熟地黄多糖的制备方法转让专利
申请号 : CN200810230919.4
文献号 : CN101402691B
文献日 : 2010-12-29
发明人 : 崔瑛 , 刘菊
申请人 : 河南中医学院
摘要 :
本发明涉及熟地黄多糖的制备方法，有效解决从熟地黄中提取熟地黄多糖的问题，其解决的技术方案是，将熟地黄加8倍体积重量的水，在98～100℃浸提4h，过滤，药渣再加8倍原药物体积重量的水在98～100℃浸提4h，挤尽药渣水分，过滤，合并滤液，浓缩至相当于原药材0.5g/mL，加乙醇搅拌使含醇量达80％，缓加快搅，醇沉24h，抽滤，用4倍药材体积重量的95％乙醇洗涤沉淀，挥至无醇味，加水溶解至药材体积重量的2倍，调pH至8～9，加入无水氯化钙，使W/V达7％，溶解，放置室温，离心，取上清液浓缩至稠膏，95℃减压干燥即得，本发明用无水氯化钙对熟地黄多糖进行蛋白脱除，避免使用有毒试剂，脱蛋白效率达50.54％，熟地黄多糖保存率达77.15％，经济和社会效益巨大。
权利要求 :
1.一种熟地黄多糖的制备方法，其特征在于，将熟地黄加8倍体积重量的水，在98～
100℃浸提4h，过滤，药渣再加8倍原药物体积重量的水在98～100℃浸提4h，挤尽药渣水分，过滤，合并滤液，浓缩至相当于原药材0.5g/mL，加乙醇搅拌使含醇量达80％，缓加快搅，醇沉24h，抽滤，用4倍药材体积重量的95％乙醇洗涤沉淀，挥至无醇味，加水溶解至药材体积重量的2倍，调pH至8～9，加入无水氯化钙，使W/V达7％，溶解，放置室温，离心，取上清液浓缩至稠膏，95℃减压干燥即得熟地黄多糖。
2.根据权利要求1所述的熟地黄多糖的制备方法，其特征在于，将熟地黄100g加水
800ml，在98～100℃浸提4h，过滤，药渣再加水800ml在98～100℃浸提4h，挤尽药渣水分，过滤，合并滤液，浓缩至相当于原药材0.5g/mL，加乙醇搅拌使含醇量达80％，缓加快搅，醇沉24h，抽滤，用400mL质量浓度为95％的乙醇洗涤沉淀，挥至无醇味，加水溶解至
200mL，调pH至8～9，加入无水氯化钙，使W/V达7％，溶解，放置室温，离心，取上清液浓缩至稠膏，95℃减压干燥即得熟地黄多糖。
3.根据权利要求1所述的熟地黄多糖的制备方法，其特征在于，将熟地黄1000g加水
8000ml，在98～100℃浸提4h，过滤，药渣再加水8000ml在98～100℃浸提4h，挤尽药渣水分，过滤，合并滤液，浓缩至相当于原药材0.5g/mL，加乙醇搅拌使含醇量达80％，缓加快搅，醇沉24h，抽滤，用4000mL质量浓度为95％的乙醇洗涤沉淀，挥至无醇味，加水溶解至
2000mL，调pH至8～9，加入无水氯化钙，使W/V达7％，溶解，放置室温，离心，取上清液浓缩至稠膏，95℃减压干燥即得熟地黄多糖。
4.根据权利要求1所述的熟地黄多糖的制备方法，其特征在于，将熟地黄200g加水
1600ml，在98～100℃浸提4h，过滤，药渣再加水1600ml在98～100℃浸提4h，挤尽药渣水分，过滤，合并滤液，浓缩至相当于原药材0.5g/mL，加乙醇搅拌使含醇量达80％，缓加快搅，醇沉24h，抽滤，用800mL质量浓度为95％的乙醇洗涤沉淀，挥至无醇味，加水溶解至
400mL，调pH至8～9，加入无水氯化钙，使W/V达7％，溶解，放置室温，离心，取上清液浓缩至稠膏，95℃减压干燥即得熟地黄多糖。
说明书 :
熟地黄多糖的制备方法
一、技术领域
[0001] 本发明涉及医药，特别是一种熟地黄多糖的制备方法。
[0002] 二、背景技术
[0003] 地黄来源于玄参科植物地黄(Rehmanniag Lutinosa Libosch)新鲜或干燥根茎，为常用中药。熟地黄是地黄的炮制品，具有益精填髓，滋阴补血的功，效，用于肝肾阴虚、目昏耳鸣、腰虚酸软、骨蒸潮热、内热消渴、血虚萎黄、心悸怔仲、月经不调、崩漏下血、眩晕耳鸣、须发早白等症。经现代研究表明，熟地黄中含苷类、糖类、氨基酸等成分，通过药理实验已经获得熟地黄多糖有抗焦虑活性。为了生产抗焦虑药物，需将多糖从熟地黄中提取出来(称熟地黄多糖)，近年来，植物多糖作为药效物质日受人们重视，关于多糖的工艺、药理方面研究取得较大进展。熟地黄多糖的药理作用、含量测定研究也较多，现虽有多种提取方法，均是实验室研究，不能投入生产。故为了生产需要，对熟地黄多糖制备工艺进行改造，形成新的大生产工艺势在必行。
[0004] 三、发明内容
[0005] 针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明之目的就是提供一种熟地黄多糖的制备方法，可有效解决从熟地黄中提取熟地黄多糖的问题，其解决的技术方案是，将熟地黄加8倍体积重量(体积重量是指熟地黄用g计，水用ml计)的水，在98～100℃浸提4h，过滤，药渣再加8倍原药物体积重量的水在98～100℃浸提4h，挤尽药渣水分，过滤，合并滤液，浓缩至相当于原药材0.5g/mL，加乙醇搅拌使含醇量达80％，缓加快搅，醇沉24h，抽滤，用4倍药材体积重量的95％乙醇洗涤沉淀，挥至无醇味，加水溶解至药材体积重量的
2倍，调pH至8～9，加入无水氯化钙，使W/V达7％，溶解，放置室温，离心，取上清液浓缩至稠膏，95℃减压干燥即得熟地黄多糖，本发明采用无水氯化钙对熟地黄多糖进行蛋白脱除，操作简便，避免使用有毒试剂，价廉易得，脱蛋白效率达50.54％，熟地黄多糖保存率达
77.15％，是从熟地黄中制备熟地黄多糖的优良方法，经济和社会效益巨大。 [0006] 四、具体实施方式
2倍，调pH至8～9，加入无水氯化钙，使W/V达7％，溶解，放置室温，离心，取上清液浓缩至稠膏，95℃减压干燥即得熟地黄多糖，本发明采用无水氯化钙对熟地黄多糖进行蛋白脱除，操作简便，避免使用有毒试剂，价廉易得，脱蛋白效率达50.54％，熟地黄多糖保存率达
77.15％，是从熟地黄中制备熟地黄多糖的优良方法，经济和社会效益巨大。 [0006] 四、具体实施方式
[0007] 以下结合实际情况和实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。 [0008] 将熟地黄100g加水800ml，在98～100℃浸提4h，过滤，药渣再加水800ml在98～100℃浸提4h，挤尽药渣水分，过滤，合并滤液，浓缩至相当于原药材0.5g/mL，加乙醇搅拌使含醇量达80％，缓加快搅，醇沉24h，抽滤，用400mL质量浓度为95％的乙醇洗涤沉淀，挥至无醇味，加水溶解至200mL，调pH至8～9，加入无水氯化钙，使W/V达7％，溶解，放置室温，离心，取上清液浓缩至稠膏，95℃减压干燥即得熟地黄多糖，脱蛋白效率达50.54％，熟地黄多糖保存率达77.15％。
[0009] 将熟地黄1000g加水8000ml，在98～100℃浸提4h，过滤，药渣再加水8000ml在98～100℃浸提4h，挤尽药渣水分，过滤，合并滤液，浓缩至相当于原药材0.5g/mL，加乙醇搅拌使含醇量达80％，缓加快搅，醇沉24h，抽滤，用4000mL质量浓度为95％的乙醇洗涤沉淀，挥至无醇味，加水溶解至2000mL，调pH至8～9，加入无水氯化钙，使W/V达7％，溶解，放置室温，离心，取上清液浓缩至稠膏，95℃减压干燥即得熟地黄多糖，脱蛋白效率达
50.54％，熟地黄多糖保存率达77.15％。
50.54％，熟地黄多糖保存率达77.15％。
[0010] 将熟地黄200g加水1600ml，在98～100℃浸提4h，过滤，药渣再加水1600ml在98～100℃浸提4h，挤尽药渣水分，过滤，合并滤液，浓缩至相当于原药材0.5g/mL，加乙醇搅拌使含醇量达80％，缓加快搅，醇沉24h，抽滤，用800mL质量浓度为95％的乙醇洗涤沉淀，挥至无醇味，加水溶解至400mL，调pH至8～9，加入无水氯化钙，使W/V达7％，溶解，放置室温，离心，取上清液浓缩至稠膏，95℃减压干燥即得熟地黄多糖，脱蛋白效率达
50.54％，熟地黄多糖保存率达77.15％。
50.54％，熟地黄多糖保存率达77.15％。
[0011] 本发明工艺新颖、脱蛋白效果好，操作简便，避免有毒试剂，价廉，安全，易制备熟地黄多糖，与其它制备方法相比具有明显的优势，是制备熟地黄多糖的一个创造，并为试验所证实.
[0012] 1正交实验优选熟地黄水提工艺
[0013] 试验以加水量、提取时间、提取次数为考察因素，每因素设三个水平，以干膏收率(％)，多糖含量(以葡萄糖计)为指标，综合评分y＝0.4a+0.6b(a为 干膏收率，b为多糖含量)，因素水平表见表1：
[0014] 表1熟地多糖提取工艺正交因素和水平
[0015]
[0016] 1.2多糖含量和干膏收率测定将正交九份溶液稀释合适倍数，测定方法按4.1项和4.2项。
[0017] 2单因素实验优选醇沉浓度
[0018] 2.1方法：称取熟地黄药材适量，加10倍量水，于水浴98～100℃提取2次，每次4h，合并滤液，减压浓缩至相当于生药0.5g/ml。分别吸取五份10ml药液，加质量浓度为
95％的乙醇使醇沉浓度分别达到30％、50％、70％、80％、90％，静置24h，抽滤，得粗多糖，用质量浓度为95％的乙醇反复洗涤沉淀，挥至无醇味，定容。
95％的乙醇使醇沉浓度分别达到30％、50％、70％、80％、90％，静置24h，抽滤，得粗多糖，用质量浓度为95％的乙醇反复洗涤沉淀，挥至无醇味，定容。
[0019] 2.2多糖含量和干膏收率测定将以上五份溶液稀释相同倍数，测定方法同4.1项和4.2项。
[0020] 3单因素实验优选脱蛋白工艺
[0021] 3.1无水氯化钙法称取熟地黄饮片50.0g，按优选的水提醇沉工艺，药液定容至相当于原药材0.5g/ml。分别吸取四份，均为10ml，至已经干燥的小烧杯中，加1mol/L的NaOH调pH至8～9。水浴加热至85℃，加入无水氯化钙使浓度(w/v)分别达到3％、5％、7％、10％。搅拌溶解，取出，放至室温，离心15min，3000转/分，弃沉淀，定容。 [0022] 3.2三氯乙酸法取按优选水提醇沉工艺所得药液四份置干燥烧杯中，冰浴中加入等体积浓度为3％、5％、7％、10％三氯乙酸液，搅拌10分钟，4℃放置4h，调pH至中性，离心，取上清液定容。
[0023] 3.3多糖保存率和蛋白脱除率测定
[0024] 用4.1项方法测得多糖含量，计算多糖保存率。按4.3项测定蛋白含量，计算多糖保存率和蛋白脱除率计算公式如下：
[0025]
[0026]
[0027] 4含量测定及干膏收率测定
[0028] 4.1多糖含量测定
[0029] 4.1.1标准曲线的绘制精密称取P2O5干燥器干燥至恒重的葡萄糖标准品25.02mg，加水溶解定容，配制成0.10008m g/ml对照溶液备用。精密吸取葡萄糖对照溶液0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7ml置于10ml的干燥具塞刻度试管中，依次加水使体积均为1.0ml，另取
1.0ml蒸馏水作空白对照.再分别加入5％苯酚溶液1.0ml，摇匀，迅速用酸式滴定管滴加浓H2SO45.0ml，充分摇匀，室温放置30min，在最大吸收波长488nm处测定吸光度值，数据处理得回归方程：A＝0.0621 C-0.0151(R＝0.9974)。葡萄糖浓度在20.016～70.056μg范围内线性良好。
1.0ml蒸馏水作空白对照.再分别加入5％苯酚溶液1.0ml，摇匀，迅速用酸式滴定管滴加浓H2SO45.0ml，充分摇匀，室温放置30min，在最大吸收波长488nm处测定吸光度值，数据处理得回归方程：A＝0.0621 C-0.0151(R＝0.9974)。葡萄糖浓度在20.016～70.056μg范围内线性良好。
[0030] 4.1.2样品含量测定将定容好的多糖液，按标准曲线下方法操作，测得吸收度，代4
入回归方程，计算多糖含量。结果见L9(3) 表2：
入回归方程，计算多糖含量。结果见L9(3) 表2：
[0031] 4.2干膏收率的测定将定容的多糖液，吸取25ml至已干燥称重的蒸发皿中，干燥至恒重。计算收膏率。收膏率(％)＝(称得干膏重量×稀释倍数/药材重量)×100％。 [0032] 4.3蛋白质含量测定
[0033] 4.3.1标准曲线的绘制精密称取牛血清白蛋白10.68mg，加超纯水定容至100mL。精密称取考马斯亮蓝G250 10.52mg，溶于5ml 90％(v/v)的乙醇(蓝色)中，再加入85％(m/v)的磷酸(血红色)10ml，最后用超纯水定容至100ml(褐色)，备用。精密吸取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置干燥具塞试管中依次加水至1mL，加入考马斯亮蓝G250试剂5ml，摇匀，在最大吸收波长594nm处测定吸收度，以吸收度对浓度绘制标准曲线，得 A
2
＝0.0331C+0.0066，r ＝0.9993，线性范围：21.36～106.8μg/mL
2
＝0.0331C+0.0066，r ＝0.9993，线性范围：21.36～106.8μg/mL
[0034] 4.3.2样品含量测定将脱过蛋白溶液稀释至适当倍数，在594nm处测定吸收度，计算含量。
[0035] 5实验结果
[0036] 5.1熟地多糖水提工艺结果
[0037] 见表2和结果分析表3：
[0038] 表2 水提工艺研究结果
[0039]
[0040] 表3 熟地多糖提取工艺综合评分方差分析结果
[0041]
[0042] 注：F1-0.1(2，2)＝9.00F1-0.05(2，2)＝19.00F1-0.01(2，2)＝99.00 [0043] 由直观分析可知，影响水提因素顺序为：B>C>A，即提取时间>提取次数>加水量。根据正交结果表，B选择B1，C、A因素影响不显著，又根据生产实际考 虑，可选择C3A3，综合选择最优方案为A3B1C3。即加8倍量水，提取2次，每次4h。
[0044] 5.2醇沉浓度优选结果
[0045] 结果见表4：
[0046] 表4 不同醇沉浓度对干膏收率和多糖吸收度的影响
[0047]
[0048] 从结果可以看出熟地多糖最佳醇沉浓度为80％。
[0049] 5.3脱蛋白工艺优选结果