一种以富含淀粉中药材为原料发酵生产2,3-丁二醇的方法

摘要

本发明公开了一种以富含淀粉中药材为原料发酵生产2，3-丁二醇的方法，属于生物化工技术领域。其特征是以富含淀粉中药材为原料，经液化、糖化得到糖化液，以糖化液为碳源，与灭菌后的无机盐营养成分混合，接入产2，3-丁二醇的菌种，进行摇瓶发酵、批式发酵或通过补加固体葡萄糖，进行批式流加发酵，得到较高浓度2，3-丁二醇。本发明的效果与益处是原料易于取材，不存在与人争粮、与粮争地等问题，能够有效降低生物转化法生产2，3-丁二醇的成本，同时获得较高浓度的2，3-丁二醇，对提高中药材的高值化利用具有广泛的前景。

权利要求

1.一种以富含淀粉中药材为原料发酵生产2，3-丁二醇的方法，是以药材糖化液为原料，与灭菌后的无机盐成分混合，接入产2，3-丁二醇的菌种，发酵得到2，3-丁二醇的发酵液，其特征在于如下步骤：(1)菌种：采用的菌种为克雷伯氏菌CICC 10011；

(2)原料制备和处理：盾叶薯蓣或山药干燥药材粉碎后按料水比1∶2-1∶10(w/w)进行调浆，在80-90℃下预糊化20-40min，加入耐高温α-淀粉酶6-200U/g，温度控制在

90-110℃，液化10-120min，之后冷却降温，用盐酸将pH值调至4.0-4.5，加入葡萄糖淀粉酶

50-300U/g，温度控制在40-65℃，糖化2-20h，所得糖化液还原糖浓度范围：80-450g/L；

(3)培养基：种子培养基是将(2)中药材糖化液与种子培养基中无机盐营养成分分别在115-121℃条件下灭菌15-20min，冷却后混合得到；

发酵培养基是将(2)中药材糖化液与发酵培养基中无机盐营养成分分别在115-121℃条件下灭菌15-20min，冷却后混合得到；

(4)发酵培养：经活化后(1)中的菌种按照1-5％的接种量接种到种子培养基中，温度

35-38℃，转速180-220rpm，培养20-24h，将得到的种子按照2-10％(v/v)的接种量接种到发酵培养基中，温度35-38℃，转速200-300rpm，通空气量0.02-0.5vvm，pH 5.0-7.0条件下进行发酵。

2.根据权利要求1所述的一种以富含淀粉中药材为原料发酵生产2，3-丁二醇的方法，其特征在于采用的发酵工艺是批式发酵或批式流加发酵；批式发酵得到2，3-丁二醇的最终浓度为25-60g/L，2，3-丁二醇与乙偶姻浓度之和为30-70g/L；通过补加固体葡萄糖进行批式流加发酵，得到2，3-丁二醇最终浓度60-100g/L，2，3-丁二醇与乙偶姻浓度之和为

70-110g/L。

说明书

一种以富含淀粉中药材为原料发酵生产2，3-丁二醇的方

法

技术领域

[0001] 本发明属于生物化工技术领域，涉及一种发酵生产2，3-丁二醇的方法，特别涉及到一种以富含淀粉中药材为原料经微生物发酵生产2，3-丁二醇的方法。

背景技术

[0002] 2，3-丁二醇(英文名：2，3-Butanediol，以下简称2，3-BD)作为一种极其重要的化工原料，广泛应用于化工、食品、航空航天等领域。它的热值与乙醇接近，是一种极具价值的液体燃料。它脱水成甲乙酮，可用作树脂、油漆的溶剂或燃料添加剂；脱水成丁二烯，可用于合成橡胶；脱氢成乙偶姻和二乙酰化合物，可用来制作高价值香料和食品添加剂；它还可以代替1，4-丁二醇，用于聚酯和聚亚胺酯的合成；同甲乙酮缩合并进行加氢形成辛烷，可用来生产高级航空用油；与乙酸反应生成2，3-丁二醇二乙酸酯，添加到奶油中用于改善风味。此外，2，3-BD还可以用来制备聚合物、油墨、香水、防冻剂、香薰剂、增湿剂、炸药以及药物的手性载体等(Appl Microbiol Biotechnol，2001，55(1)：10-18；精细与化工专用品，2006，14(15)：15-18)。

[0003] 2，3-BD的生产方法主要有化学法和生物转化法。由于化学法存在诸多问题，至今未能实现工业化生产。生物转化法即以可再生资源为原料，通过微生物代谢将单糖转化为目标产物。由于生物转化法具有安全、环保、反应条件温和及原料可再生等特点，逐步成为国内外研究的热点。目前对生物转化法生产2，3-BD的报道比较多，其碳源多为葡萄糖(Appl Microbiol Biotechnol，1991，34(4)：463-468；Chin J Chem Eng，2006，14(1)：132-136)，但是葡萄糖为碳源存在着价格高，与人争粮、与粮争地等一系列弊端。同时也有报道利用糖蜜、淀粉或甘蔗汁为碳源发酵生产2，3-BD(Z.Naturforsch，2001，56：787-791；
中国专利：CN1710086A)，还有报道是以纤维素为碳源(Appl Microbiol Biotechnol，2001，
55：10-18；Enzyme MicrobTechnol，1991，13：110-115，中国专利：CN101153291A)，但最终产物2，3-BD的浓度都不高。因此，寻找一种既廉价又有效的非粮原料替代或部分替代粮食作物是推进发酵生产2，3-BD的必经之路。

[0004] 近年来，随着中草药和中成药的蓬勃发展，其中富含淀粉中药材只有部分有效成分被提取，而药材的主要组分淀粉因包含在药渣内或水解后进入废液浪费掉，还有一些药材因其应用受限而造成资源的白白浪费。因此，以富含淀粉中药材为原料发酵生产2，3-BD将成为一个重要的选择。

[0005] 目前，在我国年产量100万吨以上，且淀粉含量在40％以上的中药材主要有盾叶薯蓣、山药、葛根等。盾叶薯蓣，俗名黄姜，是薯蓣科薯蓣属多年生藤本植物。目前盾叶薯蓣全国种植面积已达4000多万亩，是我国提取甾体激素类药物原料薯蓣皂苷元的主要植物。盾叶薯蓣中除了含有甾体皂苷及其配基薯蓣皂苷元外，还含有45～50％淀粉和40～50％纤维素及有机酸等微量化学成分。盾叶薯蓣液化、糖化后，其糖化液可用于发酵生产2，
3-BD，残渣则用于提取薯蓣皂苷元。另外，盾叶薯蓣中所含有的有机酸成分对发酵有一定促进作用。黄进等从盾叶薯蓣中提取葡萄糖(农业工程学报，2001，17(6)：119-122.)，楚德强等利用盾叶薯蓣发酵生产酒精(酿酒科技，2007，2：24-28)，也有报道利用鲜黄姜生产白酒(中国专利：CN1389559A)。山药(又名山芋、薯蓣等)，是薯蓣科植物薯蓣的块茎。山药中富含蛋白质、淀粉、脂肪、维生素和糖类，还含有山药素、尿囊素、皂苷、胆碱、氨基酸及其它的微量化学成分，其中山药干药材淀粉含量高达约80％。张元等从山药中提取多糖(中国中药杂志，2008，33(4)：374-377)，也有从山药中提取多糖、糖蛋白等保健因子，制成保健食品和饮料(中国专利：CN03147395.4)。我国每年种植收获的山药产量在几千万吨以上，各种野生的山药产量更大，多因开发不利而浪费掉。葛根(葛条、粉葛等)是豆科葛属多年生落叶藤本植物的块根。目前我国葛类总面积约600万亩，年产量在150万吨以上，其中小部用来制备中药材及淀粉加工，也有报道利用葛根生产燃料乙醇(中国专利：CN101191134；
中国专利：CN101190908；中国专利：CN101191134)，还有相当多的资源没有被开发和利用。
因此利用非粮可再生的富含淀粉中药材为原料发酵生产2，3-BD，在一定程度上降低了生物转化法生产2，3-BD的成本，加强了药材的综合利用，同时为富含淀粉中药材的开发提供了一个新的途径。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种使用非粮的原料富含淀粉中药材来替代或部分替代葡萄糖发酵生产2，3-BD的技术方法，解决目前主要利用葡萄糖为底物发酵生产2，3-BD存在成本较高的问题。

[0007] 为实现上述目的，本发明的技术方案具体步骤如下：

[0008] (1)菌种：采用的菌种通常为克雷伯氏菌属、多粘芽孢杆菌属或产气肠杆菌属。

[0009] (2)原料制备和处理：以干燥的药材为原料，粉碎后按料水比1:2-1:10(w/w)进行调浆，在80-90℃下预糊化20-40min。加入耐高温α-淀粉酶6-200U/g，温度控制在90-110℃，液化10-120min，之后冷却降温，用盐酸将pH值调至4.0-4.5，加入葡萄糖淀粉酶
50-300U/g，温度控制在40-65℃，糖化2-20h，所得糖化液还原糖浓度范围80-450g/L。

[0010] (3)培养基：

[0011] 种子培养基是将(2)中药材糖化液与无机盐营养成分分别在115-121℃条件下灭菌15-20min，冷却后混合得到；培养基中无机盐营养成分包括：(NH4)2HPO46.0g/L；KCl1.8g/L；EDTA0.51g/L；MgSO4·7H2O0.6g/L；柠檬酸0.21g/L；柠檬酸钠0.294g/L。

[0012] 发酵培养基是将(2)中药材糖化液与无机盐营养成分分别在115-121℃条件下灭菌15-20min，冷却后混合得到；培养基中无机盐营养成分包括：KH2PO41.36g/L；(NH4)2SO46.61g/L；MgCl2·6H2O0.26g/L；酵母粉1g/L；柠檬酸0.42g/L。

[0013] (4)发酵培养：经活化后(1)中的菌种按照1-5％的接种量接种到种子培养基中，温度35-38℃，转速180-220rpm，培养20-24h；将上述种子按照2-10％的接种量接种到发酵培养基中，温度35-38℃，转速200-300rpm，通空气量0.02-0.5vvm，pH5.0-7.0条件下进行发酵。

[0014] 所述发酵工艺是将药材粉碎后调浆，经液化、糖化后制成糖化液，然后以糖化液为底物，进行摇瓶发酵和批式发酵，可得到2，3-BD最终浓度25-60g/L，2，3-BD与乙偶姻浓度之和为30-70g/L，采用批式流加发酵方式，补加固体葡萄糖，可得到2，3-BD最终浓度60-100g/L，2，3-BD与乙偶姻浓度之和为70-110g/L。

[0015] 本发明的有益效果：本发明所用原料易于取材，不存在与人争粮、与粮争地等问题，能够有效降低生物转化法生产2，3-BD的成本，获得较高浓度的2，3-BD。同时能够降低中药制药工业中的污染，提高中药材的高值化利用。

具体实施方式

[0016] 以下结合技术方案详细叙述本发明的具体实施例。

[0017] 实例1：以盾叶薯蓣糖化液为原料进行摇瓶培养

[0018] (1)菌种：克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)，中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)保藏，保藏号CICC No.10011。

[0019] (2)盾叶薯蓣液化、糖化：将盾叶薯蓣干药材粉碎，按料水比1:4调浆，在80-90℃下预糊化30min。加入耐高温α-淀粉酶12U/g，温度控制在90-95℃，液化30min，之后冷却降温，用8％(w/w)盐酸将pH值调至4.2，加入葡萄糖淀粉酶120U/g，温度控制在58-60℃，糖化12h，将糖化液在8000rpm离心，得到还原糖浓度为134.4g/L的薯蓣糖化液。

[0020] (3)培养基：将薯蓣糖化液在115℃条件下单独灭菌15min，冷却后与灭菌的培养基中无机盐营养成分混合；培养基中无机盐营养成分包括：(NH4)2HPO46.0g/L；KCl1.8g/L；EDTA0.51g/L；MgSO4·7H2O0.6g/L；柠檬酸0.21g/L；柠檬酸钠0.294g/L。

[0021] (4)培养方式与结果：摇瓶培养在500mL三角瓶中，装液量为60mL，接种量为2％(v/v)，培养温度为37℃，转速为200rpm，培养24h。发酵液中2，3-BD最终浓度为27.59g/L，2，3-BD与乙偶姻最终浓度之和为38.67g/L，生产强度为1.61g/(L·h)。

[0022] 实例2：以山药糖化液为原料进行摇瓶培养

[0023] (1)菌种：同实例1

[0024] (2)山药液化、糖化：将鲜山药清洗，干燥后粉碎。按料水比1:5调浆，在80-90℃下预糊化30min。加入耐高温α-淀粉酶12U/g，温度控制在90-95℃，液化30min，之后冷却降温，用8％(w/w)盐酸将pH值调至4.2，加入葡萄糖淀粉酶120U/g，温度控制在58-60℃，糖化12h，得到还原糖浓度为320g/L的山药糖化液。

[0025] (3)培养基：将山药糖化液在115℃条件下单独灭菌15min，冷却后与灭菌的培养基中无机盐营养成分混合；培养基中无机盐营养成分包括：(NH4)2HPO46.0g/L；KCl1.8g/L；EDTA0.51g/L；MgSO4·7H2O0.6g/L；柠檬酸0.21g/L；柠檬酸钠0.294g/L。

[0026] (4)培养方式与结果：摇瓶培养在500mL三角瓶中，装液量为60mL，接种量为2％(v/v)，培养温度为37℃，转速为200rpm，培养22h。发酵液中2，3-BD最终浓度为37.71g/L，2，3-BD与乙偶姻最终浓度之和为42.17g/L，生产强度为1.92g/(L·h)。

[0027] 实例3：以盾叶薯蓣糖化液为原料进行批式发酵

[0028] (1)菌种：同实例1

[0029] (2)盾叶薯蓣液化、糖化：同实例1

[0030] (3)培养基：将薯蓣糖化液在115℃条件下单独灭菌15min，冷却后与灭菌的发酵培养基中无机盐营养成分混合；发酵培养基中无机盐营养成分包括：KH2PO41.36g/L；(NH4)2SO46.61g/L；MgCl2·6H2O0.26g/L；酵母粉1g/L；柠檬酸0.42g/L。

[0031] (4)培养方式与结果：发酵培养使用5L发酵罐，装液量为1.5L，接种量为5％(v/