

[0115]

[0116] 式XII

[0117] 式中，阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位。大写英文字母是化学结构中环的编号

[0118]

[0119] 式XIII

[0120] 式中，阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位。大写英文字母是化学结构中环的编号

[0121] 取海绵Iotrochota baculifera样品(600克)匀浆，用25升90％(体积比？)乙醇动态搅拌提取3次，每次2小时。提取液合并，浓缩，无水甲醇除盐，得总提物40克。将乙醇提取物悬浮于水中，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，得乙酸乙酯萃取物5.0克，正丁醇萃取物3.0克。

[0122] 取正丁醇萃取物5克，用适量氯仿-甲醇混合溶剂溶解后加10克200-300目硅胶G(青岛海洋化工集团公司产品)拌样，上到装填有50克青岛海洋化工集团公司产薄层层析用硅胶G的玻璃减压柱上，以氯仿-甲醇(10:1，5:1，2:1)(体积比)梯度洗脱，洗脱溶剂的极性通过提高氯仿中甲醇的用量来梯度递增，每个洗脱流份分别接收200毫升，根据薄层层析检测合并流份，得到3个组分(组分III，组分V和组分VII)。

[0123] 将组分V(1.4克，氯仿-甲醇4:1-2:1(体积比)洗脱物)经sephadex LH-20柱层析(5.0×150厘米)以90％甲醇-水系统分段，得到含有化合物16的组分9-10(200毫克)。组分9-10经sephadex LH-20柱层析(3.0×70厘米)精制，以80％(体积比)甲醇-水系统洗脱，得到化合物16纯品20毫克。

[0124] 将组分VII(0.8克，氯仿-甲醇2:1-0:l(体积比)洗脱物)经反相RP-18柱层析(5.0×31厘米)以35-50％(体积比)甲醇-水系统分段，洗脱溶剂的极性通过提高甲醇中水的用量来梯度递增，按色带分成6个组分，即组分3(50毫克)、组分4(144毫克)、组分10(50毫克)、组分12(76毫克)、组分15(50毫克)和组分17(68毫克)。

[0125] 组分12(76毫克)经反相RP-18柱层析(4.0×31厘米)以50％(体积比)甲醇-水洗脱，按色带得到2个组分，即组分12-1(21毫克)和组分12-3(37毫克)。组分
12-1经反相RP-18(2.0×20厘米)柱层析精制，得到化合物14纯品12毫克。

[0126] 组分15(50毫克)经sephadex LH-20(3.0×70厘米)柱层析，以60％(体积比)甲醇-水洗脱，按色带分成组分15-3(9毫克)和组分15-4(11毫克)。组分15-3经反相RP-18(2.0×20厘米)柱层析精制，以35％(体积比)甲醇-水洗脱，得到化合物15纯品6毫克。组分15-4经反相RP-18(2.0×20厘米)柱层析精制，以40％甲醇-水洗脱，得到化合物10纯品3毫克。

[0127] 组分17(68毫克)经sephadex LH-20(3.0×70厘米)柱层析，以60％(体积比)甲醇-水洗脱，按色带分成2个组分，即组分17-2(17毫克)和组分17-3(35毫克)。组分17-2经反相RP-18(2.0×20厘米)柱层析精制，以45％(体积比？)甲醇-水洗脱，得到化合物12纯品12毫克。组分17-3反相RP-18(2.5×30厘米)柱层析，以45％(体积比)甲醇-水洗脱，得到化合物9纯品9.6毫克和组分17-3-2(30毫克)。组分17-3-2经sephadexLH-20(2.0×60厘米)柱层析精制，以60％甲醇-水洗脱，分别得到化合物11纯品13毫克和化合物13纯品8毫克。

[0128] 化 合 物 9 橙 黄 色 粉 末。 无 光 学 活 性。HRESIMS[M+H]+m/z566.1451，- - 1 13C32H23NO9(calc.566.1446)，ESIMS[M-H]m/z564.2，[M+]Na]m/z586.2；H和 C NMR谱数据见表3。

[0129] 化合物10橙黄色粉末。无光学活性。UV(MeOH)λmax224，301，355，450nm；IR(KBr)-1 -λmax3700-3000，1699，1628，1570，1516，1440，1293，1117，1048cm ；HRESIMS[M-H]m/
1 13
z644.0871，C32H23NO12S(calc.644.0868)；H和 C NMR谱数据见表3。

[0130] 化合物11橙黄色粉末。无光学活性。UV(MeOH)λmax224，301，355，450nm；IR(KBr)-1 +λmax3700-3000，1699，1627，1400，1349，1121，1051cm ；HRESIMS[M+H]m/z646.1017，+ -
C32H23NO12S(calc.646.1014)，[M+Na]m/z668.0825(calc.668.0833)；ESIMS[M-H]m/- + 1 13
z644.1，[M-SO3]m/z564.1；ESIMS[M+Na]m/z668.0；H和 C NMR谱数据见表3。

[0131] 化 合 物12红 色 粉 末。 无 光 学 活 性。UV(MeOH)λmax226，475nm；IR(KBr)-1 +λmax3700-3000，1627，1400，1348，1114，1060cm ；HRESIMS[M+H] m/z636.1127，+ -
C34H21NO12(calc.636.1136)，[M+Na]m/z658.0950(calc.668.0956)；ESIMS[M-H]m/z634.1，- + 1 13
[M-CO2]m/z590.1；ESIMS[M+Na]m/z658.1；H和 C NMR谱数据见表4。

[0132] 化 合 物13红 色 粉 末。 无 光 学 活 性。UV(MeOH)λmax226，475nm；IR(KBr)-1 +λmax3700-3000，1626，1558，1449，1293，1166，1042cm ；HRESIMS[M+H]m/z716.0706，+ +
C34H21NO15S(calc.716.0705)，[M+Na]m/z738.0511(calc.738.0524)；ESIMS[M+H]m/+ + 1 13
z716.0，[M+Na]m/z738.0，[M-SO3+H]m/z636.1；H和 C NMR谱数据见表4。

[0133] 化 合 物14 红 色 粉 末。[α]20D-31.8(c0.5，MeOH)；UV(MeOH)λmax224，298，-1 +370nm；IR(KBr)λmax3400，1670，1628，1595，1428，1383，1293，1025cm ；HRESIMS[M+H]m/- 1 13
z504.0928，C26H18NO10(calc.504.0925)，ESIMS[M-CO2]m/z458，H和 C NMR谱数据见表5。

[0134] 化 合 物15 红 色 粉 末。[α]20D-23.1(c0.5，MeOH)；UV(MeOH)λmax224，298，-1 +370nm；IR(KBr)λmax3400-3100，1695，1628，1592，1426，1290，1053cm ；HRESIMS[M+H]m/- 1 13
z504.0940，C26H18NO10(calc.504.0925)，ESIMS[M-CO2]m/z458；H和 C NMR谱数据见表5。

[0135] 化合物16亮黄色粉末。无光学活性。UV(MeOH)λmax325，303，262nm；IR(KBr)-1 -λmax3400，1702，1617，1494，1375，1256，1153cm ；HRESIMS[M-H] m/z445.9822，
1 13
C18H8NO11S(calc.445.9823)；H和 C NMR谱数据见表6。

[0136] 表3化合物9-11在氘代甲醇中的500MHz1H和150MHz13C NMR数据a)

[0137]

[0138]

[0139] 本表信号归属基于DEPT、PFG1H-1H COSY、PFG HMQC及PFG HMBC图谱解析结果。碳信号的多重度利用DEPT方法确定并分别用s(单重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和q(四重峰)表示。

[0140] 表4化合物12-13在氘代甲醇中的500MHz1H和150MHz13C NMR数据

[0141]

[0142] 本表信号归属基于DEPT、PFG1H-1H COSY、PFG HMQC及PFG HMBC图谱解析结果。碳信号的多重度利用DEPT方法确定并分别用s(单重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和q(四重峰)表示。

[0143] 表5化合物14-15在氘代甲醇中的500MHz1H和150MHz13C NMR数据

[0144]

[0145]1 1

[0146] 本表信号归属基于DEPT、PFGH-H COSY、PFG HMQC及PFG HMBC图谱解析结果。碳信号的多重度利用DEPT方法确定并分别用s(单重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和q(四*重峰)表示。 标注有差别的位置
1 13

[0147] 表6化合物16在氘代二甲基亚砜中的500MHzH和150MHz C NMR数据

[0148]

[0149]1 1

[0150] 本表信号归属基于DEPT、PFGH-H COSY、PFG HMQC及PFG HMBC图谱解析结果。碳信号的多重度利用DEPT方法确定并分别用s(单重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和q(四重峰)表示。

[0151] 实施例3片螺素生物碱同系物抗HIV-1活性试验实例

[0152] (1)材料：

[0153] 细 胞 ：MT-4 细 胞、MAGI test(Multinuclear Activation ofGalactosidaseIndicator 之 简 写 )，又 称 Single Life Cycle，所 用 细 胞 为HeLa-CD4-LTR-β-ga1。北京工业大学生命科学与生物工程学院培养保存。

[0154] 毒株：HIV-1IIIB北京工业大学生命科学与生物工程学院培养保存。

[0155] 药物：待测定化合物分别为代号分别为F-3(化合物8)、F-4-2(化合物3)、F-4-43(化合物7)、F-4-4(化合物5)、F-6-3(化合物13)、F-8-5(化合物9)、F-12-1(化合物14)、F-17-21(化合物12)、F-12-3(化合物1)、F-12-4(化合物2)、F-10-1(化合物4)、F-17-3(化合物10)、F-6-3(化合物13)。

[0156] 方法：

[0157] 1.各样品在MT4细胞中抗HIV-1IIIB活性的检测

[0158] 离心收集500万MT-4细胞，加入1ml含10000TCID50HIV-1 IIIB的RPMI1640培养液，37℃、5％CO2孵箱中孵育2小时。1500rpm离心后，RPMI1640培养液洗涤一次，离心，加入4
10ml RPMI1640培养液重悬，96孔板每孔加入100μl细胞病毒悬液(含5×10 细胞/孔)。
选用药物最高浓度为250μg/ml，5倍比稀释5个浓度，每个浓度4个复孔，每孔100μl(药物终浓度减半)。同时设立病毒对照组(只加病毒，不加药物)、细胞对照组(不加病毒，不加药物)。于37℃、5％CO2孵箱中继续培养5天，期间，第3天更换药液。逐日观察细胞生长与形态变化。细胞对照组细胞生长状态良好，病毒对照组于培养后第3～4天出现合胞体。培养第5天，收获培养上清，以测定p24抗原的方法，检测培养上清p24抗原含量，以示病毒的增殖情况。将给药组与病毒对照组进行比较，以下列公式计算药物的抑制率：

[0159]

[0160] 以P24抗原检测法测定药物对HIV-1IIIB毒株的抑制作用，结果见表1。以药物浓度的对数为横坐标，以对病毒的抑制率为纵坐标绘制曲线，利用直线回归方法计算回归曲线，计算各样品对HIV-1IIIB毒株的50％抑制病毒浓度(IC50)。

[0161] 表7各样品在MT4细胞中对HIV-1IIIB毒株的抑制作用

[0162]

[0163]

[0164] 2.各样品在MAGI细胞中的抗HIV-1IIIB活性

[0165] MAGI test又称single life cycle，反应病毒在此细胞中仅进行一个周期的复制，病毒的复制是同步的，不同时段表示进入病毒生活史的某阶段，因此接种病毒后不同时段加入药物，观察药物对病毒复制周期的不同阶段的抑制作用，可以判定药物作用于病毒作用的阶段。所用细胞之一系由HeLa细胞系衍生而来。本法可以定量测定HIV的滴度，以计算药物对病毒的抑制率。发生的时相。

[0166] 取一个96孔细胞培养板每孔接种0.6万细胞MAGI细胞。选用药物最高浓度为200μg/ml，4倍比稀释5个浓度，每个浓度4个复孔，每孔100μl。同时设立病毒对照组(只加病毒，不加药物)、细胞对照组(不加病毒，不加药物)。将各孔中培基吸出，病毒对照组和药物测试组中，每孔接种病毒液(2000TCID50)100μl。在接种病毒的同时加入100μl上述稀释的药液(药物终浓度减半)。37℃，5％CO2孵育40～48h，固定，染色。倒置显微镜下计数蓝斑数目(见表8)。

[0167] 表8各样品在MAGI细胞中对HIV-1IIIB毒株的抑制作用

[0168]

[0169]

[0170] 由蓝斑计数结果显示：接种病毒后0h加药，多数样品的最高浓度对HIV-1IIIB的抑制率可达到96％以上。

[0171] 3.各样品抗HIV-1活性靶点的确定(BIAcore)

[0172] 本研究采用本发明化合物进行其对gp41(穿膜蛋白)、Vif(病毒感染因子)、APOBEC3G(某类淋巴细胞抗病毒细胞因子)结合作用的结果见表9、图1至图6。将基因重组的gp41、Vif及APOBEC3G蛋白分别偶联至BIAcore检测仪的芯片上，分别加入一定浓度的各样品溶液，仪器即检测出各样品与gp41、Vif及APOBEC3G蛋白的结合作用。

[0173] 表9各样品与gp41、Vif及APOBEC3G蛋白的结合值(RU)

[0174]

[0175]

[0176] /：未做