一种筛查免疫相关疾病疑似患者的酶联免疫试剂盒

摘要

本发明公开了一种筛查免疫相关疾病疑似患者的酶联免疫试剂盒。该试剂盒包括抗原和酶标二抗；所述抗原为下述蛋白质或多肽中的至少一种：1)至少含有自GenBankAccession Number AAH03453的氨基末端的第21位-253位氨基酸残基的由calreticulin蛋白缺失得到的多肽；2)至少含有自GenBank Accession Number P27773的氨基末端的第27位-250位氨基酸残基的由ERp57蛋白缺失得到的多肽；3)vimentin蛋白；4)calreticulin蛋白；5)ERp57蛋白。该试剂盒可与其它临床信息相互结合，并相互印证，提高诊断效率。

权利要求

1.一种筛查免疫相关疾病疑似患者的酶联免疫试剂盒，包括抗原和酶标二抗；所述抗原的氨基酸序列是自GenBank Accession Number AAH03453的氨基末端的第21位-253位氨基酸残基的calreticulin多肽。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括免疫相关疾病患者血清、阴性对照血清。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括洗涤液、封闭液、底物溶液和终止液。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述免疫相关疾病为系统性红斑狼疮和/或慢性乙型肝炎和/或类风湿关节炎。

说明书

一种筛查免疫相关疾病疑似患者的酶联免疫试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及一种筛查免疫相关疾病疑似患者的酶联免疫试剂盒。

背景技术

[0002] 免疫系统通过多条渠道的正、负反馈调节将免疫应答控制在适当强度之内。这其中包括抗原、神经系统和内分泌系统的调节，但受到关注最多的而且也是至关重要的是调节性T细胞的调节。这种多渠道调节作用的有效整合确保实现免疫系统的自稳平衡。

[0003] T细胞是适应性免疫应答的核心，也是免疫调节的主要靶点。许多免疫性疾病源自T细胞活化或者调控的异常。这些疾病包括自身免疫疾病、过敏性疾病等。自身免疫病是一类多发的严重危害人体健康的疾病，已经发现的人类自身免疫病共有80余种。在许多自身免疫病的形成过程中，T细胞都扮演重要角色，以T细胞为靶点的免疫治疗是现代免疫治疗的重要发展方向。常见自身免疫病发生和治疗以及相应动物模型的建立都与T细胞在体内对免疫调节的影响密切相关。

[0004] 系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)是典型的抗体介导的自身免疫病。东方人和黑人育龄妇女发病率最高，约为0.1％。在我国，这一疾病近年来呈明显的上升趋势，几乎已经成为育龄妇女的常见病。SLE的主要特点是多克隆淋巴细胞的非特异性活化。患者在活动期的主要临床表现为关节疼痛，发烧，面部红斑，血尿、蛋白尿，白细胞贫血，血沉加快，高丙种球蛋白血症等。DNA、核蛋白、红细胞、白细胞、血小板等均成为自身免疫反应的靶抗原。血液中含有大量的核蛋白、DNA以及其它自身抗原(如红细胞表面抗原等)的抗体以及抗原-抗体复合物。免疫病理以抗DNA抗体在皮下、关节和肾小球基底膜等处沉积造成炎症反应为主。也有学说认为抗DNA抗体能够与肾小球基底膜等处的胶原蛋白发生交叉反应。对于红斑狼疮的发病来说，自身抗体的产生是导致疾病发生的主要原因，而在自身抗体产生的过程中，除了B细胞以外，T细胞同样发挥着重要的作用。红斑狼疮T细胞存在着非常复杂的严重缺陷，其中包括T细胞共刺激分子异常、T细胞信号传导异常、T细胞凋亡异常、细胞因子产生异常以及自身反应性T细胞的产生。每种异常对于T细胞的活化、功能发挥以及消亡都起着非常重要的作用，同时也严重地影响了自身抗体的产生。

[0005] 为研究红斑狼疮的发病机制所建立的BXSB小鼠动物模型中，成年雄性动物80％发病，雌性动物则较少发病，其自身免疫现象与人SLE十分相似。发病动物血清中有高水平的抗核抗体和抗双链DNA抗体并伴有自身免疫性贫血现象，晚期出现肾小球肾炎。

[0006] 类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是以另一种常见的自身免疫性病，该病以慢性进行性关节滑膜以及关节软骨坏损为特征，影响了全世界人口的1％。发病年龄一般在40-50岁，女性的发病率是男性的3-4倍；绝大多数病人的血液中都有高水平的RF因子(针对自体IgG的IgM抗体)。患病早期，关节肿胀、疼痛并伴有功能障碍。关节滑膜炎症使其变得肥厚、皱褶，并有淋巴细胞浸润，关节软骨遭到破坏。重症者晚期的慢性进行性炎症导致关节软骨坏损和关节畸形。

[0007] 用完全佛氏佐剂(CFA)皮下免疫LEWS大鼠可诱导全身关节的炎症性病变。其特征与人的RA非常类似，包括关节滑膜的中性粒细胞和单核细胞浸润，关节软骨的损伤造成关节变形以至完全失去功能。用病鼠的Th细胞过继转移可以造成受体鼠引发同样的病变，而血清过继转移则无此作用，这也是T细胞调节作用影响自身免疫病进程的又一个证明。

[0008] 治疗自身免疫病的最佳方案当然是帮助机体恢复应有的自身免疫耐受状态，但晚期自身免疫病多涉及多个自身抗原，而且诱导免疫耐受的方法尚不成熟，这一目标目前尚难以实现。现行治疗方案主要着眼于控制患者的炎症反应，比较常用的有非特异性阿司匹林类药物(NSAIDs)和糖皮质激素。去除血清中的自身抗体或者免疫复合物、置换血浆也有一定的短期疗效。细胞毒性抗癌药或者淋巴器官放射线照射(清除自身免疫性T和B淋巴细胞)对某些晚期重症自身免疫病患者有一定疗效。用环孢素A能够较特异地抑制T细胞，用抗T和B细胞单克隆抗体有可能达到抑制T和B细胞活性的目的，但是这类治疗有时会造成继发性免疫缺陷。

[0009] 自身免疫病是免疫应答失调而对自身抗原产生过度反应以至导致造成机体损伤的现象，超敏反应是宿主对外来或者自身抗原的过度免疫应答而引起炎症反应的现象。在本质上两者的发病机制是一致的。超敏反应分为四型，I型超敏反应是个别宿主对某些环境抗原(变应原)发生正性反应的结果，通常由IgE和肥大细胞介导，以黏膜下肥大细胞的迅速激发为主要特征。II型和III型超敏反应由IgM和/或IgG介导，前者导致细胞及结缔组织的损伤，而后者以免疫复合物沉积为主。虽然这些超敏反应的免疫损伤是由抗体介导的，但超敏状态的形成和维持却依赖于Th细胞。与依赖于抗体介导的超敏反应不同，IV型超敏反应由T淋巴细胞介导，由于此型超敏反应在抗原攻击后48小时才出现反应，又称为迟发型超敏反应。其核心是CD4和/或CD8阳性效应T细胞在识别靶抗原后所造成的以淋巴细胞浸润为主要病理特征的炎症损伤，这类疾病至少有下列几种表现形式：接触性皮炎、结核菌素反应、肉芽肿。慢性自身免疫性肝炎的本质也是IV型超敏反应。

[0010] 目前的观点认为，正常机体内本身就存在微弱的调节性的抗T细胞免疫应答，T细胞免疫只是大增强了已有的免疫应答的水平。其中调节性T细胞的作用已得到较为全面的论述，但有关T细胞疫苗(TCV)诱导调节性体液免疫应答的研究较少。

[0011] 国内外研究均证明，TCV诱导了抗T细胞的体液免疫反应。TCV免疫动物后，可明显抑制T细胞增生，阻止自身免疫疾病或诱导同种移植物的存活期延长；在动物血清中检测到抗TCV抗体(IgG)存在。体外实验证明，TCV免疫后血清对同一克隆T细胞具有强烈的抑制作用。吸收实验结果表明，这些抗体具有TCV特异性，能差异性识别活化T细胞和正常淋巴细胞。用针对人II型胶原的特异性T细胞系给DBA/IJ小鼠接种，能诱发小鼠对关节炎的抵抗力，并发现在小鼠血清中还存在一种抗独特型抗体，能与针对人II型胶原的自身抗体起反应。在Lewis大鼠中，T细胞疫苗也诱导出了几种同基因型T细胞起反应的自身抗体。T细胞疫苗免疫后，体内自然存在的体液网络的反应得到加强。研究还表明，Lewis大鼠从EAE疾病恢复的过程也与抗T细胞抗体的产生有关。在体外，患实验性变态反应性脑脊髓膜炎(EAE)后和疫苗注射后的血清都可强烈抑制同基因T细胞克隆的增殖，其抑制作用由抗体介导并呈现部分补体依赖性；在体内，两种血清均可改善EAE的症状。从Epstein-Barr Virus(EBV)转染TCV免疫多发性硬化症(MS)病人的B细胞克隆得到抗T细胞抗体。

[0012] 关于TCV免疫后抗体的作用研究较少，但目前研究已证明活化T细胞免疫后宿主可产生抗细胞表面活化分子抗体，用针对人II型胶原的特异性T细胞系给BDA/IJ小鼠接种，能诱发小鼠对关节炎的抵抗力，并发现在小鼠血清中还存在一种抗独特型抗体，能与针对人II型胶原的自身抗体起反应。在Lewis大鼠中，T细胞疫苗也诱导出了与几种同基因型T细胞蛋白起反应的自身抗体。T细胞免疫后，体内自然存在的体液网络的反应得到加强。研究还表明，Lewis大鼠从EAE疾病恢复的过程也与抗T细胞抗体的产生有关。在体外，患EAE后和疫苗注射后的血清都可强烈抑制同基因T细胞克隆的增殖。这一抑制作用由抗体介导并呈现部分补依赖性，在体内，两种血清均可改善EAE的症状。

[0013] 确定这些抗活化态T细胞抗体所识别的靶蛋白并对其功能加以研究，有助于加深对TCV的免疫调节机制的认识。免疫蛋白组学的出现，使系统分析TCV诱发的体液免疫应答成为可能。

[0014] Western blotting是鉴定免疫原性蛋白的经典方法，而通常所用的Western blotting和免疫共沉淀技术很难确认靶分子的本质；但二者结合产生一门新的技术—免疫蛋白组学，应用此项技术能够鉴定出所有的免疫原性蛋白，讫今为止已成功应用于微生物苗的筛选及鉴定肿瘤抗原等，这种技术特别适用于复杂生物样品的分析。

[0015] 由于钙网蛋白(calreticulin，CRT)与免疫功能密切相关。CRT与T细胞生长、控制T细胞穿过细胞内皮细胞在体内迁移、钙离子调节、抗原递呈、细胞粘附和基因表达、抑制血管生成等生理功能有关。CRT不仅在细胞内发挥作用，而且能在细胞膜上发挥多种功能。CRT、ERp57与Misfolded-MHCI复合物可表达于T细胞膜上，是T细胞活化的关键因素；CRT在膜上分布、表达量及与CD47，LRP等分子的相互作用决定了巨噬细胞对该细胞是否吞噬。CRT还与系统性红斑狼疮、腹腔疾病、风湿性关节炎、干燥综合症、混合结缔组织病等多种自身免疫病的发病有关，如膜表面CRT还可作为抗dsDNA抗体的受体，介导其进入细胞；
膜表面CRT与中性粒细胞表面的补体Clq受体同源性很高，CRT和Clq结合导致Clq介导的免疫复合物清除障碍。ERp57与CRT形成复合物参与T细胞的活化。

[0016] Vimentin与Tubulin beta-5 chain还是构成细胞骨架的主要成份。细胞骨架对于细胞运动、膜受体的重布、细胞增殖分裂及细胞间的相互作用有关。近来研究还发现Tubulin及Vimentin等骨架蛋白与T细胞活化信号从膜向细胞核的传导有关。有研究表明，当T细胞活化后，Vimentin可快速出现在细胞膜上，其自制的抗Vimentin单克隆抗体SC5能够明显抑制CD3对T细胞的刺激作用，在培养体系中加入IL2可去除这种抑制作用。膜型Vimentin在结构与功能上与胞内Vimentin很可能不同，可能与血细胞通过血管内皮的运动及巨噬细胞、血小板的活化有关。Vimentin亦可在凋亡的人T细胞及中性粒细胞表面表达，辅助巨噬细胞识别与吞噬凋亡细胞。

发明内容

[0017] 本发明的目的是提供一种筛查免疫相关疾病疑似患者的酶联免疫试剂盒，包括抗原和酶标二抗；所述抗原为下述蛋白质或多肽中的至少一种：

[0018] 1)氨基酸序列是自GenBank Accession Number AAH03453的氨基末端的第21位-253位氨基酸残基的calreticulin多肽；

[0019] 2)是将由自GenBank Accession Number AAH03453的氨基末端的第1至416位氨基酸残基组成的calreticulin蛋白自氨基末端的第416位氨基酸残基开始，向氨基末端连续缺失0至163中任意整数个氨基酸残基得到的164个多肽或蛋白质之一；

[0020] 3)是将由自GenBank Accession Number AAH03453的氨基末端的第1至416位氨基酸残基组成的calreticulin蛋白自氨基末端的第1位氨基酸残基开始，向羧基末端连续缺失1至20中任意整数个氨基酸残基得到的20个多肽或蛋白质之一；

[0021] 4)氨基酸序列是自GenBank Accession Number P27773的氨基末端的第27位-250位氨基酸残基的ERp57多肽；

[0022] 5)是将由自GenBank Accession Number P27773的氨基末端的第1至505位氨基酸残基组成的ERp57蛋白自氨基末端的第505位氨基酸残基开始，向氨基末端连续缺失0至255中任意整数个氨基酸残基得到的256个多肽或蛋白质之一；

[0023] 6)是将由自GenBank Accession Number P27773的氨基末端的第1至505位氨基酸残基组成的ERp57蛋白自氨基末端的第1位氨基酸残基开始，向羧基末端连续缺失1至26中任意整数个氨基酸残基得到的26个多肽或蛋白质之一；

[0024] 7)氨基酸序列是自GenBank Accession Number P20152氨基末端的第1位-466位氨基酸残基的vimentin蛋白。

[0025] 为了便于检测，该试剂盒还包括用作质量控制的免疫相关疾病患者血清、阴性对照血清、常规ELISA检测用的各种试剂溶液：洗涤液、底物溶液和终止液等。

[0026] 其中，免疫相关疾病患者血清为至少10例免疫相关疾病患者的混合血清，用于检验实验操作是否正确。阴性对照血清为至少40例正常人的混合血清。

[0027] 所述酶标二抗中的标记酶可为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，优选为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶可通过戊二醛法或高碘酸钠法交联在二抗体上；所述二抗可为抗鼠或抗兔抗抗体。

[0028] 所述抗原固定于固相载体表面。可作为固相载体的物质很多，如聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等。该载体的形式可以是试管、微量反应板凹孔、小珠、小圆片等。

[0029] 实验证明氨基酸序列是自GenBank Accession Number AAH03453的氨基末端的第21位-253位氨基酸残基的calreticul in多肽(名称为calreticulin—1)、氨基酸序列是自GenBank Accession Number P27773的氨基末端的第27位-250位氨基酸残基的ERp57多肽(名称为ERp57-1)可用于筛查免疫相关疾病疑似患者血清，所以calreticulin全长蛋白、ERp57全长蛋白也能用于筛查免疫相关疾病疑似患者血清。

[0030] 为了提高免疫相关疾病疑似患者的筛查效果，所述抗原优选为calreticulin全长蛋白和/或ERp57全长蛋白和/或vimentin全长蛋白。氨基酸序列是自GenBank AccessionNumber AAH03453的氨基末端的第21位-253位氨基酸残基的calreticulin多肽可能会漏筛只含有只能和calreticulin其余片段结合的患者血清；氨基酸序列是自GenBankAccession Number P27773的氨基末端的第27位-250位氨基酸残基的ERp57多肽可能会漏筛只含有只能和ERp57其余片段结合的患者血清。

[0031] 本发明以活化T细胞作为疫苗诱导BALB/c小鼠产生抗活化态T细胞抗体。结合二维电泳、Western blot及蛋白质组学，找到抗活化态T细胞特异性识别的靶分子，用流式细胞术、ELISA、Western blot对上述抗体、蛋白进行鉴定。用细胞ELISA证实抗活化态T细胞抗体靶分子在活化态T细胞表面的表达。并通过抗T细胞抗体过继转移，观察其对小鼠迟发性超敏反应的影响实验结果表明通过T细胞免疫可以在小鼠体内诱导相应的抗T细胞抗体。抗活化态T细胞血清识别的活化态T细胞靶分子是钙网蛋白(calreticulin)，ERp57，波形蛋白(vimentin)等。

[0032] 以钙网蛋白(calreticulin)，ERp57，波形蛋白(vimentin)的重组蛋白作为抗原免疫小鼠，可以诱导产生高水平的特异性抗体。体内实验中，过继抗活化态T细胞抗体的小鼠迟发性超敏反应受到抑制。通过用上述活化态T细胞抗体特异性识别的靶分子重组蛋白为抗原制备的抗体可用于自身免疫病的诊断。

[0033] 本发明根据大多数免疫相关疾病患者的血清中针对上述抗原的抗体水平明显高于健康人，提供了可以检测待测血清中针对上述抗原的抗体水平的试剂盒。使用时，阴性对照血清可点3个孔，将该3个孔的检测值的平均值(如492nm的OD值)与其二倍标准差作为参考值，如待测血清的检测值大于该参考值，则该待测血清为免疫相关疾病疑似患者血清。本发明提供了一种有助于在体外诊断免疫相关疾病的工具，可与其它临床信息相互结合，并相互印证，提高诊断效率。

附图说明

[0034] 图1为人外周血中的CD4+CD25+T细胞的流式细胞数分析结果

[0035] 图2为活化的OVA-T细胞的流式细胞术纯度鉴定结果

[0036] 图3为活化态OVA-T细胞免疫小鼠血清的ELISA测定结果

[0037] 图4A为流式细胞术分析活化态OVA-T细胞与活化态OVA-T细胞免疫小鼠血清以及静息态OVA-T细胞免疫小鼠血清结合情况的结果

[0038] 图4B为流式细胞术分析静息态OVA-T细胞与活化态OVA-T细胞免疫小鼠血清以及静息态OVA-T细胞免疫小鼠血清结合情况的结果

[0039] 图4C为流式细胞术分析用ConA活化的小鼠脾细胞与活化态OVA-T细胞免疫小鼠血清以及静息态OVA-T细胞免疫小鼠血清结合情况的结果

[0040] 图4D为流式细胞术分析用抗CD3抗体活化的小鼠脾细胞与活化态OVA-T细胞免疫小鼠血清以及静息态OVA-T细胞免疫小鼠血清结合情况的结果

[0041] 图5A为活化态OVA-T细胞与活化态OVA-T细胞免疫小鼠血清结合情况的激光共聚焦显微镜照片

[0042] 图5B为活化态OVA-T细胞与静息态OVA-T细胞免疫小鼠血清结合情况的激光共聚焦显微镜照片

[0043] 图5C为静息态OVA-T细胞与活化态OVA-T细胞免疫小鼠血清结合情况的激光共聚焦显微镜照片

[0044] 图5D为静息态OVA-T细胞与静息态OVA-T细胞免疫小鼠血清结合情况的激光共聚焦显微镜照片

[0045] 图6为Western blot检测免疫小鼠血清识别靶的抗原

[0046] 图7为活化态OVA-T细胞的总蛋白的双向电泳图谱

[0047] 图8为ATV-S血清与活化态OVA-T细胞蛋白的Western blot结果

[0048] 图9为RTV-S血清与活化态OVA-T细胞蛋白的Western blot结果

[0049] 图10为用ESI-MS/MS鉴定出的CRT蛋白的部分肽段氨基酸序列图

[0050] 图11为ATV-S血清对重组calreticulin—1、Vimentin和ERp57-1的识别[0051] 图12为细胞ELISA检测活化态T细胞表面Calreticulin、Vimentin和ERp57的表达结果

[0052] 图13A为用ERp57-1通过ELISA检测正常人血清中抗ERp57-1抗体的结果[0053] 图13B为用ERp57-1通过ELISA检测慢性乙型肝炎患者血清中抗ERp57-1抗体的结果

[0054] 图14A为用calreticulin—1通过ELISA检测正常人血清中抗calreticulin—1抗体的结果

[0055] 图14B为用calreticulin—1通过ELISA检测慢性乙型肝炎患者血清中抗calreticulin—1抗体的结果

[0056] 图15A为用Vimentin通过ELISA检测正常人血清中抗Vimentin抗体的结果[0057] 图15B为用Vimentin通过ELISA检测慢性乙型肝炎患者血清中抗Vimentin抗体的结果

[0058] 图16A为用ERp57-1通过ELISA检测RA或SLE患者血清中抗ERp57-1抗体的结果

[0059] 图16B为 用calreticulin—1 通过ELISA 检测 RA或SLE患 者血 清 中 抗calreticulin—1抗体的结果

[0060] 图16C为用Vimentin通过ELISA检测RA或SLE患者血清中抗Vimentin抗体的结果

具体实施方式

[0061] 下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

[0062] 下述实施例中所用的实验材料：OVA为来源于BALB/c小鼠的卵清蛋白(III级，购自Sigma)。

[0063] 实施例1、抗活化态T细胞抗体所识别的靶蛋白为calreticulin(CRT)、ERp57和vimentin

[0064] 在研究TCV诱导的免疫调节机制的过程中，人们对TCV诱导的调节性T细胞应答有了较为深入的了解，但对TCV诱导的特异性体液应答(即抗体)知之甚少。在本发明中，用来源于BALB/c小鼠的卵清蛋白(OVA)特异性T细胞系作为疫苗免疫同品系小鼠，发现TCV能够诱导针对活化态T细胞的体液免疫应答。这一结果揭示了抗T细胞调节性抗体的存在，为今后对调节性抗T细胞抗体(regulatory anti-T-cell Abs)的研究奠定了基础，也为通过这一途径治疗免疫相关疾病提出了新的策略和方法。

[0065] 1、OVA特异性T细胞系的建立

[0066] 用来源于BALB/c小鼠的卵清蛋白皮下免疫BALB/c小鼠，取引流淋巴结细胞，在体d外用OVA反复刺激，建立了H-2 限制的OVA特异性T细胞系(OVA-T)。所获得的抗原特异性T细胞经活化后可作为TCV用来免疫小鼠，进行TCV诱导免疫应答的研究。具体方法如下：

[0067] 浓度为2mg/mL的来源于BALB/c小鼠的卵清蛋白(OVA，III级，购自Sigma)溶液与完全弗氏佐剂(CFA，购自(Sigma))按1:1的体积比充分混合后，免疫6-8周雌性BALB/dc(H-2)小鼠，100μg OVA/每只，于小鼠尾根部皮下免疫，免疫7-10天后杀鼠，取腹股沟和主动脉旁淋巴结，不锈钢筛网上研磨，并用PBS洗二次，然后计数并重悬于完全RMP1 1640
6
培养基(Hyclone)中，得到淋巴细胞悬液。每孔2×10 个淋巴细胞置于24孔板(每孔2ml)，并加入OVA，终浓度至100μg/ml，37℃，5％CO2培养，进行第一轮刺激。培养7-10天后，进行第二轮刺激，第二轮刺激7-10天后，再进行第三轮刺激，依此类推，进行新一轮的刺激，并
6
测定细胞对OVA的特异性反应。第一轮刺激不加饲养细胞，以后每轮刺激时，每孔加3×10个经2000 rad γ射线照射后的同系小鼠脾细胞作为作为饲养细胞，同时加入OVA(100μg/ml)及rIL2(北京瑞得合通药业有限公司)(20U/ml)，刺激抗原特异性T细胞活化增殖。

[0068] 按照如下方法测定每轮OVA刺激细胞对OVA的特异性反应：将新一轮刺激前的T4 5
细胞，加入96孔平底培养板，2.5×10 个/孔，同时加入4×10 个经2000 rad γ射线照射后的同系小鼠脾细胞作为饲养细胞及OVA(100μg/ml)，以不加抗原作为阴性对照，37℃，
3
5％ CO2培养72小时，终止培养前8小时掺入H-TdR，0.2μCi/孔；用96孔道收集器将细胞收集到玻璃纤维滤纸，WALLAC β 2 counter测定放射活性结果表明第3~8轮OVA刺激的淋巴细胞对OVA的特异性最佳。

[0069] 为保证用于免疫的T细胞的质量，结合淋巴细胞分层液分层及磁珠分选的办法，得到高纯度的T细胞，具体方法如下：第3~8轮OVA刺激的淋巴细胞在刺激三天后，收集细胞于15ml EP管内，2000rpm，离心3min；弃上清，加5mlPBS，平铺于5ml小鼠淋巴细胞分层液上，2000rpm，室温，20min，吸取白色云雾层狭窄带，PBS洗二次，末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640(Hyclone)，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞，计算出活细胞百分率。

[0070]

[0071]

[0072] 结果表明活细胞百分率在95％以上。

[0073] 对得到的T细胞用PE-抗CD25抗体(美国BD公司)，抗CD3抗体进行检测，结果d表明其中活细胞接近99％(图2)，获得了H-2 限制的OVA特异性T细胞系(OVA-T)。高纯度的T细胞确保了小鼠内的免疫反应是由T细胞所诱导产生，保证了所构建的2-D图谱中没有来自其他细胞蛋白的污染。

[0074] 2、TCV诱导抗活化态T细胞抗体的动力学

[0075] 在上述步骤1的OVA特异性T细胞系过程中，由加入饲养细胞及抗原刺激开始第三天后T细胞作为活化态OVA-T细胞，之后半量换液，并半量补充IL-2维持至第5-7天作为静息态OVA-T细胞。

[0076] 将雌性、6-8周龄的BALB/c小鼠随机分成三组，试验组、对照组和正常组，每组106 6
只。实验组用活化态OVA-T细胞尾根部皮下免疫(2×10 个细胞/每只，该2×10 个细胞用200μlPBS重悬)，对照组用同等数量的静息态OVA-T细胞免疫。正常组小鼠不进行免疫。每两周加强免疫一次，共加强免疫5次，分别于第一次免疫后2、4、6、8、10周取血，收集血清，通过T细胞-ELISA方法检测其中抗T细胞抗体的滴度。具体方法如下：收集活化态
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OVA-T细胞，调细胞浓度为2×10 个/ml，100μl/孔，即2×10/孔，加入96孔酶标板中，离心，1500rpm，2min，弃上清；1:200稀释待检血清及对照血清，100μl/孔加于酶标板中，每个稀释度做三个重复孔，4℃60min每孔加200μl PBS-T(含0.5％吐温的磷酸盐缓冲液(0.5M pH7.2))，震荡后，静置30s，离心，1500rpm，2min，弃上清控干。洗涤后每孔加入1：
3000稀释的酶标兔抗小鼠IgG-HRP(北京中杉)100μl，4℃，60min。洗涤后，各孔加入OPD显色液100μl，混匀，室温反应5-10min。50μl/孔1M H2SO4，终止反应，492nm酶标仪读数。
结果如图3所示，实验组(活化态OVA-T细胞免疫)在初次免疫2周后开始产生抗活化态T细胞IgG抗体，加强免疫后该抗体滴度进一步增高，至第6周达到平台，具有典型的再次应答的特征。静息态T细胞免疫组小鼠的血清与活化态T细胞以及静息态T细胞均没有明显的结合。图3中，ATV-S为活化态OVA-T细胞免疫小鼠血清，RTV-S为静息态OVA-T细胞免疫小鼠血清，NMS为正常鼠血清。在下面的描述中，将用活化态OVA-T细胞免疫雌性、6-8周龄的BALB/c小鼠获得的抗血清简称为ATV-S，静息态OVA-T细胞免疫雌性、6-8周龄的BALB/c小鼠获得的抗血清简称为RTV-S。

[0077] 3、流式和免疫荧光法分析抗T细胞抗体与T细胞的结合

[0078] 为了进一步确认TCV诱导抗体与T细胞的特异性结合，用间接免疫荧光法结合流式细胞记数仪(FACS)对抗血清与T细胞的结合情况做了进一步的分析。

[0079] 取小鼠脾细胞终浓度2*106个/mL，加入ConA终浓度5μg/ml或抗CD3抗体5μg/ml，37℃，5％CO2，培养48小时，得到ConA活化的小鼠脾细胞、抗CD3抗体活化的小鼠脾细胞。

[0080] 用PBS将活化态OVA-T细胞、静息态OVA-T细胞、ConA活化小鼠脾细胞和抗CD3抗6
体活化小鼠脾细胞的细胞浓度调整为1×10 个/ml；分别取1ml细胞悬液加入15ml EP管中，1500rpm，5min；加入1∶20(PBS稀释)一抗(ATV-S或RTV-S)，4℃ 30min；用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右，1500rpm，5min；弃上清，加入50μl工作浓度的FITC标记一抗(ATV-S或RTV-S)，4℃，30min；用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1500rpm，5min；
加适量固定液，FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存(5～7天)。
双标记检测细胞表型时，加入FITC标记抗体的同时加入针对另一靶抗原的PE标记的抗体。
FCM结果如图4A-4D所示，ATV-S与活化态T细胞的结合明显地强于RTV-S。激光共聚焦显微镜观察结果(图5A-5B)与FACS分析一致，ATV-S与活化态OVA-T细胞的样品中可看见绿色荧光，而RTV-S与活化态OVA-T细胞的样品中看不见绿色荧光；ATV-S与静息态OVA-T细胞的样品中看不见绿色荧光，RTV-S与静息态OVA-T细胞的样品中也看不见绿色荧光。为了排除TCV免疫血清只能识别OVA-T细胞的可能性，用ConA及抗CD3抗体活化的小鼠脾细胞作为靶细胞重复上述实验，得到了同样的结果，说明OVA-T诱导产生的抗体并非只针对OVA-T细胞，而是具有广泛的代表性。

[0081] 4、抗活化态T细胞抗体识别靶点的鉴定

[0082] T细胞的活化伴随着表面分子的变化，例如，开始出现CD25、CD26、CD30、CD69、CD70、胰岛素受体和转铁蛋白受体等新的分子，CD2、CD27及CD44等分子的表达也会明显升高。这些分子是否会成为抗T细胞抗体的靶分子？抗T细胞抗体是否会通过这些分子来调节T细胞的功能？对这些问题的答案有重要的理论和应用意义。在下面的实验中，通过WesternBlot、免疫共沉淀和免疫蛋白质组学等方法对抗T细胞抗体所识别的靶抗原进行鉴定和分析。

[0083] (1)Western blot鉴定ATV-S血清识别的靶抗原

[0084] 首先用Western blot法检测ATV-S和RTV-S血清识别T细胞抗原的情况，具体7
方法如下：取5×10 个上述活化态OVA-T细胞，PBS洗三遍，去上清，加入1ml蛋白提取液，超声破碎细胞，2mw/5s/次，共3次，15000g离心，30分钟，收集上清即为总蛋白。上述活化态OVA-T细胞的总蛋白，进行凝胶浓度T为12％、交联度C为％的SDS-PAGE，分别以正常雌性、6-8周龄的BALB/c小鼠血清、活化态OVA-T细胞免疫雌性、6-8周龄的BALB/c小鼠获得的抗血清(ATV-S)，静息态OVA-T细胞免疫雌性、6-8周龄的BALB/c小鼠获得的抗血清(RTV-S)和OVA免疫雌性、6-8周龄的BALB/c小鼠获得的抗血清(OVA-S)为一抗，进行Western blot。结果表明ATV-S与活化态T细胞的分子量为45-93kD的蛋白有明显的结合，而RTV-S血清则基本无反应(图6)。图6中，M为蛋白质分子量标准，1为正常雌性、6-8周龄的BALB/c小鼠血清，2为RTV-S，3为ATV-S，4为OVA-S。

[0085] (2)鉴定抗T细胞抗体所识别的靶分子

[0086] 上述的Western blot结果并不能确认抗血清所识别的靶分子。为实现这一目的，有必要通过免疫蛋白质组学的手段加以分析。其主要流程是先用二维电泳将T细胞蛋白进行分离，随后通过Wester blot来鉴定抗血清所能够特异识别的蛋白质斑点，再配以质谱测序，鉴定出抗体所识别的靶分子。

[0087] 提取上述活化态OVA-T细胞的总蛋白，进行双向电泳。其中，第一向等电聚焦电泳采用的是pH3-10，分离范围7cm的IPG胶条，上样量1mg/胶条；第二向SDS-PAGE电泳使用的是凝胶浓度T为12％、交联度C为2.9％的SDS-PAGE，每次三块胶，其中一块用于考马斯亮兰染色，另二块作用于转膜，作Western blotting检测。该活化态OVA-T细胞的总蛋白的双向电泳图谱如图7所示，图7中，1为Calreticulin，5为Vimentin，7为ERp57。

[0088] 用ATV-S及RTV-S血清与转至NC膜上的活化态OVA-T细胞蛋白反应，作Western blot检测确定其中的免疫原性蛋白，作blot之前膜先用丽春红染色，标出具有特征性的点(如边界、染色较深的点)当坐标，以辅助定位。由于本法是用2-D blot与胶比对，与传统的两块2-D胶比对不同，且膜上的点较少、清昕，所以并未用专门的匹配软件。而是用考马斯亮兰染色的2-D胶作母板，将丽春红染色及2-D blot结果在图形处理软件Photoshop上叠加，同时参考1-D blot结果(靶蛋白分子量大小)，确定2-D blot有反应的点在胶上的定位，并标以数字。图8和图9代表了四次独立实验的结果。

[0089] 将图8和图9中所鉴定的特异性蛋白斑点从胶上取下，进行电喷雾电离串联质谱(ESI-MS/MS)分析，所有测定均在正离子方式下进行，雾化气体为氮气，碰撞气体为氩气，源温80℃，锥孔电压50V，TOF加速电压为0.2kV，MCP检测器电压为2.7kV，当进行LC-ESI-MS/MS自动分析时，毛细管电压为3000V。测定结果仪器以peaklist文件形式给出，通过Mascot软件(http://www.matrixscience.com)检索NCBI数据库鉴定蛋白质点，并得到部分肽片段序列。结果列于表1。图10为用ESI-MS/MS鉴定出的CRT蛋白的部分肽段氨基酸序列图。

[0090] 为保证结果的可靠性，对Calreticulin、Vimentin和ERp57蛋白点进行了MALDI-TOF-MS肽指纹图分析。MALDI-TOF-MS分析采用反射模式，正离子谱测定，离子源加速电压20KV，飞行管长2.5m，反射电压比1.12，N2激光波长337nm，脉冲宽度3ns，离子延迟-7提取100ns，真空度4×10 Torr，质谱信号单次扫描累加50次，使用胰蛋白酶自降解峰m/z842.50和m/z 2211.10作为内校正，获得肽质量指纹图谱(PMF)。Mascot软件检索NCBI数据库鉴定蛋白质。

[0091] 表1 ATV-S识别靶蛋白

[0092]

[0093] 由表1中的结果来看，抗T细胞抗体所识别的靶分子并不包括已知的“T细胞活化分子”，如CD2、CD27、CD44、CD25、CD26、CD30、CD69、CD70、胰岛素受体和转铁蛋白受体等。Calreticulin、Vimentin和ERp57并非T细胞特异蛋白，它们的表达谱广泛。这一发现揭示了T细胞活化与调节的新的规律。

[0094] (3)质谱结果的进一步确认

[0095] 为确认上述质谱分析结果的可靠性，表达了氨基酸序列是自GenBank Accession NumberAAH03453的氨基末端的第21位-253位氨基酸残基CRT N端片段(名称为calreticulin—1)，氨基酸序列是自GenBank Accession Number P27773的氨基末端的第
27位-250位氨基酸残基的ERp57片段(名称为ERp57-1)及全长的Vimentin重组蛋白(自GenBankAccession Number P20152的氨基末端的第1位-466位氨基酸残基)。

[0096] 获取calreticulin、ERp57、vimentin蛋白质序列和mRNA序列，再使用DNAstar或Vector NTI Advance等生物学软件进行引物设计，并对其引物参数进行评估，加上酶切位点和保护碱基，合成上游引物和下游引物。其中，用于扩增calreticulin—1的引物为：5’-cgc ggatcc atc tat ttc aaa gag cag ttc ttg-3’和5’-ccc aagctt tta cca gtcctc agg ctt ctt agc atc-3’，用于扩增ERp57-1的引物为：5’-cgc ggatcc gtg ttg gaactg acg gac gaa aac ttc-3’和5’-ccc aagctt ttaatc ttc cgt cat atg agg aca gag-3’，用于扩增Vimentin的引物为：5’-cgc ggatcc atg tct acc agg tct gtg tcc tcgtct tcc t-3’和5’-ccc aagctt ttatta ttc aag gtc atc gtg atg ctg aga agt c-3’(上述引物中带下划线的碱基为酶切位点，斜体字为附加的终止密码子)。从蛋白表达较高的C57小鼠T细胞系EL4细胞中提取总RNA，分别利用上述引物进行RT-PCR获取目的片段，将目的片段的PCR产物与分别与pGEM-T载体连接，测序结果表明calreticulin—1的PCR产物具有自GenBank Accession Number BC003453.1的5′末端的第97位-795位核苷酸序列，ERp57-1的PCR产物具有自GenBank Accession Number NM_007952.2的5′末端的第216位-887位核苷酸序列，全长的Vimentin的PCR产物具有自GenBank Accession NumberNM_011701.3的5′末端的第481位-1881位核苷酸序列，将calreticulin—1的PCR产物、ERp57-1的PCR产物和全长的Vimentin的PCR产物分别插入pET28a载体的BamH I和HindIII位点间，得到重组表达载体pET28a-calreticulin-1、pET28a-ERp57-1和pET28a-Vimentin。
pET28a-calreticulin-1、pET28a-ERp57-1和pET28a-Vimentin分别转化BL21(DE3)大肠杆菌，挑单克隆，IPIG诱导表达；Ni-NTA柱阳离子亲和层析纯化，PD10Sephadex G25脱盐柱脱盐；测定浓度，纯度鉴定，分装并于-80℃保存备用。经过上述过程，获得90％以上纯度的重组蛋白，其浓度经测定最高可达5mg/mL，产量每升菌可达10-20mg。表达的蛋白经N末端氨基酸序列测定，证实它们分别为重组表达calreticulin—1(自GenBank Accession Number AAH03453的氨基末端的第21位-253位氨基酸残基)、全长的Vimentin重组蛋白(自GenBank Accession Number P20152的氨基末端的第1位-466位氨基酸残基)和ERp57-1(自GenBank Accession Number P27773的氨基末端的第27位-250位氨基酸残基)。

[0097] 将重组表达的calreticulin—1、全长的Vimentin重组蛋白和ERp57-1经SDS-PAGE电泳后转到NC膜上，以ATV-S抗血清为第一抗体进行Western Blotting，结果在预期的分子量位置上出现了特异的条带(图11)，ATV-S抗血清与重组表达的calreticulin—1在30kD得到杂交条带，ATV-S抗血清与全长的Vimentin重组蛋白在57kD得到杂交条带，ATV-S抗血清与ERp57-1在27kD得到杂交条带；RTV-S血清与calreticulin—1、全长的Vimentin重组蛋白和ERp57-1均无杂交条带。图11中，泳道2、6、9为Vimentin，3、5、8为calreticulin—1重组蛋白，1、4、7为无关对照蛋白。这一结果证明了ATV-S血清中确实含有calreticulin—1、Vimentin特异性抗体。

[0098] 5、Calreticulin，Vimentin，Erp57在活化T细胞膜表面的表达

[0099] 由于calreticulin，Erp57和vimentin等均是胞内蛋白。CRT和ERp57在内质网中作为分子伴侣起作用，ERp57与CRT形成复合物参与T细胞的活化。而Vimentin是细胞骨架蛋白。这些蛋白是否真的会出现在活化态T细胞的表面？运用了高灵敏度的细胞-ELISA法确认了这些蛋白在活化态T细胞膜表面的表达。具体方法如下：将细胞作为5
抗原(4×10 个/孔)离心包被在ELISA板上，2％牛血清白蛋白37℃封闭2小时，以抗全长calreticulin抗体(Anti-CRT)(Santa Crutz)，抗全长ERp57抗体(Anti-ERp57)(Santa Crutz)，抗全长vimentin抗体(anti-vimentin)(Santa Crutz)为一抗，37℃孵育1小时，HRP偶联抗IgG作为二抗，37℃孵育1小时，加入显色液显色并适时终止。

[0100] 结果如图12所示，与对照anti-goat IgG(图中以goat IgG表示)相比，抗全长calreticulin抗体，抗全长ERp57抗体，抗全长vimentin抗体对活化态T细胞有较明显的识别，表明calreticulin，Erp57和vimentin在活化态T细胞膜表面表达。

[0101] 综上所述，TCV主动免疫诱导产生了针对CRT、ERp57及Vimentin的特异性IgG抗体。这些抗体与T细胞膜上相应的靶分子相互作用，通过影响自身反应性T细胞膜的流动性、膜受体的重新分布、免疫突触的形成、细胞活化信号的传导、穿过血管内皮细胞进入靶器官的能力等方面发挥免疫调节作用，同时还可能间接增强了调节性T细胞的功能。

[0102] 实施例2、筛查免疫相关疾病疑似患者的ELISA试剂盒

[0103] 本发明开发了CRT、ERp57和Vimentin特异性抗体检测ELISA试剂盒，并用其测定了慢性乙型肝炎患者、类风湿关节炎患者和SLE患者的血清抗体。

[0104] 1、试剂盒的组成

[0105] 试剂盒的组成以calreticulin—1、ERp57-1或vimentin包被的酶标板为主，还含有抗HRP标记的人或者小鼠IgG、常规ELISA检测用的各种试剂溶液：洗涤液、底物溶液和终止液。

[0106] 其中，calreticulin—1，ERp57-1或vimentin重组蛋白按照如下方法包被酶标板：用包被液(0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液)将calreticulin—1，ERp57-1或vimentin重组蛋白分别稀释成0.1-1μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h，4℃过夜，倾去包被缓冲液，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入含5％脱脂牛奶的0.05M磷酸盐缓冲液250μl，37℃温育1-2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

[0107] 底物液：OPD 0.6mg/mL。

[0108] 洗涤液：含0.05％吐温的磷酸盐缓冲液(0.05M pH7.2)。

[0109] 显色液：0.2M Na2HPO425.7mL，0.1M柠檬酸24.3mL，混合用超纯水稀释一倍。

[0110] 终止液：1mol/L硫酸。

[0111] 检测时，在酶标板小孔中加入50μl待测血清(用洗涤液稀释)，覆上盖板膜于18℃-30℃放置1h，用洗涤液洗酶标板3次，用吸水纸拍干，之后用洗涤液稀释配置酶标抗体溶液(0.1mg/L)并加入酶标板小孔中，30℃放置30min，再用洗涤液洗酶标板3次，拍干，取100μl底物液加入酶标板小孔后混匀，避光显色约15min，最后每孔加入终止液(1mol/L硫酸)100μl，用酶标仪测定492nm处的OD值。

[0112] 2、检测慢性乙型肝炎患者血清

[0113] 用含有ERp57-1包被的酶标板的试剂盒对44名健康献血员以及95位HBV慢性感染者的血清中针对ERp57-1的IgG抗体进行了比较。其中，以44例健康献血员血清的OD492nm的平均值±2SD为参考值，该参考值为0.283±0.016(平均值±2SD)，小于该参考值的血清为阴性血清，大于该参考值的血清为阳性。结果表明健康人血清中抗ERp57-1抗体均为阴性(少数为临界)(图13A)，而HBV患者80％为阳性(图13B)。图13B中，每一个柱为一个HBV患者血清。

[0114] 用含有calreticulin—1包被的酶标板、vimentin包被的酶标板的试剂盒对44名健康献血员以及95位HBV慢性感染者的血清中针对calreticulin—1和vimentin的抗体也进行了比较。其中，以44例健康献血员血清的OD492nm的平均值±2SD为参考值，calreticulin—1包被的酶标板检测中，该参考值为0.279±0.019，小于该参考值的血清为阴性血清，大于该参考值的血清为阳性；vimentin包被的酶标板检测中，该参考值为0.281±0.017，小于该参考值的血清为阴性血清，大于该参考值的血清为阳性。结果表明健康人血清中抗calreticulin—1和抗vimentin抗体阳性者约为10％，而HBV患者70％为阳性(图14A、14B、15A和15B)。图14B和图15B中，每一个柱为一个HBV患者血清。

[0115] 3、检测类风湿关节炎(RA)患者和系统性红斑狼疮(SLE)患者的血清抗体[0116] 又比较了RA和SLE患者血清中针对calreticulin—1，ERp57-1和vimentin抗体的水平，每种抗原各检测20名患者。结果如图16A、16B和16C所示，表明RA患者中抗ERp57-1抗体、抗calreticulin—1抗体和抗vimentin抗体阳性率分别为100％、65％、45％；SLE患者中抗ERp57-1抗体、抗calreticulin—1抗体和抗vimentin抗体阳性率分别为85％、40％、80％。图16A、16B和16C中，左侧20例为SLE患者血清，右侧20例为RA患者血清，N10为十位健康人混合血清。