脱水河豚毒素高纯单体的制备方法

摘要

脱水河豚毒素高纯单体的制备方法，涉及一种天然杂环化合物，尤其是涉及一种用于高纯单体，特别是高纯药源单体的脱水河豚毒素的制备方法。提供一种操作简便、收率高、适于规模化生产、所制备的脱水河豚毒素高纯单体的纯度高于98％、特别是用于高纯药源单体的脱水河豚毒素高纯单体的制备方法。以河豚毒素粗品为原料，醋酸水溶液为溶媒，配制成待分离制备液；将待分离制备液转入制备型高效液相-质谱仪器系统的储料管中，选择流动相，启动制备型高效液相-质谱仪器系统，进行分离纯化制备脱水河豚毒素，得脱水河豚毒素纯化液，流动相选择醋酸体系、三氟乙酸体系或醋酸-醋酸铵体系等；将脱水河豚毒素纯化液真空浓缩，低温结晶，干燥，得产品。

权利要求

1.脱水河豚毒素高纯单体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)以河豚毒素粗品为原料，醋酸水溶液为溶媒，配制成待分离制备液；

醋酸水溶液的浓度为0.01％～6.0％；待分离制备液中河豚毒素粗品的浓度为10～

50mg/ml；

2)将待分离制备液转入制备型高效液相-质谱仪器系统的储料管中，选择流动相，启动制备型高效液相-质谱仪器系统，进行分离纯化制备脱水河豚毒素，得脱水河豚毒素纯化液，流动相选择醋酸体系、三氟乙酸体系或醋酸-醋酸铵体系；

醋酸体系选自醋酸水溶液、醋酸-甲醇水溶液、醋酸-乙睛水溶液中的一种；三氟乙酸体系选自三氟乙酸水溶液、三氟乙酸-甲醇水溶液、三氟乙酸-乙腈水溶液中的一种；醋酸-醋酸铵体系选自醋酸-醋酸铵水溶液、醋酸-醋酸铵-甲醇水溶液、醋酸-醋酸铵-乙腈水溶液中的一种；

按质量百分比，各种流动相的浓度分别为：醋酸体系：醋酸的浓度为0.01％～1.0％；

甲醇的浓度为0～50％，乙腈的浓度为0～50％；三氟乙酸体系：三氟乙酸的浓度为

0.01％～1.0％，甲醇的浓度为0～50％，乙腈的浓度为0～50％；醋酸-醋酸铵体系：醋酸的浓度为0.01％～2.0％，醋酸铵的浓度为0.01％～2.0％，甲醇的浓度为0～50％，乙腈的浓度为0～50％；

3)将脱水河豚毒素纯化液真空浓缩，低温结晶，干燥，得脱水河豚毒素高纯单体。

2.如权利要求1所述的脱水河豚毒素高纯单体的制备方法，其特征在于在步骤1)中，按质量百分比，河豚毒素粗品中脱水河豚毒素的含量大于10％。

3.如权利要求1所述的脱水河豚毒素高纯单体的制备方法，其特征在于在步骤1)中，待分离制备液进行加热转化，加热的温度为30～100℃；加热的时间为0.1～24h。

4.如权利要求3所述的脱水河豚毒素高纯单体的制备方法，其特征在于所述加热的温度为70～90℃；加热的时间为4～8h。

5.如权利要求1所述的脱水河豚毒素高纯单体的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述制备型高效液相-质谱仪器系统选用的制备柱采用C4、C8、C18或离子交换色谱柱，制备柱的直径为10～50mm。

6.如权利要求1所述的脱水河豚毒素高纯单体的制备方法，其特征在于在步骤2)中，将待分离制备液转入制备型高效液相-质谱仪器系统的储料管中，待分离制备液的进样量为0.1～10.0ml/次。

7.如权利要求6所述的脱水河豚毒素高纯单体的制备方法，其特征在于所述待分离制备液的进样量为1.0～5.0ml/次。

8.如权利要求1所述的脱水河豚毒素高纯单体的制备方法，其特征在于在步骤2)中，流动相的流速为5.0～150.0ml/min；所述真空浓缩的温度为25～50。

9.如权利要求8所述的脱水河豚毒素高纯单体的制备方法，其特征在于所述流动相的流速为10.0～50.0ml/min；所述真空浓缩的温度为30～40℃。

10.如权利要求1所述的脱水河豚毒素高纯单体的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述低温结晶的温度为0～15℃。

11.如权利要求10所述的脱水河豚毒素高纯单体的制备方法，其特征在于所述低温结晶的温度为2～10℃。

说明书

脱水河豚毒素高纯单体的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种天然杂环化合物，尤其是涉及一种用于高纯单体，特别是高纯药源单体的脱水河豚毒素的制备方法。

背景技术

[0002] 脱水河豚毒素(Anhydrotetrodotoxin，简称Anh-TTX)是一种与河豚毒素(Tetrodotoxin，简称TTX)结构非常相似的氨基全氢喹唑啉类化合物，在自然界中一般与TTX共存，主要存在于河豚鱼的卵巢、肝脏、皮肤和肠胃中。Anh-TTX在上述生物体中的含量+仅次于TTX，是一种极其重要的TTX衍生物。Anh-TTX是生物细胞Na 通道阻滞剂，主要的+
生理作用是可快速阻断Na 通道，可广泛应用于神经生物学和生理学及其他科学研究，其毒性远低于TTX，约为TTX毒力的1％，是一种具有广阔药用前景的化合物。

[0003] Anh-TTX在生物体内含量极低，约为百万分之一至千万分之一，而且在生物体内含有与Anh-TTX的分子结构、分子量及理化性质都非常接近的共有组分。因此，获取高纯度的Anh-TTX非常困难。20世纪80年代，Munetomo Nakamura等人(Nakamura M.，Yasumoto T.，tetrodotoxin derivatives in puffer fish，Toxicon.1985，23(2)：271-276)和Takeshi Yasumoto 等 人 (Takeshi Yasumoto，Mari Yotsu，Michio Murata，New tetrodotoxin analogues from the newtcynops ensicauda，J.Am.Chem.Soc.，1988，110，2344-2345)先后采用活性炭柱、Bio-Gel P-2柱、Bio-Rex70柱、Hitachi-gel柱和TSK-gel柱等实现分离纯化，再通过浓缩、沉淀、干燥等步骤获得Anh-TTX，该工艺冗长，得率低。

[0004] 公告号为CN1206009的中国发明专利提供一种提取脱水河豚毒素的方法，所用原料为纯化河豚毒素的母液，经高效液相色谱分离，再经离子交换树脂、生物凝胶脱盐回收得到脱水河豚毒素结晶。该工艺从2g粗品TTX中可获得60mg纯度在97％以上的Anh-TTX。

[0005] 公告号为CN1361107的中国发明专利以提纯TTX时所残留的溶液为原料，采用高效液相方法，以庚烷磺酸钠溶液为流动相及ODS柱分离，再经温热下减压浓缩，然后用浓氨水调节为碱性，低温下放置沉淀，然后水洗，真空干燥，得到Anh-TTX结晶。该工艺从1g粗品TTX中可获得65mg纯度在97％以上的Anh-TTX。

[0006] 上述中国发明专利为发展Anh-TTX制备技术起到了积极的作用，但其工艺存在以下问题：(1)所采用的流动相为不易挥发的磷酸盐或庚烷磺酸钠体系，后续工艺很难完全去除这些不挥发性盐，从而影响Anh-TTX纯品的质量和收率。(2)对有关理化特性与Anh-TTX十分相近的共有组分难以有效分离，无法满足制备高纯Anh-TTX所需的工艺要求。(3)Anh-TTX收率较低，难以满足规模化生产Anh-TTX高纯单体的要求。因此，迫切需要研发适于制备脱水河豚毒素高纯单体的方法。

发明内容

[0007] 本发明的目的是针对采用现有制备高纯脱水河豚毒素的工艺所存在的不足，提供一种操作简便、收率高、适于规模化生产、所制备的脱水河豚毒素高纯单体的纯度高于98％、特别是用于高纯药源单体的脱水河豚毒素高纯单体的制备方法。

[0008] 本发明的技术方案是在HPLC—UV联用技术的基础上，采用制备型高效液相—质谱(HPLC-MS)仪器系统制备高纯脱水河豚毒素。

[0009] 本发明包括以下步骤：

[0010] 1)以河豚毒素粗品为原料，醋酸水溶液为溶媒，配制成待分离制备液；

[0011] 2)将待分离制备液转入制备型高效液相-质谱仪器系统的储料管中，选择流动相，启动制备型高效液相-质谱仪器系统，进行分离纯化制备脱水河豚毒素，得脱水河豚毒素纯化液，流动相选择醋酸体系、三氟乙酸体系或醋酸-醋酸铵体系等；

[0012] 3)将脱水河豚毒素纯化液真空浓缩，低温结晶，干燥，得脱水河豚毒素高纯单体。

[0013] 在步骤1)中，按质量百分比，河豚毒素粗品中脱水河豚毒素的含量最好大于10％，醋酸水溶液的浓度最好为0.01％～6.0％，待分离制备液中河豚毒素粗品的浓度为5～100mg/ml，优选10～50mg/ml；待分离制备液最好进行加热转化，使部分河豚毒素(TTX)转化为脱水河豚毒素(Anh-TTX)，加热的温度可为30～100℃，最好为70～90℃，加热的时间可为0.1～24h，最好为4～8h。

[0014] 在步骤2)中，醋酸体系最好选自醋酸水溶液、醋酸-甲醇水溶液、醋酸-乙睛水溶液等中的一种；三氟乙酸体系最好选自三氟乙酸水溶液、三氟乙酸-甲醇水溶液、三氟乙酸-乙腈水溶液等中的一种；醋酸-醋酸铵体系最好选自醋酸-醋酸铵水溶液、醋酸-醋酸铵-甲醇水溶液、醋酸-醋酸铵-乙腈水溶液等中的一种；按质量百分比，各种流动相的浓度最好分别为：醋酸体系：醋酸的浓度为0.01％～1.0％；甲醇的浓度为0～50％，乙腈的浓度为0～50％；三氟乙酸体系：三氟乙酸的浓度为0.01％～1.0％，甲醇的浓度为0～50％，乙腈的浓度为0～50％；醋酸-醋酸铵体系：醋酸的浓度为0.01％～2.0％，醋酸铵的浓度为0.01％～2.0％，甲醇的浓度为0～50％(浓度为0表示可不必加甲醇)，乙腈的浓度为0～50％(浓度为0指的是不加乙腈)。

[0015] 所述制备型高效液相-质谱仪器系统选用的制备柱最好采用C4、C8、C18或离子交换色谱柱等；制备柱的直径最好为10～50mm。

[0016] 将待分离制备液转入制备型高效液相-质谱仪器系统的储料管中，待分离制备液的进样量可为0.1～10.0ml/次，优选1.0～5.0ml/次。

[0017] 流动相的流速可为5.0～150.0ml/min，优选10.0～50.0ml/min。

[0018] 在步骤3)中，所述真空浓缩的温度可为25～50℃，优选30～40℃；所述低温结晶的温度可为0～15℃，优选2～10℃。

[0019] 本发明以河豚毒素粗品为原料，先用醋酸水溶液为溶媒，制成每毫升含5～100mgTTX粗品的待分离制备液，加热使部分TTX转化为Anh-TTX以增加目标产物的含量，采用制备型高效液相-质谱(HPLC-MS)仪器系统，在紫外检测制备Anh-TTX目标产物的基础上同时联用质谱检测技术，通过质谱检测的Anh-TTX分子量信息，触发组分收集器收集所需的目标产物化合物，突破了脱水河豚毒素(Anh-TTX)高纯单体全自动化批量制备的关键技术，并有效解决了脱水河豚毒素高纯单体制备过程有关理化性质十分相近的衍生物杂质的分离控制问题，最终产物为无臭的白色结晶纯品，脱水河豚毒素高纯单体纯度大于98％。

[0020] 本发明的操作简便、收率高、制备过程自动化控制、高通量、高分离度、适于规模化生产。本发明制备的脱水河豚毒素可作为海洋生物毒素标准试剂产品或作为高纯药源单体用于人用药物开发用途，纯度大于98％。

具体实施方式

[0021] 实施例1

[0022] 制备原料：河豚毒素粗品，配制成每毫升含20mg粗品的待分离制备液，于90℃下保持5h，使部分TTX转化为Anh-TTX以增加目标产物的含量，放冷，备用。

[0023] 仪器：制备型HPLC-MS仪器系统。

[0024] 色谱系统：色谱柱：C8柱(250mm×20mm)。

[0025] 流动相：0.03％醋酸水溶液。

[0026] 质谱和紫外检测条件：紫外检测波长为200nm；质谱检测器采用离子源为电喷雾离子(ESI)，电离电压(毛细管电压)3.5KV，一级锥孔电压35V，二级锥孔电压3.0V，六级杆透镜电压0.1V，源温度(source temperature)120℃，脱溶剂温度350℃，脱溶剂氮气流速500或700L/h，锥孔氮气流速50L/h，高、低质量数分辨率分别为15，离子能量0.5，数据采集方式采用分子量扫描(Mass Scan)模式和选择离子扫描(SIM)采集模式。

[0027] 进样体积：0.5ml，进样浓度20mg/ml。

[0028] 流动相流速：20ml/min。

[0029] 浓缩温度：30～35℃。

[0030] 结晶温度：2～6℃。

[0031] 通过运行制备型HPLC-MS仪器系统获得Anh-TTX纯化液，纯化液经浓缩结晶，干燥，得到纯度为98.51％的高纯脱水河豚毒素晶体。

[0032] 实施例2

[0033] 制备原料：河豚毒素粗品，配制成每毫升含20mg粗品的待分离制备液，于80℃下保持6h，使部分TTX转化为Anh-TTX以增加目标产物的含量，放冷，备用。

[0034] 仪器：制备型HPLC-MS仪器系统。

[0035] 色谱系统：色谱柱：离子交换色谱柱(250mm×20mm)。

[0036] 流动相：0.04％醋酸+0.04％醋酸铵缓冲液。

[0037] 质谱和紫外检测条件：紫外检测波长为200nm；质谱检测器采用离子源为电喷雾离子(ESI)，电离电压(毛细管电压)3.5KV，一级锥孔电压35V，二级锥孔电压3.0V，六级杆透镜电压0.1V，源温度(source temperature)120℃，脱溶剂温度350℃，脱溶剂氮气流速500或700L/h，锥孔氮气流速50L/h，高、低质量数分辨率分别为15，离子能量0.5，数据采集方式采用分子量扫描(Mass Scan)模式和选择离子扫描(SIM)采集模式。

[0038] 进样体积：2.0ml，进样浓度20mg/ml。

[0039] 流动相流速：30ml/min。

[0040] 浓缩温度：35～40℃。

[0041] 结晶温度：2～4℃。

[0042] 通过运行制备型HPLC-MS仪器系统获得Anh-TTX纯化液，纯化液经浓缩结晶，干燥，得到纯度为98.20％的高纯脱水河豚毒素晶体。

[0043] 实施例3

[0044] 制备原料：河豚毒素粗品，配制成每毫升含20mg粗品的待分离制备液，于70℃下保持7h，使部分TTX转化为Anh-TTX以增加目标产物的含量，放冷，备用。

[0045] 仪器：制备型HPLC-MS仪器系统。

[0046] 色谱系统：色谱柱：C18柱(250mm×20mm)。

[0047] 流动相：0.05％醋酸水溶液。

[0048] 质谱和紫外检测条件：紫外检测波长为200nm；质谱检测器采用离子源为电喷雾离子(ESI)，电离电压(毛细管电压)3.5KV，一级锥孔电压35V，二级锥孔电压3.0V，六级杆透镜电压0.1V，源温度(source temperature)120℃，脱溶剂温度350℃，脱溶剂氮气流速500或700L/h，锥孔氮气流速50L/h，高、低质量数分辨率分别为15，离子能量0.5，数据采集方式采用分子量扫描(Mass Scan)模式和选择离子扫描(SIM)采集模式。

[0049] 进样体积：1.0ml，进样浓度20mg/ml。

[0050] 流动相流速：25ml/min。

[0051] 浓缩温度：35～40℃。

[0052] 结晶温度：6～8℃。

[0053] 通过运行制备型HPLC-MS仪器系统获得Anh-TTX纯化液，纯化液经浓缩结晶，干燥，得到纯度为98.83％的高纯脱水河豚毒素晶体。

[0054] 实施例4

[0055] 制备原料：河豚毒素粗品，配制成每毫升含5mg粗品的待分离制备液，于60℃下保持8h，使部分TTX转化为Anh-TTX以增加目标产物的含量，放冷，备用。

[0056] 仪器：制备型HPLC-MS仪器系统。

[0057] 色谱系统：色谱柱：C8柱(250mm×10mm)。

[0058] 流动相：0.01％醋酸水溶液。

[0059] 质谱和紫外检测条件：紫外检测波长为200nm；质谱检测器采用离子源为电喷雾离子(ESI)，电离电压(毛细管电压)3.5KV，一级锥孔电压35V，二级锥孔电压3.0V，六级杆透镜电压0.1V，源温度(source temperature)120℃，脱溶剂温度350℃，脱溶剂氮气流速500或700L/h，锥孔氮气流速50L/h，高、低质量数分辨率分别为15，离子能量0.5，数据采集方式采用分子量扫描(Mass Scan)模式和选择离子扫描(SIM)采集模式。

[0060] 进样体积：1.0ml，进样浓度5mg/ml。

[0061] 流动相流速：25ml/min。

[0062] 通过运行制备型HPLC-MS仪器系统获得Anh-TTX纯化液，经浓缩、结晶、干燥(方法同实施例1)，得到纯度为99.03％的高纯脱水河豚毒素晶体。

[0063] 实施例5

[0064] 制备原料：河豚毒素粗品，配制成每毫升含10mg粗品的待分离制备液，于50℃下保持9h，使部分TTX转化为Anh-TTX以增加目标产物的含量，放冷，备用。

[0065] 仪器：制备型HPLC-MS仪器系统。

[0066] 色谱系统：色谱柱：C4柱(250mm×15mm)。

[0067] 流动相：0.1％醋酸-10％甲醇水溶液。

[0068] 质谱和紫外检测条件：紫外检测波长为200nm；质谱检测器采用离子源为电喷雾离子(ESI)，电离电压(毛细管电压)3.5KV，一级锥孔电压35V，二级锥孔电压3.0V，六级杆透镜电压0.1V，源温度(source temperature)120℃，脱溶剂温度350℃，脱溶剂氮气流速500或700L/h，锥孔氮气流速50L/h，高、低质量数分辨率分别为15，离子能量0.5，数据采集方式采用分子量扫描(Mass Scan)模式和选择离子扫描(SIM)采集模式。

[0069] 进样体积：1.0ml，进样浓度10mg/ml。

[0070] 流动相流速：30ml/min。

[0071] 通过运行制备型HPLC-MS仪器系统获得Anh-TTX纯化液，经浓缩、结晶、干燥(方法同实施例1)，得到纯度为98.11％的高纯脱水河豚毒素晶体。

[0072] 实施例6

[0073] 制备原料：河豚毒素粗品，配制成每毫升含30mg粗品的待分离制备液，于40℃下保持10h，使部分TTX转化为Anh-TTX以增加目标产物的含量，放冷，备用。

[0074] 仪器：制备型HPLC-MS仪器系统。

[0075] 色谱系统：色谱柱：C4柱(250mm×20mm)。

[0076] 流动相：0.5％醋酸-30％乙腈水溶液。

[0077] 质谱和紫外检测条件：紫外检测波长为200nm；质谱检测器采用离子源为电喷雾离子(ESI)，电离电压(毛细管电压)3.5KV，一级锥孔电压35V，二级锥孔电压3.0V，六级杆透镜电压0.1V，源温度(source temperature)120℃，脱溶剂温度350℃，脱溶剂氮气流速500或700L/h，锥孔氮气流速50L/h，高、低质量数分辨率分别为15，离子能量0.5，数据采集方式采用分子量扫描(Mass Scan)模式和选择离子扫描(SIM)采集模式。

[0078] 进样体积：1.0ml，进样浓度30mg/ml。

[0079] 流动相流速：35ml/min。

[0080] 通过运行制备型HPLC-MS仪器系统获得Anh-TTX纯化液，经浓缩、结晶、干燥(方法同实施例1)，得到纯度为98.23％的高纯脱水河豚毒素晶体。

[0081] 实施例7

[0082] 制备原料：河豚毒素粗品，配制成每毫升含50mg粗品的待分离制备液，于90℃下保持1h，使部分TTX转化为Anh-TTX以增加目标产物的含量，放冷，备用。

[0083] 仪器：制备型HPLC-MS仪器系统。

[0084] 色谱系统：色谱柱：C4柱(250mm×30mm)。

[0085] 流动相：1.0％醋酸水溶液。

[0086] 质谱和紫外检测条件：紫外检测波长为200nm；质谱检测器采用离子源为电喷雾离子(ESI)，电离电压(毛细管电压)3.5KV，一级锥孔电压35V，二级锥孔电压3.0V，六级杆透镜电压0.1V，源温度(source temperature)120℃，脱溶剂温度350℃，脱溶剂氮气流速500或700L/h，锥孔氮气流速50L/h，高、低质量数分辨率分别为15，离子能量0.5，数据采集方式采用分子量扫描(Mass Scan)模式和选择离子扫描(SIM)采集模式。

[0087] 进样体积：1.0ml，进样浓度50mg/ml。

[0088] 流动相流速：50ml/min。

[0089] 通过运行制备型HPLC-MS仪器系统获得Anh-TTX纯化液，经浓缩、结晶、干燥(方法同实施例2)，得到纯度为98.15％的高纯脱水河豚毒素晶体。

[0090] 实施例8

[0091] 制备原料：河豚毒素粗品，配制成每毫升含5mg粗品的待分离制备液，于80℃下保持2h，使部分TTX转化为Anh-TTX以增加目标产物的含量，放冷，备用。

[0092] 仪器：制备型HPLC-MS仪器系统。

[0093] 色谱系统：色谱柱：离子交换色谱柱(250mm×10mm)。

[0094] 流动相：0.01％醋酸+0.01％醋酸铵-10％甲醇缓冲液。

[0095] 质谱和紫外检测条件：紫外检测波长为200nm；质谱检测器采用离子源为电喷雾离子(ESI)，电离电压(毛细管电压)3.5KV，一级锥孔电压35V，二级锥孔电压3.0V，六级杆透镜电压0.1V，源温度(source temperature)120℃，脱溶剂温度350℃，脱溶剂氮气流速500或700L/h，锥孔氮气流速50L/h，高、低质量数分辨率分别为15，离子能量0.5，数据采集方式采用分子量扫描(Mass Scan)模式和选择离子扫描(SIM)采集模式。

[0096] 进样体积：1.0ml，进样浓度5mg/ml。

[0097] 流动相流速：10ml/min。

[0098] 通过运行制备型HPLC-MS仪器系统获得Anh-TTX纯化液，经浓缩、结晶、干燥(方法同实施例2)，得到纯度为98.41％的高纯脱水河豚毒素晶体。

[0099] 实施例9

[0100] 制备原料：河豚毒素粗品，配制成每毫升含10mg粗品的待分离制备液，于70℃下保持3h，使部分TTX转化为Anh-TTX以增加目标产物的含量，放冷，备用。

[0101] 仪器：制备型HPLC-MS仪器系统。

[0102] 色谱系统：色谱柱：离子交换色谱柱(250mm×15mm)。

[0103] 流动相：0.1％醋酸+0.1％醋酸铵缓冲液。

[0104] 质谱和紫外检测条件：紫外检测波长为200nm；质谱检测器采用离子源为电喷雾离子(ESI)，电离电压(毛细管电压)3.5KV，一级锥孔电压35V，二级锥孔电压3.0V，六级杆透镜电压0.1V，源温度(source temperature)120℃，脱溶剂温度350℃，脱溶剂氮气流速500或700L/h，锥孔氮气流速50L/h，高、低质量数分辨率分别为15，离子能量0.5，数据采集方式采用分子量扫描(Mass Scan)模式和选择离子扫描(SIM)采集模式。

[0105] 进样体积：1.0ml，进样浓度10mg/ml。

[0106] 流动相流速：20ml/min。

[0107] 通过运行制备型HPLC-MS仪器系统获得Anh-TTX纯化液，经浓缩、结晶、干燥(方法同实施例2)，得到纯度为98.27％的高纯脱水河豚毒素晶体。

[0108] 实施例10

[0109] 制备原料：河豚毒素粗品，配制成每毫升含30mg粗品的待分离制备液，于80℃下保持4h，使部分TTX转化为Anh-TTX以增加目标产物的含量，放冷，备用。

[0110] 仪器：制备型HPLC-MS仪器系统。

[0111] 色谱系统：色谱柱：离子交换色谱柱(250mm×20mm)。

[0112] 流动相：0.5％醋酸+0.5％醋酸铵-30％乙腈缓冲液。

[0113] 质谱和紫外检测条件：紫外检测波长为200nm；质谱检测器采用离子源为电喷雾离子(ESI)，电离电压(毛细管电压)3.5KV，一级锥孔电压35V，二级锥孔电压3.0V，六级杆透镜电压0.1V，源温度(source temperature)120℃，脱溶剂温度350℃，脱溶剂氮气流速500或700L/h，锥孔氮气流速50L/h，高、低质量数分辨率分别为15，离子能量0.5，数据采集方式采用分子量扫描(Mass Scan)模式和选择离子扫描(SIM)采集模式。

[0114] 进样体积：1.0ml，进样浓度30mg/ml。

[0115] 流动相流速：25ml/min。

[0116] 通过运行制备型HPLC-MS仪器系统获得Anh-TTX纯化液，经浓缩、结晶、干燥(方法同实施例2)，得到纯度为98.13％的高纯脱水河豚毒素晶体。

[0117] 实施例11

[0118] 制备原料：河豚毒素粗品，配制成每毫升含50mg粗品的待分离制备液，于60℃下保持5h，使部分TTX转化为Anh-TTX以增加目标产物的含量，放冷，备用。

[0119] 仪器：制备型HPLC-MS仪器系统。

[0120] 色谱系统：色谱柱：离子交换色谱柱(250mm×40mm)。

[0121] 流动相：1.0％醋酸+1.0％醋酸铵缓冲液。

[0122] 质谱和紫外检测条件：紫外检测波长为200nm；质谱检测器采用离子源为电喷雾离子(ESI)，电离电压(毛细管电压)3.5KV，一级锥孔电压35V，二级锥孔电压3.0V，六级杆透镜电压0.1V，源温度(source temperature)120℃，脱溶剂温度350℃，脱溶剂氮气流速500或700L/h，锥孔氮气流速50L/h，高、低质量数分辨率分别为15，离子能量0.5，数据采集方式采用分子量扫描(Mass Scan)模式和选择离子扫描(SIM)采集模式。

[0123] 进样体积：1.0ml，进样浓度50mg/ml。

[0124] 流动相流速：40ml/min。

[0125] 通过运行制备型HPLC-MS仪器系统获得Anh-TTX纯化液，经浓缩、结晶、干燥(方法同实施例2)，得到纯度为98.55％的高纯脱水河豚毒素晶体。

[0126] 实施例12

[0127] 制备原料：河豚毒素粗品，配制成每毫升含5mg粗品的待分离制备液，备用。于60℃下保持6h，使部分TTX转化为Anh-TTX以增加目标产物的含量，放冷，[0128] 仪器：制备型HPLC-MS仪器系统。

[0129] 色谱系统：色谱柱：离子交换色谱柱(250mm×10mm)。

[0130] 流动相：0.01％三氟乙酸水溶液。

[0131] 质谱和紫外检测条件：紫外检测波长为200nm；质谱检测器采用离子源为电喷雾离子(ESI)，电离电压(毛细管电压)3.5KV，一级锥孔电压35V，二级锥孔电压3.0V，六级杆透镜电压0.1V，源温度(source temperature)120℃，脱溶剂温度350℃，脱溶剂氮气流速500或700L/h，锥孔氮气流速50L/h，高、低质量数分辨率分别为15，离子能量0.5，数据采集方式采用分子量扫描(Mass Scan)模式和选择离子扫描(SIM)采集模式。

[0132] 进样体积：1.0ml，进样浓度5mg/ml。

[0133] 流动相流速：10ml/min。

[0134] 通过运行制备型HPLC-MS仪器系统获得Anh-TTX纯化液，经浓缩、结晶、干燥(方法同实施例2)，得到纯度为98.14％的高纯脱水河豚毒素晶体。

[0135] 实施例13

[0136] 制备原料：河豚毒素粗品，配制成每毫升含10mg粗品的待分离制备液，于50℃下保持10h，使部分TTX转化为Anh-TTX以增加目标产物的含量，放冷，备用。

[0137] 仪器：制备型HPLC-MS仪器系统。

[0138] 色谱系统：色谱柱：离子交换色谱柱(250mm×15mm)。

[0139] 流动相：0.1％三氟乙酸+5％甲醇水溶液。

[0140] 质谱和紫外检测条件：紫外检测波长为200nm；质谱检测器采用离子源为电喷雾离子(ESI)，电离电压(毛细管电压)3.5KV，一级锥孔电压35V，二级锥孔电压3.0V，六级杆透镜电压0.1V，源温度(source temperature)120℃，脱溶剂温度350℃，脱溶剂氮气流速500或700L/h，锥孔氮气流速50L/h，高、低质量数分辨率分别为15，离子能量0.5，数据采集方式采用分子量扫描(Mass Scan)模式和选择离子扫描(SIM)采集模式。

[0141] 进样体积：1.0ml，进样浓度10mg/ml。

[0142] 流动相流速：25ml/min。

[0143] 通过运行制备型HPLC-MS仪器系统获得Anh-TTX纯化液，经浓缩、结晶、干燥(方法同实施例2)，得到纯度为98.16％的高纯脱水河豚毒素晶体。

[0144] 实施例14

[0145] 制备原料：河豚毒素粗品，配制成每毫升含30mg粗品的待分离制备液，于40℃下保持10h，使部分TTX转化为Anh-TTX以增加目标产物的含量，放冷，备用。

[0146] 仪器：制备型HPLC-MS仪器系统。

[0147] 色谱系统：色谱柱：离子交换色谱柱(250mm×20mm)。

[0148] 流动相：0.5％三氟乙酸+5％乙腈水溶液。

[0149] 质谱和紫外检测条件：紫外检测波长为200nm；质谱检测器采用离子源为电喷雾离子(ESI)，电离电压(毛细管电压)3.5KV，一级锥孔电压35V，二级锥孔电压3.0V，六级杆透镜电压0.1V，源温度(source temperature)120℃，脱溶剂温度350℃，脱溶剂氮气流速500或700L/h，锥孔氮气流速50L/h，高、低质量数分辨率分别为15，离子能量0.5，数据采集方式采用分子量扫描(Mass Scan)模式和选择离子扫描(SIM)采集模式。

[0150] 进样体积：1.0ml，进样浓度30mg/ml。

[0151] 流动相流速：25ml/min。

[0152] 通过运行制备型HPLC-MS仪器系统获得Anh-TTX纯化液，经浓缩、结晶、干燥(方法同实施例2)，得到纯度为98.37％的高纯脱水河豚毒素晶体。

[0153] 实施例15

[0154] 制备原料：河豚毒素粗品，配制成每毫升含50mg粗品的待分离制备液，于80℃下保持6h，使部分TTX转化为Anh-TTX以增加目标产物的含量，放冷，备用。

[0155] 仪器：制备型HPLC-MS仪器系统。

[0156] 色谱系统：色谱柱：离子交换色谱柱(250mm×30mm)。

[0157] 流动相：1.0％三氟乙酸水溶液。

[0158] 质谱和紫外检测条件：紫外检测波长为200nm；质谱检测器采用离子源为电喷雾离子(ESI)，电离电压(毛细管电压)3.5KV，一级锥孔电压35V，二级锥孔电压3.0V，六级杆透镜电压0.1V，源温度(source temperature)120℃，脱溶剂温度350℃，脱溶剂氮气流速500或700L/h，锥孔氮气流速50L/h，高、低质量数分辨率分别为15，离子能量0.5，数据采集方式采用分子量扫描(Mass Scan)模式和选择离子扫描(SIM)采集模式。

[0159] 进样体积：1.0ml，进样浓度50mg/ml。

[0160] 流动相流速：25ml/min。

[0161] 通过运行制备型HPLC-MS仪器系统获得Anh-TTX纯化液，经浓缩、结晶、干燥(方法同实施例2)，得到纯度为98.29％的高纯脱水河豚毒素晶体。

[0162] 实施例16

[0163] 制备原料：河豚毒素粗品，配制成每毫升含5mg粗品的待分离制备液，于80℃下保持6h，使部分TTX转化为Anh-TTX以增加目标产物的含量，放冷，备用。

[0164] 仪器：制备型HPLC-MS仪器系统。

[0165] 色谱系统：色谱柱：C18柱(250mm×10mm)。

[0166] 流动相：0.01％醋酸水溶液。

[0167] 质谱和紫外检测条件：紫外检测波长为200nm；质谱检测器采用离子源为电喷雾离子(ESI)，电离电压(毛细管电压)3.5KV，一级锥孔电压35V，二级锥孔电压3.0V，六级杆透镜电压0.1V，源温度(source temperature)120℃，脱溶剂温度350℃，脱溶剂氮气流速500或700L/h，锥孔氮气流速50L/h，高、低质量数分辨率分别为15，离子能量0.5，数据采集方式采用分子量扫描(Mass Scan)模式和选择离子扫描(SIM)采集模式。

[0168] 进样体积：1.0ml，进样浓度5mg/ml。

[0169] 流动相流速：15ml/min。

[0170] 通过运行制备型HPLC-MS仪器系统获得Anh-TTX纯化液，经浓缩、结晶、干燥(方法同实施例3)，得到纯度为98.38％的高纯脱水河豚毒素晶体。

[0171] 实施例17

[0172] 制备原料：河豚毒素粗品，配制成每毫升含10mg粗品的待分离制备液，于50℃下保持20h，使部分TTX转化为Anh-TTX以增加目标产物的含量，放冷，备用。

[0173] 仪器：制备型HPLC-MS仪器系统。

[0174] 色谱系统：色谱柱：C18柱(250mm×15mm)。

[0175] 流动相：0.1％醋酸水溶液。

[0176] 质谱和紫外检测条件：紫外检测波长为200nm；质谱检测器采用离子源为电喷雾离子(ESI)，电离电压(毛细管电压)3.5KV，一级锥孔电压35V，二级锥孔电压3.0V，六级杆透镜电压0.1V，源温度(source temperature)120℃，脱溶剂温度350℃，脱溶剂氮气流速500或700L/h，锥孔氮气流速50L/h，高、低质量数分辨率分别为15，离子能量0.5，数据采集方式采用分子量扫描(Mass Scan)模式和选择离子扫描(SIM)采集模式。

[0177] 进样体积：1.0ml，进样浓度10mg/ml。

[0178] 流动相流速：25ml/min。

[0179] 通过运行制备型HPLC-MS仪器系统获得Anh-TTX纯化液，经浓缩、结晶、干燥(方法同实施例3)，得到纯度为98.19％的高纯脱水河豚毒素晶体。

[0180] 实施例18

[0181] 制备原料：河豚毒素粗品，配制成每毫升含30mg粗品的待分离制备液，于40℃下保持24h，使部分TTX转化为Anh-TTX以增加目标产物的含量，放冷，备用。

[0182] 仪器：制备型HPLC-MS仪器系统。

[0183] 色谱系统：色谱柱：C18柱(250mm×20mm)。

[0184] 流动相：0.5％醋酸水溶液。

[0185] 质谱和紫外检测条件：紫外检测波长为200nm；质谱检测器采用离子源为电喷雾离子(ESI)，电离电压(毛细管电压)3.5KV，一级锥孔电压35V，二级锥孔电压3.0V，六级杆透镜电压0.1V，源温度(source temperature)120℃，脱溶剂温度350℃，脱溶剂氮气流速500或700L/h，锥孔氮气流速50L/h，高、低质量数分辨率分别为15，离子能量0.5，数据采集方式采用分子量扫描(Mass Scan)模式和选择离子扫描(SIM)采集模式。

[0186] 进样体积：1.0ml，进样浓度30mg/ml。

[0187] 流动相流速：25ml/min。

[0188] 通过运行制备型HPLC-MS仪器系统获得Anh-TTX纯化液，经浓缩、结晶、干燥(方法同实施例3)，得到纯度为98.17％的高纯脱水河豚毒素晶体。

[0189] 实施例19

[0190] 制备原料：河豚毒素粗品，配制成每毫升含50mg粗品的待分离制备液，于80℃下保持6h，使部分TTX转化为Anh-TTX以增加目标产物的含量，放冷，备用。

[0191] 仪器：制备型HPLC-MS仪器系统。

[0192] 色谱系统：色谱柱：C18柱(250mm×30mm)。

[0193] 流动相：1.0％醋酸水溶液。

[0194] 质谱和紫外检测条件：紫外检测波长为200nm；质谱检测器采用离子源为电喷雾离子(ESI)，电离电压(毛细管电压)3.5KV，一级锥孔电压35V，二级锥孔电压3.0V，六级杆透镜电压0.1V，源温度(source temperature)120℃，脱溶剂温度350℃，脱溶剂氮气流速500或700L/h，锥孔氮气流速50L/h，高、低质量数分辨率分别为15，离子能量0.5，数据采集方式采用分子量扫描(Mass Scan)模式和选择离子扫描(SIM)采集模式。

[0195] 进样体积：1.0ml，进样浓度50mg/ml。

[0196] 流动相流速：35ml/min。

[0197] 通过运行制备型HPLC-MS仪器系统获得Anh-TTX纯化液，经浓缩、结晶、干燥(方法同实施例3)，得到纯度为98.34％的高纯脱水河豚毒素晶体。

[0198] 实施例20

[0199] 制备原料：河豚毒素粗品，配制成每毫升含70mg粗品的待分离制备液，备用。

[0200] 仪器：制备型HPLC-MS仪器系统。

[0201] 色谱系统：色谱柱：C18柱(250mm×40mm)。

[0202] 流动相：0.5％醋酸水溶液。

[0203] 质谱和紫外检测条件：紫外检测波长为200nm；质谱检测器采用离子源为电喷雾离子(ESI)，电离电压(毛细管电压)3.5KV，一级锥孔电压35V，二级锥孔电压3.0V，六级杆透镜电压0.1V，源温度(source temperature)120℃，脱溶剂温度350℃，脱溶剂氮气流速500或700L/h，锥孔氮气流速50L/h，高、低质量数分辨率分别为15，离子能量0.5，数据采集方式采用分子量扫描(Mass Scan)模式和选择离子扫描(SIM)采集模式。

[0204] 进样体积：1.0ml，进样浓度70mg/ml。

[0205] 流动相流速：100ml/min。

[0206] 通过运行制备型HPLC-MS仪器系统获得Anh-TTX纯化液，经浓缩、结晶、干燥(方法同实施例3)，得到纯度为98.18％的高纯脱水河豚毒素晶体。

[0207] 实施例21

[0208] 制备原料：河豚毒素粗品，配制成每毫升含100mg粗品的待分离制备液，备用。

[0209] 仪器：制备型HPLC-MS仪器系统。

[0210] 色谱系统：色谱柱：C18柱(250mm×50mm)。