一种GKN2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

摘要

本发明涉及一种GKN2基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种GKN2基因原位杂交检测方法。另外，本发明还提供了试剂盒在制备检测胃癌疾病药物中的应用。本发明优点在于：本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

权利要求

1.一种GKN2基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测胃癌疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

3 35 125 32

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的放射性核素选自 H、S、 I或 P中的一种。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的非放射性标记物优选自地高辛。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。

7.一种GKN2基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其特征在于，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

说明书

一种GKN2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应

用

【技术领域】

[0001] 本发明涉及一种试剂盒，具体地说关于一种GKN2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用。【背景技术】

[0002] 根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数160万，死亡人数近160万，患者600万，全球每年新增癌症患者800万，死亡人数接近800万，患者约有8400万人，到2020年以上人数将翻一番，这是一组可怕的数字。根据最新报道，胃癌在全世界范围内是发病率最高的癌症之一，男性的发病率是女性的1.5～2.5倍。胃癌的发病率随着年龄的增加而显著升高，以男性胃癌发病率为例，45～54岁发病率为70/10万，55～64岁阶段为145.7/10万，65～74岁为264.3/10万。发病的高峰年龄在50岁～80岁。大约
90％的胃癌属于腺癌，可分为两个主要类型：(1)肠型胃癌，分化较好，在男性、老年患者中更常见。肠型胃癌在高风险地区中占主导地位，比如东亚、东欧、中南美洲等地区。(2)弥漫型胃癌，分化不好，在男性与女性中发病率更接近，在年轻患者中更常见。弥漫型胃腺癌的地区分布更均匀，与A型血及遗传关系密切。近几十年来肠型胃癌的发病率明显下降，带动了胃癌的整体发病率的降低，而弥漫型胃癌发病率却上升了。2002年全球每10万名男性发生胃癌的的人数为22人，女性为10.4人；死亡率在男性中为每10万人16.3人，女性为
7.9人。2002年全世界估计有90万胃癌新患者(其中男性为60万，女性为33万)，同时有
70万人死于胃癌(男性为45万人，女性为25万人)。男性中，胃癌的发病率仅次于胃癌和前列腺癌，而死亡率仅次于肺癌居第二位。在女性中，胃癌的发病率居第五位，排在乳腺癌、宫颈癌、肺癌和肠癌之后。按地理分布，有三分之二的胃癌分布在日本、中国、韩国、中南美洲、东欧和中东的部分地区，在北美、澳大利亚和新西兰、北欧和印度的发病率较低。发达国家的胃癌的发病率和死亡率在近几十年有显著下降了，美国在20世纪50年代年死亡率约为22/10万，90年代下降至3.7/10万以下。日本近年来亦有明显下降趋势，这得益于采用X线钡餐检查或胃镜定点筛查，大大提高了早期胃癌的检出率。我国胃癌的发病状况，胃癌占癌症死亡人数的近四分之一我国是胃癌的高发区，胃癌年患病率和死亡率均是世界平均水平的2倍多。在卫生部组织的1990～1992年全国第二次死因调查中，中国胃癌的粗死亡率为25.2/10万(男性为32.8/10万，女性为17.0/10万)，占到所有因癌症死亡人数的
23.2％，接近四分之一。

[0003] 男性发病率下降，女性发病率上升。根据全国肿瘤防治办公室杨玲博士2006年发表在《世界胃肠病学杂志》中的文章的估计，2005年中国胃癌发病率在男性中达37.1/10万，女性中为17.4/10万。每年新发胃癌患者达40万人，死亡人数达30万人，胃癌将是中国的第三大常见肿瘤(在男性中排在肺癌和肝癌之后，女性排在乳腺癌和肺癌之后)。从2000年到2005年间，胃癌的发病率和死亡率轻微的下降了，但这种下降的趋势是由男性引起的，相反，女性的胃癌发病率和死亡率都有上升的趋势。

[0004] 人们普遍认为，胃癌发病率的下降主要与膳食方式的改变及冰箱的普及有关。上海市区1972年男性胃癌的发病率为62/10万，女性为23.9/10万，而1995年男女发病率分别降至36/10万和18/10万，尤以男性明显。但要警惕的是，胃癌正在逼近年轻人，近年来我国青年人胃癌占全部胃癌总数的比率已由上个世纪70年代的1.7％上升到3.3％。胃癌发病率在城市中下降，在农村中大幅上升，从1973～1975年到1990～1992年的二十年间，胃癌的发病率升高了10％。城市人口胃癌发病率下降了23.8％，但在农村人口中增加了25.8％，因为中国三分之二的人口住在农村，所以胃癌仍是所有人口中最常见的癌症之一，而在城市中发病率居所有肿瘤的第三位。

[0005] 胃癌筛查可大大降低死亡率，总的说来，胃癌发病率高的地区，其患者的生存率反而更好，这主要是由于高发病的地区的胃癌在胃部的生长部位有关。肿瘤发生在幽门窦的预后比发生在贲门部位要好。对高风险地区的人群进行早期筛查有助于降低死亡率，例如日本对一些地区进行了大规模的胃癌筛查，男性的胃癌死亡率自二十世纪70年代以来几乎减少了50％。早期胃癌5年生存率可达95％

[0006] 如果胃癌仅限于胃壁的粘膜层，5年的生存率可达95％。然而，目前很少有胃癌患者在早期被发现，导致5年生存率在20％～50％。因而早期发现，早诊早治是提高胃癌治愈率、降低死亡率的关键。

[0007] 2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等多家单位做了一个年度报告，“认为人类在抗癌大战中是失败”，也就是说癌症死亡率没有降低，其列举出造成抗癌大战失败的几个因素是：1.肿瘤细胞异质性；2.肿瘤细胞耐药性；3.抗癌药物设计思路不完善等。同时，该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌症的措施。

[0008] 本发明人在研究中发现，导致癌症死亡率不降的另一个重要原因是，不能做到真正的早期诊断。依照传统的医学影像及和其它生化(如蛋白标记物)指标来诊断癌症，认为占位性癌块在2公分下是属于早期癌症的诊断(更小些有时无症状体征)，这一概念值得认真讨论。影像医学的2公分以下癌块属早期这一界定科学性是不够严谨的，从细胞学角度，1公分的肿块约有一亿个肿瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止2亿个肿瘤细胞，从癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成2公分的癌块，其病理演变过程相当长，可能是一年或两年、甚至三年以上，很难证实的是在这个过程中，肿块是癌症唯一的发生地和单独的病灶。临床上已证实：一旦形成肿块的同时，其他癌细胞通过不同途径迁移到其他部位克隆生长；一旦切除原发灶后，其他器官复发灶或多发癌块灶先后形成或转移。因此，在临床上以2公分以下的肿块大小来界定早期与否，不够严谨(有些病例，在发现原发病灶时，同时发现转移病灶，不在我们表述的内容中)，这时已经是晚期了，这是导致癌症死亡率不降的真正原因。

[0009] 随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，至今，我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆时)就能做到早期预测诊断。

[0010] 美国罗德岛医院的研究者发现两种分子标志物可用于预测胃癌患者的预后情况。胃癌是世界上最常见，也是最致命的癌症之一。胃癌外科手术后的不良表现通常与两种蛋白低表达量有关。这两种蛋白就是gastrokinel和gastrokine2(GKN1和GKN2)，通常被正常的胃细胞表达这两种蛋白。这一研究结果与以前的研究结果一致，当胃细胞表现成癌症特征时，GKN1和GKN2蛋白的表达量就十分低。这一研究是首次将低表达量的GKN与胃癌手术后的预后相结合。这发现可帮助内科医生更好地诊断胃癌患者的病况，提供个性化的治疗方案，判断哪些患者需要进行化疗，哪些患者需要接受额外的外科手术治疗。医学博士steven moss说胃癌是一种很难治疗的癌症，除非能在胃癌早期就诊断出来接受及时的治疗，但是胃癌早期通常缺乏有效的诊断线索。因此很不幸的是胃癌被诊断出来时往往已经是晚期癌症了。该项研究发现具有深远的意义。因为一旦我们的研究证实这一潜在诊断标志物有助诊断病人的预后情况，我们就可以应用这一成果拯救更多的胃癌患者，为胃癌患者提供个性化的治疗方案，使他们活得更久，活得更舒适。

[0011] 据美国国立癌症研究所统计。每年在世界范围内有大约760,000个病例被诊断为胃癌。从病理学的角度来说，胃癌可分成两种亚型。一种是扩散型(一种更具有侵袭性的癌症形式可发生于胃癌的任一阶段，一旦成为弥漫型癌细胞的移动性更强)，另一种是肠型(这在小肠或大肠里见到扩散的癌细胞)。胃癌的两种形式通常都是由于一种细菌慢性感染所致，这就是幽门螺旋杆菌(H.pylori)幽门螺旋杆菌是引起胃炎和胃溃疡的常见致病菌。外科手术是治疗胃癌的常用手段，可将胃部分切除或全部摘除。胃癌患者有5年生存率的达24％。

[0012] Moss是幽门螺旋菌研究方面的专家，他和同事首先研究幽门螺旋杆菌对正常胃细胞的影响。他的关注的热点在GKN1和GKN2，因为通常幽门螺旋杆菌感染者细胞里这两种蛋白的表达受到抑制。

[0013] 研究者对150名接受外科手术治疗的胃癌患者进行组织采样，结果发现大部分的胃癌患者GKN1和GKN2的表达都受到抑制，这些证据在弥漫型胃癌患者中特别明显。超过3/4的患者细胞里GKN1的表达量相当低，85％的患者细胞几乎没有GKN2存在。并且，肠型胃癌患者手术后GKN1和GKN2的表达量更低，而GKN1和GKN2表达量低的患者往往预后不良，这些患者的存活率中值只有两年，而GKN1和GKN2表达量正常的胃癌患者存活时间可达
10年以上。

[0014] 研究者现在不清楚GKN1和GKN2的确切功能，他们说深入的研究将会对GKN1和GKN2的分子作用机制进一步明确，并且可能将GKN1和GKN2作为潜在的临床诊断指标。该研究采集的组织样本来自155名外科手术后的胃癌患者(其中81名男性患者，74名女性患者)这些病人全来自美国罗德岛医院，接受手术的平均年龄是72岁，研究中的患者有各个阶段的，其中73名为胃癌I期患者，44名为II期患者，34名为III期患者，40名是IV期患者，其中超过60名是肠型胃癌患者，90名是弥漫型胃癌患者。

[0015] 目前对GKN基因的研究都采用高通量基因芯片技术，而这一方法多用于科研方面，不适应临床应用，特别是个性化检测应用在我国现阶段尚未见报道。根据现有的文献资料及查新报告GKN1基因的检测技术及检测试剂盒未见报道。

[0016] 原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。

[0017] 中国专利文献CN1556221公开了“IC53基因及其相关产物诊断和治疗结肠癌的用途及一种诊断结肠癌的试剂盒”。中国专利文献CN1769485公开了“栉孔扇贝病原类立克次氏体的原位杂交检测方法及其试剂盒”。中国专利文献CN1556410公开了“一种鱼类病毒的检测试剂盒及其检测方法”。中国专利文献CN1680597公开了“一种用于定量检测丙型肝炎病毒(HCV)的荧光定量PCR试剂盒”。中国专利文献CN2918435，公开了“一种检测肥胖相关基因SNP的寡核苷酸芯片及试剂盒”。但是，关于GKN2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测技术未见报道。【发明内容】

[0018] 本发明的目的是，提供一种GKN2基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测胃癌疾病药物中的应用。

[0019] 本发明的再一的目的是，提供一种GKN2基因的原位杂交检测试剂盒。

[0020] 本发明的再一的目的是，提供一种GKN2基因原位杂交检测方法。

[0021] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种GKN2基因的原位杂交检测试剂盒，在制备检测胃癌疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，其中所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。GKN2基因序列见SEQ ID NO.1，GKN2基因的核苷酸序列长度是826bp，CDS：110..664，位于染色体2p14”位点上。

[0022] 所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示的RNA序列。

[0023] 所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

[0024] 所述的放射性核素选自3H、35S、125I或32P中的一种。

[0025] 所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。

[0026] 所述的非放射性标记物优选自地高辛。

[0027] 其中，所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。

[0028] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种GKN2基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其中，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

[0029] 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：一种GKN2基因原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤：

[0030] a、将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；

[0031] b、检测a步骤得到的杂交复合体。

[0032] 所述a步骤中形成杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16—24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。

[0033] 本发明的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相结合，以GKN2基因为检测对象，合成探针是GKN2基因的DNA或RNA序列，检测的底物是人体血液标本白细胞或组织细胞的RNA的表达量。原位杂交技术的显示方法能提供GKN2基因的半定量或定量表达程度判定。根据杂交后免疫组化显色判定以上基因的表达量，正常人GKN2基因高表达，GKN2基因在胃癌晚期病人低表达，和正常人有显著差异。本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括：

[0034] 仪器操作：

[0035] 1).将待测标本放入反应槽中；

[0036] 2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；

[0037] 3).仪器自动弃去液体，自动后固定；

[0038] 4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42℃)；

[0039] 5).仪器自动弃去液体，自动清洗；

[0040] 6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42℃)；

[0041] 7).仪器自动弃去液体，自动清洗；

[0042] 8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；

[0043] 9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；

[0044] 10).取出封片镜检。

[0045] 本发明优点在于：

[0046] 1、本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。

[0047] 2、本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。克服了目前对GKN2基因的研究都采用高通量基因芯片方法，而这些方法多用于科研方面，不适应临床应用的缺陷。

[0048] 3、本发明的临床意义是更早期跟踪检测胃癌发生状况，以及用于癌症预防医学检测。本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物，以及影像医学检查有显著不同。本发明可以在基因水平上检测基因异常表达，在影像医学检查未发现占位性癌病灶之前，癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿块之前，能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床胃癌病患一个真正的早期诊断和转移侵入以及治疗后转移复发及早预测。这样才有可能实施胃癌的早期诊断、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治胃癌恶疾。
【附图说明】

[0049] 图1是本发明实施例中胃癌病人GKN2基因低表达图。

[0050] 图2是本发明实施例中正常人GKN2基因表达图。【具体实施方式】

[0051] 下面结合图对本发明提供的一种GKN2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用的具体实施方式做详细说明。

[0052] 实施例1

[0053] 一种GKN2基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物、增效剂，其中，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。杂交探针用地高辛标记。试剂盒中的其它液体和标本组成如下：

[0054] 消化液 100μl/管 1管/盒 无色透明液体

[0055] 保护液 100μl/管 1管/盒 无色透明液体

[0056] 预杂交液 1300μl/管 2管/盒 无色透明液体

[0057] 正义杂交液 10μl/管 1管/盒 无色透明液体

[0058] 反义杂交液 10μl/管 1管/盒 无色透明液体

[0059] 封闭液 1000μl/管 1管/盒 无色透明液体

[0060] 碱性磷酸酶抗体 1μl/管 1管/盒 无色透明液体

[0061] 显色剂A 175μl/管 1管/盒 黄色液体

[0062] 显色剂B 320μl/管 1管/盒 无色透明液体

[0063] 缓冲液 I 10x 90ml/瓶 1瓶/盒 浅黄色或无色透明液体[0064] 缓冲液II 10x 80ml/瓶 1瓶/盒 浅黄色或无色透明液体[0065] 缓冲液III 10x 20m/瓶 3瓶/盒 浅黄色或无色透明液体[0066] 缓冲液IV 10x 90ml/瓶 1瓶/盒 浅黄色或无色透明液体[0067] 固定液 90ml/瓶 1瓶/盒 无色透明液体

[0068] 阳性对照标本 6片/盒

[0069] 上述试剂成分说明：(所有试剂购自SIGMA)

[0070] 1、消化液：20mg/ml蛋白酶K，100mg蛋白酶K，加DEPC-H2O 5ml；

[0071] 2、保护液：0.2g的glycine加入1ml的1×缓冲液 I；

[0072] 3、预杂交液：1×缓冲液II 7.5ml

[0073] 50×D 3ml

[0074] 10mg/ml yest t-RNA 750ul

[0075] 11mg/ml SALMON TESTES DNA 682ul

[0076] 0.04M EDTA 3ml

[0077] 50％ formamide 15ml

[0078] 4、封闭液：0.03g的bloking(购买自罗氏公司)加入1ml1×缓冲液III；

[0079] 5、10x缓冲液I：(PH7.1-7.4)

[0080] NaCl 80g

[0081] Na2HPO4·12H2O 360g

[0082] KCl 2g

[0083] KH2PO4 2g

[0084] 加三蒸水至1l，并高压灭菌；

[0085] 6、10x缓冲液II：(PH7.0)

[0086] NaCl 175.3g

[0087] 柠檬酸钠 88.2g

[0088] HCl 几滴

[0089] 加三蒸水至1l，并高压灭菌；

[0090] 7、缓冲液III：(PH7.9)

[0091] Tris 121.1g

[0092] NaCl 87.66g

[0093] HCl 60ml左右

[0094] 加三蒸水至1l，并高压灭菌；

[0095] 8、缓冲液IV：

[0096] 1M Tris-HCl(PH9.5)：Tirs 121.1g加HCl 3ml左右，加水900ml，调PH至9.5，加水至1l，并高压灭菌；

[0097] 1M NaCl：NaCl 58.44加水至1l，并高压灭菌；

[0098] 0.5M MgCl2：101.65g MgCl2.6H2O加水至1l，并高压灭菌；

[0099] 9、固定液：多聚甲醛40g加1×缓冲液I至1l，稍加热(约50-60度)搅拌至溶解；

[0100] 10、显色剂A：NBT 1g加70％DMF11.44ml；

[0101] 11、显色剂B：BCIP 1g加100％DMF30ml。

[0102] 本发明的试剂盒可以多人份使用或一人份使用。

[0103] 实施例2

[0104] 一种GKN2基因原位杂交检测方法及其试剂盒应用

[0105] 一、标本处理

[0106] 1、用10ml的离心管，装4.5ml淋巴细胞分离液，再将3ml抗凝血缓慢加入含有淋巴细胞分离液(血：淋巴细胞分离液＝1:1.5)的离心管中，2000r/min离心10min；

[0107] 2、吸取中间层白细胞至另一离心管中，再在此管中加入约两倍的1×缓冲液I，混匀，1500g/min离心10 min；

[0108] 3、弃上清.沉淀加入约两倍的1×缓冲液I，混匀，1500g/min离心10 min；

[0109] 4、弃上清，并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。再将沉淀制成悬液，滴在玻片上推片，自然干燥。(有条件的医院可以用制片机制片。)3 ml血，可以做4张片子；

[0110] 5、用40ml4％固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用1×缓冲液I洗5min。每缸可以放16片；

[0111] 6、标本可保存在-20℃，或继续做实验。

[0112] 二、将试剂盒中试剂配制成使用浓度

[0113] 1、将10×缓冲液I用三蒸水按1:10稀释成1×缓冲液I；

[0114] 2、将20×缓冲液II用三蒸水按1:10稀释成2×缓冲液II；

[0115] 按1:100稀释成0.2×缓冲液II；按1:200稀释成0.1×缓冲液II；

[0116] 3、将10×缓冲液III用三蒸水按1:10稀释成1×缓冲液III；

[0117] 4、10×缓冲液IV用三蒸水按1:10稀释成×缓冲液IV(取1#，2#，3#各10ml，加水至100ml既可)。

[0118] 三、实验步骤：

[0119] 1、取每位待检者标本两张，(另外两张留作复查用)及阳性对照标本两张(每次实验做一对阳性对照)；

[0120] 2、在玻璃缸里加消化液(消化液100ul加1×缓冲液199.9ml，即为使用浓度)20ml。37℃水浴预热10分钟。放进16张玻片，37℃处理12min，再用1×缓冲液I洗5min；

[0121] 3、用0.2％的保护液(保护液1ml加1×缓冲液I99ml即为使用浓度)洗10min，三蒸水洗5min，以上过程都在玻璃缸进行。玻片自然干燥；

[0122] 4、将玻片放入保湿盒内，加预杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中3h以上；

[0123] 5、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70％，90％，95％的乙醇各洗2min，自然干燥；

[0124] 6、将玻片放入保湿盒内，每位病人标本两张，一张加正义杂交液20ul/片，另一张加反义杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中16-24h；

[0125] 7、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内

[0126] 在42℃恒温水浴箱中用2×缓冲液II洗两次，每次15min

[0127] 在42℃恒温水浴箱中用0.2×缓冲液II洗一次，每次15min

[0128] 在42℃恒温水浴箱中用0.1×缓冲液II洗两次，每次15min；

[0129] 8、用1×缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥；

[0130] 9、将玻片放入保湿盒内，加0.5％l封闭液(1ml封闭液加5ml1×缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min；

[0131] 10、取出玻片，用1×缓冲液III洗30s，自然干燥；

[0132] 11、将玻片放入保湿盒内，加碱性磷酸酶抗体(加入1.8ml1×缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒在室温下作用30min；

[0133] 12、取出玻片，用1×缓冲液III洗3次，每次15min；

[0134] 13、1×缓冲液IV洗2min，加显色剂(显色剂A73.3ul，显色剂B157.5ul加到30ml1×缓冲液IV中，混匀)，室温避光12h以上；

[0135] 14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10％的1×缓冲液I混匀)封片镜检。

[0136] 四、结果判断

[0137] 在光镜下计数100-300个细胞，计算染上紫色细胞的百分比。

[0138] 阳性对照标本加反义杂交液的应该80％以上染上紫色。

[0139] 所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。

[0140] 胃癌病人GKN2基因低表达图见图1。正常人GKN2基因表达图见图2。

[0141] 地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点)，将该杂交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。

[0142] 本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的GKN2基因表达量，用来确定胃癌是否发生，临床研究表明，GKN2基因是胃癌的抑癌基因，因为GKN2基因在正常人中高表达，如果GKN2基因低表达，说明胃癌已经发生，而且可能已转移，从而获得胃癌症的诊断信息。

[0143] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

[0144] SEQUENCE LISTING

[0145] <110>芮屈生物技术(上海)有限公司

[0146] <120>一种GKN2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用[0147] <130>/

[0148] <160>1

[0149] <170>PatentIn version 3.1

[0150] <210>1

[0151] <211>826

[0152] <212>DNA

[0153] <213>智人(Homo sapiens)

[0154] <400>1

[0155]