检测猪瘟病毒的方法和试剂盒、从疫苗菌株中区别感染性菌株的方法

摘要

本发明提供一种检测猪瘟病毒的方法和试剂盒。本发明还提供用于检测猪瘟病毒的寡核苷酸。所述试剂盒包括一对PCR引物和一对SNP巢式PCR引物。

权利要求

1.一种检测猪瘟病毒或从疫苗用猪瘟病毒株中区别感染性猪瘟病毒株的试剂盒，包括(a)SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的一对引物；和(b)SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的一对SNP引物。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还进一步包括如SEQ ID NO.5所示的探针。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述探针标记有磁珠。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述磁性珠通过粘合剂标记在探针上，所述粘合剂包含有1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述如SEQ ID NO.3所示的SNP引物连接有生物素。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素与酶连接，所述酶的底物为发光底物以测量光度。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述酶为辣根过氧化物酶。

说明书

检测猪瘟病毒的方法和试剂盒、从疫苗菌株中区别感染性

菌株的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种用于检测猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)的试剂盒，该试剂盒包括一个探针、一对引物以及一对SNP(单核苷酸多态性)引物，此外本发明还涉及一种用于鉴定CSFV的多聚核苷酸和磁珠探针(Magbeadsprobe)。

背景技术

[0002] 猪瘟(CSF)或猪霍乱是一种家猪和野猪的高传染性疾病。该疾病会导致发热、皮肤损伤及抽搐，且通常导致动物(特别是幼仔)在15天内死亡。其症状与非洲猪瘟的症状难以区分。该疾病流行于亚洲大部分地区、中美洲及南美洲以及欧洲和非洲的部分地区。人们之前认为，在英国猪瘟已于1966年被消灭(根据环境、食品和农村事物部报告)，但该疾病在2000年东安格利亚又一次爆发。根据美国农业部的报告，在美国猪瘟已于1978年被消灭。其它地区，包括澳大利亚、加拿大、爱尔兰、新西兰以及斯堪的纳维亚都被认为没有猪瘟。虽然猪瘟不会在人类引起食源性疾病，但是如果该疾病在任何国家再次发生，都会对猪肉生产者造成巨大的经济损失。

[0003] 健康猪和感染了霍乱的猪的直接接触是最常见的传染方法。该疾病还可通过接触感染动物的身体分泌物以及排泄物而被传染。健康猪接触到受污染的交通工具、猪圈、饲料或者衣饰，都有可能感染疾病。鸟类、昆虫类和人类可以实现将病毒从感染猪携带到健康猪的物理传播。养猪人通过给他们的猪群喂食含有猪油渣的未经过处理的食物废料也会无意中导致感染。

[0004] 猪霍乱的临床症状随感染的程度而有所不同。疾病的形式分为三种：急性、慢性和轻微性。

[0005] 急性猪霍乱是高致命性的，它引发的持续高热可以使体温升高到107℉。急性猪霍乱的另一个症状是抽搐和缺乏食欲。受感染的猪会聚堆或挤作一团。猪霍乱症状在感染后的几天内可能表现得不明显。通常，动物在发病后的5到14天内死亡。

[0006] 慢性猪霍乱与急性猪霍乱的临床症状相似，但没有急性症状剧烈。常发现腹腔皮肤变色、耳及四肢周围出现红斑。感染了慢性猪霍乱的猪在发病后可以活过100天。

[0007] 轻微性猪霍乱或临床症状不明显的猪霍乱很少引发显著的临床症状。感染的猪在经历短期的疾病之后会有一段恢复期。但最终还是会复发。轻微性猪霍乱可以引起猪崽个体小，死产以及其他生殖疾病。断乳期的高死亡率也显示了轻微性猪霍乱的发生。

[0008] 猪瘟是最具破坏性的猪疾病。抑制和最终消除猪瘟需要调查疾病形成和传播的原因，同时还需要有关诊断和预防方法的信息。

[0009] 猪瘟的感染源是黄病毒科(或披膜病毒科)瘟病毒属的CSFV(以前称作猪瘟病毒)病毒。CSFV与主要感染牛的牛病毒性腹泻(BVDV)和边界病(BDV)的反刍动物瘟病毒有很密切的关系。

[0010] 不同的CSFV株病毒作用不同，导致了广泛的临床症状。高致病菌株与急性、明显的疾病和高死亡率有关，包括神经学症状和皮肤出血。低致病菌株可以导致亚急性和慢性疾病的传染，这种类型的传染不易被检测到，但仍然会升高胎儿和新生儿的死亡率。受感染但临床症状不明显的母猪生下受感染的小猪，从而维持了疾病的流行。其它症状包括嗜睡、发热、免疫抑制及次级呼吸道感染。CSFV的潜伏期为2到14天，而症状可能会在2到4周后才明显出现。急性感染的动物在最终死亡前可存活2到3个月。

[0011] 根除CSF是有难度的。目前的方案主要围绕快速检测和诊断，以及预防性的剔除和其后可能采取的紧急接种措施。维持和引入传染的传染源可能包括猪和猪肉产品的广泛运输，还有野猪和野猪种群的地方性CSF。

[0012] 用减毒的活猪瘟病毒(CSFV)疫苗株的“中国”菌株-LPC(也称作C-菌株)接种猪，能保护猪不受CSF感染。使用传统疫苗(例如，LPC)接种猪的主要缺点在于，这些接种了的猪与受CSFV野生株感染的猪在血清学上无法区别开来。然而，LPC被认为是最安全、有效的活疫苗之一。因此，能够鉴别疫苗株和能感染的致病菌株将是很大的进步。

[0013] 瘟病毒的基因组由一条约12.5kb的RNA分子的正链组成。然而，若干非致细胞病变的BVDV菌株的正链RNA分子基因组可能相当的大。

[0014] 尽管核苷酸测试(例如，病毒RNA或者前病毒DNA扩增方法)通常很少利用，但它也可以在一定情形下帮助诊断，并且其变得越来越令人满意。核苷酸测试(NAT)在过去十年因为具有许多用途，其重要性明显增加，例如病毒感染的诊断、抗病毒疗法的监测以及输血安全性的改善等。NAT将病原体基因组的直接和高度序列特异性检测的优点，与比抗原检测和病毒分离法高出几个数量级的分析敏感度相结合。同时，NAT也可以减少在传染和血清转换期间的病毒感染的风险、减少免疫变异病毒感染的风险、减少免疫静止运输的风险、以及隐性携带的风险。

[0015] 单核苷酸多肽性(SNP)是遗传变异最多的形式。由于其频率和分布，SNPs成为了鉴别不同物种或病株的较好的基因标记物。近年来，人们已发展了许多SNP检测方法，包括限制性片段长度多态性(RFLP)分析法、单链构型多态性分析法(SSCP)、等位基因特异的寡核苷酸探针杂交分析法(ASO)、寡核苷酸连接分析法(OLA)、引物延伸分析法、结构特异性flp核酸酶技术。目前，另一种SNP基因分型(genotyping)的方法是等位基因特异性引物延伸(ASPE)。ASPE将新型双组分引物(two component primer)限制在模板上延伸，所述模板可能包括或不包括靶标核酸序列。该引物的3′部分与模板上靠近靶标序列的部分互补。该引物的5′部分与预先选定(preselected)的不同核酸序列互补。如果，但只是如果，模板包括靶标序列，用标记的三磷酸脱氧核苷延伸的引物3′部分，就会产生标记的延伸产物。如Ye，Human mutation.17，p305(2001)和EP1302547A2所述，通过将5′部分与预选序列杂交的方式来检测这种标记引物延伸产物的存在。

[0016] 但是，在ASPE中，需要使用连接有生物素和额外的酶的dCTP来完成反应，其中一种酶为虾类碱性磷酸酶，另一种酶为外切酶I。此外，ASPE的主要缺点是一次反应只扩增一条单链，其中当引物与其中一条链开始退火时，DNA多聚酶开始复制DNA模板，而不是从引物与两条链退火时复制。因此，DNA模板的扩增呈一个等差数列。

[0017] 发明概述

[0018] 本发明提供一种用于检测猪瘟病毒(CSFV)的试剂盒，包括：(a)一对引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；以及(b)一对SNP引物SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4.

[0019] 本发明还涉及了一种检测CSFV的方法，包括：(a)使用一对PCR引物SEQID NO.1和SEQ ID NO.2以提供一个样品的扩增cDNA；(b)使用一对SNP引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4识别步骤(a)中扩增DNA；以及(c)使用电泳或探针SEQ ID NO.5鉴定步骤(b)中的扩增DNA。

[0020] 本发明进一步提供了一种从疫苗株中鉴别出传染性菌株的方法，包括：(a)使用一对从传染性菌株和疫苗株中共享相同模板的PCR引物以提供一个样品的扩增cDNA；(b)使用与步骤(a)中扩增DNA不完全互补的一对SNP引物来识别步骤(a)中的扩增DNA；以及(c)使用电泳或与步骤(b)中扩增DNA杂交的探针，从传染性菌株或疫苗株中确定步骤(b)中扩增DNA的大小。

附图说明

[0021] 图1是表示本发明的检测方法的概要图。

[0022] 图2表示了SNP引物设计的基本原理。

[0023] 图3表示了SNP巢式PCR的电泳结果。使用不同种的SNP引物来鉴别猪瘟病毒(CSFV)疫苗株LPC和其他传染性有毒菌株。NC：阴性对照；bp：碱基对。LPC表示CSFV疫苗株；4-111、4-124、4-127是三种选自野生弱CSFV菌株。ALD表示强致病CSFV菌株。

[0024] 图4表示了使用发光计对CSFV SNP巢式PCR产物的检测结果。超载表示RLU值超过200万。

[0025] 图5表示了使用本发明的分析法从1至10号临床CSFV样品中鉴定CSFV，并且从其疫苗株(LPC)中识别CSFV。上面部分是SNP巢式PCR的电泳结果。下面部分是使用发光计对PCR产物的检测结果。NC：阴性对照；bp：碱基对。LPC表示CSFV疫苗株；超载表示RLU值超过200万。

[0026] 图6表示了使用本发明的分析法从11至20号临床CSFV样品中鉴定CSFV，并且从其疫苗株(LPC)中识别CSFV。上面部分是SNP巢式PCR的电泳结果。下面部分是使用发光计对PCR产物的检测结果。NC：阴性对照；bp：碱基对。LPC表示CSFV疫苗株；超载表示RLU值超过200万。

[0027] 图7表示了使用本发明的分析法从21至30号临床CSFV样品中鉴定CSFV，并且从其疫苗株(LPC)中识别CSFV。上面部分是SNP巢式PCR的电泳结果。下面部分是使用发光计对PCR产物的检测结果。NC：阴性对照；bp：碱基对。LPC表示CSFV疫苗株；超载表示RLU值超过200万。

[0028] 图8表示了使用本发明的分析法从31至40号临床CSFV样品中鉴定CSFV，并且从其疫苗株(LPC)中识别CSFV。上面部分是SNP巢式PCR的电泳结果。下面部分是使用发光计对PCR产物的检测结果。NC：阴性对照；bp：碱基对。LPC表示CSFV疫苗株；超载表示RLU值超过200万。

[0029] 图9表示了使用本发明的分析法从41至50号临床CSFV样品中鉴定CSFV，并且从其疫苗株(LPC)中识别CSFV。上面部分是SNP巢式PCR的电泳结果。下面部分是使用发光计对PCR产物的检测结果。NC：阴性对照；bp：碱基对。LPC表示CSFV疫苗株；超载表示RLU值超过200万。

[0030] 图10表示了使用本发明的分析法从51至60号临床CSFV样品中鉴定CSFV，并且从其疫苗株(LPC)中识别CSFV。上面部分是SNP巢式PCR的电泳结果。下面部分是使用发光计对PCR产物的检测结果。NC：阴性对照；bp：碱基对。LPC表示CSFV疫苗株；超载表示RLU值超过200万。

[0031] 图11表示了使用本发明的分析法从61至70号临床CSFV样品中鉴定CSFV，并且从其疫苗株(LPC)中识别CSFV。上面部分是SNP巢式PCR的电泳结果。下面部分是使用发光计对PCR产物的检测结果。NC：阴性对照；bp：碱基对。LPC表示CSFV疫苗株；超载表示RLU值超过200万。

[0032] 图12表示了使用本发明的分析法从71至80号临床CSFV样品中鉴定CSFV，并且从其疫苗株(LPC)中识别CSFV。上部板是SNP巢式PCR的电泳结果。下面部分是使用发光计对PCR产物的检测结果。NC：阴性对照；bp：碱基对。LPC表示CSFV疫苗株；超载表示RLU值超过200万。

[0033] 图13表示了使用本发明的分析法从81至90号临床CSFV样品中鉴定CSFV，并且从其疫苗株(LPC)中识别CSFV。上面部分是SNP巢式PCR的电泳结果。下面部分是使用发光计对PCR产物的检测结果。NC：阴性对照；bp：碱基对。LPC表示CSFV疫苗株；超载表示RLU值超过200万。

[0034] 图14表示了使用本发明的分析法从91至100号临床CSFV样品中鉴定CSFV，并且从其疫苗株(LPC)中识别CSFV。上面部分是SNP巢式PCR的电泳结果。下面部分是使用发光计对PCR产物的检测结果。NC：阴性对照；bp：碱基对。LPC表示CSFV疫苗株；超载表示RLU值超过200万。

具体实施方式

[0035] 在使用了LPC疫苗的区域，猪瘟预防的主要问题是猪瘟病毒的检测。虽然LPC被认为是最有效且安全的活疫苗之一，但当前的检测还无法将LPC接种的猪与感染了CSFV野生菌的猪区别开来。由于CSFV检测受LPC疫苗株的干扰，特别是在检测具有轻微症状或临床症状不明显的猪时，CSF的流行病预防逐渐失去了控制。为了克服这种问题，本发明改进了目前的检测方法，如图1所示，是本发明的检测方法的概述。该方法提供了一种更有效、快速、灵敏的试剂盒和方法，用来检测猪瘟病毒，以尽快地控制其流行之势。通过该方法，CSFV的存在可被轻易地诊断出来而不受LPC疫苗株的干扰。本发明提供了寡核苷酸、扩增和检测CSFV的方法，和含有所述寡核苷酸的试剂盒。

[0036] 在本发明中，结合了巢式DNA PCR的SNP被称为SNP巢式PCR，其已开发用来扩增特异性的等位基因，以检测大量的SNP标志物或者同时区分不同的病毒的变异。本发明的优势在于：(1)只需要DNA聚合酶，不需要其他的特异的酶或者标记了的三磷酸脱氧核糖核苷酸；(2)当引物与两条链开始退火时，DNA聚合酶开始复制DNA模板；因此，DNA模板的扩增是等比级数。

[0037] 本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包括一对PCR引物和一对SNP巢式PCR引物。

[0038] 在本实施例中，一对PCR引物，即，用来扩增猪瘟病毒的一条正向寡核苷酸和一条反向的寡核苷酸，上游引物包括(i)一条SEQ ID NO.1中的一段核酸序列，(ii)一条与序列(i)完全互补的一段核酸序列；下游引物包括(iii)SEQID NO.2中的一段核酸序列，以及(iv)与序列(iii)完全互补的核酸序列。一对SNP巢式PCR引物，即用于扩增目标等位基因和提高灵敏度的正向寡核苷酸，和用来扩增CSFV核苷酸的反向寡核苷酸；正向SNP引物包括(v)SEQ ID NO.3里的核苷酸序列，和(vi)一条与核酸序列(v)完全互补的核酸序列；反向的引物包括(vii)SEQ ID NO.4里的核苷酸序列，和(viii)与核酸序列(vii)完全互补的一段核酸序列。探针，即，用于检测猪瘟病毒核酸的寡核苷酸，包括(ix)SEQ ID NO.5里的核苷酸序列，和(x)与核酸序列(ix)完全互补的核酸序列。

[0039] 在优选的实施方式中，所述探针标记了磁珠。所述磁珠通过含EDC(乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸)的粘合剂被连接到探针上。

[0040] 本发明的试剂盒除了包含引物，还包括dNTP，Taq DNA聚合酶，RNA酶抑制剂，ddH2O以及延伸缓冲液。

[0041] 本发明的延伸缓冲液包括但并不局限于Tris-HCl，MgCl2以及KCl。

[0042] 在另一个实施方式中，区分传染性菌株与疫苗株的方法包括：

[0043] (a)通过一对PCR引物(该引物共享传染性菌株与疫苗株相同的模板)，得到样品的扩增的cDNA；

[0044] (b)用一对和步骤(a)里扩增的DNA不完全互补的SNP引物区分步骤(a)得到的扩增DNA；

[0045] (c)通过电泳或与步骤(b)得到的扩增DNA进行探针杂交的方法确认步骤(b)得到的扩增DNA的片段大小，从而区分传染性菌株和疫苗株。

[0046] 在一个优选的实施方式中，用突出或不互补的核苷酸造成与扩增的DNA的不完全互补性。在不完全互补的SNP引物结合以及在步骤(a)中感染株扩增的DNA中的突出或不互补的核苷酸是分布在一个，两个或三个区域中。

[0047] 在一个更优选的实施方式中，在不完全互补结合的SNP引物以及在步骤(a)中感染株扩增的DNA中的突出或不互补的核苷酸是分布在三个区域中。

[0048] 所述的核酸指以单链或双链的形式存在的脱氧核糖核苷酸或核苷酸聚合体，除了其他限制，将包括功能相似的自然核苷的类似物。核酸可以运用本领域常用技术通过克隆或合成得到。

[0049] 所述的互补，指的是在许可的盐浓度及温度的条件下，核酸通过碱基互补配对自然的结合。比如，序列“A-G-T”结合互补序列“T-C-A”.两条单链核酸的互补可能是部分的，其中，仅仅一部分核酸结合，或者当在单链的全部互补性存在时，可能会完成结合。核酸链之间的互补程度在核酸链杂交的效率及长度上有显著的影响。

[0050] PCR(聚合酶链式反应)和其他形式的核酸扩增方法在用于研究、司法、临床应用的感兴趣的特异DNA序列的定量检测上，作为强有力的工具，已经得到的很大的发展。在本发明中，使用RT-PCR(反向聚合酶链式反应)是一种扩增从临床样品里提取的限定的RNA的技术。RNA链首先反转录为互补DNA，然后再通过PCR扩增DNA。

[0051] 为了确保PCR的特异性，本方法中进一步使用巢式PCR，巢市PCR是指两对PCR引物用于同一段序列。第一对引物，也叫做外引物，在RT-PCR中扩增目标区段，第二对引物(巢式，内引物)结合在第一次PCR得到的产物，并产生第二次PCR产物，比第一次的产物短。这种方法的原理是，如果非特异性区域在第一次PCR中被错误地扩增，则在第二次PCR中被扩增的几率非常低。

[0052] 使用生物信息学软件，PRIMER 5，BCM网(http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/)以及BOXSHADE3.21(http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)来选择并分析过程的结果。用来设计引物和探针的软件，不仅仅是针对于所需要的特异的目标区域，而且也避免了引物和探针内部的互补结合，比如发夹结构，即核酸具有茎环结构以及一段互补序列，使得其在同一条链上的互补核苷酸形成氢键而连接在一起。

[0053] 由于猪瘟病毒是一种单链RNA病毒，存在高突变率和变异，因此，猪瘟病毒的检测可能会受ELISA或一些较差的NAT方法的影响。为了避免这个问题，在本发明中，引物设计区域在猪瘟病毒基因组中的变异及突变率低的NS5B处。当猪瘟病毒感染宿主后，NS5B是第一个被转录的基因。NS5B的产物，一种RNA依赖的RNA聚合酶，是一种非常重要的病毒基因组复制的蛋白。不仅有助于猪瘟病毒基因组由单链复制为双链，而且帮助病毒蛋白及后续过程中的翻译，以合成一些结构蛋白，如p14，gp44/48(ERNS)，gp33(E1)，以及gp55(E2)。因此，为了保证NS5B的功能，非常有必要保证NS5B基因序列的稳定性。

[0054] 在本发明中，如图2所示，为用SNP技术检测区分核苷酸序列的示意图。比如，在图2a中，SNP引物A与模板A不是完全互补的，但是SNP引物A及模板A的鼓泡处(突出及未结合的核酸)并不阻碍DNA聚合酶的反应。这样，模板A的特异片段可以扩增，然而，在图2b中，SNP引物A及模板B的鼓泡处非常多，以至于DNA聚合酶较难发挥作用。本发明基于此原理，设计了SNP引物，以便区分猪瘟病毒疫苗株和其他的感染病毒株。

[0055] 在本发明中，将SNP技术与巢式PCR技术向结合，用于扩增特异的等位基因，以检测大量的SNP标志物或同时区分不同的病毒的变异。在优选例中，本发明克服了如下问题：

[0056] 用SNP引物设计避免由LPC疫苗株所带来的噪声信号；

[0057] SNP引物针对于NS5B基因区域，以确保病毒检测的准确率和高亲和性。

[0058] 用巢式PCR增强了病毒检测的灵敏度。

[0059] 如上所述得到的扩增产物能够在扩增模板序列时或之后能够被检测得到。凝[0060] 胶电泳可以用来检测扩增产物。一条或更多条的引物或者在扩增反应中的dNTPs可以标记，以便于扩增子能直接通过常规技术检测得到。比如，扩增产物与探针杂交，和其他的反应物分离开，然后用微珠及标记的探针检测。近来已经发展了很多检测技术，通过测量标记探针的特异活性，其中，酶常用于检测扩增DNA灵敏度的生物催化标记。

[0061] 为了促进猪瘟病毒的检测，本发明也提供了一种磁珠，用来检测猪瘟病毒，包含一段用来检测猪瘟病毒的寡核苷酸及磁珠。

[0062] 在具体实施例中，一种检测猪瘟病毒的方法包括：

[0063] 通过一对PCR引物扩增样品的一段cDNA；引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

[0064] 通过一对SNP引物，区分步骤(a)得到的扩增的DNA，引物序列为SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4；

[0065] 通过电泳或探针检测步骤(b)得到的扩增的DNA，探针序列为SEQ IDNO.5。

[0066] 优选地，SNP引物SEQ ID NO.3与扩增的DNA不完全互补，这是因为突出或没结合的核苷酸导致的。在不完全结合的SNP引物SEQ ID NO.3和猪瘟病毒感染的病毒株的扩增的DNA之间的突出或没有结合的核酸位于一个，两个或三个区域。

[0067] 更优选地，运用SNP巢式PCR扩增293个碱基对。产物可以通过电泳或探针SEQ ID NO.5来验证。SNP巢式PCR引物SEQ ID NO.3标记生物素，而生物素连接了发光底物的酶，该酶为辣根过氧化物酶。此方法还通过加入发光底物来检测其发光。

[0068] 本发明所用的封闭液包括但不局限于酪蛋白。

[0069] 本发明所用的酶试剂包括但不局限于链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶。

[0070] 本发明所用的发光底物为双氧水及发光氨。

[0071] 任何体液，如CSF(脑脊液)、血清、血液、唾液、膜渗出液、咽拭子及粪便都可能被用作临床检测物。本发明优选样品为CSF(脑脊液)、血清、血液、唾液、膜渗出液、咽拭子。

[0072] 本发明所述的样品是最广泛的含义。含有包含可疑的编码猪瘟病毒的核酸的生物样品或可能包括一种体液，细胞提取液，染色体，细胞器官，或细胞的膜提取物，基因组DNA，RNA，或cDNA(溶液状或结合在固体支持物上，组织，组织印记等等)。

[0073] 本发明所述的探针是一种底物，可以特异地识别特异的目标片段。通常，探针被吸附在固相支持物上，以便于分离DNA。在本发明中，探针连接磁珠更是优选。磁珠通过其表面的羧酸酯基团共价结合带氨基的寡核苷酸。磁珠的极小颗粒使得磁珠可以保持悬浮状态数小时，已足够实验并分析，并提供了一种近水相的反应动力。

[0074] 本发明所述的杂交指核苷酸的一条链通过碱基配对与互补链结合，形成G，C配对或A，T配对的氢键，从而在两个核酸序列间形成杂交复合体。这些氢键可能被碱基堆积作用而进一步稳定。两条互补核酸序列氢键处于反平行的构型。杂交的复合体可能在溶液中形成，另一端核酸序列固定在固相支持物上，细胞或其核酸已经固定在其上的，比如纸，膜，过滤器，芯片，插脚，玻片或者其他合适的底物。

[0075] 一般用来标记核酸的标记物有生物素，荧光物质，放射性分子，发光底物，半发光物质等；但不局限于这些。在本发明中，优选标记了生物素的核酸或寡核苷酸。如果用生物素来标记，则用亲和素，链酶亲和素或类似物来检测，后者结合了检测标记物，如酶(比如辣根过氧化物酶)。

[0076] 引物和探针标记可检测的组分或分子，以便于使用。探针标记磁性微粒作为磁性探针。引物，包括正向引物，反向引物或两者，标记了生物活性组分，比如生物素。扩增的DNA产物与磁性探针杂交，形成杂交复合体，该杂交体能结合磁性物质，因而该杂交复合体通过磁架能容易的从未结合DNA的产物中分离出来。杂交复合体通过标记的引物能进一步定量。比如，如果引物标记了生物素，亲和素，生物素的底物，将被加入到单独的杂交复合体中。杂交复合体将通过照度计来定量。

[0077] 实施例

[0078] 材料与方法

[0079] 主要试剂盒A：(50次/盒，室温保存)。

[0080] (1)杂交缓冲液(1500微升/瓶，2瓶)。

[0081] 主要试剂盒B：(50次/盒，2～8℃保存)。

[0082] (1)检测溶液(1500微升/瓶，2瓶)。

[0083] (2)磁性探针(180微升/瓶，1瓶)

[0084] CSFV探针，磁珠数：3

[0085] CSFV探针(SEQ ID NO：5)：

[0086] amin-TAGAAGTGTTGTCTGACCACCTTACTTGTATTGG

[0087] 主要试剂盒C：(50次/盒，-20±5℃保存。)

[0088] (1)核苷扩增溶液1(420微升/瓶，5瓶，-20±5℃保存。)

[0089]DEPC，水
CSFV外部上游引物(5μM)
TGTTAACAATGGTTTACGCCTGCTGCGAG
CSFV外部下游引物(5μM)
GTGGTTGACTTGCCTGGTTTCACTTGCGGTT
10×聚合酶缓冲液(热启动：JMR-470)
dNTP(A、U、C、G)(10mM)
MgCl2(25mM)

[0090] (2)核苷扩增溶液2(420微升/瓶，5瓶，-20±5℃保存。)

[0091]DEPC，水
CSFV-SNP上游引物(5μM)
AGAAATTGGCGAGTAAAGGA GGCCAGATCCTA
CSFV内部下游引物(5μM)
TCTGATTAGTGGGTTCCAGG ATTACATCAGC
10×聚合酶缓冲液(热启动：JMR-470)
dNTP(A、U、C、G)
MgCl2(25mM)

[0092] (3)逆转录酶(5.5微升/瓶，1瓶，-20±5℃保存。)

[0093] (4)RNase抑制酶(27微升/瓶，1瓶，-20±5℃保存。)

[0094] (5)聚合酶(11微升/瓶，1瓶，-20±5℃保存。)

[0095] 实施例1：核苷序列的分析，引物及探针的设计。

[0096] 收集和整合已经确定的基因组序列。然后，采用生物信息软件primer primer5，BCM 网 (http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/)， 和 BOXSHADE3.21(http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)进行对比和分析。在NS5B域，我们选择并设计了一个目标片段作为引物或者探针，其序列具有典型特征，特异性强，能够识别CSFV病毒。CSFV的单核苷酸多态性引物是特别设计用于区别野生传染CSFV菌株和CSFV的疫苗菌株。
基本原理见图2。分析和交叉对比所选择的探针和成套引物，避免二聚体或者发夹结构。进一步需要做的是，将所选择的探针和成套引物单独与其他各种病毒基因组进行比对，以避免非特异性识别。

[0097] 实施例2：建立临床样本处理的方法。

[0098] 最初的测试样本，如血清或者淋巴细胞富集液，用于提取RNA进行RT-PCR反应。这一步骤检验不同的提取方法以便简化提取步骤。

[0099] 实施例3：临床样本的研究。

[0100] 研究和检验各种临床样本以选择最优的取样时间和对象。对象可以是小猪、母猪或公猪。

[0101] 实施例4：建立和最优化核酸的扩增。

[0102] 4.1首先，确定CSFV检测的PCR条件：建立CSFV的灵敏度分析并比较平行进行的实时PCR，采用相同的血清样本作为量化的标准。这个样本可以用于以后进行临床样本灵敏度分析的对照。在这些实验中，逆转录实验也采用相同的条件。

[0103] 4.2建立内标：这一步骤用于确认和区别阴性和假阳性的结果。量化的内标放入血清样本中，通过提取、逆转录和核酸扩增的过程，以调整CSFV RT-PCR的最优反应条件。

[0104] 实施例5：SNP巢式PCR的建立和优化。

[0105] 本发明提供了一种更灵敏的检测CSFV的方法。关键在于SNP巢式PCR的过程。RT-PCR的产物作为模板，SNP引物SEQ ID NO.3连接一个生物素作为上游引物，加入CSFV内部下游引物SEQ ID NO.4，DNA聚合酶和dNTPs，然后通过SNP巢式PCR，特异片段就被选中并进行扩增。结果，我们感兴趣的片段被选中和扩增，以改进检测的灵敏度。如图3所示，这是一个SNP巢式PCR的电泳结果。各种特异的SNP引物用于区别猪瘟病毒疫苗菌株和其他传染病毒菌株。

[0106] 实施例6：检验CSFV探针的最佳条件和杂交反应。

[0107] 本发明提供了一种探针SEQ ID NO.5，并获得了使用这些探针的RT-PCR和单核苷酸多态性巢式PCR的结果。整个实验采用一步法，并基于液体杂交反应。杂交实验的主要影响因素还在研究中，包括盐浓度、洗涤剂的种类和浓度、反应温度、反应时间，综合这四个因素来确定实验是交叉影响还是单因素影响。测试稀释检测缓冲液以降低试剂盒的需求量。该项工作的目的是为了找出最优化的高信号值的杂交实验结果(MFI＞100，阳性值/背景值≥5)，和较低的背景(MFI＜100)。如图4所示，CSFV单核苷酸多态性巢式PCR产物的检测结果决定于照度计。超载表示RLU值超过2百万。

[0108] 实施例7：检测临床样本和校准化验系统。

[0109] 采用临床检测，并使用该测试结果以校准化验系统，完成CSFV临床样本扫描的高灵敏度需要。如下列表格所示，100例来自中国台湾不同县的临床CSFV样本，其基因型由其他方法测定。本发明对这些样本进行测试，确定CSFV检测的灵敏度。临床样本的检测结果见图5-14。

[0110]序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
基因型 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1
序号 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1
基因型
序号 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
基因型 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1
序号 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
基因型 1.1 3.4 3.4 3.4 3.4 3.4 3.4 3.4 3.4 3.4
序号 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
基因型 3.4 3.4 3.4 3.4 3.4 2.1a 2.1a 2.1a 3.4 3.4
序号 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
基因型 2.1 3.4 3.4 2.1 3.4 2.1 3.4 3.4 1.1 1.1
序号 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70
基因型 2.2 2.2 3.4 3.4 3.4 3.4 3.4 1.1 2.1 2.1
序号 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80
基因型 3.4 3.4 3.4 2.1 3.4 2.1 1.1 2.1 2.1 3.4
序号 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90
1.1 2.1 3.4 3.4 2.1 3.4 1.1 1.1 1.1 1.1
基因型
序号 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100
基因型 1.1 3.4 3.4 1.1 3.4 2.1a 3.4 2.2 3.4 3.4[0111] 序列表

[0112]

[0113]

[0114]