包特氏菌减毒活菌株作为抗百日咳的单剂量疫苗

摘要

本发明提供了一种包特氏菌突变菌株，其至少含有突变的ptx基因，缺失的或突变的dnt基因以及异源ampG基因。该包特氏菌减毒突变菌株可以用于治疗或防止包特氏菌感染的免疫原组合物或疫苗。还提供了所述包特氏菌减毒突变菌株用于制备疫苗或免疫原组合物的应用，以及保护哺乳动物抵抗包特氏菌感染的方法。

权利要求

1.一种包特氏菌减毒菌株BPZE1，其于2006年3月9日保藏在法国微生物保藏中心(C.N.C.M.)，保藏号为I-3585。

2.如权利要求1所述的包特氏菌减毒菌株BPZE1在制备抗包特氏菌菌种所引起感染的疫苗中的应用。

3.一种免疫原组合物，其含有权利要求1所述的包特氏菌减毒菌株BPZE1。

4.根据权利要求3所述的免疫原组合物，其还包含药物上可以接受的赋形剂、介质和/或载体。

5.根据权利要求4所述的免疫原组合物，其还包含佐剂。

6.一种疫苗，其含有权利要求1所述的包特氏菌减毒菌株BPZE1。

7.根据权利要求6所述的疫苗，其被配制成用于鼻腔给药。

8.一种试剂盒，其含有权利要求6所述的疫苗以及说明书。

9.如权利要求1所述的包特氏菌减毒菌株BPZE1在制备防止包特氏菌感染的疫苗中的应用。

10.权利要求1所述的包特氏菌减毒菌株BPZE1在制备同时防止包特氏百日咳杆菌感染和副百日咳包特氏菌感染的疫苗中的应用。

11.根据权利要求9或10所述的包特氏菌减毒菌株BPZE1的应用，其中，所述疫苗通过注射或吸入经皮下(s.c.)、皮内(i.d.)、肌肉(i.m.)、静脉(i.v.)、口服或鼻腔来进行给药。

12.根据权利要求9或10所述的包特氏菌减毒菌株BPZE1的应用，其中所述疫苗被鼻腔给药。

13.根据权利要求9或10所述的包特氏菌减毒菌株BPZE1的应用，其中，所述疫苗被给药于需要抗包特氏菌感染的快速保护性免疫的哺乳动物。

14.根据权利要求13所述的包特氏菌减毒菌株BPZE1的应用，其中，所述疫苗被给药于新生儿。

15.根据权利要求13所述的包特氏菌减毒菌株BPZE1的应用，其中，所述疫苗被给药于儿童。

16.根据权利要求9或10所述的包特氏菌减毒菌株BPZE1的应用，其中，所述疫苗以单剂量给药一次。

17.根据权利要求9或10所述的包特氏菌减毒菌株BPZE1的应用，其包括a)给药权利要求1所述的包特氏菌减毒菌株BPZE1；以及b)使用相同的菌株或无细胞疫苗或二者的结合进行至少一次回忆。

18.如权利要求1所述的包特氏菌减毒菌株BPZE1在制备疫苗中的应用，所述疫苗用于在哺乳动物中提供粘膜应答和系统性应答以治疗包特氏菌感染。

说明书

包特氏菌减毒活菌株作为抗百日咳的单剂量疫苗

发明领域

[0001] 本发明涉及包特氏菌(Bordetella)突变菌株，其至少含有突变的ptx基因、缺失或突变的dnt基因以及异源的ampG基因。包特氏菌减毒突变菌株可以用于产生免疫性的组合物或疫苗用于治疗或防止包特氏菌感染。本发明还涉及包特氏菌减毒菌株用于制备疫苗或产生免疫性的组合物的应用，以及用于保护哺乳动物免受包特氏菌感染的方法。

背景技术

[0002] 百日咳(Pertussis)仍是全球死亡的主要原因，并且即使在疫苗高度覆盖的国家，其发病率也在逐渐提高。尽管所有年龄群都是易感染的，但其在婴儿中是最严重的，因为婴儿太年轻而不能受到目前可以利用的疫苗保护。

[0003] 在20世纪后半叶引入有效疫苗之前，百日咳(whooping cough)或百日咳(Pertussis)是引起高死亡率的严重儿童疾病。这些疫苗的成功引发关于该疾病被基本上得到控制的观点，然而据报道每年仍有200,000～400,000例百日咳相关的死亡，并且该疾病仍在由于传染性物质所引起死亡的病因中排第6位[1]。尽管主要在发展中国家流行，但在包括美国的发达国家，该疾病又重新出现了[2，3]，在过去的20年中，美国的发病率已经提高了5倍[4]。出乎意料的，在高疫苗覆盖的国家，百日咳的流行病学已经改变，在这些国家青少年和成年人的百日咳日益频繁[5]。这可能是因为在青少年期日益减弱的疫苗介导的免疫。百日咳通常是非典型因此难以诊断的，并且通常在成年人中不是威胁生命的，因此，在许多病例中百日咳仍被忽视。然而，被感染的成年人构成了重要的储存宿主把该疾病传播到非常年轻的儿童，这些儿童太年轻而未被接种疫苗，因此有发展成具有高死亡率的严重疾病的风险。

[0004] 百日咳接种疫苗通常在2个月大时开始，而完全的保护需要以1～2个月为间隔的至少3次免疫接种。因此，在6个月大之前，使用目前可以利用的疫苗，婴儿不能完全被保护。为了降低非常年轻和大部分容易受到攻击的年龄组中百日咳的发病率，早期的免疫接种，可能在出生时，将是高度期望的。然而，在人类和动物模型中的大量研究显示，新生儿的免疫系统太不成熟，而不能有效地诱导疫苗介导的保护性免疫[6，7]。与较大的儿童或成人相比，对于产生对百日咳的保护性免疫很重要的Th1应答的指示[8]，特别是IFN-γ的产生，似乎在人新生儿中显著降低[9]。这一点也通过以下事实得以反映，即，在儿童中使用百日咳疫苗，特别是非细胞疫苗(aPV)进行接种疫苗，仅能够在几个月(≥6个月)后产生显著量的抗原特异性IFN-γ[10]。

[0005] 包特氏百日咳杆菌(Bordetella Pertussis)的自然感染长期以来被认为诱导长期的强免疫性，其衰退比疫苗诱导的免疫性要晚得多[5，11]。而且，包特氏百日咳杆菌的感染即使在非常年轻的儿童中(1个月大)也诱导了可检测的抗原特异性Th1型免疫应答[12]。这些观察结果暗示，可以通过经鼻途径以便尽可能模拟自然感染来施加的活疫苗，可以是比可利用的疫苗更吸引人的替代。

[0006] 现有技术中已知有许多进行接种疫苗的组合物用于治疗包特氏菌感染。然而，这些用于治疗的产生免疫反应的组合物没有被用于治疗新生儿，或者未用于需要流行性的和快速保护性的免疫的病例中。

[0007] 因此法国专利FR0206666公开了缺失选自PTX、DNT、AC和TCT中至少两种毒素的包特氏菌菌株。该专利公开了通过加入强启动子，以及加入来自大肠杆菌(E.coli)ampG基因的11个末端氨基酸，从而过表达内源性ampG基因。

[0008] Mielcarek等人在Vaccine(2006；24S2：S2/54-S2-55)中公开了一种PTX-，DTN-和-TCT 包特氏百日咳杆菌减毒菌株，用于小鼠的免疫接种。该参考文献公开了，为了降低气管细胞毒素的产生，ampG基因需要被过表达。然而，通过进一步评测，作者认识到通过过表达ampG基因，气管细胞毒素有提高，而不是一开始认为的降低。

[0009] Mielcarek等人在Advance Drug Delivery Review51(2001)pgs.55-69中公开了，活疫苗在通过口服或经过经鼻途径给药时，能够诱导系统性和粘膜应答。

[0010] Roduit等人在Infection and Immunity(2002Jul；70(7)：3521-8)中描述了使用具有DTP组合物的包特氏菌突变菌株对新生儿和婴儿进行疫苗接种。

[0011] Mattoo等人在Frontiers of Bioscience 6，e168-e186(2001)中表示，使用大肠杆菌ampG基因替代包特氏菌中的内源ampG基因，其结果是降低了所产生的TCT的量。

[0012] 因此，尽管现有技术公开了多种类型的接种疫苗组合物，但其都不能解决提供能够为6个月以前的新生儿提供保护的疫苗或免疫原组合物的问题。而且，现有技术没有公开提供抗包特氏菌感染的保护性免疫的免疫原组合物或疫苗。现有技术没有公开提供抗包特氏菌感染的保护性免疫的免疫原组合物或疫苗，所述保护性免疫在接种疫苗后至少2个月内持续提高。

[0013] 因此，本发明的一个目的是解决现有技术的缺陷。

[0014] 本发明的另一个目的是提供一种减毒的活疫苗候选物或免疫原组合物，其通过对包特氏菌菌株例如包特氏百日咳杆菌(B.Pertussis)或副百日咳包特氏菌(B.paraPertussis)进行遗传减毒，以减少致病性，而维持繁殖和诱导保护性免疫的能力。

[0015] 本发明的另一个目的是提供一种疫苗或免疫原组合物，其在新生儿中单次鼻腔给药后诱导保护，这优于目前aPV所提供的保护。

[0016] 本发明的另一个目的是提供抗副百日咳包特氏菌以及包特氏百日咳杆菌感染的保护，这是在使用aPV接种疫苗后未观察到的。

[0017] 本发明的另一个目的是在新生儿中诱导抗包特氏菌感染的强保护性免疫。

[0018] 本发明的另一个目的是提供诱导黏膜和系统性免疫的疫苗或免疫原组合物。

[0019] 本发明的另一个目的是生产减毒的包特氏百日咳杆菌活菌株，其被作为在生命早期的单剂量鼻腔疫苗，其被称作BPZE1。

[0020] 本发明的另一个目的是提供疫苗，其不仅能够用于为新生儿进行接种疫苗，而且可以用于在流行百日咳时对任何年龄的所有动物进行接种疫苗。

[0021] 本发明的另一个目的是提供抗包特氏菌感染的疫苗，其诱导快速的保护性免疫和/或在接种疫苗之后至少2个月内提高的保护性免疫。

[0022] 本发明的另一个目的是提供以相对低的生产成本提供抗包特氏菌感染的防止或治疗。

[0023] 正如本发明的发明内容、优选实施方式和权利要求的描述，本发明完成了这些和其他的目的。

发明内容

[0024] 本发明提供了一种包特氏菌突变菌株，其至少含有突变的百日咳毒素(ptx)基因、缺失的或突变的皮肤坏死毒素(dnt)基因以及异源ampG基因。

[0025] 在另一个方面，本发明涉及免疫原组合物，其含有包特氏菌突变菌株，所述包特氏菌突变菌株至少含有突变的百日咳毒素(ptx)基因，缺失的或突变的皮肤坏死毒素(dnt)基因以及异源ampG基因。

[0026] 在另一个方面，本发明提供了一种疫苗，其含有包特氏菌减毒菌株，所述包特氏菌减毒菌株至少含有突变的百日咳毒素(ptx)基因、缺失的或突变的皮肤坏死毒素(dnt)基因以及异源ampG基因。

[0027] 在另一个方面，本发明提供了包特氏菌减毒菌株用于制备防止包特氏菌感染的疫苗的应用，所述包特氏菌减毒菌株至少含有突变的ptx基因、缺失的或突变的dnt基因以及异源ampG基因。

[0028] 在另一个方面，本发明提供了包特氏菌减毒菌株用于制备疫苗的应用，所述包特氏菌减毒菌株至少含有突变的ptx基因，缺失的或突变的dnt基因以及异源ampG基因，所述疫苗用于诱导抗所述减毒的包特氏菌的优先通过Th1通路的免疫应答。

[0029] 还提供了保护哺乳动物免于包特氏百日咳杆菌(Bordetella Pertussis)以及副百日咳包特氏菌(Bordetella paraPertussis)感染所引起的疾病的方法，其包括将包特氏菌突变菌株给药于需要这种治疗的哺乳动物，所述包特氏菌突变菌株至少含有突变的ptx基因、缺失的或突变的dnt基因以及异源ampG基因。

[0030] 本发明的另一个方面是，一种提供抗包特氏菌感染的快速保护性免疫的方法，其包括将至少含有突变的ptx基因、缺失的或突变的dnt基因以及异源ampG基因的包特氏菌突变菌株给予需要这种治疗的哺乳动物。

[0031] 本发明的另一个方面是，一种提供抗包特氏菌感染的快速保护性免疫的方法，其包括将至少含有突变的ptx基因、缺失的或突变的dnt基因以及异源ampG基因的包特氏菌突变菌株给予需要这种治疗的哺乳动物，其中所述包特氏菌突变菌株，其中所述方法进一步在接种疫苗后至少2个月内提供了所述保护性免疫的提高。

[0032] 本发明的另一方面是，包特氏菌突变菌株用于制备治疗呼吸疾病的多价疫苗(即用于防止或治疗多种病原体所引起感染的疫苗)的方法，其中所述包特氏菌突变菌株至少含有突变的ptx基因、缺失的或突变的dnt基因以及异源ampG基因。

[0033] 本发明的另一方面是，发明的减毒包特氏菌菌株通过给药于需要抗包特氏菌感染的快速保护性免疫的哺乳动物的应用，其中所述保护性免疫在给药后至少2个月内提高。

[0034] 本发明的另一个方面是，提供哺乳动物中用于治疗或避免包特氏菌感染的粘膜应答和系统应答的方法。

附图说明

[0035] 图1是表示在BPSM和BPZE1培养物上清中所存在TCT的柱状图，其表示为每种菌株3份独立培养物的nM/OD540nm平均值(±标准误差)。

[0036] 图2是BPSM(泳道1)和BPZE1(泳道2)培养物上清中PTX产量的免疫印迹分析。在左侧空白处给出kDa为单位表达的Mr标记物的分子大小。

[0037] 图3是BPSM(泳道1)和BPZE1(泳道2)中dnt基因座的Southern印迹分析。如左侧空白处所显示的，分子大小标记物的长度是碱基对(bp)为单位表示的。

[0038] 图4是表示液体培养中BPSM(黑线)和BPZE1(虚线)生长速率的图表。

[0039] 图5是在液体培养基中生长24小时的BPSM(左)和BPZE1(右)的电子显微镜图片代表。

[0040] 图6是表示BPSM(黑柱)和BPZE1(白柱)与人肺上皮细胞A549(左)和鼠巨噬细胞类J774细胞(右)的体外黏附的图。结果表示为来自3组不同实验的相对于在接种物中所存在细菌的结合细菌百分比的平均值。

[0041] 图7是表示鼻腔感染106CFU的BPZE1或BPSM的成年小鼠肺部形成BPSM菌落(黑线)和BPZE1菌落(虚线)的图表。数据表达为每组3～4只小鼠的CFU平均值(±标准*误差)，并代表两组独立的实验。，P＝0.004。

[0042] 图8是来自BPZE1感染(上图)或BPSM感染(中图)成年小鼠与被提供PBS的对照(下图)的肺组织分析图。在感染1周后，无菌地取出肺，并在甲醛中固定。使用苏木精和曙红对切片进行染色并通过光学显微镜进行检测。

[0043] 图9是表示针对在(a)成年小鼠和(b)幼鼠中包特氏百日咳杆菌或在幼鼠中副百日咳包特氏菌(d)保护的图表。使用BPSM(a和b)或副百日咳包特氏菌(d)对BPZE1、aPV或PBS(未进行处理的)免疫的小鼠进行激发，并在3小时后(白色柱)和7天后(黑色柱)对肺CFU数目进行确定。结果表示为来自每组3～4只小鼠的CFU平均值(±标准误* *差)，并代表2组独立的实验。(b，，P＝0.009；d，，P＝0.007)(c)与对照相比，在BPZE1或aPV接种疫苗的成年小鼠中BPSM激发3小时后CFU数目。结果来自3组独立的实验，并表达为每只小鼠CFU相对于相同实验中未免疫组平均值的百分比。

[0044] 图10是表示BPZE1或aPV免疫所诱导免疫应答的柱状图。在BPZE1或aPV免疫的小鼠中BPSM激发之前(白色柱)和激发之后1周(黑色柱)，(a)抗FHA IgG(H+L)的滴度和(b)IgG1/IgG2a的比例。(c)与对照(灰色柱)相比，在使用BPZE1(黑色柱)或aPV(白色柱)进行免疫之前2个月，FHA-、PTX-或ConA-刺激的小鼠脾细胞所产生的IFN-γ：IL-5比例。对于三次测试的每组4只小鼠，在每只小鼠中检测抗体和细胞因子，并将结果表达为平均值(±标准误差)。

[0045] 图11是百日咳毒素的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)(胰岛激活蛋白S1)。最开始的34个氨基酸是信号肽序列，而35～269是成熟链。

[0046] 图12是皮肤坏死毒素的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

[0047] 图13是包特氏百日咳杆菌AmpG的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。

[0048] 图14是大肠杆菌AmpG的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。

[0049] 本发明优选实施方式的描述

[0050] 这里所使用的缩写“PTX”是指百日咳毒素，其合成和分泌一种ADP-核糖基化毒素。PTX由六条多肽S1～S5构成，酶活性部分被称作S1。PTX具有一段34个氨基酸的信号肽序列，而成熟的肽链则由氨基酸35～269构成。PTX是包特氏百日咳杆菌所表达的主要毒性因子。这些毒素的A部分表现出ADP-核糖基转移酶活性，B部分介导毒素与寄主细胞受体的结合以及将A转移到其作用位点上(57)。

[0051] 这里所使用的缩写“DNT”是指百日咳皮肤坏死毒素，是一种热不稳定毒素，如果经皮内注射，DNT诱导小鼠以及其他实验动物的局部损伤。在以低剂量静脉注射时(58～61)，DNT对小鼠是致命的。DNT被认为是猪萎缩性鼻炎中发生鼻甲萎缩的毒性因子(62，63)。

[0052] 这里所使用的缩写“TCT”是指气管细胞毒素，其是包特氏菌所合成的毒性因子。TCT是肽聚糖片断，并且具有诱导产生白介素-1和一氧化氮合成酶的能力。TCT具有引起纤毛郁积的能力，并对呼吸上皮细胞具有致命效应。

[0053] 术语“哺乳动物”包括任何哺乳类温血脊椎动物包括人，其特征在于皮肤上覆盖有毛，并且雌性动物具有产生乳汁的乳腺用于抚养幼崽。

[0054] 术语“减毒”的意思是弱化的，毒性差的包特氏菌菌株，其能够刺激免疫应答，并形成保护性免疫，但不会引起任何疾病。

[0055] 术语“快速保护性免疫”的意思是在本发明包特氏菌减毒突变菌株给药之后短时间内提供针对包特氏菌的免疫性。“短时间”是指在接种疫苗和激发之后1周。更具体的，+ +现有病原体特异性的外周淋巴细胞、CD8 细胞毒性效应分子(CTL)和CD4 辅助细胞快速扩+
张。CD4 辅助细胞诱导B细胞成熟和抗体产生。因此，记忆库内的淋巴细胞准备好在后续感染时快速增殖。

[0056] 术语“包特氏菌菌株”包括选自包特氏百日咳杆菌(Bordetella Pertussis)、副百日咳包特氏菌(Bordetella paraPertussis)和支气管败血性包特氏菌(Bordetella bronchiseptica)的菌株。

[0057] 用语“包特氏菌感染”的意思是下列三种菌株中至少一种所引起的感染：包特氏百日咳杆菌、副百日咳包特氏菌和支气管败血性包特氏菌。

[0058] “儿童”的意思是年龄在6个月～12岁之间的人或哺乳动物。

[0059] 术语“新生儿”的意思是年龄在1天～24周之间的人或哺乳动物。

[0060] 这里所使用的术语“治疗”不限于治愈疾病和除去病因，而是特别地覆盖治愈、缓解、除去或减轻所感兴趣疾病相关的症状，或者防止或降低寄主身体感染任何疾病或机能失常的可能。

[0061] 术语“保护”和“防止”这里被可以交换使用，并且意思是阻止包特氏菌的感染。

[0062] “预防疫苗”的意思是防止将来暴露所引起的包特氏菌感染。

[0063] “优先通过Th1途径”是表示Th1途径优先于Th2途径。

[0064] 术语“免疫原组合物”的意思是该组合物能够诱导免疫应答，并且因此是抗原。“免疫应答”的意思是免疫系统的任何反应。这些反应包括响应抗原的生物体免疫系统活性的变化，并且可以包括例如抗体产生、诱导细胞介导的免疫、补体激活或免疫耐受性的产生。

[0065] 更具体的，本发明提供了至少一种三突变包特 氏菌菌株(triple mutatedBordetalla strain)，其能够被用作免疫原组合物或疫苗。能够理解的是，所述至少三突变包特氏菌菌株含有突变的ptx基因、缺失的或突变的dnt基因以及异源ampG基因。所述异源ampG基因产物大量降低了所产生的气管细胞毒素的量。

[0066] 本发明不仅限于上述的三突变体。可以采取其他另外的突变，例如腺苷酸环化酶(AC)缺陷突变体(64)、脂多糖(LPS)缺陷突变体(65)、丝状血凝素(FHA)(66)以及任何bvg调节的组分(67)。

[0067] 突变的起始菌株可以是任何包特氏菌菌株，包括包特氏百日咳杆菌、副百日咳包特氏菌和支气管败血性包特氏菌。在一个方式中，被用于获得包特氏菌突变菌株的起始菌株是包特氏百日咳杆菌。

[0068] 构建包特氏菌突变菌株是从将菌株中的包特氏菌ampG基因替换为异源ampG基因开始的。在本发明中，可以使用任何异源ampG基因。这些包括所有释放非常少量肽聚糖进入每代培养基中的革兰氏阴性细菌。革兰氏阴性细菌的例子包括但不限于大肠杆菌、沙门氏菌(Salmonella)、肠杆菌(Enterobacteriaceae)、假单胞菌(Pseudomonas)、莫拉氏菌(Moraxella)、螺杆菌(Helicobacter)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas)、军团菌(Legionella)等。

[0069] 通过将包特氏菌ampG基因替换为异源ampG基因，所得到菌株中产生的气管细胞毒素(TCT)的量低于残余TCT活性的1％。在另一个实施方式中，所得到菌株所表达的TCT毒素的量在残余TCT活性的0.6％～1％，或者残余TCT活性的0.4％～3％，或者残余TCT活性的0.3％～5％。

[0070] PTX是对应包特氏百日咳杆菌感染系统性效应的主要毒性因子，以及主要保护性药物之一。由于其性能，自然ptx基因被突变版本所替换，以得到酶活部分S1编码无酶活的毒素，但是百日咳毒素的免疫原性能不受到影响。这可以通过将序列第9位的赖氨酸(Lys)替换为精氨酸(Arg)所达到。此外，第129位的谷氨酸(Glu)替换为甘氨酸(Gly)。

[0071] 也可以作出其他突变，例如在美国专利6,713,072中所描述的，此处将美国专利6,713,072引入作为参考，以及任何已知的或其他能够将毒素活性降低到无法检测水平的突变。等位基因交换被用于首先缺失ptx操纵子，接着插入突变版本。

[0072] 最后，接着通过使用等位基因交换从包特氏菌菌株除去dnt基因。除了完全除去外，还能够通过点突变抑制酶活性。因为DNT是由N末端的受体结合区和C末端部分的催化区所构成的，因此将Cys-1305替换为Ala-1305的dnt基因中的点突变会抑制DNT的酶活性(68)。DNT已经被鉴定为支气管败血性包特氏菌中的重要毒素，并且通过注射极少量而显示致命活性(26)。

[0073] 除了通过使用等位基因交换插入突变的ptx基因，以及被抑制或缺失的dnt基因外，还可以通过插入基因序列或质粒破坏基因的开放阅读框。在本发明中也可以应用该方法。

[0074] 本发明的三突变菌株被称作BPZE1菌株，并已经于2006年3月9日被保藏在法国巴黎的法国微生物保藏中心(Collection Nationale de Cultures deMicroorganismes，CNCM)，其保藏号为CNCM I-3585。在BPZE1中所引入的突变导致强烈的减毒，但允许细菌形成菌落并保持。因此，在另一个实施方式中，本发明提供了BPZE1，其能够在给药时诱导粘膜免疫和系统免疫。在另一个方面，BPZE1被鼻腔给药。

[0075] 本发明的包特氏菌突变菌株可以用于免疫原组合物。这些免疫原组合物可以用于在哺乳动物中产生免疫应答，抗体应答和或优选T细胞应答。有利的，T细胞应答是其保护哺乳动物抵抗包特氏菌感染或抵抗其后续疾病。

[0076] 本发明的包特氏菌突变菌株可以在疫苗或免疫原组合物中作为活菌株使用，或者化学或热灭活菌株使用。在一个方面中，活菌株被用于经鼻给药，而化学或热灭活的菌株可以用于系统或粘膜给药。

[0077] 在用于系统或局部给药时，免疫原组合物还可以含有药物上适当的赋形剂或载体和/或介质(vehicle)。所述药物上可以接受的介质包括但不限于磷酸盐缓冲盐溶液、蒸馏水、乳液如油/水乳液、各种类型的湿润剂无菌溶液等。

[0078] 本发明的免疫原组合物也可以含有佐剂(adjuvants)即任何能够促进或提高T细+ +胞介导应答的物质或化合物，特别是针对本发明有效成分的CD4-介导或CD8-介导的免疫应答。赋形剂例如胞壁肽如MDP、IL-12、磷酸铝、氢氧化铝、Alum和/或 可以用于本发明免疫原组合物中。

[0079] 本领域技术人员可以理解的是，如果在疫苗或免疫原组合物中使用化学或热处理的包特氏菌突变菌株时，在免疫原组合物中使用赋形剂和乳液。

[0080] 本发明的免疫原组合物至少含有一种具有针对包特氏菌感染或包特氏菌感染毒害作用的预防效果的分子，例如核酸、蛋白质、多肽、载体或药物。

[0081] 本发明的免疫原组合物用于在被给于该组合物的寄主中引发T细胞免疫应答。上面所述的所有免疫原组合物可以被通过各种途径给药：皮下注射(s.c.)、皮内注射(i.d.)、肌肉注射(i.m.)或静脉注射(i.v.)，口服给药和鼻腔给药或吸入。

[0082] 在为皮下注射而进行配制时，本发明的免疫原组合物或疫苗每注射剂量优选含有10μg～100μg的该包特氏菌菌株，更优选20μg～60μg/剂量，特别是在一次注射中大约50μg/剂量。

[0083] 在为鼻腔给药而进行配制时，以大约1×103～1×106个细菌的剂量给药该包特氏菌菌株，这依赖于接受包特氏菌菌株的哺乳动物的体重和年龄。在另一个方式中，可以使用4 6
1×10 ～5×10 的剂量。

[0084] 本发明的包特氏菌突变菌株可以用作减毒疫苗以保护免于未来的包特氏菌感染。关于这一点，本发明的优点是可以单剂量对哺乳动物给药，而保护可以持续超过2个月的时间，特别是超过6个月。可以将本发明的疫苗被给于新生儿，并保护免于百日咳的感染。
这是特别关键的，因为对于低于1个月的婴儿，包特氏百日咳杆菌的死亡率是大约1.3％。

[0085] 而且，本发明的疫苗能够在流行的地方用于成年哺乳动物中或者超过60岁的老年人中，因为这些老年人的并发症风险可能比稍大的儿童或健康成年人要大。

[0086] 可以使用在免疫原组合物中所列出的生理赋形剂配制疫苗。例如，药物上可以接受的介质包括但不限于磷酸盐缓冲盐溶液、蒸馏水、乳液如油/水乳液、各种类型的湿润剂无菌溶液等。在疫苗中可以使用赋形剂例如胞壁肽如MDP、IL-12、磷酸铝、氢氧化铝、Alum和/或

[0087] 本发明的疫苗能够诱导针对FHA的高滴度血清IgG。抗原特异性细胞因子特征分析显示给药本发明包特氏菌减毒突变菌株引起强TH1应答。

[0088] 本发明的疫苗提供了针对包特氏菌感染的高水平保护，即高于90％的保护水平，特别是高于95％，更特别是高于99％(如实施例9详细描述，注射7天后所计算的)。接种疫苗后至少2个月，与未接种疫苗的(未进行处理的)小鼠相比，含有BPZE1菌株的疫苗的保护水平达到了99.999％。

[0089] 可以通过皮下注射(s.c.)、皮内注射(i.d.)、肌肉注射(i.m.)或静脉注射(i.v.)、口服给药和鼻腔给药或吸入给药疫苗。通常，给药疫苗是单剂量。或者，本发明疫苗给药是首次进行的(起始接种疫苗)，接着是最后使用相同菌株、组合物或疫苗或非细胞疫苗或其组合的一次回忆(后续给药)。

[0090] 在一个方面，完成疫苗的鼻腔给药或者吸入给药，这种给药类型成本低并且能够使本发明的减毒菌株在呼吸道形成菌落：上呼吸道(鼻子和鼻道、鼻窦和咽喉或咽部)和/或呼吸气道(喉咙或喉头、气管、支气管和细支气管)和/或肺(呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊和肺泡)。

[0091] 以液体溶液、悬浮液、乳液、脂质体、霜剂、凝胶等多相组合物的形式完成免疫原组合物或疫苗的鼻腔给药。溶液和悬浮液以滴剂给药。也可以作为来自鼻喷瓶或从鼻吸入器的细薄雾给药溶液。将凝胶分配在含有所需剂量的小注射器中用于一次施加。

[0092] 溶液、悬浮液和粉末形式下的免疫原组合物或疫苗形成吸入剂；通过气雾剂或干粉吸入器给药这些制剂。使用吹入器或喷射器给药化合物粉末。

[0093] 本发明的另一方面是包特氏菌突变菌株用于制备治疗呼吸疾病的多价疫苗的应用，所述包特氏菌突变菌株至少含有突变的ptx基因、缺失的或突变的dnt基因以及异源ampG基因。关于这一点，上述的包特氏菌减毒突变菌株可以用作将异源抗原提供给呼吸粘膜的异源表达平台。因此，这些呼吸性病原体例如奈瑟氏菌(Neisseria)、肺炎球菌(Pneumophila)、耶尔森氏菌(yersinia)、假单胞菌、分枝杆菌(mycobacteria)、流感等能够使用BPZE1作为载体防止感染。

[0094] 本发明还包括这里所描述的包特氏菌减毒突变活菌株用于制备治疗或防止包特氏菌感染的疫苗的应用。关于这一点，所述疫苗可以用于同时治疗或防止包特氏百日咳杆菌和副百日咳包特氏菌的感染。

[0095] 本发明还包括疫苗用于在百日咳流行时提供快速保护性免疫的应用。

[0096] 本发明还包括疫苗用于提供快速保护性免疫的应用，所述免疫在接种疫苗后至少两个月内持续提高。

[0097] 还将疫苗或免疫原组合物提供在试剂盒中。该试剂盒含有疫苗或免疫原组合物和说明书用于提供免疫接种指导的说明书(leaflet)。

[0098] 本发明还涉及诱导T细胞介导免疫应答的方法，特别是CD4+-介导的免疫应答或+CD8-介导的免疫应答，该方法包括在非人类哺乳动物或人中给药包特氏菌减毒活菌株。

[0099] 本发明的另一个实施方式是一种保护哺乳动物免于包特氏菌感染所引起疾病的方法，其包括将包特氏菌突变菌株给药于所述需要这样治疗的哺乳动物，所述包特氏菌突变菌株至少含有突变的ptx基因、缺失的或突变的dnt基因以及异源ampG基因。该方法包括治疗或防止感染包特氏百日咳杆菌和/或副百日咳包特氏菌。在一个方式中，在该方法中使用BPZE1菌株。

[0100] 本发明还包括一种提供抗包特氏菌感染的快速保护性免疫的方法，其包括将包特氏菌突变菌株给药于需要治疗的所述哺乳动物，所述包特氏菌突变菌株至少含有突变的ptx基因、缺失的或突变的dnt基因以及异源ampG基因。在一个方式中，在该方法中使用BPZE1菌株。

[0101] 而且，本发明的包特氏菌减毒突变活菌株诱导黏膜免疫以及系统性免疫。因此，在另一个方式中，本发明还涉及一种诱导粘膜免疫和系统性免疫的方法，其通过将包特氏菌减毒突变活菌株给药于需要该治疗的哺乳动物给药本发明的来进行诱导。在一个方式中，在该方法中使用BPZE1菌株。

[0102] 除了在防止和/或治疗包特氏菌感染中的作用外，本发明的突变菌株可以用作载体以携带至少另一种编码感兴趣的RNA(例如反义RNA)或蛋白质的异源核酸序列。这意味着所述突变菌株除了异源ampG基因以外，还携带至少另一种异源核酸序列。在一个方式中，所述至少另一种异源核酸序列所编码的蛋白质是期望在呼吸道中表达的蛋白质。另一方式中，所感兴趣的蛋白质是抗原例如病毒、细菌或肿瘤抗原，针对所述抗原的免疫应答是期望的。因此，所述携带至少另一种异源核酸序列的包特氏菌突变菌株可以用作疫苗。上述为给药疫苗或免疫原组合物所提供的定义也应用于含有携带至少另一种异源核酸序列的包特氏菌突变菌株的疫苗。异源蛋白的例子是病原体的抗原，其中所述病原体造成与呼吸道相关的疾病感染：小儿麻痹症、流行性感冒(正粘病毒(Orthomyxoviridae)家族的流感病毒(influenzavirus))或者肺炎球菌的抗原(例如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae))。

[0103] 已经对本发明的许多实施方式进行了描述。然而，应该理解的是，可以进行各种修改而不离开本发明的主旨和范围。

[0104] 实施例

[0105] 材料和方法

[0106] 实施例1-包特氏菌菌株和生长条件

[0107] 在本发明中所使用的包特氏百日咳杆菌菌株全部衍生自包特氏百日咳杆菌BPSM[13]，副百日咳包特氏菌是菌株12822的抗链霉素衍生物(由法国巴黎Institut Pasteur的Dr.N.Guiso惠赠)。所有的包特氏菌菌株都生长在鲍-金(Bordet-Gengou)(BG)琼脂培养基上(Difco，Detroit，Mich.)，其补充了1％甘油、20％去纤维蛋白的羊血和100μg/ml链霉素。为了进行细胞黏附检验，将指数生长的包特氏百日咳杆菌接种在600nm光密度为0.15的2.5ml改进Stainer-Scholte培养液中[14]，其含有1g/l七(2，6-二邻
35 35
甲基)β-环糊精(Sigma公司)并补充65μCi/ml L-[ S]甲硫氨酸和L-[ S]半胱氨酸(NEN，Boston，Mass.)，并在37℃下生长24小时。接着通过离心收获细菌，在磷酸盐缓冲液(PBS)中清洗三次，并以期望的密度重悬浮在RPMI1640中(Gibco，Grand Island，N.Y.)[0108] 实施例2构建包特氏百日咳杆菌BPZE1

[0109] 为了构建包特氏百日咳杆菌BPZE1，通过等位基因交换将包特氏百日咳杆菌ampG基因替换为大肠杆菌ampG。使用寡聚核苷酸A：

[0110] 5’-TATAAATCGATATTCCTGCTGGTTTCGTTCTC-3’(SEQ ID No：5)和B：5’-TATAGCTAGCAAGTTGGGAAACGACACCAC-3’(SEQ ID No：6)，以及包特氏百日咳杆菌BPSM[13]基因组DNA作为模板，扩增命名为met的PCR片断，其定位于包特氏百日咳杆菌ampG基因上游的49,149位～49,990位。将该634-bp片断插入到Topo PCRII(In Vitrogen Life Technology公司，格罗宁根(Groningen)，荷兰)中，接着作为ClaI-NheI片断切出，并插入到ClaI-和NheI-消化的一种含有大肠杆菌ampG基因的自杀载体pBP23中[50]，在大肠杆菌ampG基因的5’和3’末端分别是618bp的包特氏百日咳杆菌DNA(包特氏百日咳杆菌基因组的50,474～51,092位)和379bp的包特氏百日咳杆菌DNA(包特氏百日咳杆菌基因组的
52,581～52,960位)。将所得到的质粒转入到大肠杆菌SM10[51]，接着将大肠杆菌SM10与BPSM接合，并根据描述，对两次连续的同源重组事件进行选择[52]。通过下面的PCR筛选10个单独的菌落。将菌落悬浮在100μl H2O中，95℃下加热20分钟，并在15,000×g下离心5分钟。接着，将1μl悬浮液作为模板进行PCR，该PCR中使用寡聚核苷酸A和C：5’-TAAGAAGCAAAATAAGCCAGGCATT-3’(SEQ ID No：7)，确定大肠杆菌ampG的存在，并使用寡聚核苷酸D：

[0111] 5’-TATACCATGGCGCCGCTGCTGGTGCTGGGC-3’(SEQ ID No：8)和E：5’-TATATCTAGACGCTGGCCGTAACCTTAGCA-3’(SEQ ID No：9)用于确认包特氏百日咳杆菌ampG的缺失。接着选择含有大肠杆菌ampG并缺少包特氏百日咳杆菌ampG的菌株，并对整个ampG基因座进行测序。接着将该菌株用于进一步改造。

[0112] 根据[21]所描述的，从该菌株染色体中去除ptx基因，接着使用编码无活性PTX的突变ptx进行替换。将来自pPT-RE含有突变ptx基因座的EcoRI片断[16]插入到pJQ200mp18rps1的EcoRI位点[53]。接着在通过与大肠杆菌SM10接合后利用同源重组，将所得到的质粒整合到包特氏百日咳杆菌染色体的ptx基因座中。对所得到包特氏百日咳杆菌菌株染色体中的ptx基因座进行测序，确认期望的突变的存在。通过免疫印迹分析毒素的产生，其使用对PTX的亚基S1特异性的单克隆抗体IB7[54]和对PTX的亚基S2和S3特异性的11E6[55]。

[0113] 最后，在使用BPSM基因组DNA作为模板，寡聚核苷酸F：5’-TATAGAATTCGCTCGGTTCGCTGGTCAAGG-3’(SEQ ID No：10)和G：5’-TATATCTAGAGCAATGCCGATTCATCTTTA-3’(SEQ ID No：11)作为dnt上游区引物，H：5’-TATATCTAGAGCGGCCTTTATTGCTTTTCC-3’(SEQ IDNo：12)和I：5’-TATAAAGCTTCTCATGCACGCCGGCTTCTC-3’(SEQ IDNo：13)作为dnt下游区引物扩增dnt两侧区时，从所得到的包特氏百日咳杆菌中除去dnt基因。分别使用EcoRI/XbaI和XbaI/HindIII对所得到的799-bp和712-bp DNA片断进行消化，并使用Fast Link试剂盒(Epicentre Biotechnologies公司，Madison，WI)连接起来。通过PCR使用寡聚核苷酸F和I扩增所连接的片断，并将1505-bp的PCR片断插入到pCR2.1-Topo中(英杰(Invitrogen)公司)，从所得到的质粒中重新分离为EcoRI片断并插入到pJQmp200rpsL18唯一的EcoRI位点。通过大肠杆菌SM10的结合，将所得到的质粒引入到包特氏百日咳杆菌中。使用对应dnt上游区的PCR片段作为探针，通过对PvuII-消化的包特氏百日咳杆菌基因组DNA进行Southern印迹，确认成功除去dnt基因。使用DIG Easy Hyb标记试剂盒(Roche，Meylan，法国)对探针进行标记。通过Dig-标记的DNA分子标记物III(Roche)的迁移距离确定杂交带的大小。对该最终菌株中的dnt基因座(命名为BPZE1)进行测序。

[0114] 实施例3分析TCT的产生

[0115] 为了对TCT的产生进行灵敏的定量，收集包特氏百日咳杆菌培养到对数期的培养上清液，并进行固相提取[15]，并使用异硫氰酸苯酯(PITC，Pierce)进行衍生。通过使用C8柱的反相HPLC(Perkin Elmer)分离所得到的硫氰酸苯酯(PTC)衍生物，并在254nm处进行检测。通过将峰值面积和洗脱时间与相同处理的TCT标准进行比较，确定每个样品中包特氏百日咳杆菌PTC-TCT的量。

[0116] 实施例4细胞黏附检验

[0117] 为了分析包特氏百日咳杆菌菌株的黏附性能，根据之前所描述的[16]，检测它们与人上皮细胞系A549(ATCC n°CCL-185)和鼠巨噬细胞系J774(ATCCn°TIB-67)的结合速率。

[0118] 实施例5透射电子显微镜

[0119] 根据之前所描述的[17]，通过下列修饰使用单滴负染色程序。将20μl大约109个细菌/ml的悬浮液吸附到涂碳镍网格2分钟(400mesh；ElectronMicroscopy Sciences公司(EMS)，华盛顿，PA)。该网格空气干燥30秒后，使用20μl2％的磷钨酸(pH7；EMS)对网格进行染色2分钟，并在空气干燥后在透射电子显微镜(Hitachi7500，日本)下以60千伏和高分辨率进行检测。

[0120] 实施例6鼻腔感染和接种疫苗

[0121] 将3周和8周大的雌性Balb/C小鼠保持在没有特异性病原体的条件下，并在Institut Pasteur de Lill动物研究委员会的指导下进行所有的实验。为小鼠鼻腔感染6
20μl PBS内的大约4×10 的细菌，并根据之前的描述[18]，检测肺中的CFU动力学。为了进行aPV(Tetravac；Aventis-Pasteur，法国)的疫苗接种，对小鼠腹膜注射(i.p.)20％的人剂量进行免疫，并在一个月后使用相同的剂量进行增强。

[0122] 实施例7抗体确定

[0123] 收集血清，并且根据之前所述[18]，通过酶联免疫吸附检验(ELISA)确定抗体滴度。

[0124] 实施例8细胞因子检验

[0125] 在免疫后的不同时间点对来自个体小鼠的脾细胞检验体外细胞因子的产生，其6 6
产生对应于热灭活包特氏百日咳杆菌BPSM(10cells/ml)(10 个细胞/ml)、5.0μg/ml PTX(根据之前所述[20]从包特氏百日咳杆菌BPGR4所纯化的[19]，并在80℃下热失活
20分钟)、5.0μg丝状血凝素(FHA，根据之前所述[22]从包特氏百日咳杆菌BPRA纯化的[21])、5μg/ml刀豆球蛋白A(Sigma化学公司，St.Louis，Mo.)或者作为对照的培养液。在
37℃和5％CO2中孵育72小时后，从三批培养物中除去上清，并通过免疫检验确定IFN-γ和IL-5含量(BDOptEIA set，Pharmingen公司)。

[0126] 实施例9鼻腔感染和接种疫苗：在第1、2、3和4周激发

[0127] 幼鼠(3周龄)模型[29]用于将使用BPZE1的接种疫苗的效率与非细胞百日咳疫6
苗(aPv)的接种疫苗的效率进行比较。使用20μl PBS内大约1×10BPZE1菌株鼻腔感染雌性Balb/C小鼠。为了使用aPv(Tetravac；Aventis-Pasteur，法国)进行接种疫苗，对小鼠腹膜注射人剂量的20％来进行免疫。在使用BPZE1或aPv接种疫苗后，1、2、3、或4周，使用毒性包特氏百日咳杆菌BPSM/bctA-lacZ菌株进行鼻腔激发[53]。该菌株是衍生自BPSM的庆大霉素抗性菌株，在含有10μg/ml庆大霉素和100μg/ml链霉素(BGg)的鲍-金(Bordet-Gengou)(BG)琼脂平板上，其能够与BPZE1(庆大霉素敏感)区别。对照组对应于使用BPSM/bctA-lacZ激发的空白小鼠。激发感染后一星期，将肺无菌取出，匀浆并铺在BGg平板上，根据之前所述的进行CFU确定[18]。

[0128] 使用BPZE1或aPv对小鼠进行疫苗接种，并在接种疫苗1、2、3或4周后使用毒性包特氏百日咳杆菌进行激发。在3小时或7天后，确定肺CFU计数。结果表示为来自每组3～5只小鼠的CFU平均值(±标准误差)。将每次激发感染的保护水平计算为激发感染后7天，每组CFU相对于非免疫组CFU平均数的平均百分比(表2～5)。

[0129] 实施例10统计分析

[0130] 使用非成对学生t检验(unpaired Student’sttest)和克鲁斯凯-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test)，如果适当的话接着进行Dunn试验后检验(Dunn’spost-test)(GraphPad Prism程序)，对结果进行分析。如果P≤0.05，则认为差异显著。

[0131] 结果

[0132] 构建包特氏菌BPZE1

[0133] 遗传定位三个毒性因子：气管细胞毒素(TCT)、百日咳毒素(PTX)和皮肤坏死毒素(DNT).。

[0134] TCT引起被感染寄主气管中纤毛细胞的破坏[24，25]，并可能因此参与咳嗽综合症。TCT是革兰氏阴性细菌细胞壁中肽聚糖的分解产物，其中通常细菌通过AmpG转运子将TCT内化到细胞质中以在细胞壁的生物合成中重新利用。包特氏百日咳杆菌AmpG在内化肽聚糖分解产物中效率低。因此，我们将包特氏百日咳杆菌AmpG替换为大肠杆菌ampG。所得到的菌株表达低于1％的残余TCT活性(图1)。

[0135] PTX是对应包特氏百日咳杆菌感染的主要毒性因子，其由被称作S1的酶活性部分以及负责与靶细胞受体结合的部分构成(综述，参见26)。然而，其还是主要的保护性抗原之一，这促使我们将天然的ptx基因替换为编码无酶活毒素的突变版本。这通过将S1中的Lys-9替换为Arg，Glu-129替换为Gly来实现，其中这两个关键的残基分别参与底物结合以及催化。等位基因交换被用于首先除去ptx操纵子，接着加入突变的版本。通过免疫印迹分析评估在包特氏百日咳杆菌培养物上清中的相关毒素类似物的存在(图2)。

[0136] 最后，等位基因交换被用于除去dnt基因(图3)。尽管DNT在包特氏百日咳杆菌毒性中的作用还不确定，但其已经被鉴定为紧密相关的物种支气管败血性包特氏菌中的重要毒素，并且显示了通过注射极少量后的致命活性(综述，参见26)。

[0137] 体外鉴定包特氏百日咳杆菌BPZE1

[0138] 由于BPZE1中的某些基因改变可能会潜在地影响细菌细胞壁的合成，因此将BPZE1的大小和形状以及体外生长速率与亲代菌株BPSM进行比较。BPZE1的生长速率与BPSM没有不同(图4)，并且通过电子显微镜分析明确了，在BPZE1和BPSM之间没有监测到细菌形状或大小上的区别(图5)。然而，BPZE1的细胞壁一直比BPSM的细胞壁薄一些。

[0139] 为了确定是否任何在BPZE1中目标毒素的缺失或改变会影响包特氏百日咳杆菌的黏附性能，将BPZE1的附着速率与BPSM的附着速率进行比较，使用人肺上皮细胞系A549和鼠巨噬细胞系J774作为两种细胞模型，其通常用于研究包特氏百日咳杆菌的黏附。在两种菌株之间没有观察到与任何一种细胞系黏附的显著差异(图6)。

[0140] 包特氏百日咳杆菌BPZE1的减毒

[0141] 为了确定是否在包特氏百日咳杆菌BPZE1中引入突变导致减毒，而仍允许生物体在呼吸道中形成菌落，使用BPZE1或BPSM对Balb/C小鼠进行经鼻感染，之后随着时间形成菌落。BPZE1与BPSM一样，能够形成菌落，并保持在小鼠的肺中(图7)。然而，在使用BPSM感染7天后观察到的繁殖峰一直在使用BPZE1感染的小鼠中没有观察到。使用单种毒素基因突变的菌株进行的研究显示这是由于ptx基因座的突变引起的(数据未提供)。如果对肺检测组织病理学变化和炎症渗透，则在感染7天后，发现BPSM感染诱导强支气管周围血管渗透以及炎症细胞聚集，这与支气管上皮细胞的强过度生长有关(图8)。相反，在BPZE1感染的动物中没有观察到这些变化，BPZE1感染的动物地组织学与接受PBS而不是细菌的对照小鼠的组织学类似。BPSM感染诱导的炎症持续至少2个月(数据未提供)。这些结果说明引入到BPZE1的突变导致了强烈的减毒，但使细菌在肺部形成菌落并持续。

[0142] 使用BPZE1对成年小鼠进行鼻腔接种疫苗后的抗包特氏百日咳杆菌激发的保护[0143] 为了评估BPZE1所提供的保护，将为8周龄Balb/C小鼠鼻腔单次给药该菌株对后续野生型激发菌株BPSM的形成菌落的影响与使用1/5人类剂量的aPV进行的两次腹腔注射免疫的影响进行比较。该aPV免疫方案已经被充分描述，最好与人临床样品中的百日咳疫苗效力相关[27，28]。如通过激发感染7天后肺中细菌菌落数目的全部清除所显示的，鼻腔单次给药BPZE1和通过两次腹腔注射aPV的免疫都提供了类似水平的保护(图9a)。在接受两次PBS注射而不是疫苗的对照小鼠中发现了高细菌负载。

[0144] 在为幼鼠使用BPZE1鼻腔免疫后针对包特氏百日咳杆菌的保护

[0145] 由于新型百日咳疫苗的主要目标是目前使用可利用疫苗不能被保护的幼婴，因此开发了幼鼠模型(3周龄)[29]，并用于将使用BPZE1接种疫苗的效力与使用aPV接种疫苗的效力进行比较。单次经鼻给药BPZE1完全保护幼鼠抵抗激发感染(图9b)，因为在激发后一周观察到肺中细菌的完全清除。相对地，激发感染后1周，在aPV接种疫苗的动物中仍残余实质量的细菌。BPZE-1接种疫苗的和aPV-接种疫苗的小鼠之间细菌负载的差别是统计上显著的，这说明在幼鼠模型中，使用BPZE1的单次鼻腔给药提供了比两次系统性给药aPV好的保护。

[0146] 另外，与aPV-接种疫苗动物相比，如果小鼠已经被使用BPZE1进行免疫，则稳定观察到给药后3小时激发菌株细菌负载的大量下降(图9c)，这说明使用BPZE1进行接种疫苗降低了对激发菌株感染的易感性。在8周的小鼠和幼鼠中都观察到了该效果。相反，与对照小鼠相比，aPV在感染3小时后对细菌数目没有影响。

[0147] 在鼻腔接种疫苗BPZE1后的抗包特氏百日咳杆菌的保护

[0148] 关于儿童中包特氏百日咳杆菌感染有越来越多的关注，特别是在免疫的人群中[30，31]。副百日咳包特氏菌引起了更轻微的百日咳类综合症，其频率可能被大大低估。而且，副百日咳包特氏菌感染的发病率在过去几十年已经持续提高，可能是因为已知的百日咳疫苗对副百日咳包特氏菌具有非常低或者没有保护性效力[32，33]。相反，最近已经报道包特氏百日咳杆菌感染会进行保护抗副百日咳包特氏菌的感染[34]。还使用幼鼠检验BPZE1的抗副百日咳包特氏菌的保护。然而，正如之前所报道的，两次给药aPV不提供针对副百日咳包特氏菌的任何保护，根据激发后1周接种疫苗的小鼠肺中副百日咳包特氏菌的低数目所检测的，单次鼻腔给药BPZE1提供了强保护(图9d)。

[0149] BPZE1疫苗接种诱导的免疫应答

[0150] 尽管抗包特氏百日咳杆菌(B.Pertussis)感染的保护性免疫的机制还未完全了解，但是在小鼠中已经证明了B细胞与IFN-γ作用的明确证据[28]。使用一次鼻腔剂量的BPZE1或两次腹腔注射给药aPV诱导了高滴度抗FHA的血清，包特氏百日咳杆菌的主要表面抗原[35]，这同样在aPV中出现(图10a)。在包特氏百日咳杆菌激发之后，在BPZE1-接种疫苗的动物和aPV-接种疫苗的动物中检测阳性回忆应答，表现为与包特氏百日咳杆菌感染之前初次应答相比，抗FHA IgG滴度的提高。抗FHA IgG1/IgG2a比例的检测显示这些比例在给药aPV之后比BPZE1接种疫苗之后高，其中抗FHAIgG1/IgG2a比例是Th2型应答的特征(图10b)。尽管在aPV接种疫苗的小鼠中激发后抗FHA-IgG1/IgG2a降低，但它仍保持了比BPZE1接种疫苗的动物在包特氏百日咳杆菌(B.Pertussis)激发后实质高的水平。

[0151] BPZE1或aPV接种疫苗所诱导的包特氏百日咳杆菌抗原特异性细胞因子特征的分析确认BPZE1给药促进比aPV接种疫苗强的Th1型应答。这是由使用PHA或PT或使用多克隆激活剂ConA刺激的脾细胞所产生的IFN-γ与IL-5的比例，在BPZE1接种疫苗的小鼠中比在aPV接种疫苗的小鼠中药显著得高(图10c)。

[0152] 一段时间内BPZE1的保护性免疫(1周～4周)

[0153] 如下表1～5中所示，尽管给药aPV提供了抗包特氏百日咳杆菌的有限保护(与第一周的未接种疫苗小鼠相比，细菌负载降低75％)，但针对在接种疫苗一周后进行的包特氏百日咳杆菌激发感染，单次鼻腔给药BPZE1也提供了高水平的保护(细菌负载降低97.64％)。如果激发感染出现在接种疫苗后2周，与未接种疫苗的小鼠相比，则BPZE1诱导的保护水平达到了99.99％以上，并且显著优于aPV疫苗所诱导的保护(与未接种疫苗的小鼠相比，92％大约)。因此，BPZE1的抗包特氏百日咳杆菌激发的疫苗效率在接种疫苗1周后仍显著，并且在接下来的2个月中持续提高。

[0154]

[0155] 表1：在幼鼠中抗包特氏百日咳杆菌激发的疫苗效力的动力学

[0156]

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[0159]

[0160] 百日咳是第一个传染性疾病，其发病率在高疫苗覆盖的国家持续增加。这种自相矛盾的状况可能与因为大量引入高度有效的疫苗而所观察到的流行病学改变有关。与接种疫苗之前的时代不同，目前青少年和成人百日咳的病理越来越频繁。尽管在该年龄组通常不威胁生命，但包特氏百日咳杆菌感染的成人对于非常年轻的儿童的感染是非常重要的贮主，这些非常年轻的儿童太小而不能通过接种疫苗而得到保护。因此，特别期望早期，可能是在出生时接种疫苗，但会受到新生儿和婴儿不成熟的免疫系统的限制。然而，天然包特氏百日咳杆菌感染即使在生命早期也能够诱导婴儿中强Th1应答[12]的事实促使我们开发通过经鼻途径给药的包特氏百日咳杆菌减毒疫苗活菌株，从而作为目前可以利用的疫苗的替代。

[0161] 基于灵长类动物的感染实验，Huang等人已经在1962年得到结论：抗百日咳的最终保护可能最好是遵循接种活包特氏百日咳杆菌[36]。在兽医学中，包特氏菌减毒菌株已经被用于针对狗和小猪中博德杆菌病(bordetellosis)进行接种疫苗。支气管败血性包特氏菌减毒活菌株已经显示在经鼻给药后在狗中提供针对犬窝咳(Kennel Cough)的强保护[37]。早在接种疫苗后48小时就观察到这种保护。使用支气管败血性包特氏菌减毒活菌株进行鼻腔接种疫苗也已经显示在两天大的小猪中提供抗萎缩性鼻炎的保护[38]，这说明减毒形式的包特氏菌活疫苗在新生动物中可以是高度活性的。

[0162] 之前将包特氏百日咳杆菌遗传减毒为活疫苗候选物的努力得到了非常有限的成功。根据用于对沙门氏菌(Salmonella)疫苗菌株成功减毒的策略[39]，Roberts等人已经去除了包特氏百日咳杆菌的aroA基因[40]。aroA突变体的确是高度减毒的，但也丧失了在鼻腔接种疫苗的动物的呼吸道内形成菌落的能力，并只有在重复高剂量给药才能诱导保护性免疫。我们利用关于包特氏百日咳杆菌毒性分子机理的知识，开发了高度减毒的BPZE1菌株。该菌株含有遗传改变，这导致三种主要毒素PTX、TCT和DNT的缺失或失活。与aroA突变体相反，该菌株能够在小鼠呼吸道内形成菌落，并在单次鼻腔给药后提供完全保护。在成年小鼠中的保护与通过两次给药1/5人剂量的aPV所诱导的保护没有区别。然而，在幼鼠中观察到了显著的区别，其中单次给药BPZE1完全保护，而aPV仅提供了部分保护。在难以使用目前可以利用的疫苗在生命早期诱导婴儿中的保护的前提下，这些结果为开发新型接种疫苗策略提供了希望，其可以用于非常年轻的儿童，甚至可能是在出生时。另外，BPZE1保护抵抗副百日咳包特氏菌，而aPV则不能。因此，使用BPZE1也应该对由副百日咳包特氏菌在婴儿中造成的百日咳发病率有影响。

[0163] 尽管最近在很多国家使用新型的aPV替换最早开发的全细胞疫苗已经显著降低了使用全细胞疫苗所观察到的系统性副作用，但重复接种疫苗以获得保护的需要仍没有消除。这导致不能够在非常年轻的儿童(<6个月)获得保护，这提供了产生炎症疾病的最大风险。另外，广泛使用aPV已经显示了新的未预见的问题。重复给药aPV可能造成在注射点大范围的肿胀[41]，这是用全细胞疫苗则没有发现。在大约5％的案例中，这种肿胀会影响整个肢体，并持续1周以上。尽管该肿胀的机理还没有被确定，但是已经认为是由于初次免疫所诱导的高抗体水平所造成的Arthus超敏反应[42]。然而，其也可能与Th2免疫应答的倾斜有关，因为与全细胞疫苗相比，aPV给药在接种疫苗的儿童中诱导更多的Th2型细胞因子[10]，并造成Th1产生的延迟(Mascart等人，准备中)。Th1功能的延迟成熟化已经与遗传倾向的个体中遗传性过敏症的风险有关[33]。这两个机理不是相互排斥的。与aPV相比，对BPZE1给药的免疫应答会更不偏向于Th2一边，并且由于BPZE1被经粘膜给药，因此不会发生肿胀反应。

[0164] 使用减毒的活细菌作为疫苗提高了它们的生物安全性。因此，它们满足了基因修饰的生物适于释放到环境的规定和指导。这些规定和指导描述了许多需要满足的条款，包括危害鉴定和环境风险评估[44]。潜在的病原性需要被认真考虑，特别是在免疫损伤的个体中，例如感染HIV的个体。包特氏百日咳杆菌的自然生物性是在这一点上特别令人感兴趣的。尽管HIV感染的对象中百日咳已经被偶尔描述，但是在AIDS患者中还是相当少见的[45]。因此，包特氏百日咳杆菌以它遗传减毒的形式被认为不会在感染HIV的儿童中造成重大问题，特别是如同对于许多疫苗，如果严重的AIDS是被排除的标准。包特氏百日咳杆菌形成菌落是特别限于呼吸上皮，而没有肺外细菌分布，这自然不包括BPZE1疫苗菌株的系统性菌血症。然而，如果发生了未预料的安全问题，也能够通过大环内酯抗生素例如红霉素消除该疫苗菌株，几乎所有的包特氏百日咳杆菌分离物都对红霉素高度敏感。

[0165] 与所有活疫苗一样，其它的考虑是可能将疫苗菌株释放到环境中，以及释放之后的事情。包特氏百日咳杆菌是严格的病原体，并且没有动物载体或贮主。而且，与支气管败血性包特氏菌不同，环境中野生型包特氏百日咳杆菌的存活是非常受到限制的[46]。百日咳仅能够由咳嗽的个体传播，并且似乎没有无症状的带菌者[47]。在本研究中所使用的小鼠模型中不能检验咳嗽。然而，由于BPZE1中基因改变的特征，特别是TCT的大大降低以及PTX的遗传失活，该菌株被认为不诱导咳嗽。已经显示活性的PTX在咳嗽大鼠模型中对于咳嗽是必须的，尽管其机理还不知道[48]。然而，如果疫苗菌株被传递给未接种疫苗的小鼠个体，最差也是将导致疫苗覆盖面的提高。因此，这些潜在危害的结果能够被认为可以忽略的，并且能够简单快速的被抗生素处理(如果必要的话)而控制。

[0166] 使用BPZE1的优点包括相对低的生产成本，使其对于发展中国家特别有吸引力，其不使用针的简单安全的给药模式以及其除了系统性免疫以外诱导粘膜免疫的潜力。尽管令人吃惊的是，抗百日咳的粘膜免疫还没有被大量研究，但是包特氏百日咳杆菌是严格粘膜病原体的事实，导致很可能粘膜免疫应答可以显著促进保护。目前还没有任何可以利用的疫苗诱导显著的粘膜应答。

[0167] 在接种疫苗中使用BPZE1的其他优点是：

[0168] -在单次鼻腔给药BPZE1之后获得快速的保护性免疫应答，因此在接种疫苗后1周可以检测到诱导疫苗；

[0169] -在接种疫苗后至少两个月内保护性疫苗持续提高；以及

[0170] -完全的保护性免疫，因为在接种疫苗后2周获得了超过99.999％的保护水平。

[0171] 使用包特氏百日咳杆菌减毒活菌株进行粘膜接种疫苗提供了另一个优点。包特氏百日咳杆菌能够用于对呼吸粘膜的异源抗原的表达(综述，参见49)。因此，使用BPZE1作为异源表达平台可以有助于产生针对多种呼吸道病原体的多价疫苗。然而，由于鼻腔给药BPZE1还诱导强系统免疫应答，如这里通过高水平的抗FHA抗体和抗原特异性IFN-γ产生所示，其还可以用于产生期望系统免疫应答期望的抗原。

[0172] 尽管本发明已经对各种优选的实施方式进行了描述，但本领域技术人员能够接受可以进行各种修饰、替换、省略和改变，而不离开本发明的范围。因此，本发明的范围是由后面的权利要求包括其等同物所限定的。

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